Descrito es el método de cultivo celular y exposición de un modelo bronquial in vitro para la exposición realista y repetida a partículas para pruebas de toxicidad.
Para pruebas de toxicidad de partículas en el aire, se han desarrollado sistemas de exposición a la interfaz aire-líquido (ALI) para pruebas in vitro con el fin de imitar condiciones de exposición realistas. Esto impone demandas específicas a los modelos de cultivo celular. Muchos tipos de células se ven afectados negativamente por la exposición al aire (por ejemplo, secado) y sólo permanecen viables durante unos días. Esto limita las condiciones de exposición que se pueden utilizar en estos modelos: por lo general, las concentraciones relativamente altas se aplican como una nube (es decir, gotas que contienen partículas, que se asientan rápidamente) en un corto período de tiempo. Estas condiciones experimentales no reflejan una exposición realista a largo plazo a bajas concentraciones de partículas. Para superar estas limitaciones se investigó el uso de una línea celular epitelial bronquial humana, Calu-3. Estas células se pueden cultivar en condiciones ali durante varias semanas mientras se conserva una morfología saludable y una monocapa estable con uniones estrechas. Además, este modelo bronquial es adecuado para probar los efectos de las exposiciones repetidas a concentraciones bajas y realistas de partículas en el aire utilizando un sistema de exposición ALI. Este sistema utiliza un flujo de aire continuo en contraste con otros sistemas de exposición a ALI que utilizan una sola nebulización que produce una nube. Por lo tanto, el sistema de flujo continuo es adecuado para la exposición repetida y prolongada a partículas en el aire mientras monitorea continuamente las características de las partículas, la concentración de exposición y la dosis administrada. En conjunto, este modelo bronquial, en combinación con el sistema de exposición continua al flujo, es capaz de imitar condiciones realistas y repetidas de exposición a la inhalación que se pueden utilizar para pruebas de toxicidad.
Los pulmones son vulnerables a la exposición a la inhalación a partículas en el aire. Para evaluar la toxicidad potencial de las partículas en el aire, se ha avanzado en el desarrollo de sistemas de exposición a la interfaz aire-líquido (ALI)1,2,3,4,5. Los sistemas de exposición ALI permiten modelos de exposición más relevantes y realistas en comparación con la exposición sumergida tradicional a través del medio de cultivo que altera las características y cinéticas de las partículas6. Los sistemas de exposición ali ponen demandas específicas en los modelos de cultivo celular, ya que los modelos carecen de medio de cultivo y por lo tanto nutrientes en el lado apical. Muchos modelos celulares se ven afectados negativamente por ser cultivados y expuestos al aire (por ejemplo, secarse) y sólo permanecen viables durante unos días. Esto limita las condiciones de exposición que se pueden utilizar en estos modelos: normalmente se aplican concentraciones relativamente altas en un corto período de tiempo como una nube (es decir, gotas que contienen partículas, que se asientan rápidamente). Estas condiciones experimentales no reflejan una exposición realista a largo plazo a bajas concentraciones de partículas; por lo tanto, la pertinencia de los resultados puede ser cuestionada. Para superar estas limitaciones, se optimizó el protocolo de cultivo y exposición para un modelo bronquial que consiste en la línea celular epitelial bronquial humana Calu-37.
La mayoría de los modelos pulmonares in vitro utilizados para la exposición a ALI contienen otras líneas celulares como A549, BEAS-2B y 16HBE14o- (16HBE) o células primarias como base8. Estas líneas celulares tienen la desventaja de que siguen siendo viables durante sólo unos días cuando se cultivan en el ALI. Además, algunas de estas líneas celulares se sobrecargan cuando se cultivan durante un período superior a 5 días. Por último, las células A549 pierden uniones estrechas funcionales y, por lo tanto, no pueden formar una barrera apretada que se necesita para imitar los pulmones9,10. Las células epiteliales primarias pueden ser una buena opción para la exposición a ALI, ya que pueden ser cultivadas en el ALI durante semanas. Sin embargo, las células primarias difieren de un lote a otro, son más difíciles de mantener y son más costosas en comparación con las líneas celulares, lo que las hace menos adecuadas para las pruebas de toxicidad y la detección. Al comparar diferentes líneas celulares epiteliales bronquiales humanas (16HBE, Calu-3, H292 y BEAS-2B), sólo las células Calu-3 cumplen todos los criterios necesarios para la exposición realista y repetida de ALI: siguen siendo viables durante semanas mientras se cultivan en el ALI, proporcionan una alta integridad de barrera, no superan y son fáciles de desarrollar y mantener. Las células Calu-3 se originan a partir de un adenocarcinoma y son capaces de producir moco11,12. Hay inconsistencias en cuanto a si las células pueden desarrollar cilio11,13. Las células Calu-3 también son un modelo adecuado para estudiar infecciones por el virus respiratorio sincitial (RSV) que infectan las células epiteliales de las vías respiratoriasciliadas 14.
Además del modelo celular, se utiliza un sistema automatizado de exposición (AES) para la exposición aire-líquido a aerosoles15,16. El AES tiene la ventaja de que utiliza un flujo de aire continuo para exponer el modelo celular a aerosoles. Esto contrasta con otros sistemas de exposición aire-líquido que suelen utilizar concentraciones relativamente altas en un corto período de tiempo como nube (es decir, gotas que contienen partículas que se asientan rápidamente)17,18,19. Estos sistemas en la nube no reflejan una exposición realista a largo plazo a bajas concentraciones de partículas. Al aplicar un flujo de aire continuo utilizando el AES, el modelo celular puede estar expuesto a una baja concentración de partículas durante un período de tiempo más largo, lo que refleja condiciones de exposición realistas. Otra ventaja sobre los sistemas en la nube es que el AES tiene la opción de conectar instrumentos de caracterización de partículas, lo que permite medir el tamaño de las partículas, la concentración numérica y la masa a lo largo del tiempo. Una limitación del AES es que utiliza flujos de aire relativamente altos entre 10 mL/min y 100 mL/min.
Este artículo describe un método para cultivar células epiteliales bronquiales humanas bajo ALI y exponer este modelo bronquial a aerosoles o gases. La ventaja de usar células Calu-3 es que forman uniones estrechas, siguen siendo una monocapa, son capaces de soportar el flujo de aire y se pueden cultivar durante semanas en el ALI, a diferencia de muchos otros tipos de células (por ejemplo, 16HBE, H292 y BEAS-2B). El uso de la estación de exposición automatizada (AES) vitrocell® tiene la ventaja de que las células pueden ser expuestas en condiciones realistas y relevantes, ya que se pueden aplicar bajas concentraciones utilizando un flujo de aire continuo.
Los sistemas de flujo continuo, como el AES, tienen ventajas en comparación con el uso de sistemas en la nube3,32, que utilizan una sola nebulización de una suspensión. El flujo continuo es más realista y muchas variables como el caudal, la humedad y la temperatura se controlan. Además, la deposición se puede mejorar utilizando un campo eléctrico. Por último, las características del aerosol como el tamaño, la concentración numérica y la masa se supervisan en línea. Una desventaja es que los sistemas de flujo continuos son más complejos en comparación con los sistemas en la nube. Por lo tanto, es importante llevar a cabo experimentos preparatorios que se centren en las características de las partículas del aerosol y la dosis administrada en la plaquita. La concentración inicial inicial de las partículas y los ajustes de AES se pueden ajustar para lograr la dosis deseada en las células33. Dependiendo del tipo de partículas que se prueben, el método de generación de aerosoles puede diferir. El uso de la deposición electrostática depende del tipo de partícula y funciona mejor para partículas metálicas. Para las partículas con una carga superficial positiva, se debe aplicar un campo electrostático negativo y viceversa.
La selección de las concentraciones de exposición puede ser difícil para cualquier experimento de exposición aire-líquido. Para las exposiciones DQ12, el objetivo era lograr una dosis acumulada total de 1 μg/cm2 después de 3 semanas de exposición, 5 días a la semana, 4 h por día. Esta dosis es similar a las dosis que indujeron un efecto in vivo21,25,27,32,33. Al realizar las exposiciones, hubo alguna variación entre los diferentes días de exposición. Aunque la dosis real depositada de 1,6 μg/cm2 es superior a la 1 μg/cm2 destinada, la dosis podría haber sido demasiado baja para observar los efectos en el modelo Calu-3. Sólo se observaron diferencias menores en el TEER, la viabilidad y la respuesta a las citoquinas entre la exposición al aire limpio y la exposición al DQ12, y estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Una explicación para la observación de que la exposición DQ12 durante 3 semanas no indujo efectos significativos en las células Calu-3 es que faltaban macrófagos del modelo Calu-3. Posiblemente, después de la absorción de DQ12 macrófagos producen citoquinas proinflamatorias que pueden afectar a las células calu-3. Otra explicación es que el lote DQ12 que se utilizó para los experimentos no fue tan reactivo como se esperaba. Cuando se utiliza LPS como sustancia de control positiva, Calu-3 muestra una respuesta, medida por un aumento en la liberación de LDH y un aumento en la liberación de TNF-α. Esto indica que el modelo puede detectar toxicidad.
El modelo de celda Calu-3 tiene muchas ventajas, como se describe en la sección de resultados. Además, cuando se cultiva durante más tiempo en el ALI, las células Calu-3 pueden cultivar estructuras cilia/cilia-like13 y producir moco11,12,13. A pesar de estas ventajas, el modelo tiene limitaciones con respecto a su relevancia fisiológica. Las líneas celulares Calu-3 se originan a partir de un adenocarcinoma, mientras que 16HBE y BEAS-2B se originan en tejido sano. Desafortunadamente, estos dos últimos no son adecuados para la exposición repetida de ALI, ya que no permanecen como un monocapa estable con el tiempo. Otra limitación del modelo Calu-3 es que solo representa un solo tipo de celda. En el pulmón humano, hay múltiples tipos de células que interactúan y responden de manera diferente a la exposición. Las partículas inhaladas se depositarán en diferentes regiones de los pulmones dependiendo de su tamaño aerodinámico. Aquí es donde las partículas entran en contacto con la barrera celular epitelial, como imita el modelo Calu-3. En el pulmón humano, los macrófagos alveolares se sienten atraídos por las partículas, las envuelven y las eliminan de los pulmones. Los macrófagos también desempeñan un papel esencial en la respuesta de inflamación a la exposición a partículas. Por lo tanto, se están haciendo esfuerzos para extender el modelo Calu-3 añadiendo macrófagos primarios para imitar la barrera pulmonar más de cerca. La desventaja de los macrófagos es que siguen siendo viables sólo durante unos 7 días cuando se cultivan encima de las células Calu-3 en el ALI. Por lo tanto, los macrófagos deben leerse semanalmente para transformar el actual modelo Calu-3 en un modelo de cocultura. La optimización del protocolo de cocultura está actualmente en curso.
Dado lo anterior, el modelo bronquial Calu-3 es un modelo adecuado para la exposición repetida a aerosoles de sustancias parcialmente solubles como productos químicos del humo del cigarrillo y LPS. Estas sustancias solubles inducen aumentos significativos en las respuestas de citoquinas en las células calu-3. Para probar partículas insolubles como el escape diésel y el DQ12, se necesita un modelo de cocultura, porque los macrófagos desempeñan un papel crucial en la inducción de efectos por exposición a partículas.
Para las exposiciones descritas, se utilizaron membranas de inserción con poros de 3,0 μm. La razón principal para elegir este tipo de plaquita es que es posible probar la translocación de nanomateriales. Cuando se utiliza un tamaño de poro más pequeño de 0,4 μm, los aglomerados de partículas no podrán cruzar la membrana de la plaquita. La desventaja de usar un tamaño de poro grande es que las células necesitan más tiempo para confluentes y que es más difícil visualizar la morfología de las células usando microscopía ligera. Para comprobar que las células forman una monocapa confluente, el TEER debe ser >1.000 Ω x cm2 antes de iniciar una exposición.
En conjunto, el modelo bronquial Calu-3 presentado aquí es adecuado para su uso para la exposición repetida a aerosoles, al menos hasta 3 semanas. El modelo puede soportar ser cultivado y expuesto a través de un flujo de aire continuo y es capaz de detectar toxicidad para el epitelio bronquial.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo está financiado por el proyecto de la UE PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) y el Ministerio holandés de Salud, Bienestar y Deporte (proyecto V/050012). Nos gustaría agradecer a la Dra. Yvonne Staal y al Dr. Jan van Benthem por revisar críticamente el manuscrito.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |