Summary
Beschrieben wird die Zellkultur und Expositionsmethode eines In-vitro-Bronchialmodells für eine realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Partikeln für Toxizitätstests.
Abstract
Für Toxizitätstests von Partikeln in der Luft wurden Expositionssysteme für Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI) für In-vitro-Tests entwickelt, um realistische Expositionsbedingungen nachzuahmen. Dies stellt spezifische Anforderungen an die Zellkulturmodelle. Viele Zelltypen sind durch die Exposition gegenüber Luft (z.B. Austrocknung) negativ beeinflusst und bleiben nur für ein paar Tage lebensfähig. Dies begrenzt die Expositionsbedingungen, die in diesen Modellen verwendet werden können: In der Regel werden relativ hohe Konzentrationen als Wolke (d. h. Tröpfchen mit Partikeln, die sich schnell absetzen) innerhalb kurzer Zeit angewendet. Solche experimentellen Bedingungen spiegeln keine realistische Langzeitexposition gegenüber niedrigen Partikelkonzentrationen wider. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde die Verwendung einer menschlichen Bronchialepithelzelllinie untersucht. Diese Zellen können unter ALI-Bedingungen für mehrere Wochen kultiviert werden, wobei eine gesunde Morphologie und eine stabile Monoschicht mit engen Knoten beibehalten werden. Darüber hinaus eignet sich dieses Bronchialmodell zur Prüfung der Auswirkungen wiederholter Expositionen bei niedrigen, realistischen Konzentrationen von Partikeln in der Luft mit einem ALI-Expositionssystem. Dieses System verwendet einen kontinuierlichen Luftstrom im Gegensatz zu anderen ALI-Expositionssystemen, die eine einzige Vernebelung verwenden, die eine Wolke erzeugt. Daher eignet sich das kontinuierliche Durchflusssystem für wiederholte und längere Exposition gegenüber Luftpartikeln, während die Partikeleigenschaften, die Expositionskonzentration und die gelieferte Dosis kontinuierlich überwacht werden. Zusammengenommen ist dieses Bronchialmodell in Kombination mit dem kontinuierlichen Strömungsexpositionssystem in der Lage, realistische, wiederholte Expositionsbedingungen zu imitieren, die für Toxizitätstests verwendet werden können.
Introduction
Die Lunge ist anfällig für inhalative Exposition gegenüber Luftpartikeln. Um die potenzielle Toxizität von Partikeln in der Luft zu bewerten, wurden Fortschritte bei der Entwicklung von Expositionssystemen für luft-flüssige Schnittstelle (ALI)1,2,3,4,5erzielt. ALI-Expositionssysteme ermöglichen relevantere und realistischere Expositionsmodelle im Vergleich zur herkömmlichen Unterwasserexposition über Kulturmedium, das die Eigenschaften und Kinetik der Partikel verändert6. Die ALI-Expositionssysteme stellen spezifische Anforderungen an die Zellkulturmodelle, da den Modellen kulturmittel und damit Nährstoffe auf der apikalen Seite fehlen. Viele Zellmodelle werden durch kultivierte und exponierte Luft (z.B. Austrocknung) negativ beeinflusst und bleiben nur für ein paar Tage lebensfähig. Dies begrenzt die Expositionsbedingungen, die in diesen Modellen verwendet werden können: In der Regel werden relativ hohe Konzentrationen innerhalb kurzer Zeit als Wolke (d. h. Tröpfchen mit Partikeln, die sich schnell absetzen) angewendet. Solche experimentellen Bedingungen spiegeln keine realistische Langzeitexposition gegenüber niedrigen Partikelkonzentrationen wider; somit kann die Relevanz der Ergebnisse in Frage gestellt werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde das Kultur- und Expositionsprotokoll für ein Bronchialmodell, bestehend aus der menschlichen Bronchialepithelzelllinie Calu-37, optimiert.
Die meisten In-vitro-Lungenmodelle, die für die ALI-Exposition verwendet werden, enthalten andere Zelllinien wie A549, BEAS-2B und 16HBE14o- (16HBE) oder Primärzellen als Basis8. Diese Zelllinien haben den Nachteil, dass sie nur für ein paar Tage lebensfähig bleiben, wenn sie an der ALI kultiviert werden. Darüber hinaus überwachsen einige dieser Zelllinien, wenn sie länger als 5 Tage kultiviert werden. Schließlich vermissen A549-Zellen funktionelle enge Kreuzungen und können daher keine enge Barriere bilden, die benötigt wird, um die Lunge9,10nachzuahmen. Primäre Epithelzellen könnten eine gute Option für eine ALI-Exposition sein, da sie wochenlang an der ALI kultiviert werden können. Primärzellen unterscheiden sich jedoch von Charge zu Charge, sind schwieriger zu pflegen und im Vergleich zu Zelllinien teurer, wodurch sie weniger für Toxizitätstests und -screenings geeignet sind. Beim Vergleich verschiedener menschlicher Bronchialepithelzelllinien (16HBE, Calu-3, H292 und BEAS-2B) erfüllen nur die Calu-3-Zellen alle Kriterien für eine realistische, wiederholte ALI-Exposition: Sie bleiben wochenlang lebensfähig, während sie an der ALI kultiviert werden, bieten eine hohe Barriereintegrität, wachsen nicht und sind leicht zu kultiessen und zu pflegen. Calu-3-Zellen stammen aus einem Adenokarzinom und sind in der Lage, Schleim zu produzieren11,12. Es gibt Unstimmigkeiten, ob die Zellen Zilien11,13entwickeln können. Calu-3-Zellen sind auch ein geeignetes Modell, um Respiratorien (RSV) zu untersuchen, die Zilien-Atemwegsepithelzellen14infizieren.
Neben dem Zellmodell wird ein automatisiertes Expositionssystem (AES) für die luft-flüssige Exposition gegenüber Aerosolen15,16eingesetzt. Die AES hat den Vorteil, dass sie einen kontinuierlichen Luftstrom nutzt, um das Zellmodell Aerosolen auszusetzen. Dies steht im Gegensatz zu anderen luft-flüssigen Expositionssystemen, die in der Regel innerhalb kurzer Zeit relativ hohe Konzentrationen als Wolke verwenden (d.h. Tröpfchen, die Partikel enthalten, die sich schnell absetzen)17,18,19. Diese Cloud-Systeme spiegeln keine realistische Langzeitexposition gegenüber niedrigen Partikelkonzentrationen wider. Durch die Anwendung eines kontinuierlichen Luftstroms mit dem AES kann das Zellmodell über einen längeren Zeitraum einer geringen Konzentration von Partikeln ausgesetzt werden, was realistische Expositionsbedingungen widerspiegelt. Ein weiterer Vorteil gegenüber Cloud-Systemen besteht darin, dass die AES die Möglichkeit hat, Partikelcharakterisierungsinstrumente zu verbinden, die eine Messung der Partikelgröße, der Zahlenkonzentration und der Masse im Zeitverlauf ermöglichen. Eine Einschränkung des AES besteht darin, dass er relativ hohe Luftströme zwischen 10 ml/min und 100 ml/min verbraucht.
Protocol
1. Vorbereitung des Zellkulturmediums (CCM)
- Bereiten Sie eine Flasche von 500 ml des minimalen essentiellen Mediums (MEM) mit Glutamin ergänzt.
- Fügen Sie 5 ml Penicillin-Streptomycin hinzu (d. h. 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin).
- Fügen Sie 5 ml nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) Lösung hinzu.
- 10 ml Amphotericin B hinzufügen (optional).
- Fügen Sie 50 ml FBS hinzu (Wärme inaktiviert, folgen Sie bitte dem ATCC-Protokoll zur Wärmeinaktivierung; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx, Seite 19)).
2. Subkulierung von Calu-3-Zellen
HINWEIS: Calu-3-Zellen werden in T75- oder T175-Zellkulturkolben bei 37 °C und 5%CO2kultiviert. Zellen werden alle 7 Tage bei 60–80% Konfluenz mit CCM-Erneuerung alle 2–3 Tage durchzogen. CCM wird abgegossen und frisches CCM (T25 = 5 ml, T75 = 15 ml und T175 = 25 ml) in den Kolben gepumpt und der Kolben wieder in den Inkubator gelegt. Die Zellen sollten mindestens 2x nach dem Auftauen, vor der Verwendung in Experimenten oder vor dem Einfrieren, und sie sollten nicht mehr als 25x insgesamt durchgesiet werden.
- Bestätigen Sie, ob der Kolben 60–80 % konfluent ist, indem Sie unter einem Lichtmikroskop überprüfen.
- Gießen Sie den CCM aus dem Kolben.
- Waschen Sie die Zellen 2x mit 5 ml 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Kalzium und ohne Magnesium. Entsorgen Sie den HBSS nach jeder Wäsche. HBSS entfernt Serum, das Trypsin hemmt.
- Fügen Sie 3 ml Trypsin-EDTA für einen T75 (4 ml für einen T175) hinzu und legen Sie den Kolben bei 37 °C und 5%CO2 für 10–15 min wieder in den Inkubator. Überprüfen Sie nach 10 min, um sicherzustellen, dass sich die Zellen von der Kolbenoberfläche gelöst haben. Falls die Zellen auf >80% Konfluenz angewachsen sind, lösen sie sich nicht mit Trypsin 0,05% und Trypsin 0,25% könnten verwendet werden.
- Fügen Sie dem Kolben 6 ml (d. h. das doppelte Trypsin-EDTA-Volumen, das ursprünglich hinzugefügt wurde) von CCM hinzu und schaukeln Sie die Kolben sanft, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Dadurch soll sichergestellt werden, dass das Trypsin vom FBS im CCM neutralisiert und seine Aktivität auf den Zellen angehalten wurde. Wenn Trypsin zu lange mit den Zellen in Kontakt bleiben darf, werden sie nicht wieder angefügt, wenn sie in einen neuen Zellkulturkolben gesteckt werden.
- Gießen Sie den gesamten Inhalt des Kolbens in ein 50 ml Zentrifugenrohr.
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 130 x g, um sicherzustellen, dass die Zentrifuge richtig ausbalanciert ist.
- Bringen Sie die Durchstechflasche mit den Zellen wieder in aseptische Bedingungen zurück und entfernen Sie den Überstand sanft, ohne das Pellet zu stören. Der Überstand kann abgegossen und der Rest abgelassen werden, damit das Pellet nicht gestört wird.
- Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml CCM wieder auf, indem Sie nach oben und unten pfeifen, bis alle Zellen suspendiert sind (d. h. es werden keine Pellets oder Zellagglomerate beobachtet). Zusätzliches CCM kann hinzugefügt werden, um die Zellsuspension zu verdünnen.
- Zählen Sie die Zellen, sowohl tot als auch lebendig, in 1 ml CCM mit einem Hämozytometer. Bei Bedarf für die richtige Zählung, verdünnen Sie die Zellen in 3 oder 4 ml.
- Setzen Sie die Zellen in das erforderliche CCM-Volumen aus, und fügen Sie die Zellsuspension in jeden Kolben ein. Um eine Konfluenz von etwa 80 % in einer Woche zu erreichen, samen 2 x 106 Zellen in einem T75 oder 6 x 106 Zellen in einem T175.
- Den Kolben vorsichtig schaukeln und bei 37 °C und 5%CO2wieder in den Inkubator legen.
- Ersetzen Sie alle 2–3 Tage durch frisches CCM und subkultur, wenn die Zellen 60–80 % Konfluenz erreichen.
3. Saatierung von Calu-3-Zellen auf Kultureinsätze
HINWEIS: Einsätze sind in verschiedenen Porengrößen erhältlich. Kleine Porengrößen (z.B. 0,4 m) haben den Vorteil, dass die Zellen leichter wachsen und bereits nach 5 Tagen Kultivierung unter Getauchtbedingungen eine gute Barriere erreichen können, gemessen mit Trans epithelialer elektrischer Beständigkeit (TEER). Wenn Sie jedoch an der Partikeltranslokation interessiert sind, sind diese Poren zu klein und werden die Partikel einfangen. Daher werden in der Regel größere Porengrößen (z.B. 3 m) gewählt, um Partikel zu testen. Bei Verwendung einer größeren Porengröße benötigen die Zellen längere Zeiträume (z. B. 7–10 Tage Kultivierung unter getauchten Bedingungen), um einen guten TEER zu erreichen.
- Bereiten Sie die Zellsuspension mit bekannter Konzentration nach den Schritten 2.1–2.10 vor.
- Verdünnung von Zellen auf eine Konzentration von 5 x 105 Zellen/ml in vorgewärmtem CCM für 6 Brunneneinsätze oder 2,5 x 105 Zellen/ml für 12 Brunneneinsätze.
- Nehmen Sie eine Zellkulturplatte mit Einsätzen und platzieren Sie sie unter aseptischen Bedingungen.
- Füllen Sie die basolaterale Seite mit 2 ml vorgewärmten CCM für 6 Brunneneinsätze oder 1 ml für 12 Brunneneinsätze. Nehmen Sie beim Hinzufügen des Kulturmediums den Einsatz mit einer Pinzette heraus.
- Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Pipette 1,0 ml für 6 Brunneneinsätze und 500 l für 12 Brunneneinsätze (entspricht 100.000 Zellen/cm2) auf der Oberseite der Membran inder Zellkulturbeilage mit 0,4 m Poren. Erhöhen Sie bei 3,0 m Poren die Zelldichte auf 128.000 Zellen/cm2.
- Bedecken Sie die Zellkulturplatte und brüten Sie bei 37 °C und 5%CO2.
- Ändern Sie den CCM alle 2–3 Tage.
- Lassen Sie die Zellen für 7 Tage unter Getauchtbedingungen konfluent werden, bevor Sie weiter an der ALI kulturieren.
- Messen Sie TEER.
- Nehmen Sie ein Epithelial Voltohmmeter, ergänzt mit Chopstick Electrode Set, und laden Sie das Batteriesystem über Nacht auf.
- Trennen Sie das Voltohmmeter vom Ladegerät und schließen Sie die Essstäbchenelektrode an.
- Reinigen Sie die Elektrode mit 70% Ethanol.
- Legen Sie die Elektrode in das CCM, indem Sie die längere Elektrode in die externen Kulturmedien legen, bis sie den Boden der Schale berührt und die kürzere Elektrode in die Medien legt, ohne die Membran zu berühren.
- Beginnen Sie mit einem leeren Insert ohne Zellen. Warten Sie, bis sich die Messung stabilisiert, und notieren Sie den Widerstand in Ohms. Diese Messung ist der Widerstand der Insert-Membran ohne Zellen (d.h. Blankwiderstand).
- Wiederholen Sie die Messung für jeden Einsatz und subtrahieren Sie den Blankowiderstand, um den tatsächlichen Widerstand zu erhalten.
- Für die Datenanalyse multiplizieren Sie die Widerstandswerte mit der Oberfläche des Einsatzes in Ω x cm2. Für einen 6-Well-Einsatz beträgt die Oberfläche 4,67 cm2. Wenn also ein Widerstand von 600 Ohm gemessen wird und der Hintergrund 120 Ohm beträgt, beträgt der Widerstand 480 Ohm, der dann mit der Oberfläche von 4,67 cm2 für insgesamt 2.241,6 Ohm x cm2multipliziert wird. Der TEER sollte >1.000 Ω x cm2 betragen, um fortzufahren.
- Entfernen Sie das CCM von der apikalen Seite der Einsätze.
- Fügen Sie 2 ml vorgewärmte CCM für 6 Gut und 1 ml für 12 Brunneneinsätze auf die basolaterale Seite des Brunnens (d.h. unter dem Zellkultureinsatz). Das CCM sollte die Membran von unten berühren, aber nicht auf die Oberseite des Einsatzes austreten.
- An diesem Punkt werden Zellen apisch der Luft ausgesetzt, die als Kultivierung an der ALI bezeichnet wird.
- Kulturzellen am ALI im Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für 7 Tage vor der Exposition.
- Ändern Sie das basolaterale CCM alle 2–3 Tage. Die Zellen können im ALI für 6 Wochen verwendet werden.
4. Vorbereiten der Belichtungseinrichtung
ANMERKUNG: In den Abschnitten 5–7 werden Präparate für die Partikelexposition mithilfe einer automatisierten Expositionsstation (AES, siehe Tabelle der Materialien) beschrieben. Das Setup für Partikelvernebelung und Charakterisierung ist auch mit anderen ALI-Belichtungssystemen anderer Hersteller kompatibel. Als Beispiel wird die Exposition gegenüber Partikeln unten beschrieben. Solche Systeme können auch für andere Expositionen wie Sensibilisierungsmittel, Zigarettenrauch und Dieselabgase verwendet werden. Abbildung 1 zeigt das AES und ein Belichtungsmodul. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der Belichtungseinrichtung einschließlich aller anderen Instrumente.
- Bevor Sie mit der AES-Exposition beginnen, schließen Sie das System an mehrere Instrumente an, um aerosolische Eigenschaften zu messen; Diese werden in einem Seitenstrom kurz vor dem Eindringen der Aerosole in den Schrank gemessen.
HINWEIS: Ein Strömungsspalter wird verwendet, um den Seitenstrom mit dem Belichtungscharakterisierungsgerät zu verbinden. Im Allgemeinen werden folgende Geräte verwendet: Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS), Optical Particle Sizer (OPS), Condensation Particle Counter (CPC), Tapered Element oscillating microbalance (TEOM). Die SMPS- und OPS-Messungen werden 1x pro Stunde durchgeführt und verwenden die gleichen Schläuche aus dem Durchflussteiler. Die CPC und TEOM führen kontinuierliche Messungen durch, und daten von beiden werden auf einem Eichhörnchen-Datenlogger des Modells 2020 protokolliert. Darüber hinaus wird die gravimetrische Massenkonzentration durch eine Mikrobalance bei kontrollierter relativer Luftfeuchtigkeit (40–70%) bestimmt. Temperatur (21–23 °C). Teflonfilter werden vor und nach jeder Exposition gewogen, um die Expositionskonzentration zu bestätigen. Zur Erfassung des Auspuffs wird ein HEPA-Filter verwendet. Das Setup mit technischen Nanomaterial(ENM) Suspensionen und Verneblern wird alle in einem Durchflussschrank platziert, um eine Exposition gegenüber Menschen zu verhindern. Das AES kann zur Prüfung vieler verschiedener Arten von ENMs verwendet werden, einschließlich Metallen und Metalloxiden. - Bereiten Sie eine Nanomaterialsuspension kurz vor der Exposition vor. Üblicherweise wird eine 1%ige Suspension als Lagerlösung vorbereitet. Zum Beispiel 100 mg Nanomaterial in 10 ml reinem Wasser aussetzen.
HINWEIS: Bei DQ12-Exposition werden 300 mg verwendet, um etwa 2 g/cm2zu erreichen. Dieser Betrag kann in einer einmaligen Exposition verwendet oder auf wiederholte Expositionen aufgeteilt werden (z. B. werden 300 mg in 30 ml für eine einmalige Exposition ausgesetzt oder 21,5 mg werden in 2,15 ml täglich für 3 Wochen wiederholte Exposition frisch ausgesetzt). Die Suspension wird an jedem Expositionstag frisch zubereitet. Die Partikelsuspension wird 16 min lang mit Sondenbeschallung beschallt. Das Volumen der 1% Stofflösung wird durch Zugabe von reinem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml angepasst. - Legen Sie die ENM-Suspension in eine kleine Flasche mit einer Kappe und einem Magnetrührer, um eine Absetzung der Partikel zu verhindern. Schließen Sie die Flasche über ein kleines Rohr an eine peristaltische Pumpe an und stellen Sie den Durchfluss auf 25 ml/h ein.
- Schließen Sie die peristaltische Pumpe an eine Sprühdüse an und passen Sie die Einstellungen an, um eine kontinuierliche Aerosolisierung zu ermöglichen.
- Die Sprühdüse ist auf einem 60 cm langen Aluminiumrohr montiert (Mischkammer, Durchmesser 15 cm, erhitzt auf 60 °C). Das Setup ist über ein 1,5 Meter langes Kupferrohr (Durchmesser 15 cm) mit dem AES verbunden. Auf dem AES entfernt ein Schlagkraftgerät alle Aerosole größer als 2,5 m.
- Schließen Sie die Sprühdüse über zwei Massendurchflussregler (MFC) an 3 bar Druckluft an, um eine Vernebelung von Suspensionen zu ermöglichen. Für die Sprühdüse wird ein Durchfluss von 14 l/min verwendet, der andere MFC zum Mischen der Luft im Rohr.
- Schalten Sie am Tag vor Beginn der Belichtung die AES ein, damit der Schrank eine Temperatur von 37 °C erreichen kann.
- Schalten Sie den Luftstrom und die Feuchtigkeit im Schrank 2 h vor Beginn der Belichtung ein, um 85% Luftfeuchtigkeit zu erreichen. Schalten Sie die Erwärmung der Belichtungskammern ein, in denen die Einsätze mit den Zellen platziert werden.
- Schalten Sie die Quarz-Mikrowaage (QCM) ein und legen Sie den Anfangswert mit der Software auf 0 fest. Starten Sie die Protokollierung. Alle 10 s wird die Masse gemessen und als ng/cm2ausgedrückt.
- Erwärmen Sie die Zellkulturmedien in einem Wasserbad auf 37 °C (ca. 20–30 min).
5. Vorbereitung von Calu-3-Zellen auf die Exposition
HINWEIS: Für eine typische ALI-Exposition mit dem AES werden 15–20 Einsätze mit einer konfluenten Zellschicht benötigt. Diese bestehen aus 3 Reinluftsteuerungen, 3 Inkubatorsteuerungen, die ähnlich wie die anderen Einsätze ohne Belichtung im AES behandelt werden, 6–8 Einsätzen für Aerosolbelichtung (je nach Verwendung von 0, 1 oder 2 Mikrowaagen), 1-3 Einsätzen für Regelmessungen (z. B. maximale LDH-Freisetzung) und 3 Ersatzeinsätzen für den Fall, dass der TEER einiger Der Einsätze nicht ausreicht. Die Zellen sollten über einen TEER von >1.000 Ω x cm2 verfügen, um fortzufahren.
- Am ersten Tag der Exposition, waschen Zellen 1x mit CCM, überprüfen Zellmorphologie, und messen Sie den TEER des Zellmodells mit einem Voltohmmeter. Die Zellen sollten eine enge Monoschicht ohne Lücken bilden.
- 2 ml/1 ml HEPES gepuffertes CCM ohne FCS auf die basolaterale Seite von 6 Well/12 Wellplatten legen und die Kultureinsätze mit Zellen auf die neuen Platten übertragen.
HINWEIS: Während der Exposition ist keinCO2 im AES vorhanden. Daher wird HEPES gepuffertes Kulturmedium (25 mM HEPES) während des Transports und der Exposition verwendet. Dieses Medium wird sowohl für die exponierten Zellen in der AES als auch für die Inkubator-Kontrollzellen verwendet. - Wenn die Zeit, um die Zellkulturen zum AES zu transportieren, mehr als 5 min beträgt, legen Sie die Zellen während des Transports in einen tragbaren Inkubator von 37 °C.
6. Umgang mit dem AES während einer Exposition
- Füllen Sie am AES die Belichtungsmodule mit HEPES-gepufferter CCM ohne fetales Wadenserum (FCS). Die Menge an CCM hängt von der verwendeten Einheit und dem Typ der Zellkultureinfügung ab. Denken Sie daran, dass das Medium, um Zellen am ALI zu halten, den Boden der Membran erreichen sollte, aber nicht auf der Oberseite der Membran auslaufen sollte. Wenn Sie 6 Brunneneinsätze verwenden, fügen Sie den Belichtungsmodulen 6 ml HEPES-gepuffertes CCM hinzu.
- Übertragen Sie die Einsätze mit Zellen von den Platten mit steriler Pinzette auf die Belichtungsmodule. Prüfen Sie, ob es keine Luftblasen an der basolateralen Seite der Zellen gibt, und entfernen Sie cCM auf der apikalen Seite der Einsätze. Falls es einige Luftblasen an der basolateralen Seite gibt, drehen Sie die Einsätze vorsichtig mit der sterilen Pinzette, bis sie entfernt werden. Bewahren Sie die Platten, die CCM enthalten, in einem Inkubator auf, um sie nach einer Exposition zu übertragen.
- Verwenden Sie das Touchscreen-Display, um Belichtungsdauer, Luftdurchflussrate und elektrostatische Abscheidungsverbesserung auszuwählen. Das Display kann auch verwendet werden, um Feuchtigkeit und Temperatur zu überprüfen. In der Regel wird eine Belichtungsdauer von 4 h gewählt, mit einer Durchflussrate von 50 ml/min an den Einsätzen bei 37 °C und 85% Luftfeuchtigkeit.
ANMERKUNG: Die Module der ersten Ebene (Abbildung 1) werden für die Luftexposition verwendet; Einsätze in diesem Niveau werden als Luftbelichtungskontrollen für saubere Luft verwendet. Die anderen Module der zweiten und dritten Ebene können für die Aerosolexposition verwendet werden, einschließlich zwei Modulefür Quarzkristall-Mikrowaagen (QCM), um die Ablagerung online zu messen. - Die Dichtheitsprüfung sollte vor Beginn der Exposition durchgeführt werden. Die Leckage muss weniger als 5 ml/min betragen. Folgen Sie den Anweisungen auf dem AES-Display. Wenn die Dichtheitsprüfung abgeschlossen ist, kann die Belichtung gestartet werden. Im Falle eines Lecks sollten die Schläuche überprüft werden.
- Öffnen Sie am Ende der Belichtung die Tür eines AES-Moduls, öffnen Sie die Belichtungsmodule, platzieren Sie die Zellkultureinsätze wieder auf die Zellkulturplatten und übertragen Sie die Platten in den tragbaren Inkubator.
- Sammeln Sie die Medien aus den Modulen (d. h. exponierten Proben) und von den Platten (d. h. Inkubatorsteuerungen) für spätere Analysen, wie z. B. Laktatdehydrogenase (LDH) Messung.
- Zurück im Zellkulturlabor, übertragen Sie die Zellkultureinsätze auf Platten, die mit frischem Standard-CCM gefüllt sind. Legen Sie die Zellkulturplatten in den Inkubator bis zur nächsten Exposition oder bis zur Analyse.
- Nach dem letzten Belichtungstag die Einsätze bis zum nächsten Tag in den Inkubator geben.
- Am Tag nach der endgültigen Belichtung fügen Sie CCM auf die apikale Seite, um TEER mit einem Voltohmmeter zu messen. Sammeln Sie sowohl das apikale als auch das basolaterale CCM separat für die Analyse von Zytokinen.
- Entfernen Sie alle CCM und führen Sie einen Zelllebensfähigkeitstest durch, indem Sie beispielsweise ein Proliferationsreagenz zur apikalen Seite hinzufügen.
7. Reinigung der AES
- Füllen Sie die Belichtungsmodule mit Wasser, warten Sie 1 min und entfernen Sie das Wasser. Als nächstes füllen Sie die Module mit 70% Ethanol, lassen Sie es für 10 min, und entfernen Sie das Ethanol. Reinigen Sie die Belichtungstrompeten auch mit 70% Ethanol.
- Stoppen Sie die 85% Feuchtigkeitsregelung, aber lassen Sie die Temperatur des Gehäuses bei 37 °C für das nächste Experiment.
Representative Results
Dieser Artikel bietet eine Methode zur Kultivierung und Exposition menschlicher Bronchialepithelzellen am ALI, die realistische, wiederholte Expositionsbedingungen imitiert, die für Toxizitätstests verwendet werden können. Die Eigenschaften sowohl des Zellmodells als auch des Expositionssystems sind für die Erreichung eines realistischen Inhalations-Expositionsmodells unerlässlich, das für wiederholte Expositionen verwendet werden kann. Die Ergebnisse zu diesen Merkmalen sind unten dargestellt.
Anforderungen und Auswahl von Zellmodellen
Bei der Auswahl eines geeigneten Zellmodells sind folgende Merkmale zu berücksichtigen:
- Das Zellmodell sollte in der Lage sein, eine konfluente Monoschicht mit funktionierenden engen Knoten zu bilden, um die Lungenbarriere nachzuahmen.
- Das Zellmodell sollte eine optimale Leistung aufweisen, wenn es wiederholt bedingter (Temperatur und Feuchtigkeit) Luft ausgesetzt wird.
- Das Zellmodell sollte auf eine Exposition reagieren.
Diese Studie begann mit vier verschiedenen menschlichen Bronchialepithelzelllinien: 16HBE, Calu-3, H292 und BEAS-2B. Diese sind alle weit verbreitet für Toxizitätstests von Nanomaterialien und Chemikalien verwendet. Von den vier Zelllinien erfüllten nur die Calu-3-Zellen alle oben genannten Anforderungen. Die Zellen bildeten eine Monoschicht mit engen Knoten(Abbildung 3), die im Laufe der Zeit eine stabile Barriere blieb, gemessen von TEER, während die anderen Zelllinien entweder keine Barriere bildeten oder einen Rückgang der Barrierefunktion zeigten, wenn sie am ALI kultiviert wurden (Abbildung 4). Darüber hinaus neigten H292 und BEAS-2B dazu, in mehrere Zellschichten überwuchern, wenn sie für einen längeren Zeitraum kultiviert wurden. Die traditionelle Untergetauchtzellkultivierung und ALI-Kultivierung unterschieden sich stark, da bei der ALI Nährstoffe nur von der basolateralen Seite verfügbar waren und die Zellen trockenen Bedingungen auf der apikalen Seite ausgesetzt waren. Diese Bedingungen können zu Belastungen für die Zellmodelle führen, die durch Messung der Zelllebensfähigkeit im Laufe der Zeit beobachtet werden könnten. Die Zelllinien 16HBE, H292 und BEAS-2B zeigten alle eine erhöhte LDH-Freisetzung, wenn sie am ALI kultiviert wurden, während Calu-3-Zellen nur eine leichte LDH-Freisetzung zeigten (Abbildung 5).
Als nächstes wurde die Reaktion des Calu-3-Modells auf Substanzen getestet. Als positiv kontrollierbare Substanz wurde LPS durch Vernebelung auf die apikale Seite des Modells verabreicht. Die hinterlegte Dosis betrug 0,25 g/cm2. Die Calu-3-Zellen zeigten eine Reaktion auf Lipopolysaccharid (LPS) durch eine Erhöhung der LDH-Freisetzung und der Tumornekrosefaktor-Alpha (TNF-α)(Abbildung 6).
Schließlich wurde die Monoschicht Calu-3 Quarzkiesioxid (DQ12) Nanomaterialien (IOM, Edinburgh) ausgesetzt. Kristalline Kieselsäure kann Silikose induzieren und auch Lungentumoren verursachen. Daher hat die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) kristalline Kieselsäure als menschliches Karzinogen der Gruppe I20eingestuft. Der Wirkmechanismus von kristalliner Kieselsäure wird angenommen, über die Induktion von persistenten Entzündungen durch seine reaktive Oberfläche verursacht sein21,22,23. Mehrere In-vivo-Studien an Ratten und Mäusen berichten über die Induktion von Entzündungen und histopathologischen Veränderungen, einschließlich Tumoren und Fibrose, nach inhalierender Exposition gegenüber kristalliner Kieselsäure24,25,26,27,28,29. Diese Effekte werden alle nach wiederholter Exposition und/oder langzeitfolgender Exposition beobachtet. Das Calu-3-Modell wurde verwendet, um zu untersuchen, ob die Beobachtungen aus den In-vivo-Studien mit einem In-vitro-Modell nachgeahmt werden könnten, das wiederholt am ALI exponiert werden konnte.
Calu-3-Zellen wurden 3 aufeinanderfolgende Wochen, 5 Tage pro Woche, 4 h pro Tag dQ12 ausgesetzt. Die hinterlegte Dosis wurde mit einem QCM gemessen. Die durchschnittliche abgelagerte Dosis betrug 120 ng/cm2 pro Tag, mit einer kumulativen Dosis von 1,6 g/cm2, ähnlich wie die Dosen, die einen Effekt in vivo induzieren. Weitere Partikeleigenschaften sind in Tabelle 1dargestellt. Nach 3 Wochen Exposition induzierte DQ12 keine signifikanten Auswirkungen auf TEER, Zelllebensfähigkeit und Monozyten-Chemoattractantprotein 1 (MCP-1) im Vergleich zu den Reinluftkontrollen(Abbildung 7). Da auf der Grundlage der In-vivo-Daten eine größere Toxizität von DQ12 erwartet wurde, wurde die Reaktivität der Partikel mit einem azellulären Assay gemäß dem im EU-Projekt GRACIOUS optimierten Protokoll (Lieferwert 5.3) überprüft. Die Reaktivität der DQ12-Charge war niedriger als erwartet (Abbildung 8), Größenordnungen niedriger als die positiven Kontrollpartikel Ruß (CB). Dieser Mangel an Reaktivität könnte das Fehlen einer Toxizitätsreaktion im Calu-3-Modell erklären.
Abbildung 1: Die automatische Belichtungsstation (AES).
Die linke Abbildung zeigt die Außenseite des Schrankes mit dem Touchpanel. Das AES hat drei Ebenen mit Belichtungsmodulen: die oberste Ebene für saubere Luftexpositionen und die mittlere und untere Ebene für Aerosol-Expositionen. Die rechte Abbildung zeigt das Belichtungsmodul, in dem Einsätze mit Zellen platziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Belichtungseinrichtung.
Von links nach rechts: 1) die ENM-Aufhängung, die über eine Peristaltikpumpe mit der Sprühdüse verbunden ist; 2) Mit Druckluft vernebelt die Sprühdüse die ENM-Aufhängung und über eine Mischkammer werden die Aerosole zum AES geführt; 3) Kurz vor dem Eintritt in die AES sind Aerosol-Charakterisierungsinstrumente angeschlossen: SMPS, OPS, CPC und TEOM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentatives Bild der Calu-3-Zellen nach der Kultivierung an der Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI) für 10 Tage.
Fluoreszenzmikroskopie Bild von Calu-3 Zellen nach der Kultivierung an der ALI für 10 Tage. Enge Kreuzung Protein ZO-1 ist in grün gefärbt, Kerne der Zellen sind in blau gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Transepitheliale elektrische Beständigkeit (TEER) von vier verschiedenen Zelllinien während eines Kulturzeitraums von 21 Tagen.
TEER-Werte von 16HBE, Calu-3, H292 und BEAS-2B, wenn sie 21 Tage lang kultiviert werden: die ersten 7 Tage unter Getaucht, gefolgt von 14 Tagen im ALI. TEER-Werte wurden für den Hintergrundwiderstand des Inserts korrigiert und mit der Oberfläche des Inserts multipliziert. Die Symbole und Fehlerbalken stellen den Durchschnittswert und die Standardabweichung von sechs Einsätzen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: LDH-Freisetzung von vier verschiedenen Zelllinien während eines Kulturzeitraums von 21 Tagen.
LDH-Freisetzung von 16HBE, Calu-3, H292 und BEAS-2B, wenn sie 21 Tage lang kultiviert wurde: 7 Tage unter Getaucht, gefolgt von 14 Tagen im ALI. Die angezeigten LDH-Werte sind relativ zur maximalen LDH-Freisetzung pro Zelltyp. Die Symbole und Fehlerbalken stellen den Durchschnittswert und die Standardabweichung von fünf Einfügungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Zelluläre Effekte in Calu-3-Zellen, die LPS ausgesetzt sind.
Calu-3-Zellen wurden durch Wolkenvernebelung 0,25 g/cm2 LPS ausgesetzt. (A) Die WST-1-Konvertierung. (B) LDH-Freigabe. (C) TNF-α Freigabe nach LPS-Exposition. Die Symbole und Fehlerbalken stellen Durchschnittswerte und Standardabweichungen von drei Einfügungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Zelluläre Effekte in Calu-3-Zellen, die DQ12-Nanomaterialien ausgesetzt sind.
Calu-3-Zellen wurden 3 Wochen lang (4 h pro Tag, 5 Tage pro Woche) DQ12-Nanomaterialien ausgesetzt, etwa 120 ng/cm2 pro Tag, kumulative Dosis von 1,6 g/cm2. (A) TEER-Werte. (B) LDH-Freigabe. (C) MCP-1-Version nach DQ12-Exposition. Alle Symbole und Fehlerbalken stellen Durchschnittswerte und Standardabweichungen von drei Einsätzen für die Steuerelemente und sechs Einsätzen für die DQ12-Belichtung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Azelluläre Reaktivität von DQ12.
DQ12 wurde mit einer 2ʹ,7ʹ-Dichlorfluorescein-Diacetat (DCFH-DA)-Sonde inkubiert, um seine Oberflächenreaktivität zu erkennen. Als positiv zu kontrollierende, Rußpartikel (CB) wurden einbezogen. Im Vergleich zu CB weist DQ12 eine sehr geringe Oberflächenreaktivität auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Partikelmasse (g/m3) | Partikelnummer (b./cm3) | Mobilitätspartikelgröße (nm) | Geometrische Standardabweichung | Optische Partikelgröße (m) |
| 2969 (418) | 83983 (10215) | 66.6 | 2.5 | 1.1 (1.3) |
Tabelle 1: DQ12-Expositionsmerkmale. Die Werte werden als Durchschnitt mit Standardabweichung in Klammern angezeigt.
Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultivierung menschlicher Bronchialepithelzellen unter ALI und zur Exposition dieses Bronchialmodells gegenüber Aerosolen oder Gasen. Der Vorteil der Verwendung von Calu-3-Zellen besteht darin, dass sie enge Knoten bilden, eine Monoschicht bleiben, dem Luftstrom standhalten und im Gegensatz zu vielen anderen Zelltypen (z. B. 16HBE, H292 und BEAS-2B) wochenlang an der ALI kultiviert werden können. Der Einsatz der vitroCELL® automatisierten Expositionsstation (AES) hat den Vorteil, dass die Zellen unter realistischen und relevanten Bedingungen exponiert werden können, da niedrige Konzentrationen mit einem kontinuierlichen Luftstrom angewendet werden können.
Kontinuierliche Strömungssysteme, wie z. B. das AES, haben Vorteile gegenüber der Verwendung von Cloud-Systemen3,32, die eine einzige Vernebelung einer Suspension verwenden. Der kontinuierliche Durchfluss ist realistischer und viele Variablen wie Durchfluss, Luftfeuchtigkeit und Temperatur werden gesteuert. Darüber hinaus kann die Ablagerung durch ein elektrisches Feld verbessert werden. Schließlich werden Aerosoleigenschaften wie Größe, Zahlenkonzentration und Masse online überwacht. Ein Nachteil ist, dass kontinuierliche Durchflusssysteme im Vergleich zu Cloud-Systemen komplexer sind. Daher ist es wichtig, vorbereitende Experimente durchzuführen, die sich auf die Partikeleigenschaften des Aerosols und die gelieferte Dosis auf dem Einsatz konzentrieren. Die Anfangskonzentration der Partikel und die AES-Einstellungen können dann angepasst werden, um die gewünschte Dosis auf den Zellen33zu erreichen. Je nach Art der getesteten Partikel kann sich die Aerosolgenerierungsmethode unterscheiden. Die Verwendung der elektrostatischen Abscheidung hängt vom Partikeltyp ab und eignet sich am besten für metallische Partikel. Bei Partikeln mit einer positiven Oberflächenladung sollte ein negatives elektrostatisches Feld aufgebracht werden und umgekehrt.
Die Auswahl der Expositionskonzentrationen kann für jedes Luft-Flüssig-Expositionsexperiment schwierig sein. Bei den DQ12-Expositionen bestand das Ziel darin, nach 3 Wochen Exposition, 5 Tagen pro Woche und 4 h pro Tag eine kumulative Gesamtdosis von 1 g/cm2 zu erreichen. Diese Dosis ist ähnlich wie Dosen, die eine Wirkung in vivoinduziert 21,25,27,32,33. Bei der Durchführung der Expositionen gab es einige Unterschiede zwischen den verschiedenen Expositionstagen. Obwohl die tatsächlich abgelagerte Dosis von 1,6 g/cm2 höher ist als die angestrebte Dosis von 1 g/cm2, könnte die Dosis zu niedrig gewesen sein, um Effekte im Calu-3-Modell zu beobachten. Zwischen der Exposition in sauberer Luft und der DQ12-Exposition wurden nur geringfügige Unterschiede in TEER, Lebensfähigkeit und Zytokin-Antwort beobachtet, und diese Unterschiede waren statistisch nicht signifikant. Eine Erklärung für die Beobachtung, dass die DQ12-Exposition für 3 Wochen keine signifikanten Auswirkungen in den Calu-3-Zellen induzierte, ist, dass Makrophagen aus dem Calu-3-Modell fehlten. Möglicherweise produzieren Makrophagen nach DQ12-Aufnahme proinflammatorische Zytokine, die Calu-3-Zellen beeinflussen können. Eine weitere Erklärung ist, dass die DQ12-Charge, die für die Experimente verwendet wurde, nicht so reaktiv war wie erwartet. Bei der Verwendung von LPS als Positivkontrollsubstanz zeigt Calu-3 eine Reaktion, gemessen an einer Erhöhung der LDH-Freisetzung und einer Erhöhung der TNF-α-Freisetzung. Dies weist darauf hin, dass das Modell Toxizität erkennen kann.
Das Calu-3-Zellmodell hat viele Vorteile, wie im Ergebnisbereich erläutert. Darüber hinaus können die Calu-3-Zellen, wenn sie länger am ALI kultiviert werden, Zilien/Zilien-ähnliche Strukturen13 anbauen und Schleim produzieren11,12,13. Trotz dieser Vorteile hat das Modell Einschränkungen in Bezug auf seine physiologische Relevanz. Die Calu-3-Zelllinien stammen von einem Adenokarzinom, während 16HBE und BEAS-2B aus gesundem Gewebe stammen. Leider sind die beiden letztgenannten nicht für eine wiederholte ALI-Exposition geeignet, da sie im Laufe der Zeit keine stabile Monoschicht bleiben. Eine weitere Einschränkung des Calu-3-Modells besteht darin, dass es nur einen einzelnen Zelltyp darstellt. In der menschlichen Lunge sind mehrere Zelltypen vorhanden, die unterschiedlich auf die Exposition reagieren und darauf reagieren. Eingeatmete Partikel lagern sich je nach aerodynamischer Größe in verschiedenen Regionen der Lunge ab. Hier treten die Teilchen mit der Epithelzellbarriere in Berührung, wie sie vom Calu-3-Modell nachgeahmt wird. In der menschlichen Lunge werden Alveolader Makrophagen zu den Partikeln angezogen, verschlingen sie und befreien sie aus der Lunge. Makrophagen spielen auch eine wesentliche Rolle bei der Entzündungsreaktion auf Partikelexposition. Daher werden Anstrengungen unternommen, um das Calu-3-Modell durch hinzufügenprimäre Makrophagen zu erweitern, um die Lungenbarriere genauer nachzuahmen. Der Nachteil der Makrophagen ist, dass sie nur für etwa 7 Tage lebensfähig bleiben, wenn sie auf Calu-3-Zellen an der ALI kultiviert werden. Daher sollten Makrophagen wöchentlich neu hinzugefügt werden, um das aktuelle Calu-3-Modell in ein Cokulturmodell umzuwandeln. Die Optimierung des Cokulturprotokolls läuft derzeit.
Aus diesen Gründen ist das Bronchialmodell Calu-3 ein geeignetes Modell für die wiederholte Exposition gegenüber Aerosolen von teilweise löslichen Stoffen wie Chemikalien aus Zigarettenrauch und LPS. Diese löslichen Substanzen induzieren signifikante Erhöhungen der Zytokin-Antworten in den Calu-3-Zellen. Für die Prüfung unlöslicher Partikel wie Dieselabgase und DQ12 ist ein Cokulturmodell erforderlich, da die Makrophagen eine entscheidende Rolle bei der Induktion von Effekten durch Partikelexposition spielen.
Für die beschriebenen Expositionen wurden Einschubmembranen mit 3,0 m Poren verwendet. Der Hauptgrund für die Wahl dieser Art von Einsatz ist, dass es möglich ist, die Translokation von Nanomaterialien zu testen. Bei kleineren Porengrößen von 0,4 m können Partikelagglomerate die Insert-Membran nicht kreuzen. Der Nachteil der Verwendung einer großen Porengröße ist, dass die Zellen eine längere Zeit benötigen, um konfluent zu wachsen, und dass es schwieriger ist, die Morphologie der Zellen mithilfe der Lichtmikroskopie zu visualisieren. Um zu überprüfen, ob die Zellen eine konfluente Monoschicht bilden, sollte der TEER >1.000 Ω x cm2 betragen, bevor eine Exposition gestartet wird.
Zusammengenommen ist das hier vorgestellte Bronchialmodell Calu-3 für die wiederholte Exposition gegenüber Aerosolen geeignet, mindestens bis zu 3 Wochen. Das Modell kann es widerstehen, kultiviert und über einen kontinuierlichen Luftstrom exponiert zu werden und ist in der Lage, Toxizität für das Bronchialepithel zu erkennen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird vom EU-Projekt PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) und dem niederländischen Ministerium für Gesundheit, Wohlfahrt und Sport (Projekt V/050012) finanziert. Wir danken Dr. Yvonne Staal und Dr. Jan van Benthem für die kritische Prüfung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| 0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
| 2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
| 3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
| Automated exposure station | Vitrocell | ||
| Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
| Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
| DQ12 | IOM | nanomaterials | |
| ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
| EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
| FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
| Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
| Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
| Light microscope | Olympus | CKX41 | |
| Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
| Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
| Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
| OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
| Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
| Pure water | Merck | MilliQ | |
| SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
| Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
| Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
| TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
| Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
| Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |
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