وصفها هو ثقافة الخلية وطريقة التعرض لنموذج القصبات الهوائية في المختبر واقعية، والتعرض المتكرر للجسيمات لاختبار السمية.
وفيما يتعلق باختبار السمية للجسيمات المحمولة جوا، تم تطوير نظم للتعرض للواجهة البينية الهوائية السائلة (ALI) من أجل الاختبارات المختبرية من أجل محاكاة ظروف التعرض الواقعية. وهذا يضع مطالب محددة على نماذج ثقافة الخلية. تتأثر أنواع كثيرة من الخلايا سلباً بالتعرض للهواء (على سبيل المثال، الجفاف) ولا تبقى قابلة للحياة إلا لبضعة أيام. وهذا يحد من حالات التعرض التي يمكن استخدامها في هذه النماذج: وعادة ما يتم تطبيق تركيزات عالية نسبيا كسحابة (أي قطرات تحتوي على جسيمات، والتي تستقر بسرعة) في غضون فترة قصيرة من الزمن. ولا تعكس هذه الظروف التجريبية التعرض الواقعي الطويل الأجل لتركيزات منخفضة من الجسيمات. للتغلب على هذه القيود استخدام خط الخلايا الظهارية القصبية بشرية، تم التحقيق في Calu-3. هذه الخلايا يمكن أن تكون مثقفة في ظروف ALI لعدة أسابيع مع الاحتفاظ مورفولوجيا صحية و أحادية مستقرة مع تقاطعات ضيقة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا النموذج الشعب الهوائية هو مناسبة لاختبار آثار التعرض المتكرر لتركيزات منخفضة وواقعية من الجسيمات المحمولة جوا باستخدام نظام التعرض ALI. يستخدم هذا النظام تدفق الهواء المستمر على عكس أنظمة التعرض ALI الأخرى التي تستخدم البخاخة واحدة تنتج سحابة. ولذلك، فإن نظام التدفق المستمر مناسب للتعرض المتكرر والمطول للجسيمات المحمولة جواً مع الرصد المستمر لخصائص الجسيمات وتركيز التعرض والجرعة التي يتم تسليمها. معا, هذا النموذج الشعب الهوائية, في تركيبة مع نظام التعرض للتدفق المستمر, قادر على محاكاة واقعية, ظروف التعرض للاستنشاق المتكررة التي يمكن استخدامها لاختبار السمية.
الرئتان عرضة للتعرض للاستنشاق للجسيمات المحمولة جواً. لتقييم السمية المحتملة للجسيمات المحمولة جوا، وقد أحرز تقدم لتطوير واجهة الهواء والسائل (ALI) نظم التعرض1،2،3،4،5. وتتيح نظم التعرض لـ ALI نماذج تعرض أكثر صلة وواقعية مقارنة بالتعرض المغمور التقليدي عبر الوسط الثقافي الذي يغير خصائص وحركيات الجسيمات6. تضع أنظمة التعرض لـ ALI مطالب محددة على نماذج ثقافة الخلية ، حيث تفتقر النماذج إلى الثقافة المتوسطة وبالتالي العناصر الغذائية في الجانب المحمول. تتأثر العديد من نماذج الخلايا سلبًا بزرعها وفضحها في الهواء (على سبيل المثال، الجفاف) وتظل قابلة للحياة لبضعة أيام فقط. وهذا يحد من ظروف التعرض التي يمكن استخدامها في هذه النماذج: وعادة ما يتم تطبيق تركيزات عالية نسبيا في غضون فترة قصيرة من الزمن كسحابة (أي قطرات تحتوي على جسيمات، والتي تستقر بسرعة). ولا تعكس هذه الظروف التجريبية التعرض الواقعي الطويل الأجل لتركيزات منخفضة من الجسيمات؛ وبالتالي، يمكن أن تكون مسألة أهمية النتائج موضع تساؤل. للتغلب على هذه القيود، تم تحسين الثقافة والتعرض بروتوكول لنموذج الشعب الهوائية التي تتكون من خط الخلية الظهارية الشعب الهوائية الإنسان Calu-37.
معظم نماذج الرئة في المختبر المستخدمة في التعرض ALI تحتوي على خطوط الخلية الأخرى مثل A549، BEAS-2B، و 16HBE14o-(16HBE) أو الخلايا الأولية كأساس8. هذه الخطوط الخلوية لها عيب أنها تبقى قابلة للحياة لبضعة أيام فقط عندما مثقف في ALI. بالإضافة إلى ذلك، بعض هذه خطوط الخلية فوق النمو عند مثقف لفترة أطول من 5 أيام. وأخيرا، الخلايا A549 يغيب عن تقاطعات ضيقة وظيفية، وبالتالي لا يمكن أن تشكل حاجز ضيق اللازمة لتقليد الرئتين9،10. الخلايا الظهارية الأولية قد يكون خيارا جيدا للتعرض ALI كما أنها يمكن أن تكون مثقفة في ALI لأسابيع. ومع ذلك، تختلف الخلايا الأولية من دفعة إلى أخرى، وأكثر صعوبة للحفاظ عليها، وأكثر تكلفة مقارنة بخطوط الخلايا، مما يجعلها أقل ملاءمة لاختبار السمية والفرز. عند مقارنة مختلف خطوط الخلايا الظهارية القصبية البشرية (16HBE، Calu-3، H292، وPIAS-2B)، فقط الخلايا Calu-3 تلبية جميع المعايير اللازمة للتعرض واقعية، ALI المتكررة: أنها تبقى قابلة للحياة لأسابيع في حين مثقف في ALI، وتوفير سلامة حاجز عال، لا الإفراط في النمو، وسهلة الثقافة والحفاظ عليها. الخلايا Calu-3 تنشأ من غدية و هي قادرة على إنتاج المخاط11,12. هناك تناقضات حول ما إذا كان يمكن تطوير الخلايا أهداب11,13. Calu-3 الخلايا هي أيضا نموذج مناسب لدراسة التهابات فيروس متزامن الجهاز التنفسي (RSV) التي تصيب الخلايا الظهارية مجرى الهواءciliated 14.
وإلى جانب نموذج الخلية، يتم استخدام نظام التعرض الآلي (AES) للتعرض للهواء السائل للهباء الجوي15،16. لدى AES ميزة أنه يستخدم تدفق الهواء المستمر لتعرض نموذج الخلية للهباء الجوي. وهذا على النقيض من غيرها من أنظمة التعرض للهواء والسائلة التي عادة ما تستخدم تركيزات عالية نسبيا في غضون فترة قصيرة من الزمن كسحابة (أي، قطرات تحتوي على الجسيمات التي تستقر بسرعة)17،18،19. ولا تعكس هذه النظم السحابية التعرض الواقعي على المدى الطويل لتركيزات منخفضة من الجسيمات. من خلال تطبيق تدفق الهواء المستمر باستخدام AES، يمكن أن يتعرض نموذج الخلية لتركيز منخفض من الجسيمات على مدى فترة زمنية أطول، مما يعكس ظروف التعرض واقعية. ميزة أخرى على أنظمة السحب هو أن AES لديه الخيار لربط أجهزة توصيف الجسيمات، مما يسمح بقياس حجم الجسيمات، وتركيز العدد، والكتلة مع مرور الوقت. وهناك قيد من AES هو أنه يستخدم تدفق الهواء عالية نسبيا بين 10 مل / دقيقة و 100 مل / دقيقة.
هذه الورقة تصف طريقة استزراع الخلايا الظهارية القصبية البشرية تحت ALI وتعريض هذا النموذج الشعب الهوائية للهباء الجوي أو الغازات. وميزة استخدام الخلايا Calu-3 هي أنها تشكل تقاطعات ضيقة، وتظل أحادية الطبقة، وقادرة على تحمل تدفق الهواء، ويمكن أن تكون مثقفة لأسابيع في ALI، على عكس العديد من أنواع الخلايا الأخرى (على سبيل المثال، 16HBE، H292، و BEAS-2B). باستخدام محطة التعرض الآلي® VITROCELL (AES) لديه ميزة أن الخلايا يمكن أن تتعرض في ظروف واقعية و ذات صلة حيث يمكن تطبيق تركيزات منخفضة باستخدام تدفق الهواء المستمر.
نظم التدفق المستمر، مثل AES، لها مزايا مقارنة باستخدام أنظمة السحابة3،32، والتي تستخدم حجب واحد من تعليق. التدفق المستمر هو أكثر واقعية ويتم التحكم في العديد من المتغيرات مثل معدل التدفق والرطوبة ودرجة الحرارة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعزيز ترسب باستخدام حقل كهربائي. وأخيراً، يتم رصد خصائص الهباء الجوي مثل الحجم وتركيز العدد والكتلة عبر الإنترنت. ومن المساوئ أن نظم التدفق المستمرة أكثر تعقيدا مقارنة بالنظم السحابية. ولذلك، من المهم إجراء تجارب تحضيرية تركز على خصائص الجسيمات في الهباء الجوي والجرعة التي يتم تسليمها في الإدراج. ويمكن بعد ذلك ضبط التركيز الأولي للجسيمات و AES من أجل تحقيق الجرعة المطلوبة على الخلايا33. اعتمادا على نوع الجسيمات التي يجري اختبارها، يمكن أن تختلف طريقة توليد الهباء الجوي. يعتمد استخدام الترسيب الكهربائي على نوع الجسيمات ويعمل بشكل أفضل للجسيمات المعدنية. بالنسبة للجسيمات ذات الشحنة السطحية الموجبة، ينبغي تطبيق حقل كهرباءً سالبًا والعكس بالعكس.
قد يكون اختيار تركيزات التعرض صعبًا لأي تجربة تعرض للهواء والسائل. وبالنسبة للتعرض للضّرّ، كان الهدف هو تحقيق جرعة تراكمية إجماليّة قدرها 1 ميكروغرام/سم2 بعد التعرّض لمدة 3 أسابيع، و5 أيام في الأسبوع، و4 ساعات في اليوم. هذه الجرعة هي مماثلة للجرعات التي تسبب تأثير في الجسم الحي21,25,27,32,33. وعند تنفيذ التعرض، كان هناك بعض التباين بين أيام التعرض المختلفة. ورغم أن الجرعة المودعة الفعلية التي تبلغ 1.6 ميكروغرام/سم2 أعلى من الجرعة التي كانت موجهة إلى 1 ميكروغرام/سم2، فإن الجرعة ربما كانت منخفضة جداً بحيث لا تسمح بملاحظة الآثار في نموذج Calu-3. ولم تلاحظ سوى اختلافات طفيفة في استجابة الـ تير، والقابلية للبقاء، والسيتوكين بين التعرض للهواء النظيف والتعرض لـ DQ12، ولم تكن هذه الاختلافات ذات دلالة إحصائية. تفسير الملاحظة التي تعرض DQ12 لمدة 3 أسابيع لم تستحث آثار كبيرة في الخلايا Calu-3 هو أن الضامة كانت تفتقر إلى نموذج Calu-3. ربما, بعد DQ12 امتصاص الضامة إنتاج السيتوكينات proinflammatory التي قد تؤثر على الخلايا Calu-3. تفسير آخر هو أن الدفعة DQ12 التي استخدمت للتجارب لم تكن رد الفعل كما هو متوقع. عند استخدام LPS كمادة مراقبة إيجابية، لا تظهر استجابة Calu-3، كما تقاس بزيادة في إطلاق LDH وزيادة في إطلاق TNF-α. وهذا يشير إلى أن النموذج يمكن الكشف عن سمية.
نموذج الخلية Calu-3 لديه العديد من المزايا، كما نوقش في قسم النتائج. وعلاوة على ذلك، عندما مثقف لفترة أطول في ALI، يمكن أن تنمو الخلايا Calu-3 أهداب / أهداب تشبه الهياكل13 وإنتاج المخاط11،12،13. على الرغم من هذه المزايا ، فإن النموذج له قيود فيما يتعلق بأهميته الفسيولوجية. تنشأ خطوط الخلايا Calu-3 من غدية، في حين أن 16HBE و BEAS-2B ينشأان من الأنسجة السليمة. لسوء الحظ، فإن الأخيرين ليست مناسبة للتعرض ALI المتكرر لأنها لا تبقى أحادية مستقرة مع مرور الوقت. وثمة قيد آخر من نموذج Calu-3 هو أنه يمثل فقط نوع خلية واحدة. في الرئة البشرية، توجد أنواع خلايا متعددة تتفاعل وتستجيب بشكل مختلف للتعرض. سوف تترسب الجسيمات المستنشقة في مناطق مختلفة من الرئتين اعتمادا على حجمها الأيرودينامية. هذا هو المكان الذي تتصل الجسيمات حاجز الخلية الظهارية، كما تحاكيها نموذج Calu-3. في الرئة البشرية، تنجذب الضامة السنخية إلى الجسيمات، وتغمرها، وتمسحها من الرئتين. كما تلعب الضامة دورًا أساسيًا في استجابة الالتهابات للتعرض للجسيمات. ولذلك، تبذل جهود لتوسيع نموذج Calu-3 عن طريق إضافة الضامة الأولية لتقليد حاجز الرئة عن كثب. وعيب الضامة هو أنها تبقى قابلة للحياة فقط لمدة 7 أيام فقط عندما مثقف على رأس الخلايا Calu-3 في ALI. لذلك، يجب قراءة الضامة أسبوعياً لتحويل نموذج Calu-3 الحالي إلى نموذج لزراعة تعايشية. ويجري حاليا تحسين بروتوكول الزراعة التكُنّية.
وبالنظر إلى ما سبق، فإن نموذج الشعب الهوائية Calu-3 هو نموذج مناسب للتعرض المتكرر للهباء الجوي من المواد القابلة للذوبان جزئيا مثل المواد الكيميائية من دخان السجائر و LPS. هذه المواد القابلة للذوبان تحفز زيادات كبيرة في ردود السيتوكين في الخلايا Calu-3. لاختبار الجسيمات غير القابلة للذوبان مثل عادم الديزل وDQ12، هناك حاجة إلى نموذج الزراعة المشتركة، لأن الضامة تلعب دورا حاسما في تحريض الآثار عن طريق التعرض للجسيمات.
وبالنسبة للتعرض الموصوف، تم استخدام أغشية إدخال بمسام 3.0 ميكرومتر. والسبب الرئيسي لاختيار هذا النوع من إدراج هو أنه من الممكن لاختبار نقل المواد النانوية. عند استخدام أصغر حجم المسام 0.4 μm، agglomerates الجسيمات لن تكون قادرة على عبور غشاء إدراج. عيب استخدام حجم المسام الكبيرة هو أن الخلايا تحتاج إلى وقت أطول لتنمو التقاء وأنه من الصعب أكثر تصور مورفولوجيا الخلايا باستخدام المجهر الخفيف. للتحقق من أن الخلايا تشكل طبقة أحادية التقاء، يجب أن يكون TEER > 1000 Ω × سم2 قبل بدء التعرض.
معا، ونموذج الشعب الهوائية Calu-3 المعروضة هنا هو مناسبة للاستخدام للتعرض المتكرر للهباء الجوي، على الأقل تصل إلى 3 أسابيع. النموذج يمكن أن تصمد أمام كونها مثقفة وتتعرض عبر تدفق الهواء المستمر وقادرة على الكشف عن سمية ظهارة الشعب الهوائية.
The authors have nothing to disclose.
ويمول هذا العمل من قبل دورية مشروع الاتحاد الأوروبي (أدوات ذات أساس فسيولوجي من أجل المخاطر النانوية الواقعية) ووزارة الصحة والرفاه والرياضة الهولندية (المشروع V/050012). نود أن نشكر الدكتورة إيفون ستال والدكتور يان فان بنثم على مراجعة المخطوطة بشكل نقدي.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |