Summary
説明は、毒性試験のために粒子への吸入を繰り返し暴露するためのインビトロ気管支モデルの細胞培養および曝露方法である。
Abstract
空気粒子の毒性試験のために、空気液体界面(ALI)露光システムは現実的な露出条件を模倣するためにインビトロ試験のために開発された。これは、細胞培養モデルに特定の要求を置きます。多くの細胞タイプは空気への暴露(例えば、乾燥)によって悪影響を受け、数日間しか生存しない。これは、これらのモデルで使用できる暴露条件を制限します:通常、比較的高い濃度が雲として適用されます(すなわち、粒子を含む液滴は、急速に落ち着きます)。。このような実験条件は、低濃度の粒子への現実的な長期暴露を反映していない。これらの制限を克服するためにヒト気管支上皮細胞株の使用、Calu-3を調査した。これらの細胞は、健康な形態とタイトな接合を有する安定した単層を保持しながら、数週間のALI条件で培養することができる。さらに、この気管支モデルはALI露出システムを使用して、空気中の粒子の低い、現実的な濃度への反復暴露の効果をテストするのに適している。このシステムは、雲を生成する単一のネビュライゼーションを使用する他のALI露光システムとは対照的に、連続的な気流を使用します。したがって、連続流動システムは、粒子特性、曝露濃度、および送達用量を連続的に監視しながら、空中粒子への反復および長期の暴露に適している。この気管支モデルは、連続流動露光システムと組み合わせて、毒性試験に使用できる現実的で繰り返し吸入暴露条件を模倣することができる。
Introduction
肺は、空気中の粒子への吸入暴露に対して脆弱である。空気中の粒子の潜在的な毒性を評価するために、空気液体界面(ALI)露光システム1、2、3、4、5の開発が進められている。ALI露光システムは、粒子の特性と運動を変える培養媒体を介した従来の水没露光と比較して、より関連性の高い現実的な露光モデルを可能にする6.ALI露光システムは、細胞培養モデルに特定の要求を課します, モデルは、培養培地を欠いているため、したがって、補助側の栄養素.多くの細胞モデルは、空気中で培養および暴露されることによって悪影響を受け(例えば、乾燥)、数日間だけ生存可能なままである。これは、これらのモデルで使用できる暴露条件を制限します:通常、比較的高い濃度が雲として短期間(すなわち、粒子を含む液滴、急速に落ち着く)として適用されます。このような実験条件は、粒子の低濃度への現実的な長期暴露を反映していません。したがって、結果の関連性を問われる可能性があります。これらの制限を克服するために、ヒト気管支上皮細胞系Calu-3-7からなる気管支モデルの培養および曝露プロトコルが最適化された。
ALI曝露に用いられるほとんどのインビトロ肺モデルは、A549、BEAS-2B、および16HBE14o—(16HBE)またはプライマリ細胞を基底8として含む他の細胞株を含む。これらの細胞株は、ALIで培養した場合、わずか数日間生存可能であるという欠点を有する。また、これらの細胞株の一部は、5日よりも長い期間培養すると過剰増殖する。最後に、A549細胞は機能的なタイトな接合部を見逃し、したがって肺9、10を模倣するために必要な堅い障壁を形成することはできません。原発性上皮細胞は、ALIで数週間培養できるため、ALI曝露に適した選択肢となる可能性があります。しかし、一次細胞はバッチによって異なり、維持が難しく、細胞株に比べて高価であり、毒性試験やスクリーニングにはあまり適していません。異なるヒト気管支上皮細胞株(16HBE、Calu-3、H292、およびBEAS-2B)を比較すると、Calu-3細胞だけが現実的で繰り返されるALI暴露に必要なすべての基準を満たしている:彼らはアリで培養しながら数週間生存可能であり、高いバリア完全性を提供し、成長し、培養し、維持しやすい。カル3細胞は腺癌に由来し、粘液11,12を産生することができる。細胞が繊毛11,13を発症できるかどうかについては矛盾がある。Calu-3細胞はまた、毛様化気道上皮細胞14に感染する呼吸間性ウイルス(RSV)感染を研究するのに適したモデルである。
セルモデルに加えて、エアゾル15,16への空気液体暴露には自動暴露システム(AES)が使用される。AESには、連続気流を使用してセルモデルをエアロゾルに公開できるという利点があります。これは、通常、雲として短期間で比較的高濃度を使用する他の空気液体暴露システム(すなわち、急速に沈降する粒子を含む液滴)17、18、19とは対照的である。これらのクラウド システムは、パーティクルの低濃度への現実的な長期暴露を反映していません。AES を使用して連続的な気流を適用することで、現実的な露光条件を反映して、より長い期間にわたって、低濃度のパーティクルにセル モデルを露出させることができます。クラウドシステムに対するもう1つの利点は、AESが粒子の特性測定器を接続するオプションを持ち、粒子サイズ、数濃度、質量を時間の経過とともに測定できる点です。AESの制限は、10 mL/minと100 mL /minの間の比較的高い空気流量を使用していることです。
Protocol
1. 細胞培養培地(CCM)の調製
- グルタミンを添加した最低必須培地(MEM)の500 mLのボトルを準備します。
- ペニシリンストレプトマイシン(すなわち、100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を5 mL加えます。
- 5 mLの非必須アミノ酸(NEAA)溶液を加えます。
- 10 mLのアンホテリシンBを加える(オプション)。
- FBSの50 mLを追加(不活性化熱、熱不活性化のためのATCCプロトコルに従ってください。(https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20ガイド/AnimCellCulture_Guide.ashx、19ページ)
2. カル3細胞の培養
注:カル3細胞は、37°Cおよび5%CO2でT75またはT175細胞培養フラスコで培養される。細胞は7日ごとに60~80%のコンフルエンシーで、CCMは2~3日ごとに更新されます。CCMを注ぎ、新鮮なCCM(T25= 5 mL、T75 = 15 mL、およびT175 = 25 mL)をフラスコにパイプして、フラスコをインキュベーターに戻します。細胞は解凍後、実験で使用する前、または凍結する前に少なくとも2倍の経過をとるべきであり、合計で25倍以下で通過すべきである。
- フラスコが60~80%コンフルエントであるかどうかを確認し、光顕微鏡で確認します。
- フラスコからCCMを注ぎます。
- カルシウムを含まずマグネシウムを使用せずに、5 mLの1xハンクスバランスソルト溶液(HBSS)で細胞2倍を洗浄します。洗浄を行うごとにHBSSを廃棄します。HBSSは、トリプシンを阻害する血清を除去する。
- T75用にトリプシン-EDTAを3 mL(T175の場合は4 mL)、フラスコを37°Cのインキュベーターに戻し、10〜15分間5%CO2 をインキュベーターに戻します。10分後に細胞がフラスコ表面から剥離していることを確認してください。細胞が>80%合流に成長した場合、トリプシン0.05%を使用してデタッチせず、トリプシン0.25%を使用することができます。
- フラスコにCCMの6mL(すなわち、トリプシン-EDTAボリュームを2倍)フラスコに加え、フラスコを穏やかに揺らし、適切な混合を確実にします。これは、CCMのFBSによってトリプシンが中和され、細胞上での活性が停止していることを確認するためである。トリプシンが細胞とあまりにも長く接触し続けることを許されるならば、彼らは新しい細胞培養フラスコに入れたときに再び付着しない。
- フラスコの内容物を50 mL遠心管に注ぎます。
- 130 x gで5分間細胞を遠心分離し、遠心分離機が正しくバランスを取っていることを確認します。
- 細胞を含むバイアルを無菌状態に戻し、ペレットを邪魔することなく上清を穏やかに取り除きます。上清を注ぎ、残りをパイプオフしてペレットが乱れないことを保証する。
- CCMの1mLで細胞ペレットを再懸濁し、全ての細胞が懸濁されるまで上下にピペット化する(すなわち、ペレットや細胞凝集は見られない)。追加のCCMを追加して、細胞懸濁液を希釈することができます。
- ヘモサイトメーターを使用して、CCMの1 mLで、死んで生きている細胞を数えます。適切なカウントのために必要な場合は、3または4 mLで細胞を希釈します。
- 必要なCCMボリュームにセルをサスペンドし、各フラスコに細胞懸濁液を加えます。1週間で約80%の合流率を達成するために、T75に2 x 106 細胞、T175中に6 x 106 細胞をシードします。
- フラスコを穏やかに揺らし、37°Cと5%CO2でインキュベーターに戻します。
- 細胞が60~80%の合流率に達したら、2~3日ごとに新鮮なCCMとサブカルチャーを交換してください。
3. カル3細胞を培養インサートにシーミングする
メモ:挿入は、異なる細孔サイズで利用可能です。小さな細孔サイズ(例えば、0.4 μm)は、細胞がより容易に成長し、トランス上皮電気抵抗(TEER)によって測定されるように、水没条件下で培養した5日後にすでに良好なバリアを達成できるという利点を有する。しかし、粒子転位に興味がある場合、これらの細孔は小さすぎて粒子をトラップします。したがって、大きな孔サイズ(例えば、3μm)は、通常、粒子をテストするために選択されます。より大きな孔サイズを使用する場合、細胞は良好なTEERを達成するためにより長い期間(例えば、水没条件下で培養する7〜10日)を必要とします。
- ステップ2.1-2.10に続く既知の濃度の細胞懸濁液を調製する。
- 細胞を5 x 105 細胞/mLの濃度に希釈し、6ウェルインサートのプレウォームCCMで、または12ウェルインサートの場合は2.5 x 105 細胞/mLの濃縮を行います。
- 挿入物と細胞培養プレートを取り、無菌条件下で配置します。
- バソラショナル側に、6ウェルインサート用の2mLの前温めCCM、または12ウェルインサートの場合は1mLで埋めます。培養液を添加しながら、ピンセットを使用してインサートを取り出します。
- 慎重に上下にピペットで細胞懸濁液を混合します。ピペット1.0 mLは6ウェルインサート用、500 μLは12ウェルインサート(100,000細胞/cm2に相当)、0.4 μmの孔を含む細胞培養インサートの膜の上部に挿入します。 3.0 μmの細孔の場合、セル密度を 128,000 セル/cm2に増やします。
- 細胞培養プレートを覆い、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
- CCM を 2 ~ 3 日ごとに変更します。
- アリで培養を続ける前に、細胞を水没条件下で7日間コンフルエントにします。
- TEER を測定します。
- 箸電極セットを補った上皮ボルトメーターを取り、バッテリーシステムを一晩充電してください。
- ボルトメーターを充電器から取り外し、箸電極を接続します。
- 70%エタノールで電極を洗浄してください。
- 長い電極を皿の底に触れるまで外部培養培地に入れ、より短い電極を膜に触れずに媒体に入れて、CCMに電極を入れる。
- セルを挿入せずに空の挿入から始めます。測定が安定するまで待ち、オームズで抵抗を書き留めます。この測定は、細胞を含まない挿入膜の抵抗(すなわち、ブランク抵抗)である。
- 各挿入物の測定を繰り返し、真の抵抗を得るためにブランク抵抗を減算します。
- データ解析では、抵抗値に挿入物の表面積を掛けて x cm2Ω。6ウェルインサートの場合、表面積は4.67 cm2です。したがって、600オームの抵抗が測定され、背景が120オームである場合、抵抗は480オームであり、その後、合計2,241.6オームxcm2の表面積4.67cm2を掛けた。続行するには、TEER は 1,000 Ω x cm2である必要があります。
- 挿入部の補助側から CCM を取り外します。
- ウェルのバソラテラ側側に12ウェルインサート(すなわち、細胞培養インサート)に12ウェル挿入のための6ウェルのための2mLの前温化CCMの2 mLを加える。CCMは下部から膜に触れる必要がありますが、挿入物の上部に漏れ出しません。
- この時点で細胞は空気に対して格言的に露出し、これはALIでの培養と呼ばれる。
- 培養器中のALIで培養細胞を37°Cで、5%CO2を曝露前7日間培養した。
- 2~3日ごとに、バソアハラCCMを変更します。この細胞は、6週間のALIで使用することができる。
4. 露出設定の準備
注: セクション 5 ~ 7 では、自動露出ステーションを使用したパーティクル露出の準備について説明します(AES、 材料表を参照)。粒子のネビュライゼーションと特性評価のセットアップは、他のメーカーの他のALI露光システムとも互換性があります。一例として、粒子への曝露を以下に説明する。このようなシステムは、感作剤、タバコの煙、ディーゼル排気などの他の露出にも使用できます。 図 1 は、AES と露出モジュールを示しています。 図2 は、他のすべての機器を含む露出設定の概略表現を示しています。
- AESを使用して露出を開始する前に、エアロゾルの特性を測定するためにシステムをいくつかの機器に接続してください。これらは、エアロゾルがキャビネットに入る直前のサイドストリームで測定されます。
注: フロー スプリッターは、サイド ストリームを露出特性化装置に接続するために使用されます。一般的に、以下の装置が使用される:走査移動度粒子サイザー(SMPS)、光粒子サイザー(OPS)、凝縮粒子カウンター(CPC)、テーパー要素振動マイクロバランス(TEOM)。SMPSおよびOPS測定は1時間あたり1倍に実行され、フロースプリッターから同じチューブを使用します。CPCとTEOMは連続的な測定を行い、両方からのデータはSquirrelモデル2020データロガーに記録される。さらに、重量測定質量濃度は、制御された相対湿度(40~70%)のマイクロバランスを使用して決定されます。温度(21~23°C)の条件。テフロンフィルターは、各曝露の前後に計量され、曝露濃度を確認する。排気をキャプチャするために、HEPAフィルタを使用します。設計されたナノ材料(ENM)懸濁液およびネブライザーを含むセットアップはすべてフローキャビネットに置かれ、人への暴露を防ぎます。AESは金属および金属酸化物を含む多くの異なるタイプのEnmをテストするために使用することができる。 - 露出の直前にナノ材料懸濁液を準備します。通常、1%懸濁液は、ストック溶液として調製される。例えば、100mgのナノ材料を純水10mLに懸濁させる。
注意:DQ12露光の場合、300mgを使用して約2μg/cm2を達成します。この量は、単一の暴露で使用するか、または繰り返しの暴露で分割することができます(例えば、300mgは、単一の暴露のために30mLに懸濁されるか、または21.5mgが3週間の繰り返し暴露のために毎日2.15 mLに吊り下げされます)。懸濁液は、各暴露日に新たに調製されます。粒子懸濁液は、プローブ超音波処理を使用して16分間超音波処理されます。1%ストック溶液の体積は純水を加えることによって100 mLの総容積に調節される。 - ENM懸濁液をキャップと磁気スターラー付きの小さなボトルに入れ、粒子の沈降を防ぎます。小さい管を介して蠕動ポンプにボトルを接続し、25 mL/hに流れを調節します。
- 蠕動ポンプをスプレーノズルに接続し、設定を調整して連続エアロゾル化を可能にします。
- スプレーノズルは、長さ60cmのアルミニウムチューブ(混合チャンバー、直径15cm、60°Cに加熱)に取り付けられています。設定は1.5メートル長い銅管(直径15 cm)を介してAESに接続される。AESの上にインタクタは2.5 μmより大きいすべてのエアロゾルを取除く。
- スプレーノズルを2つのマスフローコントローラ(MFC)を介して3バー圧縮空気に接続し、サスペンションのネビュライゼーションを可能にします。14 L/minの1つの流れは、スプレーノズルに使用され、もう一方のMFCは、チューブ内の空気の混合に使用されます。
- 露光開始の前日に、AESをオンにして、キャビネットが37°Cの温度に達するようにします。
- 露光開始の2時間前にキャビネット内の空気の流れと湿度をオンにして、湿度85%に達します。セルと挿入物が配置される露出チャンバーの加熱をオンにします。
- 石英マイクロバランス (QCM) をオンにし、ソフトウェアを使用して初期値を 0 に設定します。ログを開始します。質量は10sごとに測定され、ng/cm2として表されます。
- 水浴で細胞培養培地を37°Cに温めます(〜20~30分)。
5. 光3細胞の露出の準備
注: AES を使用した一般的な ALI エクスポージャーでは、コンフルエント セル レイヤを使用する 15 ~ 20 個の挿入が必要です。これらは、3つのクリーンエアコントロール、AESで露出せずに他のインサートと同様に処理される3つのインキュベーターコントロール、エアロゾル暴露用の6-8インサート(0、1、または2マイクロバランスの使用に応じて)、制御測定用の1-3挿入物(LDHリリースの最大放出など)、および3つの予備挿入物で構成されています。セルの TEER は 、>1,000×x cm2 Ωを持つ必要があります。
- 露光初日に、CCMで細胞1xを洗浄し、細胞の形態をチェックし、Voltohmmeterを用いて細胞モデルのTEERを測定する。細胞は、ギャップのないタイトな単層を形成する必要があります。
- FCSを含まない2mL/1mLのHEPES緩衝CCMを6ウェル/12ウェルプレートのバソラテラサイド側に入れ、培養インサートを新しいプレートに細胞と共に移します。
注: 露出中は、Co2 は AES に存在しません。そのため、輸送および曝露時にHEPES緩衝培養培地(25mM HEPES)が用いられる。この培地は、AES内の露出細胞およびインキュベーターコントロール細胞の両方に使用される。 - 細胞培養物をAESに輸送する時間が5分以上である場合には、輸送中に細胞を37°Cのポータブルインキュベーターに入れる。
6. 暴露時のAESの取り扱い
- AESでは、胎児子牛血清(FCS)なしでHEPES緩衝CCMで露光モジュールを充填します。CCMの量は、使用される単位と細胞培養挿入物の種類によって異なります。アリで細胞を維持するために、媒体は膜の底に達するべきであるが、膜の上に漏れてはならないことを覚えておいてください。6つの井戸挿入物を使用する場合、6 mLのHEPESバッファリングCCMを露光モジュールに加えます。
- 無菌ピンセットを使用して、プレートから露出モジュールにセルを持つ挿入物を転送します。細胞のバソラテラ側面に気泡がないことを確認し、挿入物の補助側のCCMを取り除きます。バソラテラ側に気泡がある場合は、滅菌ピンセットを使用して挿入物をそっと回します。CCMを含むプレートを、露光後の転写用インキュベーターに保管してください。
- タッチスクリーンディスプレイを使用して、露出時間、空気流量、静電堆積の向上を選択します。また、ディスプレイは湿度や温度を確認するために使用することができます。通常、37 °Cおよび85%の湿度で挿入物の流量50 mL/minで、4時間の露光時間が選択されます。
注: 第 1 レベルのモジュール (図 1) は、クリーンエア露出に使用されます。このレベルのインサートは、クリーンエア露出制御として使用されます。第2および第3レベルの他のモジュールは、水晶結晶マイクロバランス(QCM)がオンラインで堆積を測定するための2つのモジュールを含むエアロゾル暴露に使用することができます。 - 漏れ検査は、露光を開始する前に行う必要があります。漏出は5 mL/min未満である必要があります。AES ディスプレイの指示に従います。リークテストが終了したら、露光を開始できます。漏れの場合は、チューブをチェックする必要があります。
- 露光の終わりに、AESモジュールのドアを開け、露光モジュールを開き、細胞培養挿入物を細胞培養プレートに戻し、プレートをポータブルインキュベーターに移します。
- モジュール(すなわち、露出したサンプル)およびプレート(すなわち、インキュベーター制御)から、乳酸脱水素酵素(LDH)測定など後で分析するために、培地を収集する。
- 細胞培養ラボに戻り、新鮮な標準CCMを充填したプレートに細胞培養インサートを移します。細胞培養プレートを次の暴露まで、または分析するまでインキュベーターに入れます。
- 最終露光日の後、インキュベーターにインサートを翌日まで入れます。
- 最終露出の翌日に、CCMを補助側に加えて、Voltohmmeterを使用してTEERを測定します。サイトカインの分析のために、補助的なCCMとバソラショナルCCMの両方を別々に収集します。
- すべてのCCMを除去し、例えば、アプリカル側に増殖試薬を加えることによって細胞生存アッセイを行う。
7. AES のクリーニング
- 露出モジュールに水を入れ、1分間待ってから水を取り除きます。次に、モジュールに70%エタノールを充填し、10分間放置し、エタノールを取り除きます。70%エタノールで露光トランペットも洗浄してください。
- 85%の湿度制御を停止しますが、次の実験のためにキャビネットの温度を37°Cのままにしておきます。
Representative Results
本稿では、毒性試験に使用できる現実的で繰り返し吸入暴露条件を模倣するアリでヒト気管支上皮細胞を培養し、暴露する方法を提供する。細胞モデルと露光システムの両方の特性は、繰り返し露光に使用できる現実的な吸入露光モデルを達成するために不可欠です。これらの特性に関する結果を以下に示します。
セルモデルの要件と選択
適切なセルモデルを選択する場合、以下の特性を考慮する必要があります。
- 細胞モデルは肺障壁を模倣するために機能する堅い接合部とのコンフルエント単層を形成することができるべきである。
- セルモデルは、条件付き(温度および湿度)空気に繰り返し曝露した場合に最適な性能を示す必要があります。
- セル モデルは露出に応答する必要があります。
この研究は、4つの異なるヒト気管支上皮細胞株で始まりました: 16HBE, Calu-3, H292, およびBEAS-2B.これらはすべて、ナノ材料や化学物質の毒性試験に広く使用されています。4つの細胞株のうち、カル3細胞だけが上記の要件をすべて満たしました。細胞は、TEERによって測定される時間の経過とともに安定した障壁を保つ単層(図3)を形成し、他の細胞株は、アリで培養した場合にバリアを形成しなかったか、またはバリア機能の低下を示した(図4)。さらに、H292およびBEAS-2Bは、より長い期間培養すると、複数の細胞層に過剰増殖する傾向があった。従来の水没細胞培養およびALI培養は、ALIの栄養素がバソラテラ側からしか入手できず、細胞が補助側の乾燥状態にさらされたため、大きく異なっていた。これらの条件は、時間の経過とともに細胞の生存率を測定することによって観察することができる細胞モデルにストレスを引き起こす可能性があります。細胞株16HBE、H292、およびBEAS-2BはいずれもALIで培養した場合にLDH放出の増加を示し、カル3細胞はわずかなLDH放出のみを示した(図5)。
次に、物質に対するCalu-3モデルの応答を試験した。陽性対照物質として、LPSは、モデルの尖側にネビュライゼーションを介して投与した。沈着した用量は0.25 μg/cm2であった。カル3細胞はLDH放出の増加と腫瘍壊死因子α(TNF-α)放出によるリポ多糖(LPS)への反応を示した(図6)。
最後に、カル3単層を石英シリカ(DQ12)ナノ材料(IOM、エディンバラ)にさらした。結晶性シリカは珪肺を誘発し、肺腫瘍を引き起こす可能性もある。そこで、国際がん研究機関(IARC)は、結晶性シリカをグループIヒト発がん性物質20に分類した。結晶性シリカの作用機序は、その反応性表面21、22、23によって引き起こされる持続性炎症の誘導を介してであると考えられる。ラットおよびマウスの両方におけるいくつかのインビボ研究は、結晶性シリカ24、25、26、27、28、29への吸入暴露後に、腫瘍および線維症を含む炎症および組織病理学的変化の誘導を報告する。これらの効果はすべて、繰り返し暴露および/または長期フォローアップ後に観察される。Calu-3モデルは、ALIで繰り返し暴露できるインビトロモデルを使用して、生体内研究からの観測を模倣できるかどうかを調べるのに使用されました。
カル3細胞を3週連続で、週5日、DQ12に1日あたり4時間曝露した。堆積した用量はQCMを用いて測定した。平均沈着用量は1日あたり120 ng/cm2 で、累積用量は1.6 μg/cm2で、インビボで効果を誘発する用量と同様であった。その他の粒子特性を 表1に示す。3週間の曝露後、DQ12は、清浄空気制御と比較して、TEER、細胞生存率、及び単球化学誘引タンパク質1(MCP-1)放出において有意な効果を誘発しなかった(図7)。インビボデータに基づいてDQ12の毒性が予想されるほど、EUプロジェクトGRACIOUS(成果物5.3)内で最適化されたプロトコルに従って、粒子の反応性を無細胞アッセイを用いてチェックした。DQ12バッチの反応性は予想よりも低く(図8)、正の対照粒子カーボンブラック(CB)に比べて桁違い低かった。この反応性の欠如は、Calu-3モデルにおける毒性応答の欠如を説明するかもしれない。
図1:自動露光ステーション(AES)。
左図は、タッチパネル付きキャビネットの外側を示しています。AES には、露出モジュールの 3 つのレベルがあります: クリーンエア エクスポージャーの最上位レベルとエアロゾル露出の中間と下のレベル。右の図は、セルを挿入する露出モジュールを示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:露出設定の概略図。
左から右へ:1)ENM懸濁液は蠕動ポンプを介してスプレーノズルに接続されています。2)圧縮空気を使用して、スプレーノズルはENMサスペンションを噴霧し、混合チャンバーを介してエアロゾルはAESに導かれます。3) AES に入る直前に、エアロゾル特性測定器が接続されています:SMPS、OPS、CPC、および TEOM。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:空気・液体界面(ALI)で10日間培養した後のカル3細胞の代表的な画像。
ALIで10日間培養した後のカル3細胞の蛍光顕微鏡画像。強固な接合タンパク質ZO-1は緑色に染色され、細胞の核は青色に染色される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:21日間の培養期間中に4つの異なる細胞株の経上皮電気抵抗(TEER)を示す。
21日間培養した場合のTEER値は16HBE、Calu-3、H292、およびBEAS-2B:最初の7日間は水没し、次いでALIで14日間続く。TEER 値は、挿入物の背景抵抗を補正し、挿入物の表面積を掛けた。記号と誤差範囲は、6 つの挿入の平均値と標準偏差を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:培養期間中の培養期間中の4種類の細胞株のLDH放出が21日間である。
16HBE、カル3、H292、およびBEAS-2BのLDH放出を21日間培養した場合:7日間水没し、次いでALIで14日間培養した。表示される LDH 値は、セル・タイプごとの最大 LDH 放出に対する相対値です。記号と誤差範囲は、5 回の挿入の平均値と標準偏差を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:LPSに曝露したカル3細胞における細胞の効果
カル3細胞は、0.25μg/cm2 LPSに雲のネビュライゼーションを介して露出した。(A) WST-1 変換。(B) LDH リリース。(C) LPS暴露後のTNF-αリリース。記号と誤差範囲は、3 つの挿入の平均値と標準偏差を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:DQ12ナノ材料に曝露したカル3細胞における細胞効果
カル3細胞をDQ12ナノ材料に3週間(1日4時間、週5日)、1日あたり約120ng/cm2、累積用量1.6μg/cm2に曝露した。(A) テーラー値。(B) LDH リリース。(C) DQ12露光後の MCP-1 リリース。すべての記号と誤差範囲は、コントロールの 3 つの挿入と DQ12 エクスポージャーの 6 つの挿入の平均値と標準偏差を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:DQ12の細胞内反応性。
DQ12は、その表面反応性を検出するために2ʹ、7ʹジクロロルオレセイン・ディアセテート(DCFH-DA)プローブでインキュベートした。正の対照として、カーボンブラック(CB)粒子が含まれていた。CB と比較して、DQ12 は非常に低い表面反応性を持っています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 粒子質量(μg/m3) | 粒子数 (#/cm3) | モビリティ粒子サイズ(nm) | 幾何学的標準偏差 | 光学粒子径(μm) |
| 2969 (418) | 83983 (10215) | 66.6 | 2.5 | 1.1 (1.3) |
表1:DQ12露光特性 値は、角括弧内の標準偏差を持つ平均として表示されます。
Discussion
本論文では、ALIの下でヒト気管支上皮細胞を培養し、この気管支モデルをエアロゾルやガスにさらす方法について述べている。Calu-3細胞を使用する利点は、それらがタイトな接合部を形成し、単層のままで、空気の流れに耐えることができ、そして他の多くの細胞タイプ(例えば、16HBE、H292、およびBEAS-2B)とは異なり、ALIで何週間も培養できることである。VITROCELL®自動露光ステーション(AES)を使用すると、連続気流を使用して低濃度を適用できるため、現実的かつ関連する条件下で細胞を露出させることができるという利点があります。
AESのような継続フローシステムは、サスペンションの単一のネビュライゼーションを使用するクラウドシステム3、32を使用する場合と比較して利点があります。連続流量はより現実的であり、流量、湿度、温度などの多くの変数が制御されます。また、電界を用いて堆積を強化することができます。最後に、サイズ、数濃度、質量などのエアロゾル特性をオンラインで監視します。欠点は、継続的なフローシステムがクラウドシステムに比べて複雑になることです。したがって、エアロゾルの粒子特性と挿入物に対する投与量に焦点を当てた準備実験を行うことが重要である。粒子の初期開始濃度とAES設定は、細胞33上で所望の線量を達成するように調整することができる。試験される粒子の種類によって、エアロゾルの生成方法が異なる場合があります。静電堆積の使用は、粒子の種類に依存し、金属粒子に最適です。正の表面電荷を持つパーティクルの場合は、負の静電場を適用し、その逆も同様です。
露光濃度の選択は、空気液体暴露実験では困難です。DQ12曝露の目的は、3週間の曝露後に1μg/cm2の総累積用量を達成することであった。この用量は、生体内21、25、27、32、33で効果を誘発した用量に似ています。露光を行う場合、露光日の違いはある程度のばらつきがあった。1.6 μg/cm2の実際の沈着線量は、目的とした1μg/cm2よりも高いが、Calu-3モデルの効果を観察するには低すぎる可能性がある。クリーンエア露光とDQ12曝露の間にはTEER、生存率、サイトカイン応答のわずかな違いのみが認められ、これらの差は統計的に有意ではなかった。3週間のDQ12曝露がカル3細胞に有意な効果を誘導しなかったという観察の説明は、マクロファージがCalu-3モデルから欠けていたことである。おそらく、DQ12取り込み後マクロファージは、カル3細胞に影響を与える可能性のある炎症性サイトカインを産生する。もう一つの説明は、実験に使用されたDQ12バッチが期待したほど反応性ではなかったということです。LPSを陽性対照物質として使用する場合、Calu-3は、LDH放出の増加およびTNF α放出の増加によって測定される応答を示す。これは、モデルが毒性を検出できることを示します。
Calu-3 細胞モデルには、結果セクションで説明されているように、多くの利点があります。さらに、ALIでより長い時間培養すると、Calu-3細胞は繊毛状/繊毛様構造13を成長させ、粘液11、12、13を産生することができる。これらの利点にもかかわらず、モデルは、その生理学的関連性に関して制限を有する。カル3細胞株は腺癌に由来し、16HBEおよびBEAS-2Bは健康な組織に由来する。残念ながら、後者の2つは、時間の経過とともに安定した単層のままであるわけではないので、繰り返しALI暴露には適していません。Calu-3 モデルのもう 1 つの制限は、単一のセル型のみを表す点です。ヒト肺では、接触し、暴露に対して異なる反応を示す複数の細胞型が存在する。吸入粒子は、空気力学的な大きさに応じて、肺の異なる領域に沈着する。これは、粒子がカル3モデルによって模倣されるように、上皮細胞の障壁に接触する場所です。ヒト肺では、肺胞マクロファージが粒子に引き付けられ、それらを巻き込み、肺から取り除く。マクロファージはまた、粒子暴露に対する炎症反応に不可欠な役割を果たす。したがって、肺バリアをより密接に模倣するために一次マクロファージを追加することによってCalu-3モデルを拡張する努力がなされている。マクロファージの欠点は、ALIでカル3細胞の上に培養した場合、約7日間のみ生存可能であり続ける点である。したがって、マクロファージは、現在のCalu-3モデルをコカルチャーモデルに変換するために毎週再追加する必要があります。コカルチャープロトコルの最適化は現在進行中です。
上記を考えると、Calu-3気管支モデルは、タバコの煙やLPSからの化学物質などの部分的に可溶性物質のエアロゾルへの繰り返し暴露のための適切なモデルです。これらの可溶性物質は、カル3細胞におけるサイトカイン応答の有意な増加を誘導する。ディーゼル排気やDQ12などの不溶性粒子の試験には、マクロファージが粒子暴露による効果の誘導において重要な役割を果たすため、共培養モデルが必要です。
記載された露光については、3.0μmの孔を有する挿入膜が使用された。このタイプの挿入を選択する主な理由は、ナノ材料の転位をテストすることができるということです。0.4μmの細孔径を使用する場合、粒子凝集体は挿入膜を横切ることができない。大きな孔サイズを使用することの欠点は、細胞がコンフルエント成長するためにより長い時間を必要とし、光顕微鏡を使用して細胞の形態を視覚化することがより困難であるということです。セルがコンフルエント単層を形成することを確認するには、露出を開始する前に TEER を >1,000 Ω x cm2 にする必要があります。
まとめると、ここで提示されるCalu-3気管支モデルは、少なくとも3週間まで、エアロゾルへの反復暴露に使用するのに適しています。このモデルは、連続気流を介して培養および暴露されることに耐えることができ、気管支上皮への毒性を検出することができます。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、EUプロジェクトPATROLS(現実的なナノ材料ハザードアセスメントのための生理学的に固定されたツール)とオランダの厚生・福祉・スポーツ省(プロジェクトV/050012)によって資金提供されています。イヴォンヌ・スタール博士とヤン・ファン・ベンテス博士が原稿を批判的に見直してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| 0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
| 2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
| 3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
| Automated exposure station | Vitrocell | ||
| Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
| Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
| DQ12 | IOM | nanomaterials | |
| ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
| EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
| FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
| Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
| Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
| Light microscope | Olympus | CKX41 | |
| Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
| Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
| Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
| OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
| Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
| Pure water | Merck | MilliQ | |
| SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
| Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
| Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
| TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
| Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
| Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |
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