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Bioengineering

Évaluation de la structure et de la fonction ventriculaires gauches à l’aide de l’échocardiographie 3D

Published: October 28, 2020 doi: 10.3791/61212

Summary

Dans cet article, nous fournissons un protocole d’acquisition et d’analyse étape par étape pour l’évaluation volumétrique et l’analyse de suivi des mouchetures du ventricule gauche par échocardiographie 3D, en nous concentrant particulièrement sur les aspects pratiques qui maximisent la faisabilité de cette technique.

Abstract

La quantification tridimensionnelle (3D) du ventricule gauche (LV) apporte une valeur ajoutée significative en termes de précision diagnostique et de stratification précise des risques dans divers troubles cardiaques. Récemment, l’échocardiographie 3D est devenue disponible dans la pratique de la cardiologie de routine; cependant, l’acquisition d’images de haute qualité et l’analyse subséquente ont une courbe d’apprentissage abrupte. Le présent article vise à guider le lecteur à travers un protocole 3D détaillé en présentant des trucs et astuces et aussi en soulignant les pièges potentiels pour faciliter l’utilisation répandue mais techniquement saine de cette technique importante concernant le LV. Tout d’abord, nous montrons l’acquisition d’un ensemble de données 3D de haute qualité avec une résolution spatiale et temporelle optimale. Ensuite, nous présentons les étapes analytiques vers une quantification détaillée de la LV en utilisant l’un des logiciels intégrés les plus largement appliqués. Nous quantifierons les volumes LV, la sphéricité, la masse et aussi la fonction systolique en mesurant la fraction d’éjection et la déformation myocardique (déformation longitudinale et circonférentielle). Nous discuterons et fournirons des exemples cliniques sur les scénarios essentiels où la transition d’une approche échocardiographique conventionnelle à une quantification basée sur la 3D est fortement recommandée.

Introduction

L’évaluation de la morphologie et de la fonction ventriculaire gauche (LV) est l’objectif prédominant des investigations générales et encore plus spécifiques en cardiologie1. L’échocardiographie transthoracique (TTE) largement disponible et non invasive, qui peut fournir des quantités denses d’informations, est la méthode de choix pour une évaluation pratique, rapide et rentable.

La mesure de la masse BT, des volumes et de la fraction d’éjection subséquente contient une valeur diagnostique et pronostique significative2. Plus une mesure donnée est précise, plus sa valeur sera élevée. Une meilleure corrélation avec les valeurs dérivées de l’imagerie par résonance magnétique cardiaque (CMR) de référence est une chasse continue aux techniques échocardiographiques. En général, les lignes directrices de pratique clinique recommandent la méthode du biplan Simpson pour la mesure du volume BT et de la fraction d’éjection3. Cependant, le LV est une structure tridimensionnelle (3D) avec une forme souvent irrégulière, et par conséquent, plusieurs plans tomographiques échoueront sans aucun doute dans certains scénarios cliniques à délimiter avec précision la morphologie et la fonction du LV. Les progrès récents de la technologie matérielle et logicielle à ultrasons ont permis le développement de l’imagerie 3D en temps réel, qui révolutionne les protocoles échocardiographiques.

De plus, la nécessité d’une approche quantitative concernant les anomalies du mouvement de la paroi a entraîné l’augmentation de l’imagerie de déformation4. Les paramètres de déformation et de taux de déformation peuvent être calculés par suivi des mouchetures à l’aide d’images en niveaux de gris standard. L’échocardiographie 3D peut également surmonter plusieurs lacunes d’une évaluation bidimensionnelle de la déformation5. À partir d’un outil scientifique coûteux, l’échocardiographie 3D a commencé à devenir une technique puissante utilisée dans la pratique clinique quotidienne, et la quantification de la LV est certainement en première ligne de cette percée.

Le présent article vise à guider le lecteur à travers un protocole 3D détaillé en présentant des trucs et astuces et aussi en soulignant les pièges potentiels pour faciliter l’utilisation répandue mais techniquement saine de cette technique importante concernant le LV.

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Protocol

Ce protocole suit les directives du Comité régional et institutionnel d’éthique des sciences et de la recherche de l’Université Semmelweis. Le présent protocole s’applique à un fournisseur spécifique. Bien que certaines étapes restent valables indépendamment de l’appareil à ultrasons et du logiciel de post-traitement, des différences importantes peuvent exister si vous utilisez les solutions d’autres fournisseurs.

1. Exigences techniques

  1. Utilisez un appareil d’échocardiographie capable d’imagerie 3D.
  2. Connectez un transducteur à réseau phasé capable d’échocardiographie transthoracique 3D.
  3. Appliquez l’ECG à 3 dérivations intégré du système d’échographie pour permettre au système de synchroniser les enregistrements et les analyses avec le cycle cardiaque.

2. Acquisition des images échocardiographiques 3D

  1. Positionnez le patient dans la position de décubitus latéral gauche (patient allongé sur le côté gauche avec le bras gauche tendu au-dessus de la tête).
  2. Assurez-vous que le traçage ECG à l’écran est de bonne qualité.
    REMARQUE: Il s’agit d’une condition préalable au post-traitement car le logiciel détectera les différents points du cycle cardiaque en fonction du signal ECG.
  3. Dégeler l’image et commencer à examiner le patient avec le transducteur. Visualisez une vue apicale conventionnelle à quatre chambres.
  4. Optimisez la qualité de l’image en ajustant la largeur du secteur sur LV, en abaissant la profondeur pour tronquer l’oreillette gauche et en utilisant un léger surgain.
    REMARQUE: Assurez-vous que toute la surface endo- et épicardique LV est visible.
  5. Appuyez sur le bouton 4D pour passer en mode 3D.
    REMARQUE: En appuyant sur le bouton Multi-Slice... sur l’écran tactile, quatre options seront disponibles (5, 7, 8, 12 tranches) pour visualiser le jeu de données 3D à l’aide de coupes standard à axe court et long. Si nécessaire, le positionnement du transducteur peut être corrigé pour assurer l’inclusion de toute l’épaisseur de la paroi BT, du niveau de la valve apicale au niveau de la valve mitrale, dans l’ensemble de données 3D pyramidale. L’utilisation de 12 tranches (avec neuf vues réglables sur axe court) est recommandée.
  6. Acquérez des images 3D en mode Multi Beat ou Single Beat .
    1. Utilisez le mode Multi Beat pour obtenir une résolution spatiale et temporelle plus élevée, où l’ensemble de données sera reconstruit à partir de 2, 3, 4 ou 6 cycles cardiaques (cela peut être configuré à l’écran) - maintien de la respiration expiratoire du patient et positionnement stable du transducteur nécessaire pour minimiser les artefacts de couture.
      REMARQUE: L’acquisition d’un seul battement est de résolution spatiale et temporelle inférieure; cependant, la plupart des transducteurs modernes ont une meilleure qualité et, par conséquent, peuvent être utilisés pour acquérir des ensembles de données 3D appropriés sans reconstruction pour subir une analyse plus approfondie. En règle générale, des débits de volume supérieurs à 15 volumes par seconde sont recommandés pour une analyse plus approfondie.
    2. Lorsque le volume complet est reconstruit à partir des sous-volumes et que l’ensemble du LV est visible, figez l’image. À l’aide des boutons Cycle Select et Number of Cycles , sélectionnez le ou les cycles cardiaques acquis optimaux et appuyez sur Image Store.
      REMARQUE : Les artefacts d’assemblage sont des sous-volumes désalignés spatialement ou temporairement les uns à côté des autres. Les ensembles de données présentant une perte importante de murs BT ou des artefacts de couture ne conviennent généralement pas à une analyse plus approfondie. La qualité du jeu de données 3D déjà acquis peut être revérifiée à l’aide du mode Multi-Slice.

3. Post-traitement pour quantifier la morphologie et la fonction LV

  1. Sélectionnez un jeu de données 3D approprié pour une analyse plus approfondie.
    REMARQUE: Cette partie du protocole nécessite les images 3D de bonne qualité précédemment acquises et enregistrées et peut être effectuée sur l’appareil à ultrasons et un poste de travail séparé.
  2. Cliquez sur Mesurer | Volume, puis sélectionnez 4D Auto LVQ.
  3. Sur le quadruple écran (trois vues apicales : vues à quatre, deux et trois chambres, et une vue à axe court, cette dernière pouvant être ajustée par un plan horizontal sur les vues à axe long), le logiciel demande Modifier l’alignement des tranches apicales sur les vues standard. Si nécessaire, corrigez manuellement les vues apicales en les inclinant et en les tournant pour afficher la vue standard correspondante, éliminant ainsi le raccourcissement. Réglez l’inclinaison pour aligner l’étrier sur l’axe long du LV en faisant glisser et en déplaçant les étriers sur les vues à axe long. Réglez la rotation par les boutons correspondants ou Rotation de tous sur la machine ou en ajustant les étriers sur l’image à axe court.
    REMARQUE: La recommandation logicielle peut être réinitialisée en appuyant sur le bouton Alignement automatique .
  4. Après avoir terminé l’alignement de la vue, cliquez sur l’étape suivante EDV. La trame diastolique terminale (DE) est automatiquement détectée à l’aide du signal ECG, mais peut être corrigée manuellement si nécessaire.
  5. Détection semi-automatique de la surface endo- et épicardique BT
    1. Sélectionnez manuellement deux points de repère sur toutes les vues apicales. Tout d’abord, identifiez l’apex LV, puis le milieu de la base LV (niveau de l’anneau mitral) dans n’importe quelle vue apicale. L’algorithme tracera automatiquement le contour de la bordure endocardique de l’ensemble du LV.
      REMARQUE: Il existe deux autres options: Manuel, ce qui signifie que deux repères basaux et un repère apical doivent être définis dans chaque vue apicale, et Auto Init, qui contournera automatiquement le LV sans aucune interaction de l’utilisateur.
    2. Vérifiez la crédibilité du contour dans trois vues apicales, trois vues à axe court de différents niveaux et un quatrième axe court contrôlé par l’utilisateur, pour permettre une vérification visuelle de la surface détectée. La correction du contour est possible en ajoutant manuellement des points qui seront ensuite incorporés dans la ligne de contour.
      REMARQUE: Avec Annuler, le point précédemment ajouté peut être supprimé. Le bouton Réinitialiser réinitialise le contouring pour démarrer la section entière depuis le début. La visibilité des contours peut être ajustée pour permettre l’appréciation de la surface endocardique sur l’image en niveaux de gris. Le remodelage endocardique et épicardique doit être effectué de manière précise et cohérente. Pour une recommandation détaillée, veuillez consulter la référence suivante6.
    3. Choisissez l’étape suivante, qui est l’ESV.
    4. Répétez la même procédure (3.5.1-3.5.2) que celle mentionnée dans les points précédents pour identifier et corriger le contour endocardique sur le cadre systolique final.
      REMARQUE: La trame systolique terminale (ES) est automatiquement détectée à l’aide du signal ECG, mais peut être corrigée manuellement si nécessaire. Les valeurs du volume diastolique final (EDV), du volume systolique final (ESV), de la fraction d’éjection (EF), de la fréquence cardiaque (HR), du volume de l’AVC (SV), du débit cardiaque (CO) et de l’indice de sphéricité (SpI) sont déjà affichées à l’écran.
    5. Appuyez sur Volume waveform pour passer à l’étape suivante. Le logiciel affiche un modèle 3D dynamique de la LV ainsi qu’une courbe temps-volume car il trace la surface endocardique tout au long du cycle cardiaque image par image (Figure 1).
      REMARQUE: Ici, il est possible de modifier la bordure endocardique à n’importe quelle image.
    6. Pour l’étape suivante, appuyez sur LV Mass. Le logiciel contourne automatiquement le contour épicardique LV sur le cadre diastolique final et calcule la masse LV (EDMass).
      Remarque : Si nécessaire, modifiez le contour de la surface épicardique en ajoutant des points à inclure (même méthode que celle décrite précédemment) dans n’importe quel plan à axe court ou long. Il est possible de sélectionner le contour à ajuster : Endo, Epi ou Endo+Epi.
    7. Appuyez sur 4D Strain ROI pour l’étape suivante. Le logiciel contourne automatiquement le contour épicardique LV sur le cadre systolique final et calcule la masse systolique finale LV (ESMass).
      Remarque : Si nécessaire, modifiez le contour systolique final de la surface épicardique en ajoutant des points à inclure (même méthode que celle décrite précédemment) dans n’importe quel plan à axe court ou long. ESMass doit avoir une valeur similaire à celle d’EDMass. Cette étape est essentielle pour calculer les valeurs de déformation 3D par suivi des mouchetures.
    8. Appuyez sur 4D Strain Results pour l’étape suivante. Le logiciel visualise le suivi 3D du myocarde sur plusieurs plans à axe court et long et les valeurs de déformation correspondantes des 17 segments LV standard tout au long du cycle cardiaque, image par image. Des courbes de contrainte temporelle et un diagramme à l’œil de bœuf sont également affichés. Les paramètres suivants sont calculés et peuvent être démontrés : déformation longitudinale, déformation circonférentielle, déformation radiale, déformation de surface, rotation et torsion.
      REMARQUE: Il est possible d’exclure un segment LV particulier de l’analyse s’il est considéré comme ayant une faible qualité de suivi par observation visuelle des images ou sur la base de la courbe de contrainte temporelle. Cependant, le logiciel recommande par défaut lors de l’approbation ou du rejet de segment. Les valeurs de déformation codées par couleur peuvent être visualisées sur un modèle 3D dynamique du LV en modifiant la « Mise en page ».
  6. Pour terminer l’analyse, appuyez sur Approuver et quitter.

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Representative Results

L’analyse 3D du LV est réalisable chez la majorité des patients. Le cas 1 est un volontaire sain avec des volumes et une fonction ventriculaires normaux (Figure 1). Le cas 2 (Figure 2) est un patient de sexe masculin de 64 ans atteint d’une cardiomyopathie dilatée et d’un large complexe QRS (160 ms) de morphologie de bloc de branches du faisceau gauche. Les mesures CMR de référence étaient les suivantes : volume diastolique final : 243 mL, volume systolique final : 160 mL, fraction d’éjection : 34 %, masse BT : 163 g. Les mesures échocardiographiques linéaires conventionnelles ont significativement sous-estimé les volumes LV (diastolique terminal: 139 mL, systolique final: 76 mL) et surestimé la fraction d’éjection (45%) et la masse LV (469 g). Cependant, les mesures échocardiographiques 3D sont beaucoup plus proches de l’étalon-or, comme le montre la figure 2. De plus, l’analyse de la mécanique myocardique par suivi 3D des mouchetures fournit des données significatives sur les contractions dyssynchrones et le dysfonctionnement segmentaire. Le patient a ensuite subi un traitement de resynchronisation cardiaque réussi.

Figure 1
Figure 1 : Analyse 3D LV d’une volontaire de 18 ans exempte de toute maladie cardiovasculaire. L’image actuelle fait référence à la forme d’onde Volume (étape 3.5.5). Sur le côté gauche de l’écran, trois vues LV à axe long différentes et une vue à axe court peuvent être vues; le contour vert représente la surface endocardique diastolique terminale. Dans le coin supérieur droit, les principaux résultats sont visibles, démontrant les volumes, la forme et la fonction LV normaux. En dessous, le modèle de surface endocardique 3D LV (rouge) et la courbe temps-volume tout au long du cycle cardiaque sont visibles. ED: diastolique terminal, ES: systolique final, EDMass: masse LV, EDV: volume diastolique final, ESV: volume systolique final, EF: fraction d’éjection, HR: fréquence cardiaque, BPM: battements par minute, SV: volume de l’AVC, CO: débit cardiaque, SpI: indice de sphéricité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse 3D LV d’un patient atteint de cardiomyopathie dilatée. L’image actuelle fait référence aux résultats de déformation 4D (étape 3.5.8). Sur le côté gauche de l’écran, les valeurs de déformation longitudinales codées par couleur sont visualisées sur un modèle 3D du LV, montrant une déformation réduite sur la paroi latérale (bleu). Quantitativement, les valeurs de déformation systolique terminale sont indiquées dans le coin inférieur droit du graphique de l’œil de bœuf des 17 segments LV standard. Dans le coin supérieur droit, les valeurs de déformation longitudinale globales et segmentaires sont visibles sur les courbes de déformation temporelle tout au long du cycle cardiaque. ED: diastolique terminal, ES: systolique final, EDV: volume diastolique final, ESV: volume systolique final, EF: fraction d’éjection, G: global, HR: fréquence cardiaque, BPM: battements par minute, SV: volume de l’AVC, CO: débit cardiaque, SpI: indice de sphéricité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les mesures morphologiques et fonctionnelles de la VLT représentent les pierres angulaires du diagnostic, de la prise en charge et du suivi des maladies cardiaques; de plus, ils sont de puissants prédicteurs de résultats. En général, l’évaluation de la VV basée sur l’échocardiographie 2D est recommandée par les lignes directrices de pratique actuelles; cependant, l’échocardiographie 3D s’est avérée plus précise car elle est exempte d’hypothèses géométriques concernant la forme LV7,8. L’imagerie de la déformation par suivi des mouchetures est une méthode robuste pour évaluer différentes directions de la tension myocardique, ce qui permet de quantifier les anomalies du mouvement de la paroi de manière plus sensible5. La déformation longitudinale a une valeur pronostique supérieure établie par rapport à la fraction d’éjection9.

Généralement, le LV est acquis à partir d’une fenêtre apicale transthoracique à l’aide d’ensembles de données 3D à volume complet reconstruits à partir de 4 à 6 cycles cardiaques pendant la rétention de la respiration expiratoire, puis les sous-volumes sont automatiquement assemblés pour obtenir une résolution spatiale et temporelle optimale. La condition préalable à un jeu de données 3D approprié est une image 2D optimisée par l’ajustement des fréquences du transducteur, de la profondeur et par l’utilisation d’un léger surgain. L’objectif est d’inclure l’ensemble de la surface endo- et épicardique LV dans un jeu de données pyramidal de bonne qualité, ce qui pourrait être assuré en vérifiant plusieurs vues à axe court et long avant l’acquisition: l’interface utilisateur de la machine fournit cette vue multiplan. On peut utiliser différents positionnements de transducteurs pour optimiser la visualisation par rapport à la vue conventionnelle utilisée pour les mesures 2D car le raccourcissement peut être corrigé pendant le post-traitement. Des manœuvres respiratoires supplémentaires peuvent également être appliquées.

Les méthodes 2D conventionnelles pour mesurer la morphologie et la fonction LV ont des limites inhérentes. Ils s’appuient fortement sur un positionnement approprié du transducteur et un contour manuel de la surface endocardique BT. De plus, la méthode du biplan Simpson actuellement recommandée ne prend en compte que deux plans tomographiques et néglige la grande surface restante de la structure LV en forme de balle. Pour quantifier les volumes LV, des hypothèses géométriques sur la forme LV sont utilisées3. Les méthodes non 3D sous-estiment considérablement les volumes LV10. Ces lacunes sont encore plus exagérées chez les patients présentant des formes LV irrégulières et des modèles inhabituels d’anomalies du mouvement de la paroi11. La masse LV est également un puissant prédicteur du résultat malgré le mode M actuel, ou les techniques 2D présentent de nombreuses limitations. La formule de Devereux largement appliquée à l’aide de mesures linéaires sous-estime la plage normale de la masse LV; cependant, il surestime considérablement lorsqu’une hypertrophie significative est présente12,13. Les mesures basées sur l’échocardiographie 3D sont plus reproductibles et ont une meilleure corrélation avec la CMR de référence. L’indice de sphéricité est une mesure traditionnelle mais performante de la forme LV, et sa mesure est plus représentative à l’aide de l’échocardiographie 3D. Les mesures de déformation et de taux de déformation deviennent un élément essentiel de la recherche et de la pratique clinique en raison de leur sensibilité supérieure et de leur valeur pronostique ajoutée14,15. Le raccourcissement longitudinal et circonférentiel et même la mécanique de rotation peuvent être quantifiés par le suivi 3D des mouchetures, tandis que les données s’accumulent prouvant leur valeur16. L’analyse 3D élimine les mouvements hors plan (limitation connue de l’approche 2D); cependant, une résolution temporelle et spatiale plus faible des ensembles de données 3D ainsi que des différences dans les algorithmes logiciels doivent être prises en considération.

Bien que la vitesse et la robustesse de la quantification 3D LV incitent les cliniciens à l’utiliser chez chaque patient, plusieurs limites doivent être gardées à l’esprit. Malgré toutes les améliorations de la qualité de l’image, il restera un certain sous-ensemble de patients dont la fenêtre échocardiographique sera insuffisante pour une mesure semi-automatique ou même manuelle. L’expérience clinique peut amener le clinicien à examiner les valeurs mesurées et à commencer à réfléchir à des techniques alternatives, telles que l’échocardiographie de contraste ou la CMR. Bien que le « globe oculaire » soit découragé, nous pouvons rechercher une corrélation entre l’anticipation des experts et les valeurs mesurées. Les algorithmes logiciels appliquent des modèles appris de forme LV lors du contour endo- et épicardique automatique; par conséquent, nous verrons un contour même dans les régions qui sont en fait hors du volume d’imagerie. Nous devons essayer d’impliquer toute la surface endo- et épicardique LV dans le volume acquis pour minimiser une telle interpolation. Lorsque, malgré tous les efforts, cet abandon persiste, les résultats doivent être interprétés avec prudence. Les artefacts de couture sont assez fréquents lors de la reconstruction à plusieurs temps, causés par un rythme irrégulier, un transducteur indésirable ou un mouvement du patient (ne pas retenir le souffle) pendant l’acquisition, ou même des problèmes techniques. Bien que les reconstructions 3D soient généralement réalisables malgré ces artefacts, les résultats doivent être remis en question et une nouvelle analyse doit être initiée à l’aide d’une autre boucle exempte d’assemblage. La plupart des transducteurs modernes permettent une résolution spatiale et temporelle adéquate (>20 volumes par seconde) sans acquisition multi-temps, ce qui, bien sûr, élimine ce problème. Pour une acquisition d’image appropriée et un post-traitement logiciel, le rôle d’un traçage ECG stable et de bonne qualité ne peut être surestimé. Placer les repères pendant le post-traitement est d’une importance cruciale, affectant de manière significative les valeurs finales et la qualité globale du suivi. Actuellement, une correction manuelle du contournage automatique est nécessaire pour presque tous les patients; Cependant, nous devons garder à l’esprit que plus nous interagissons, plus l’erreur humaine peut être introduite qui aggravera la reproductibilité. Un compromis approprié doit être défini pour gérer les erreurs de contour liées au logiciel. Ce problème sera affiné au cours de la courbe d’apprentissage et s’améliorera à mesure que l’expérience se développera. Il est important de noter qu’il existe des différences significatives entre les fournisseurs dans la mesure des valeurs de déformation 3D, et il n’y a actuellement aucune normalisation qui a déjà eu lieu en cas de déformation longitudinale globale par suivi des mouchetures 2D17. La qualité du suivi et la crédibilité des résultats sont plus élevées en ce qui concerne le suivi des mouchetures 2D, les mesures de déformation 3D sont de préférence placées dans le domaine de la recherche au moment de la rédaction de cet article.

En conclusion, les solutions logicielles basées sur l’échocardiographie 3D fournissent les résultats échocardiographiques les plus précis concernant la morphologie et la fonction LV. Ils sont validés avec CMR et se sont avérés plus reproductibles et encore moins chronophages que les techniques 2D conventionnelles. Leur application dans la recherche et aussi dans la vie clinique continuera d’évoluer. D’autres améliorations utilisant l’intelligence artificielle peuvent ouvrir la voie à la quantification automatique sans interaction humaine.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

N° de projet NVKP_16-1-2016-0017 (« Programme national de cardiologie ») a été mis en œuvre avec le soutien du Fonds national de recherche, de développement et d’innovation de Hongrie, financé dans le cadre du programme de financement NVKP_16. La recherche a été financée par le programme d’excellence thématique (2020-4.1.1.-TKP2020) du ministère de l’Innovation et de la Technologie en Hongrie, dans le cadre des programmes thématiques de développement thérapeutique et de bioimagerie de l’Université Semmelweis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3V-D/4V-D/4Vc-D General Electric n.a. ultrasound probe
4D Auto LVQ General Electric n.a. software for analysis
E9/E95 General Electric n.a. ultrasound machine
EchoPac v203 General Electric n.a. software for analysis

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References

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Ujvári, A., Lakatos, B. K.,More

Ujvári, A., Lakatos, B. K., Tokodi, M., Fábián, A., Merkely, B., Kovács, A. Evaluation of Left Ventricular Structure and Function using 3D Echocardiography. J. Vis. Exp. (164), e61212, doi:10.3791/61212 (2020).

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