המתוארת היא תרבות התא ושיטת החשיפה של מודל הסימפונות במבחנה לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לשאיפת חלקיקים לבדיקות רעילות.
לבדיקות רעילות של חלקיקים הנישאים באוויר, פותחו מערכות חשיפה לממשק נוזלי אוויר (ALI) לבדיקות חוץ גופיות על מנת לחקות תנאי חשיפה מציאותיים. זה מציב דרישות ספציפיות על מודלים תרבות התא. סוגי תאים רבים מושפעים לרעה מחשיפה לאוויר (למשל, התייבשות) ונשארים בני קיימא רק לכמה ימים. זה מגביל את תנאי החשיפה שניתן להשתמש בהם במודלים אלה: בדרך כלל ריכוזים גבוהים יחסית מוחלים כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים, אשר מתיישבים במהירות) בתוך פרק זמן קצר. תנאי ניסוי כאלה אינם משקפים חשיפה מציאותית לטווח ארוך לריכוזים נמוכים של חלקיקים. כדי להתגבר על מגבלות אלה השימוש בקו תא אפיתל הסימפונות האנושי, Calu-3 נחקר. תאים אלה יכולים להיות תרבותיים בתנאי ALI במשך מספר שבועות תוך שמירה על מורפולוגיה בריאה מונולייר יציב עם צמתים הדוקים. בנוסף, מודל סימפונות זה מתאים לבדיקת ההשפעות של חשיפות חוזרות ונשנות לריכוזים נמוכים ומציאותיים של חלקיקים הנישאים באוויר באמצעות מערכת חשיפה של ALI. מערכת זו משתמשת בזרימת אוויר רציפה בניגוד למערכות חשיפה אחרות של ALI המשתמשות בערפילית אחת המייצרת ענן. לכן, מערכת הזרימה הרציפה מתאימה לחשיפה חוזרת וממושכת לחלקיקים הנישאים באוויר תוך ניטור רציף של מאפייני החלקיקים, ריכוז החשיפה והמינון המועבר. יחד, מודל הסימפונות הזה, בשילוב עם מערכת החשיפה לזרימה רציפה, מסוגל לחקות תנאי חשיפה מציאותיים וחוזרים ונשנים לשאיפה שניתן להשתמש בהם לבדיקת רעילות.
הריאות פגיעות לחשיפה לשאיפה לחלקיקים הנישאים באוויר. כדי להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של חלקיקים הנישאים באוויר, חלה התקדמות בפיתוח מערכות חשיפה לממשק נוזלי אוויר (ALI)1,2,3,4,5. מערכות החשיפה של ALI מאפשרות מודלי חשיפה רלוונטיים ומציאותיים יותר בהשוואה לחשיפה מסורתית שקועה באמצעות מדיום תרבותי המשנה את המאפיינים והקינטיקה של החלקיקים6. מערכות החשיפה של ALI מציבות דרישות ספציפיות במודלים של תרבות התאים, שכן למודלים אין מדיום תרבותי ולכן חומרים מזינים בצד האפור. מודלים רבים של תאים מושפעים לרעה על ידי להיות תרבותי וחשוף באוויר (למשל, ייבוש) ורק להישאר קיימא במשך כמה ימים. זה מגביל את תנאי החשיפה שניתן להשתמש בהם במודלים אלה: בדרך כלל ריכוזים גבוהים יחסית מוחלים בתוך פרק זמן קצר כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים, אשר מתיישבים במהירות). תנאי ניסוי כאלה אינם משקפים חשיפה ריאלית ארוכת טווח לריכוזים נמוכים של חלקיקים; לפיכך, ניתן להטיל ספק ברלוונטיות של התוצאות. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פרוטוקול התרבות והחשיפה למודל הסימפונות המורכב מקו תאי האפיתל הסימפונות האנושי Calu-37 היה אופטימיזציה.
רוב דגמי הריאות במבחנה המשמשים לחשיפה ל- ALI מכילים קווי תאים אחרים כגון A549, BEAS-2B ו- 16HBE14o- (16HBE) או תאים ראשיים כבסיס8. קווי תאים אלה יש את החיסרון כי הם נשארים קיימא רק כמה ימים כאשר מתורבת על עלי. בנוסף, חלק מקווי תאים אלה מתגברים כאשר הם מתרבים לתקופה ארוכה מ -5 ימים. לבסוף, תאי A549 מפספסים צמתים הדוקים פונקציונליים ולכן אינם יכולים ליצור מחסום הדוק הדרוש כדי לחקות את הריאות9,10. תאי אפיתל ראשוניים עשויים להיות אפשרות טובה לחשיפה ALI כפי שהם יכולים להיות תרבותיים ב ALI במשך שבועות. עם זאת, תאים ראשוניים שונים מאצווה לאצווה, קשים יותר לתחזוקה, והם יקרים יותר בהשוואה לקווי תאים, מה שהופך אותם פחות מתאימים לבדיקות רעילות וסינון. בעת השוואת קווי תא אפיתל אנושיים שונים (16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B), רק תאי Calu-3 ממלאים את כל הקריטריונים הדרושים לחשיפה מציאותית וחוזרת על עצמה של ALI: הם נשארים בני קיימא במשך שבועות בעודם מתרבים ב- ALI, מספקים שלמות מחסום גבוהה, אינם מגזימים, וקלים לתרבות ולתחזוקה. תאים Calu-3 מקורם אדנוקרצינומה והם מסוגלים לייצר ריר11,12. ישנם חוסר עקביות בשאלה אם התאים יכולים לפתח ריסונים11,13. תאים Calu-3 הם גם מודל מתאים ללמוד וירוס סיניסיטיאלי בדרכי הנשימה (RSV) זיהומים להדביק תאי אפיתל דרכיהנשימה ciliated 14.
מלבד דגם התא, מערכת חשיפה אוטומטית (AES) משמשת לחשיפה לנוזל האוויר לתרסיסים15,16. ל- AES יש את היתרון שהוא משתמש בזרימת אוויר רציפה כדי לחשוף את דגם התא לתרסיסים. זאת בניגוד למערכות חשיפה אחרות לנוזלי אוויר, שבדרך כלל משתמשות בריכוזים גבוהים יחסית בתוך פרק זמן קצר כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים שמתיישבים במהירות)17,18,19. מערכות ענן אלה אינן משקפות חשיפה ריאלית ארוכת טווח לריכוזים נמוכים של חלקיקים. על ידי החלת זרימת אוויר רציפה באמצעות AES, מודל התא יכול להיחשף לריכוז נמוך של חלקיקים על פני תקופה ארוכה יותר, המשקף תנאי חשיפה מציאותיים. יתרון נוסף על פני מערכות ענן הוא של- AES יש אפשרות לחבר מכשירי אפיון חלקיקים, המאפשרים מדידה של גודל החלקיקים, ריכוז המספרים והמסה לאורך זמן. מגבלה של AES היא שהיא משתמשת בזרימות אוויר גבוהות יחסית בין 10 מ”ל לדקה ו 100 מ”ל / דקה.
מאמר זה מתאר שיטה ליצירת תאי אפיתל הסימפונות האנושיים תחת ALI וחשיפת מודל הסימפונות הזה לתרסיסים או גזים. היתרון של שימוש בתאי Calu-3 הוא שהם יוצרים צמתים הדוקים, נשארים מונולאייר, מסוגלים לעמוד בזרימת האוויר, וניתן לתרבת במשך שבועות ב- ALI, בניגוד לסוגי תאים רבים אחרים (למשל, 16HBE, H292 ו- BEAS-2B). שימוש בתחנת החשיפה האוטומטית® VITROCELL (AES) יש את היתרון כי התאים יכולים להיחשף בתנאים מציאותיים ורלוונטיים כמו ריכוזים נמוכים ניתן להחיל באמצעות זרימת אוויר רציפה.
מערכות זרימה מתמשכות, כגון AES, יש יתרונות לעומת שימוש במערכות ענן3,32, אשר משתמשים ערפילית אחת של השעיה. הזרימה הרציפה מציאותית יותר ומשתנים רבים כמו קצב זרימה, לחות וטמפרטורה נשלטים. בנוסף, ניתן לשפר את התצהיר באמצעות שדה חשמלי. לבסוף, מאפייני תרסיס כמו גודל, ריכוז מספרים ומסה מנוטרים באינטרנט. החיסרון הוא שמערכות זרימה מתמשכות מורכבות יותר בהשוואה למערכות ענן. לכן, חשוב להפעיל ניסויי הכנה המתמקדים במאפייני החלקיקים של התרסיס והמינון המועבר על הכנס. ריכוז ההתחלה הראשוני של החלקיקים והגדרות AES לאחר מכן ניתן להתאים כדי להשיג את המינון הרצוי על התאים33. בהתאם לסוג החלקיקים הנבדקים, שיטת ייצור התרסיס יכולה להיות שונה. השימוש בתצהיר אלקטרוסטטי תלוי בסוג החלקיקים ופועל בצורה הטובה ביותר עבור חלקיקים מתכתיים. עבור חלקיקים עם מטען משטח חיובי שדה אלקטרוסטטי שלילי צריך להיות מיושם ולהיפך.
בחירת ריכוזי חשיפה יכולה להיות קשה עבור כל ניסוי חשיפה לנוזל אוויר. עבור חשיפות DQ12, המטרה הייתה להשיג מינון מצטבר כולל של 1 מיקרוגרם / ס”מ2 לאחר 3 שבועות חשיפה, 5 ימים בשבוע, 4 שעות ליום. מינון זה דומה מינונים שגרמו השפעה vivo21,25,27,32,33. בעת ביצוע החשיפות, הייתה שונות מסוימת בין ימי חשיפה שונים. למרות המינון שהופקד בפועל של 1.6 מיקרוגרם / ס”מ2 הוא גבוה יותר מאשר 1 מיקרוגרם / ס”מ2 כי היה מיועד, המינון יכול להיות נמוך מדי כדי לצפות בהשפעות במודל Calu-3. רק הבדלים קלים בתגובת TEER, הכדאיות והציטוקינים נצפו בין החשיפה לאוויר נקי לחשיפה ל-DQ12, והבדלים אלה לא היו מובהקים סטטיסטית. הסבר לתצפית כי חשיפה DQ12 במשך 3 שבועות לא לגרום השפעות משמעותיות בתאי Calu-3 היא כי מקרופאגים היו חסרים ממודל Calu-3. ייתכן, לאחר DQ12 ספיגת מקרופאגים לייצר ציטוקינים proinflammatory שעלולים להשפיע על תאים Calu-3. הסבר נוסף הוא כי אצווה DQ12 ששימש לניסויים לא היה תגובתי כצפוי. בעת שימוש ב- LPS כחומר בקרה חיובי, Calu-3 מראה תגובה, כפי שנמדד על ידי עלייה במהדורת LDH ועלייה במהדורת TNF-α. הדבר מצביע על כך שהמודל יכול לזהות רעילות.
מודל התא Calu-3 יש יתרונות רבים, כפי שנדון בסעיף התוצאות. יתר על כן, כאשר תרבותי במשך זמן רב יותר ב ALI, התאים Calu-3 יכול לגדול מבנים דמויי ריסים / ריסים13 לייצר ריר11,12,13. למרות יתרונות אלה, למודל יש מגבלות ביחס לרלוונטיות הפיזיולוגית שלו. קווי התא Calu-3 מקורם אדנוקרצינומה, ואילו 16HBE ו BEAS-2B מקורם רקמה בריאה. למרבה הצער, השניים האחרונים אינם מתאימים לחשיפה חוזרת ונשנית של ALI מכיוון שהם אינם נשארים מונולייר יציב לאורך זמן. מגבלה נוספת של מודל Calu-3 היא שהוא מייצג רק סוג תא יחיד. בריאה האנושית קיימים סוגי תאים מרובים המקיימים אינטראקציה ומגיבים באופן שונה לחשיפה. חלקיקים בשאיפה יפקידו באזורים שונים של הריאות בהתאם לגודל האווירודינמי שלהם. כאן החלקיקים יוצרים קשר עם מחסום תא האפיתל, כפי שמחקה מודל קאלו-3. בריאה האנושית, מקרופאגים מכתשיים נמשכים לחלקיקים, בולעים אותם ומנקים אותם מהריאות. מקרופאגים גם ממלאים תפקיד חיוני בתגובה הדלקתית לחשיפה לחלקיקים. לכן, נעשים מאמצים להרחיב את מודל Calu-3 על ידי הוספת מקרופאגים ראשוניים כדי לחקות את מחסום הריאות מקרוב יותר. החיסרון של מקרופאגים הוא שהם נשארים קיימא רק במשך כ 7 ימים כאשר תרבותי על גבי תאים Calu-3 ב ALI. לכן, יש לקרוא מקרופאגים מדי שבוע כדי להפוך את מודל Calu-3 הנוכחי למודל שיתוף פעולה. אופטימיזציה של פרוטוקול coculture הוא כרגע מתמשך.
בהתחשב לעיל, מודל הסימפונות Calu-3 הוא מודל מתאים לחשיפה חוזרת ונשנית אירוסולים של חומרים מסיסים חלקית כגון כימיקלים מעשן סיגריות LPS. חומרים מסיסים אלה לגרום לעלייה משמעותית בתגובות ציטוקינים בתאי Calu-3. לבדיקת חלקיקים בלתי מסיסים כגון פליטת דיזל ו- DQ12, יש צורך במודל קוקולטורה, מכיוון שהמאקרופאג’ים ממלאים תפקיד מכריע באינדוקציה של אפקטים על ידי חשיפה לחלקיקים.
לחשיפות המתוארות, נעשה שימוש בקרומים עם נקבוביות 3.0 מיקרומטר. הסיבה העיקרית לבחירת סוג זה של הכנסה היא כי ניתן לבדוק את טרנסלוקציה של ננו. בעת שימוש קטן יותר 0.4 מיקרומטר נקבובית גודל, agglomerates חלקיקים לא יוכלו לחצות את קרום הכנס. החיסרון בשימוש בגודל נקבובי גדול הוא שהתאים זקוקים לזמן ארוך יותר כדי לגדול במקביל וכי קשה יותר לדמיין את המורפולוגיה של התאים באמצעות מיקרוסקופיה קלה. כדי לבדוק שהתאים אכן יוצרים קו monolayer של מפגש, על ה- TEER להיות >1,000 Ω x ס”מ2 לפני תחילת החשיפה.
יחד, מודל הסימפונות Calu-3 המוצג כאן מתאים לשימוש לחשיפה חוזרת ונשנית לתרסיסים, לפחות עד 3 שבועות. המודל יכול לעמוד להיות תרבותי וחשוף באמצעות זרימת אוויר רציפה והוא מסוגל לזהות רעילות אפיתל הסימפונות.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו ממומנת על ידי סיורים פרויקט האיחוד האירופי (כלים מעוגנים פיזיולוגית עבור סיכון ננו מציאותי aSsessment) ומשרד הבריאות, הרווחה והספורט ההולנדי (פרויקט V/050012). ברצוננו להודות לד”ר איבון סטאל וד”ר יאן ואן בנת’ם על הביקורתיים שכתבו את כתב היד.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |