설명된 세포 배양 및 생체 내 기관지 모델의 세포 배양 및 노출 방법은 독성 검사를 위한 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 것이다.
공중 입자의 독성 테스트를 위해, 공기 액체 인터페이스 (ALI) 노출 시스템은 현실적인 노출 조건을 모방하기 위해 시험관 내 테스트를 위해 개발되었습니다. 이것은 세포 배양 모형에 특정 한 요구를 둡시합니다. 많은 세포 모형은 공기에 노출에 의해 부정적인 영향을 받습니다 (예를 들면, 건조) 단지 며칠 동안 유효합니다. 이렇게 하면 이러한 모델에서 사용할 수 있는 노출 조건을 제한합니다: 일반적으로 상대적으로 높은 농도는 짧은 기간 내에 클라우드(즉, 입자를 포함하는 액적)로 적용됩니다. 이러한 실험 조건은 입자의 낮은 농도에 현실적인 장기 노출을 반영하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 인간 기관지 상피 세포주 사용, Calu-3조사되었다. 이 세포는 건강한 형태와 단단한 접합을 가진 안정된 단층을 유지하면서 몇 주 동안 ALI 조건에서 배양될 수 있습니다. 또한, 본 기관지 모델은 ALI 노출 시스템을 사용하여 공기 중 입자의 낮고 사실적인 농도에 반복적으로 노출되는 효과를 테스트하는 데 적합합니다. 이 시스템은 클라우드를 생성하는 단일 분무기를 사용하는 다른 ALI 노출 시스템과 달리 연속 기류를 사용합니다. 따라서, 연속 유동 시스템은 입자 특성, 노출 농도 및 전달 용량을 지속적으로 모니터링하면서 공기 중 입자에 반복적이고 장기간 노출에 적합합니다. 이 기관지 모델은 연속 유동 노출 시스템과 함께 독성 테스트에 사용할 수 있는 사실적이고 반복된 흡입 노출 조건을 모방할 수 있습니다.
폐는 공기 중 입자에 흡입 노출에 취약합니다. 공기 중 입자의 잠재적 독성을 평가하기 위해 공기 액체 인터페이스(ALI) 노출 시스템1,2,3,4,5를개발하기 위한 진전이 이루어졌습니다. ALI 노출 시스템은 입자6의특성과 운동성을 변화시키는 배양 매체를 통한 기존의 침수 된 노출에 비해 보다 관련성이 있고 사실적인 노출 모델을 허용합니다. ALI 노출 시스템은 모델이 배양 배지가 부족하고 따라서 액면에 영양이 부족하기 때문에 세포 배양 모델에 특정 요구를 배치합니다. 많은 세포 모델은 공기 중(예: 건조)에서 배양되고 노출됨으로써 부정적인 영향을 받고 며칠 동안만 실행 가능합니다. 이것은 이러한 모델에서 사용할 수 있는 노출 조건을 제한합니다: 일반적으로 상대적으로 높은 농도는 구름으로 짧은 기간 내에 적용됩니다(즉, 입자를 포함하는 방울, 즉, 빠르게 정착하는 물방울). 이러한 실험 조건은 입자의 낮은 농도에 현실적인 장기 노출을 반영하지 않습니다; 따라서 결과의 관련성에 의문을 제기할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 인간 기관지 상피 세포주 Calu-37로 구성된 기관지 모델에 대한 배양 및 노출 프로토콜이 최적화되었다.
ALI 노출에 사용되는 대부분의 체외폐 모델은 A549, BEAS-2B 및 16HBE14o-(16HBE) 또는 1차 세포와 같은 다른 세포주를 기초8로함유하고 있다. 이러한 세포주는 ALI에서 배양할 때 며칠 동안만 실행 가능한 상태로 남아 있다는 단점이 있습니다. 또한, 이러한 세포주 중 일부는 5일 이상 동안 배양될 때 과도하게 증가한다. 마지막으로, A549 세포는 기능적 단단한 접합을 놓치므로 폐9,10을모방하는 데 필요한 단단한 장벽을 형성할 수 없습니다. 1 차상 피 세포는 몇 주 동안 ALI에서 배양 될 수 있기 때문에 ALI 노출에 대한 좋은 옵션이 될 수 있습니다. 그러나, 1 차 적인 세포는 배치마다 다르고, 유지 관리가 더 어렵고, 세포주에 비해 더 비싸므로 독성 검사 및 스크리닝에 덜 적합합니다. 다른 인간 기관지 상피 세포주 (16HBE, Calu-3, H292 및 BEAS-2B)를 비교할 때, 칼루-3 세포만이 현실적이고 반복된 ALI 노출에 필요한 모든 기준을 충족합니다: 그들은 ALI에서 배양하는 동안 몇 주 동안 실행 가능한 상태를 유지하고, 높은 장벽 무결성을 제공하고, 과도하게 성장하지 않으며, 배양과 유지가 용이합니다. Calu-3 세포는 선암에서 유래하고점액(11,12)을생성할 수 있다. 세포가섬모(11,13)를개발할 수 있는지에 대한 불일치가 있다. 칼루-3 세포는 또한 섬모기도 상피세포(14)를감염시키는 호흡기 싱크성 바이러스(RSV) 감염을 연구하기에 적합한 모델이다.
셀 모델 외에도,에어로졸(15,16)에공기 액체 노출에 자동 노출 시스템(AES)이 사용된다. AES는 연속 기류를 사용하여 세포 모델을 에어로졸에 노출시키는 장점이 있습니다. 이는 일반적으로 구름(즉, 빠르게 정착하는 입자를 포함하는 액적)으로서 단기간 내에 상대적으로 높은 농도를 사용하는 다른 공기-액체 노출 시스템과 는 대조적이다)17,18,19. 이러한 클라우드 시스템은 입자의 낮은 농도에 대한 현실적인 장기 노출을 반영하지 않습니다. AES를 사용하여 연속 기류를 적용함으로써, 셀 모델은 사실적인 노출 조건을 반영하여 더 긴 기간 동안 입자의 낮은 농도에 노출될 수 있다. 클라우드 시스템보다 또 다른 장점은 AES가 파티클 특성화 계측기를 연결하여 시간이 지남에 따라 입자 크기, 수 농도 및 질량을 측정할 수 있다는 것입니다. AES의 제한은 10mL/min과 100mL/분 사이의 비교적 높은 공기 흐름을 사용한다는 것입니다.
이 논문은 ALI 의 밑에 인간 기관지 상피 세포를 배양하고 에어로졸 또는 가스에 이 기관지 모형을 드러내기 위한 방법을 설명합니다. Calu-3 셀을 사용하는 장점은 단단한 접합을 형성하고, 단층으로 남아, 공기 흐름을 견딜 수 있으며, 다른 많은 세포 유형(예를 들어, 16HBE, H292 및 BEAS-2B)과 달리 ALI에서 몇 주 동안 배양될 수 있다는 것입니다. VITROCELL® 자동 노출 스테이션(AES)을 사용하면 연속기류를 이용하여 낮은 농도를 적용할 수 있기 때문에 실적이고 관련성 있는 조건하에서 세포가 노출될 수 있다는 장점이 있다.
AES와 같은 지속적인 유동 시스템은 서스펜션의 단일 분기를 사용하는 클라우드 시스템3,32를사용하는 것과 비교하여 장점이 있습니다. 연속 흐름은 더 사실적이며 유량, 습도 및 온도와 같은 많은 변수가 제어됩니다. 또한, 기착은 전기장을 사용하여 강화될 수 있다. 마지막으로, 크기, 수 농도 및 질량과 같은 에어로졸 특성을 온라인으로 모니터링합니다. 단점은 클라우드 시스템에 비해 지속적인 흐름 시스템이 더 복잡하다는 것입니다. 따라서 에어로졸의 입자 특성과 인서트상전달용량에 초점을 맞춘 예비 실험을 실행하는 것이 중요하다. 입자 및 AES 설정의 초기 시작 농도는세포(33)에서원하는 용량을 달성하기 위해 조절될 수 있다. 테스트중인 입자의 종류에 따라 에어로졸 생성 방법이 다를 수 있습니다. 정전기 증착의 사용은 입자 유형에 따라 다르며 금속 입자에 가장 적합합니다. 양수 표면 충전이 있는 입자의 경우 음극전지장을 적용해야 하며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
노출 농도의 선택은 공기 액체 노출 실험에 어려울 수 있습니다. DQ12 노출의 경우 3주 노출 후 1 μg/cm2의 총 누적 투여량을 달성하는 것이 목표였으며, 주 5일, 하루 4시간 입니다. 이 투여량은 생체 내 효과를 유도한 투여량과유사하며, 21,25,27,32,33. 노출을 수행할 때 노출일 사이에 약간의 차이가 있었습니다. 실제 증착 용량은 1.6 μg/cm2가 목표였던 1 μg/cm2보다 높지만, 용량이 너무 낮아 Calu-3 모델의 효과를 관찰할 수 없을 수 있습니다. TEER, 생존가능성 및 사이토카인 반응의 사소한 차이만 깨끗한 공기 노출과 DQ12 노출 사이에 관찰되었으며, 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 칼루-3 세포에서 DQ12 노출이 3주 동안 유의한 효과를 유발하지 않았다는 관측에 대한 설명은 대식세포가 Calu-3 모델에서 부족했다는 점이다. 아마도, DQ12 섭취 대식세포 후 Calu-3 세포에 영향을 미칠 수 있는 염증 성 사이토카인을 생성. 또 다른 설명은 실험에 사용된 DQ12 배치가 예상대로 반응적이지 않다는 것입니다. LPS를 양성 제어 물질로 사용하는 경우, Calu-3은 LDH 방출의 증가와 TNF-α 방출의 증가로 측정된 반응을 보여줍니다. 이는 모델이 독성을 감지할 수 있음을 나타냅니다.
Calu-3 셀 모델은 결과 섹션에서 설명한 바와 같이 많은 장점이 있습니다. 더욱이, ALI에서 더 긴 시간 동안 배양될 때, Calu-3 세포는 섬모/섬모와 같은구조물(13)을 성장시키고점액(11,12,13)을생성할 수 있다. 이러한 장점에도 불구 하 고, 모델은 생리 적 관련성에 관한 제한이 있다. Calu-3 세포주 선암에서 유래, 반면 16HBE와 BEAS-2B는 건강한 조직에서 유래합니다. 불행히도, 후자의 두 가지는 시간이 지남에 따라 안정적인 단층으로 남아 있지 않기 때문에 반복된 ALI 노출에 적합하지 않습니다. Calu-3 모델의 또 다른 제한사항은 단일 셀 유형만 나타낸다는 것입니다. 인간 폐에서는 노출에 다르게 상호 작용하고 반응하는 다중 세포 모형이 존재합니다. 흡입된 입자는 공기역학적 크기에 따라 폐의 다른 영역에 보관됩니다. 이것은 입자가 Calu-3 모델에 의해 모방된 바와 같이 상피 세포 장벽에 접촉하는 곳입니다. 인간의 폐에서 폐포 대식세포는 입자에 끌리고, 삼키고, 폐에서 제거합니다. 대식세포는 또한 입자 노출에 대한 염증 반응에 필수적인 역할을 합니다. 따라서 폐 장벽을 보다 밀접하게 모방하기 위해 1차 대식세포를 추가하여 Calu-3 모델을 확장하려는 노력이 이루어지고 있다. 대식세포의 단점은 ALI에서 Calu-3 세포 위에 배양될 때 약 7일 동안만 실행 가능한 상태로 남아 있다는 것입니다. 따라서 현재 Calu-3 모델을 공동 문화 모델로 변환하려면 매주 대식대를 다시 추가해야 합니다. 동문화 프로토콜의 최적화는 현재 진행 중입니다.
상기를 감안할 때, Calu-3 기관지 모델은 담배 연기 및 LPS에서 화학 물질과 같은 부분적으로 용해성 물질의 에어로졸에 반복적으로 노출하기 위한 적합한 모델이다. 이러한 수용성 물질은 Calu-3 세포에서 사이토카인 반응에 있는 유의한 증가를 유도합니다. 디젤 배기 및 DQ12와 같은 불용성 입자를 테스트하기 위해서는 대식세포가 입자 노출에 의한 효과 유도에 중요한 역할을 하기 때문에 공동 문화 모델이 필요합니다.
설명된 노출을 위해, 3.0 μm 모공을 가진 삽입 막을 사용하였다. 이러한 유형의 인서트를 선택하는 주된 이유는 나노 물질의 전역을 테스트할 수 있기 때문입니다. 0.4 μm 모공 크기를 더 작게 사용하는 경우 입자 응집체는 삽입 막을 교차할 수 없습니다. 큰 모공 크기를 사용하는 단점은 세포가 수렴성장하는 데 시간이 길어지고 가벼운 현미경을 사용하여 세포의 형태를 시각화하기가 더 어렵다는 것입니다. 세포가 컨플루언티지 단층층을 형성하는지 확인하려면, TEER는 노출을 시작하기 전에 >1,000 Ω x cm2여야 합니다.
함께 촬영, 여기에 제시 된 Calu-3 기관지 모델은 에어로졸에 반복 노출에 사용하기에 적합, 적어도 3 주. 이 모델은 연속 기류를 통해 배양되고 노출되는 것을 견딜 수 있으며 기관지 상피에 대한 독성을 감지 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 EU 프로젝트 순찰대 (현실적인 나노 물질 위험 무분별증을위한 생리학적으로 고정 된 도구)와 네덜란드 보건 복지부 및 스포츠 부 (프로젝트 V / 050012)에 의해 지원됩니다. 이본 스탈 박사와 얀 반 벤심 박사에게 원고를 비판적으로 검토해 주신 것에 감사드립니다.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |