Описана клеточная культура и метод воздействия бронхов in vitro для реалистичного, повторного ингаляционного воздействия частиц для тестирования токсичности.
Для тестирования токсичности частиц, передающихся воздушно-капельным путем, были разработаны системы воздействия воздухо-жидкого интерфейса (ALI) для испытаний in vitro, чтобы имитировать реалистичные условия воздействия. Это ставит конкретные требования к моделям клеточной культуры. Многие типы клеток негативно влияют на воздействие воздуха (например, высыхание) и остаются жизнеспособными только в течение нескольких дней. Это ограничивает условия воздействия, которые могут быть использованы в этих моделях: обычно относительно высокие концентрации применяются в качестве облака (т.е. капель, содержащих частицы, которые быстро оседают) в течение короткого периода времени. Такие экспериментальные условия не отражают реалистичного долгосрочного воздействия низких концентраций частиц. Для преодоления этих ограничений было исследовано использование линии бронхиальных эпителиальных клеток человека. Эти клетки могут быть откоунены в условиях АЛИ в течение нескольких недель, сохраняя при этом здоровую морфологию и стабильный монослой с плотными соединениями. Кроме того, эта бронхиальная модель подходит для тестирования последствий повторного воздействия низких, реалистичных концентраций частиц в воздухе с помощью системы воздействия ALI. Эта система использует непрерывный поток воздуха в отличие от других систем воздействия ALI, которые используют одну небулизацию, производящую облако. Таким образом, система непрерывного потока подходит для повторного и длительного воздействия частиц, передающихся воздушно-капельным путем, при непрерывном мониторинге характеристик частиц, концентрации воздействия и доставленной дозы. В совокупности эта бронхиальная модель в сочетании с системой непрерывного воздействия потока способна имитировать реалистичные, повторяющиеся условия воздействия ингаляций, которые могут быть использованы для тестирования токсичности.
Легкие уязвимы для ингаляционного воздействия частиц, передающихся воздушно-капельным путем. Для оценки потенциальной токсичности частиц, передающихся воздушно-капельным путем, достигнут прогресс в разработке системвоздействия воздухо-жидкого интерфейса(АЛИ) 1,2,3,4,5. Системы воздействия ALI позволяют более релевантные и реалистичные модели экспозиции по сравнению с традиционным подводным воздействием через культурную среду, которая изменяет характеристики и кинетикичастиц 6. Системы воздействия ALI предусмотрят специфические требования к моделям клеточной культуры, так как модели не имеют культуры среды и, следовательно, питательных веществ на апической стороне. Многие модели клеток негативно влияют на то, что они культурны и подвергаются воздействию воздуха (например, высыхания) и остаются жизнеспособными только в течение нескольких дней. Это ограничивает условия воздействия, которые могут быть использованы в этих моделях: обычно относительно высокие концентрации применяются в течение короткого периода времени в качестве облака (т.е. капель, содержащих частицы, которые быстро оседают). Такие экспериментальные условия не отражают реалистичного долгосрочного воздействия низких концентраций частиц; таким образом, актуальность результатов может быть поставилась под сомнение. Для преодоления этих ограничений был оптимизирован протокол культуры и экспозиции для бронхиальной модели, состоящей из бронхиальной эпителиальной клеточной линии человекаCalu-3 7.
Большинство моделей легких in vitro, используемых для воздействия ALI, содержат другие клеточные линии, такие как A549, BEAS-2B и 16HBE14o- (16HBE) или первичные клетки в качестве основы8. Эти клеточные линии имеют недостаток, что они остаются жизнеспособными в течение всего нескольких дней, когда культурные на ALI. Кроме того, некоторые из этих клеточных линий разрастаются при культуре в течение более 5 дней. Наконец, A549 клетки пропустить функциональные жесткие соединения и поэтому не может сформировать жесткий барьер, который необходим дляимитации легких 9,10. Первичные эпителиальные клетки могут быть хорошим вариантом для воздействия АЛИ, поскольку они могут быть культурно на АЛИ в течение нескольких недель. Тем не менее, первичные клетки отличаются от партии к партии, являются более трудными в обслуживании, и являются более дорогостоящими по сравнению с клеточными линиями, что делает их менее пригодными для тестирования токсичности и скрининга. При сравнении различных линий бронхиальных эпителиальных клеток человека (16HBE, Calu-3, H292 и BEAS-2B), только клетки Calu-3 отвечают всем критериям, необходимым для реалистичного, повторного воздействия ALI: они остаются жизнеспособными в течение нескольких недель, пока они культурны в ALI, обеспечивают высокую барьерную целостность, не перерастают, и легко культуры и поддержания. Клетки Calu-3 происходят от аденокарциномы и способны производить слизь11,12. Есть несоответствия о том, клетки могут развиваться реснички11,13. Клетки Calu-3 также являются подходящей моделью для изучения респираторно-синцитиальных вирусных инфекций (РСВ), которые инфицируют цилиированные эпителиальные клеткидыхательных путей 14.
Помимо клеточной модели, автоматизированная система экспозиции (AES) используется для воздействия жидкости ввоздухе на аэрозоли 15,16. Преимущество AES заключается в том, что он использует непрерывный воздушный поток для воздействия модели клеток на аэрозоли. Это в отличие от других систем воздействия жидкости воздуха, которые обычно используют относительно высокие концентрации в течение короткого периода времени в качестве облака (т.е. капли, содержащие частицы, которые быстрооседают) 17,18,19. Эти облачные системы не отражают реалистичного долгосрочного воздействия низких концентраций частиц. Применяя непрерывный поток воздуха с помощью AES, модель клетки может подвергаться воздействию низкой концентрации частиц в течение более длительного периода времени, отражая реалистичные условия воздействия. Еще одним преимуществом облачных систем является то, что AES имеет возможность соединять инструменты характеристики частиц, что позволяет измерять размер частиц, концентрацию числа и массу с течением времени. Ограничение AES заключается в том, что он использует относительно высокие воздушные потоки между 10 мл/мин и 100 мл/мин.
В настоящем документе описывается метод культивирования человеческих бронхиальных эпителиальных клеток под АЛИ и подвергая эту бронхиатальную модель аэрозолям или газам. Преимущество использования клеток Calu-3 заключается в том, что они образуют плотные соединения, остаются монослойными, способны выдерживать поток воздуха и могут быть выдержат в течение нескольких недель в ALI, в отличие от многих других типов клеток (например, 16HBE, H292 и BEAS-2B). Использование автоматизированнойстанции ® vitroCELL (AES) имеет то преимущество, что клетки могут подвергаться воздействию в реалистичных и соответствующих условиях, поскольку низкие концентрации могут быть применены с помощью непрерывного воздушного потока.
Системы постоянного потока, такие как AES, имеют преимущества по сравнениюс использованием облачныхсистем 3,32, которые используют одну небулизацию подвески. Непрерывный поток является более реалистичным, и многие переменные, такие как скорость потока, влажность и температура контролируются. Кроме того, осаждение может быть усилено с помощью электрического поля. Наконец, аэрозольные характеристики, такие как размер, концентрация числа и масса, контролируются в Режиме онлайн. Недостатком является то, что системы постоянного потока являются более сложными по сравнению с облачными системами. Поэтому важно провести подготовительные эксперименты, которые сосредоточены на характеристиках частиц аэрозоля и доставленной дозе на вставке. Начальная начальная концентрация частиц и настройки AES могут быть скорректированы для достижения желаемой дозы на клетках33. В зависимости от типа тестируются частицы, метод генерации аэрозолей может отличаться. Использование электростатического осаждения зависит от типа частиц и лучше всего подходит для металлических частиц. Для частиц с положительным поверхностным зарядом следует применять отрицательное электростатическое поле и наоборот.
Выбор концентраций воздействия может быть трудным для любого эксперимента воздействия жидкости воздуха. Для воздействия D-12 цель состояла в том, чтобы достичь общей совокупной дозы 1мкг/см 2 после 3 недель воздействия, 5 дней в неделю, 4 ч в день. Эта доза похожа на дозы, которые индуцированных эффект в vivo21,25,27,32,33. При выполнении экспозиций, было некоторое различие между различными днями экспозиции. Хотя фактическая отложенная доза 1,6мкг/см 2 выше, чем доза 1 мкг/см2, которая была направлена на, доза, возможно, была слишком низкой, чтобы наблюдать эффекты в модели Calu-3. Между воздействием чистого воздуха и воздействием D’12 наблюдались лишь незначительные различия в TEER, жизнеспособности и реакции цитокинов, и эти различия не были статистически значимыми. Объяснением наблюдения о том, что воздействие D-12 в течение 3 недель не вызывали значительных эффектов в клетках Calu-3, является то, что макрофаги отсутствовали в модели Calu-3. Возможно, после поглощения ДЕС12 макрофаги производят провоспалительные цитокины, которые могут повлиять на клетки Calu-3. Другое объяснение заключается в том, что партия D-12, которая использовалась для экспериментов, была не так реактивна, как ожидалось. При использовании LPS в качестве положительного вещества контроля, Calu-3 показывает ответ, как измеряется увеличением выброса LDH и увеличением TNF-α выпуска. Это означает, что модель может обнаружить токсичность.
Модель ячейки Calu-3 имеет много преимуществ, о чем говорится в разделе результатов. Кроме того, при культуре в течение более длительного времени на АЛИ, Калу-3 клетки могут расти реснички / реснички,как структуры 13 и производить слизь 11,12,13. Несмотря на эти преимущества, модель имеет ограничения в отношении своей физиологической значимости. Клеточные линии Calu-3 происходят от аденокарциномы, в то время как 16HBE и BEAS-2B происходят из здоровых тканей. К сожалению, последние два не подходят для повторного воздействия ALI, поскольку они не остаются стабильным монослой с течением времени. Другим ограничением модели Calu-3 является то, что она представляет только один тип ячейки. В легких человека, несколько типов клеток, которые взаимодействуют и по-разному реагируют на воздействие присутствуют. Вдыхаемые частицы будут отложены в различных областях легких в зависимости от их аэродинамического размера. Здесь частицы соедут с эпителиальным клеточным барьером, как это имитирует модель Calu-3. В легких человека, альвеолярные макрофаги привлекают частицы, поглотить их, и очистить их от легких. Макрофаги также играют важную роль в реакции воспаления на воздействие частиц. Поэтому предпринимаются усилия по расширению модели Calu-3 путем добавления первичных макрофагов для более тесного имитации легочного барьера. Недостатком макрофагов является то, что они остаются жизнеспособными только в течение 7 дней, когда культурные на вершине Калу-3 клеток на АЛИ. Поэтому макрофаги следует читать еженедельно, чтобы превратить текущую модель Calu-3 в модель совместной культуры. В настоящее время проводится оптимизация протокола совместной культуры.
Учитывая вышесказанное, бронхиальная модель Calu-3 является подходящей моделью для повторного воздействия аэрозолей частично растворимых веществ, таких как химические вещества от сигаретного дыма и LPS. Эти растворимые вещества вызывают значительное увеличение реакций цитокинов в клетках Калу-3. Для тестирования нерастворимых частиц, таких как дизельные выхлопные газы и D-12, необходима модель кокультуры, поскольку макрофаги играют решающую роль в индукции эффектов при воздействии частиц.
Для описанных экспозиций использовались вставки мембран с порами 3,0 мкм. Основная причина выбора этого типа вставки заключается в том, что можно проверить транслокацию наноматериалов. При использовании меньшего размера поры 0,4 мкм, агломераты частиц не смогут пересечь мембрану вставки. Недостатком использования большого размера пор является то, что клеткам нужно больше времени, чтобы вырастить слияние и что труднее визуализировать морфологию клеток с помощью световой микроскопии. Чтобы проверить, что клетки действительно образуют слияние монослой, TEER должен быть 1000 фунтов стерлингов Ωсм 2 до начала экспозиции.
В совокупности представленная здесь бронхиальная модель Calu-3 подходит для повторного воздействия аэрозолей, по крайней мере, до 3 недель. Модель может выдерживать культуру и воздействие с помощью непрерывного воздушного потока и способна обнаруживать токсичность бронхового эпителия.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансируется ЕС-проект PATROLS (Физиологически якорные инструменты для реалистичных наноматериалов опасности aSsessment) и голландского министерства здравоохранения, социального обеспечения и спорта (проект V/050012). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Ивонн Стаал и д-ра Яна ван Бентема за критический обзор рукописи.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |