Beschrieben wird die Zellkultur und Expositionsmethode eines In-vitro-Bronchialmodells für eine realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Partikeln für Toxizitätstests.
Für Toxizitätstests von Partikeln in der Luft wurden Expositionssysteme für Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI) für In-vitro-Tests entwickelt, um realistische Expositionsbedingungen nachzuahmen. Dies stellt spezifische Anforderungen an die Zellkulturmodelle. Viele Zelltypen sind durch die Exposition gegenüber Luft (z.B. Austrocknung) negativ beeinflusst und bleiben nur für ein paar Tage lebensfähig. Dies begrenzt die Expositionsbedingungen, die in diesen Modellen verwendet werden können: In der Regel werden relativ hohe Konzentrationen als Wolke (d. h. Tröpfchen mit Partikeln, die sich schnell absetzen) innerhalb kurzer Zeit angewendet. Solche experimentellen Bedingungen spiegeln keine realistische Langzeitexposition gegenüber niedrigen Partikelkonzentrationen wider. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde die Verwendung einer menschlichen Bronchialepithelzelllinie untersucht. Diese Zellen können unter ALI-Bedingungen für mehrere Wochen kultiviert werden, wobei eine gesunde Morphologie und eine stabile Monoschicht mit engen Knoten beibehalten werden. Darüber hinaus eignet sich dieses Bronchialmodell zur Prüfung der Auswirkungen wiederholter Expositionen bei niedrigen, realistischen Konzentrationen von Partikeln in der Luft mit einem ALI-Expositionssystem. Dieses System verwendet einen kontinuierlichen Luftstrom im Gegensatz zu anderen ALI-Expositionssystemen, die eine einzige Vernebelung verwenden, die eine Wolke erzeugt. Daher eignet sich das kontinuierliche Durchflusssystem für wiederholte und längere Exposition gegenüber Luftpartikeln, während die Partikeleigenschaften, die Expositionskonzentration und die gelieferte Dosis kontinuierlich überwacht werden. Zusammengenommen ist dieses Bronchialmodell in Kombination mit dem kontinuierlichen Strömungsexpositionssystem in der Lage, realistische, wiederholte Expositionsbedingungen zu imitieren, die für Toxizitätstests verwendet werden können.
Die Lunge ist anfällig für inhalative Exposition gegenüber Luftpartikeln. Um die potenzielle Toxizität von Partikeln in der Luft zu bewerten, wurden Fortschritte bei der Entwicklung von Expositionssystemen für luft-flüssige Schnittstelle (ALI)1,2,3,4,5erzielt. ALI-Expositionssysteme ermöglichen relevantere und realistischere Expositionsmodelle im Vergleich zur herkömmlichen Unterwasserexposition über Kulturmedium, das die Eigenschaften und Kinetik der Partikel verändert6. Die ALI-Expositionssysteme stellen spezifische Anforderungen an die Zellkulturmodelle, da den Modellen kulturmittel und damit Nährstoffe auf der apikalen Seite fehlen. Viele Zellmodelle werden durch kultivierte und exponierte Luft (z.B. Austrocknung) negativ beeinflusst und bleiben nur für ein paar Tage lebensfähig. Dies begrenzt die Expositionsbedingungen, die in diesen Modellen verwendet werden können: In der Regel werden relativ hohe Konzentrationen innerhalb kurzer Zeit als Wolke (d. h. Tröpfchen mit Partikeln, die sich schnell absetzen) angewendet. Solche experimentellen Bedingungen spiegeln keine realistische Langzeitexposition gegenüber niedrigen Partikelkonzentrationen wider; somit kann die Relevanz der Ergebnisse in Frage gestellt werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde das Kultur- und Expositionsprotokoll für ein Bronchialmodell, bestehend aus der menschlichen Bronchialepithelzelllinie Calu-37, optimiert.
Die meisten In-vitro-Lungenmodelle, die für die ALI-Exposition verwendet werden, enthalten andere Zelllinien wie A549, BEAS-2B und 16HBE14o- (16HBE) oder Primärzellen als Basis8. Diese Zelllinien haben den Nachteil, dass sie nur für ein paar Tage lebensfähig bleiben, wenn sie an der ALI kultiviert werden. Darüber hinaus überwachsen einige dieser Zelllinien, wenn sie länger als 5 Tage kultiviert werden. Schließlich vermissen A549-Zellen funktionelle enge Kreuzungen und können daher keine enge Barriere bilden, die benötigt wird, um die Lunge9,10nachzuahmen. Primäre Epithelzellen könnten eine gute Option für eine ALI-Exposition sein, da sie wochenlang an der ALI kultiviert werden können. Primärzellen unterscheiden sich jedoch von Charge zu Charge, sind schwieriger zu pflegen und im Vergleich zu Zelllinien teurer, wodurch sie weniger für Toxizitätstests und -screenings geeignet sind. Beim Vergleich verschiedener menschlicher Bronchialepithelzelllinien (16HBE, Calu-3, H292 und BEAS-2B) erfüllen nur die Calu-3-Zellen alle Kriterien für eine realistische, wiederholte ALI-Exposition: Sie bleiben wochenlang lebensfähig, während sie an der ALI kultiviert werden, bieten eine hohe Barriereintegrität, wachsen nicht und sind leicht zu kultiessen und zu pflegen. Calu-3-Zellen stammen aus einem Adenokarzinom und sind in der Lage, Schleim zu produzieren11,12. Es gibt Unstimmigkeiten, ob die Zellen Zilien11,13entwickeln können. Calu-3-Zellen sind auch ein geeignetes Modell, um Respiratorien (RSV) zu untersuchen, die Zilien-Atemwegsepithelzellen14infizieren.
Neben dem Zellmodell wird ein automatisiertes Expositionssystem (AES) für die luft-flüssige Exposition gegenüber Aerosolen15,16eingesetzt. Die AES hat den Vorteil, dass sie einen kontinuierlichen Luftstrom nutzt, um das Zellmodell Aerosolen auszusetzen. Dies steht im Gegensatz zu anderen luft-flüssigen Expositionssystemen, die in der Regel innerhalb kurzer Zeit relativ hohe Konzentrationen als Wolke verwenden (d.h. Tröpfchen, die Partikel enthalten, die sich schnell absetzen)17,18,19. Diese Cloud-Systeme spiegeln keine realistische Langzeitexposition gegenüber niedrigen Partikelkonzentrationen wider. Durch die Anwendung eines kontinuierlichen Luftstroms mit dem AES kann das Zellmodell über einen längeren Zeitraum einer geringen Konzentration von Partikeln ausgesetzt werden, was realistische Expositionsbedingungen widerspiegelt. Ein weiterer Vorteil gegenüber Cloud-Systemen besteht darin, dass die AES die Möglichkeit hat, Partikelcharakterisierungsinstrumente zu verbinden, die eine Messung der Partikelgröße, der Zahlenkonzentration und der Masse im Zeitverlauf ermöglichen. Eine Einschränkung des AES besteht darin, dass er relativ hohe Luftströme zwischen 10 ml/min und 100 ml/min verbraucht.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultivierung menschlicher Bronchialepithelzellen unter ALI und zur Exposition dieses Bronchialmodells gegenüber Aerosolen oder Gasen. Der Vorteil der Verwendung von Calu-3-Zellen besteht darin, dass sie enge Knoten bilden, eine Monoschicht bleiben, dem Luftstrom standhalten und im Gegensatz zu vielen anderen Zelltypen (z. B. 16HBE, H292 und BEAS-2B) wochenlang an der ALI kultiviert werden können. Der Einsatz der vitroCELL® automatisierten Expositionsstation (AES) hat den Vorteil, dass die Zellen unter realistischen und relevanten Bedingungen exponiert werden können, da niedrige Konzentrationen mit einem kontinuierlichen Luftstrom angewendet werden können.
Kontinuierliche Strömungssysteme, wie z. B. das AES, haben Vorteile gegenüber der Verwendung von Cloud-Systemen3,32, die eine einzige Vernebelung einer Suspension verwenden. Der kontinuierliche Durchfluss ist realistischer und viele Variablen wie Durchfluss, Luftfeuchtigkeit und Temperatur werden gesteuert. Darüber hinaus kann die Ablagerung durch ein elektrisches Feld verbessert werden. Schließlich werden Aerosoleigenschaften wie Größe, Zahlenkonzentration und Masse online überwacht. Ein Nachteil ist, dass kontinuierliche Durchflusssysteme im Vergleich zu Cloud-Systemen komplexer sind. Daher ist es wichtig, vorbereitende Experimente durchzuführen, die sich auf die Partikeleigenschaften des Aerosols und die gelieferte Dosis auf dem Einsatz konzentrieren. Die Anfangskonzentration der Partikel und die AES-Einstellungen können dann angepasst werden, um die gewünschte Dosis auf den Zellen33zu erreichen. Je nach Art der getesteten Partikel kann sich die Aerosolgenerierungsmethode unterscheiden. Die Verwendung der elektrostatischen Abscheidung hängt vom Partikeltyp ab und eignet sich am besten für metallische Partikel. Bei Partikeln mit einer positiven Oberflächenladung sollte ein negatives elektrostatisches Feld aufgebracht werden und umgekehrt.
Die Auswahl der Expositionskonzentrationen kann für jedes Luft-Flüssig-Expositionsexperiment schwierig sein. Bei den DQ12-Expositionen bestand das Ziel darin, nach 3 Wochen Exposition, 5 Tagen pro Woche und 4 h pro Tag eine kumulative Gesamtdosis von 1 g/cm2 zu erreichen. Diese Dosis ist ähnlich wie Dosen, die eine Wirkung in vivoinduziert 21,25,27,32,33. Bei der Durchführung der Expositionen gab es einige Unterschiede zwischen den verschiedenen Expositionstagen. Obwohl die tatsächlich abgelagerte Dosis von 1,6 g/cm2 höher ist als die angestrebte Dosis von 1 g/cm2, könnte die Dosis zu niedrig gewesen sein, um Effekte im Calu-3-Modell zu beobachten. Zwischen der Exposition in sauberer Luft und der DQ12-Exposition wurden nur geringfügige Unterschiede in TEER, Lebensfähigkeit und Zytokin-Antwort beobachtet, und diese Unterschiede waren statistisch nicht signifikant. Eine Erklärung für die Beobachtung, dass die DQ12-Exposition für 3 Wochen keine signifikanten Auswirkungen in den Calu-3-Zellen induzierte, ist, dass Makrophagen aus dem Calu-3-Modell fehlten. Möglicherweise produzieren Makrophagen nach DQ12-Aufnahme proinflammatorische Zytokine, die Calu-3-Zellen beeinflussen können. Eine weitere Erklärung ist, dass die DQ12-Charge, die für die Experimente verwendet wurde, nicht so reaktiv war wie erwartet. Bei der Verwendung von LPS als Positivkontrollsubstanz zeigt Calu-3 eine Reaktion, gemessen an einer Erhöhung der LDH-Freisetzung und einer Erhöhung der TNF-α-Freisetzung. Dies weist darauf hin, dass das Modell Toxizität erkennen kann.
Das Calu-3-Zellmodell hat viele Vorteile, wie im Ergebnisbereich erläutert. Darüber hinaus können die Calu-3-Zellen, wenn sie länger am ALI kultiviert werden, Zilien/Zilien-ähnliche Strukturen13 anbauen und Schleim produzieren11,12,13. Trotz dieser Vorteile hat das Modell Einschränkungen in Bezug auf seine physiologische Relevanz. Die Calu-3-Zelllinien stammen von einem Adenokarzinom, während 16HBE und BEAS-2B aus gesundem Gewebe stammen. Leider sind die beiden letztgenannten nicht für eine wiederholte ALI-Exposition geeignet, da sie im Laufe der Zeit keine stabile Monoschicht bleiben. Eine weitere Einschränkung des Calu-3-Modells besteht darin, dass es nur einen einzelnen Zelltyp darstellt. In der menschlichen Lunge sind mehrere Zelltypen vorhanden, die unterschiedlich auf die Exposition reagieren und darauf reagieren. Eingeatmete Partikel lagern sich je nach aerodynamischer Größe in verschiedenen Regionen der Lunge ab. Hier treten die Teilchen mit der Epithelzellbarriere in Berührung, wie sie vom Calu-3-Modell nachgeahmt wird. In der menschlichen Lunge werden Alveolader Makrophagen zu den Partikeln angezogen, verschlingen sie und befreien sie aus der Lunge. Makrophagen spielen auch eine wesentliche Rolle bei der Entzündungsreaktion auf Partikelexposition. Daher werden Anstrengungen unternommen, um das Calu-3-Modell durch hinzufügenprimäre Makrophagen zu erweitern, um die Lungenbarriere genauer nachzuahmen. Der Nachteil der Makrophagen ist, dass sie nur für etwa 7 Tage lebensfähig bleiben, wenn sie auf Calu-3-Zellen an der ALI kultiviert werden. Daher sollten Makrophagen wöchentlich neu hinzugefügt werden, um das aktuelle Calu-3-Modell in ein Cokulturmodell umzuwandeln. Die Optimierung des Cokulturprotokolls läuft derzeit.
Aus diesen Gründen ist das Bronchialmodell Calu-3 ein geeignetes Modell für die wiederholte Exposition gegenüber Aerosolen von teilweise löslichen Stoffen wie Chemikalien aus Zigarettenrauch und LPS. Diese löslichen Substanzen induzieren signifikante Erhöhungen der Zytokin-Antworten in den Calu-3-Zellen. Für die Prüfung unlöslicher Partikel wie Dieselabgase und DQ12 ist ein Cokulturmodell erforderlich, da die Makrophagen eine entscheidende Rolle bei der Induktion von Effekten durch Partikelexposition spielen.
Für die beschriebenen Expositionen wurden Einschubmembranen mit 3,0 m Poren verwendet. Der Hauptgrund für die Wahl dieser Art von Einsatz ist, dass es möglich ist, die Translokation von Nanomaterialien zu testen. Bei kleineren Porengrößen von 0,4 m können Partikelagglomerate die Insert-Membran nicht kreuzen. Der Nachteil der Verwendung einer großen Porengröße ist, dass die Zellen eine längere Zeit benötigen, um konfluent zu wachsen, und dass es schwieriger ist, die Morphologie der Zellen mithilfe der Lichtmikroskopie zu visualisieren. Um zu überprüfen, ob die Zellen eine konfluente Monoschicht bilden, sollte der TEER >1.000 Ω x cm2 betragen, bevor eine Exposition gestartet wird.
Zusammengenommen ist das hier vorgestellte Bronchialmodell Calu-3 für die wiederholte Exposition gegenüber Aerosolen geeignet, mindestens bis zu 3 Wochen. Das Modell kann es widerstehen, kultiviert und über einen kontinuierlichen Luftstrom exponiert zu werden und ist in der Lage, Toxizität für das Bronchialepithel zu erkennen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird vom EU-Projekt PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) und dem niederländischen Ministerium für Gesundheit, Wohlfahrt und Sport (Projekt V/050012) finanziert. Wir danken Dr. Yvonne Staal und Dr. Jan van Benthem für die kritische Prüfung des Manuskripts.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |