Beskrevet er cellekulturen og eksponeringsmetoden til en in vitro bronkial modell for realistisk, gjentatt innåndingseksponering for partikler for toksisitetstesting.
For toksisitetstesting av luftbårne partikler er eksponeringssystemer for luftvæskegrensesnitt (ALI) utviklet for in vitro-tester for å etterligne realistiske eksponeringsforhold. Dette stiller spesifikke krav til cellekulturmodellene. Mange celletyper påvirkes negativt av eksponering for luft (f.eks. uttørking) og forblir bare levedyktige i noen dager. Dette begrenser eksponeringsforholdene som kan brukes i disse modellene: Vanligvis brukes relativt høye konsentrasjoner som en sky (det vil si dråper som inneholder partikler, som roer seg raskt) innen kort tid. Slike eksperimentelle forhold reflekterer ikke realistisk langsiktig eksponering for lave konsentrasjoner av partikler. For å overvinne disse begrensningene ble bruken av en menneskelig bronkial epitelcellelinje, Calu-3 undersøkt. Disse cellene kan dyrkes ved ALI-forhold i flere uker samtidig som de beholder en sunn morfologi og et stabilt monolag med trange veikryss. I tillegg er denne bronkialmodellen egnet for testing av effekten av gjentatt eksponering for lave, realistiske konsentrasjoner av luftbårne partikler ved hjelp av et ALI-eksponeringssystem. Dette systemet bruker en kontinuerlig luftstrøm i motsetning til andre ALI-eksponeringssystemer som bruker en enkelt forstøvning som produserer en sky. Det kontinuerlige strømningssystemet er derfor egnet for gjentatt og langvarig eksponering for luftbårne partikler mens det kontinuerlig overvåker partikkelegenskapene, eksponeringskonsentrasjonen og den leverte dosen. Samlet sett er denne bronkialmodellen, i kombinasjon med det kontinuerlige strømningseksponeringssystemet, i stand til å etterligne realistiske, gjentatte eksponeringsforhold som kan brukes til toksisitetstesting.
Lungene er sårbare for innåndingseksponering for luftbårne partikler. For å vurdere den potensielle toksisiteten av luftbårne partikler, er det gjort fremskritt for å utvikle luftvæskegrensesnitt (ALI)eksponeringssystemer 1,2,3,4,5. ALI eksponeringssystemer tillater mer relevante og realistiske eksponeringsmodeller sammenlignet med tradisjonell nedsenket eksponering via kulturmedium som endrer partiklenes egenskaper og kinetikk6. ALI-eksponeringssystemene stiller spesifikke krav til cellekulturmodellene, da modellene mangler kulturmedium og dermed næringsstoffer på den a apiske siden. Mange cellemodeller påvirkes negativt av å bli dyrket og eksponert i luften (f.eks. uttørking) og forblir levedyktige i noen dager. Dette begrenser eksponeringsforholdene som kan brukes i disse modellene: Vanligvis brukes relativt høye konsentrasjoner innen kort tid som sky (det vil si dråper som inneholder partikler, som roer seg raskt). Slike eksperimentelle forhold reflekterer ikke realistisk langsiktig eksponering for lave konsentrasjoner av partikler; Dermed kan relevansen av resultatene bli avhørt. For å overvinne disse begrensningene ble kultur- og eksponeringsprotokollen for en bronkial modell bestående av den menneskelige bronkial epitelcellelinjenCalu-3 7 optimalisert.
De fleste in vitro lungemodeller som brukes til ALI-eksponering inneholder andre cellelinjer som A549, BEAS-2B og 16HBE14o- (16HBE) eller primærceller som grunnlag8. Disse cellelinjene har ulempen at de forblir levedyktige i bare noen få dager når de dyrkes på ALI. I tillegg overvekst noen av disse cellelinjene når de dyrkes i en periode lenger enn 5 dager. Til slutt, A549 celler savner funksjonelle tette veikryss og kan derfor ikke danne en stram barriere som er nødvendig for å etterligne lungene9,10. Primære epitelceller kan være et godt alternativ for ALI eksponering som de kan dyrkes på ALI i flere uker. Primærceller varierer imidlertid fra batch til batch, er vanskeligere å vedlikeholde, og er dyrere sammenlignet med cellelinjer, noe som gjør dem mindre egnet for toksisitetstesting og screening. Når du sammenligner forskjellige humane bronkiale epitelcellelinjer (16HBE, Calu-3, H292 og BEAS-2B), oppfyller bare Calu-3-cellene alle kriteriene som trengs for realistisk, gjentatt ALI-eksponering: de forblir levedyktige i flere uker mens de dyrkes på ALI, gir en høy barriereintegritet, ikke overgrow, og er enkle å kultur og vedlikeholde. Calu-3 celler stammer fra et adenokarsinom og er i stand til å produsere slim11,12. Det er uoverensstemmelser om cellene kan utvikle flimmerhår11,13. Calu-3 celler er også en egnet modell for å studere respiratoriske syncytial virus (RSV) infeksjoner som infiserer ciliated luftveis epitelceller14.
Foruten cellemodellen brukes et automatisert eksponeringssystem (AES) til luftvæskeeksponering for aerosoler15,16. AES har fordelen at den bruker en kontinuerlig luftstrøm for å utsette cellemodellen for aerosoler. Dette er i motsetning til andre luftvæskeeksponeringssystemer som vanligvis bruker relativt høye konsentrasjoner innen kort tid som sky (det vil si dråper som inneholder partikler som roer seg raskt)17,18,19. Disse skysystemene reflekterer ikke realistisk langsiktig eksponering for lave konsentrasjoner av partikler. Ved å bruke en kontinuerlig luftstrøm ved hjelp av AES, kan cellemodellen bli utsatt for en lav konsentrasjon av partikler over en lengre tidsperiode, noe som gjenspeiler realistiske eksponeringsforhold. En annen fordel over skysystemer er at AES har muligheten til å koble partikkelkarakteriseringsinstrumenter, slik at måling av partikkelstørrelse, tallkonsentrasjon og masse over tid. En begrensning av AES er at den bruker relativt høye luftstrømmer mellom 10 ml / min og 100 ml / min.
Dette papiret beskriver en metode for å kultere menneskelige bronkial epitelceller under ALI og utsette denne bronkialmodellen for aerosoler eller gasser. Fordelen med å bruke Calu-3-celler er at de danner tette veikryss, forblir en monolayer, er i stand til å tåle luftstrømmen, og kan dyrkes i flere uker på ALI, i motsetning til mange andre celletyper (f.eks. 16HBE, H292 og BEAS-2B). Bruk av VITROCELL® automatisert eksponeringsstasjon (AES) har fordelen at cellene kan eksponeres under realistiske og relevante forhold, da lave konsentrasjoner kan brukes ved hjelp av en kontinuerlig luftstrøm.
Fortsatt strømningssystemer, som AES, har fordeler sammenlignet med å bruke skysystemer3,32, som bruker en enkelt forstøvning av en suspensjon. Den kontinuerlige strømmen er mer realistisk og mange variabler som strømningshastighet, fuktighet og temperatur styres. I tillegg kan avsetning forbedres ved hjelp av et elektrisk felt. Til slutt overvåkes aerosolegenskaper som størrelse, tallkonsentrasjon og masse på nettet. En ulempe er at fortsatt strømningssystemer er mer komplekse sammenlignet med skysystemer. Derfor er det viktig å kjøre forberedende eksperimenter som fokuserer på aerosolens partikkelegenskaper og den leverte dosen på innsatsen. Den første startkonsentrasjonen av partiklene og AES-innstillingene kan deretter justeres for å oppnå ønsket dose på cellene33. Avhengig av hvilken type partikler som testes, kan aerosolgenereringsmetoden variere. Bruk av elektrostatisk deponering avhenger av partikkeltypen og fungerer best for metalliske partikler. For partikler med positiv overflateladning bør et negativt elektrostatisk felt påføres og omvendt.
Valg av eksponeringskonsentrasjoner kan være vanskelig for ethvert luftvæskeeksponeringseksperiment. For DQ12-eksponeringene var målet å oppnå en total kumulativ dose på 1 μg/cm2 etter 3 ukers eksponering, 5 dager per uke, 4 timer per dag. Denne dosen ligner doser som induserte en effekt in vivo21,25,27,32,33. Når du utfører eksponeringene, var det en viss variasjon mellom ulike eksponeringsdager. Selv om den faktiske avsekomstdosen på 1,6 μg/cm2 er høyere enn 1 μg/cm2 som var rettet mot, kan dosen ha vært for lav til å observere effekter i Calu-3-modellen. Bare mindre forskjeller i TEER, levedyktighet og cytokinrespons ble observert mellom eksponeringen for ren luft og DQ12-eksponeringen, og disse forskjellene var ikke statistisk signifikante. En forklaring på observasjonen om at DQ12 eksponering i 3 uker ikke induserer signifikante effekter i Calu-3-cellene er at makrofager manglet fra Calu-3-modellen. Muligens, etter DQ12 opptak makrofager produsere proinflammatoriske cytokiner som kan påvirke Calu-3 celler. En annen forklaring er at DQ12-batchen som ble brukt for eksperimentene ikke var så reaktiv som forventet. Når du bruker LPS som et positivt kontrollstoff, viser Calu-3 en respons, målt ved en økning i LDH-frigjøring og en økning i TNF-α frigjøring. Dette indikerer at modellen kan oppdage toksisitet.
Calu-3 cellemodellen har mange fordeler, som omtalt i resultatdelen. Videre, når dyrket i lengre tid på ALI, kan Calu-3-cellene vokse flimmerhåre / cilia-lignendestrukturer 13 og produsere slim11,12,13. Til tross for disse fordelene har modellen begrensninger med hensyn til sin fysiologiske relevans. Calu-3 cellelinjene stammer fra et adenokarsinom, mens 16HBE og BEAS-2B stammer fra sunt vev. Dessverre er de to sistnevnte ikke egnet for gjentatt ALI-eksponering, da de ikke forblir et stabilt monolag over tid. En annen begrensning av Calu-3-modellen er at den bare representerer en enkelt celletype. I den menneskelige lunge er flere celletyper som samhandler og reagerer annerledes på eksponering, tilstede. Inhalerte partikler vil deponere i forskjellige områder av lungene avhengig av deres aerodynamiske størrelse. Det er her partiklene kontakter epitelcellebarrieren, som etterlignet av Calu-3-modellen. I den menneskelige lunge er alveolære makrofager tiltrukket av partiklene, sluke dem og fjerne dem fra lungene. Makrofager spiller også en viktig rolle i betennelsesresponsen mot partikkeleksponering. Derfor arbeides det med å utvide Calu-3-modellen ved å legge til primære makrofager for å etterligne lungebarrieren nærmere. Ulempen med makrofagene er at de forblir levedyktige bare i ca 7 dager når de dyrkes på toppen av Calu-3-celler ved ALI. Makrofager bør derfor leses ukentlig for å transformere den nåværende Calu-3-modellen til en kokulturmodell. Optimaliseringen av kokulturprotokollen pågår for tiden.
Gitt ovennevnte er Calu-3 bronkialmodellen en egnet modell for gjentatt eksponering for aerosoler av delvis løselige stoffer som kjemikalier fra sigarettrøyk og LPS. Disse løselige stoffene induserer signifikante økninger i cytokinresponser i Calu-3-cellene. For å teste uoppløselige partikler som dieseleksos og DQ12, er det nødvendig med en kokulturmodell, fordi makrofagene spiller en avgjørende rolle i induksjon av effekter ved partikkeleksponering.
For de beskrevne eksponeringene ble det brukt inn membraner med 3,0 μm porer. Hovedårsaken til å velge denne typen innsats er at det er mulig å teste translokasjonen av nanomaterialer. Ved bruk av mindre 0,4 μm porestørrelse, vil partikkel agglomerater ikke kunne krysse innsatsmembranen. Ulempen med å bruke en stor porestørrelse er at cellene trenger lengre tid til å vokse samløpet og at det er vanskeligere å visualisere cellenes morfologi ved hjelp av lett mikroskopi. Hvis du vil kontrollere at cellene danner et sammenføyd monolag, bør TEER være > 1000 Ω x cm2 før du starter en eksponering.
Samlet sett er Calu-3 bronkialmodellen som presenteres her, egnet til bruk for gjentatt eksponering for aerosoler, minst opptil 3 uker. Modellen tåler å bli dyrket og utsatt via en kontinuerlig luftstrøm og er i stand til å oppdage toksisitet for bronkial epitelet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er finansiert av EU-prosjektet PATROLS (Fysiologisk forankrede verktøy for realistisk nanomateriale fare aSessment) og det nederlandske Helse-, velferds- og sportsdepartementet (prosjekt V/050012). Vi vil takke Dr. Yvonne Staal og Dr. Jan van Benthem for kritisk gjennomgang av manuskriptet.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |