Loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) er en isotermisk nukleinsyreforsterkningstest (iNAAT) som har tiltrukket seg bred interesse for patogendeteksjonsfeltet. Her presenterer vi en multi-laboratorie-validert Salmonella LAMP-protokoll som en rask, pålitelig og robust metode for screening av Salmonella i animalsk mat og bekrefter presumptiv Salmonella fra kulturisolasjon.
Loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) har dukket opp som en kraftig nukleinsyreforsterkningstest for rask påvisning av mange bakterielle, sopp- og parasittiske og virale midler. Salmonella er et bakteriell patogen av verdensomspennende matsikkerhetsbekymring, inkludert mat til dyr. Presentert her er en multi-laboratorie-validert Salmonella LAMP protokoll som kan brukes til å raskt screene animalsk mat for tilstedeværelse av Salmonella forurensning og kan også brukes til å bekrefte presumptive Salmonella isolater utvinnes fra alle matkategorier. LAMP-analysen retter seg spesifikt mot Salmonella-invasjonsgenet (invA) og er rask, følsom og svært spesifikk. Mal dnAs er utarbeidet av berikelse buljonger av animalsk mat eller rene kulturer av presumptive Salmonella isolater. LAMP reagensblandingen tilberedes ved å kombinere en isotermisk masterblanding, primere, DNA-mal og vann. LAMP-analysen går ved en konstant temperatur på 65 °C i 30 min. Positive resultater overvåkes via sanntidsfluorescens og kan oppdages så tidlig som 5 min. LAMP-analysen viser høy toleranse for hemmere i animalsk mat eller kulturmedium, og fungerer som en rask, pålitelig, robust, kostnadseffektiv og brukervennlig metode for screening og bekreftelse av Salmonella. LAMP-metoden har nylig blitt innlemmet i US Food and Drug Administration’s Bacteriological Analytical Manual (BAM) Kapittel 5.
Loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) er en roman isotermisk nukleinsyre forsterkning test (iNAAT) oppfunnet i 2000 av en gruppe japanske forskere1. Gjennom dannelsen av en målspesifikk stilk-loop DNA-struktur under de første trinnene, bruker LAMP en strand-fortrengende DNA polymerase for å effektivt forsterke dette startmaterialet kvasi-eksponentielt, noe som resulterer i 109 kopier av målet på mindre enn 1 t1. Sammenlignet med polymerase kjedereaksjon (PCR), en mye brukt NAAT, lamp har flere fordeler. For det første utføres LAMP-reaksjoner under isotermiske forhold. Dette hindrer behovet for et sofistikert termisk sykkelinstrument. For det andre er LAMP svært tolerant overfor kulturmedier og biologiskestoffer 2 med robusthet demonstrert for både kliniske og matapplikasjoner3,4. Dette forenkler prøveklargjøring og minimerer falske negative resultater5. For det tredje er LAMP mottagelig for flere deteksjonsplattformer, for eksempel turbiditet, kolorimetri, bioluminescens, fluorescens og mikrofluidics6. Fjerde, LAMP er svært spesifikk som den bruker fire til seks spesialdesignede primere å målrette seks til åtte bestemteregioner 1,7. Femte, LAMP er ultrafølsom og mange studier har rapportert sin overlegne følsomhet for PCR eller sanntid PCR8. Endelig er LAMP raskere med mange analyser som nå vedtar en 30 min standard kjøretid mens PCR-type analyser vanligvis tar 1-2 t8.
Disse attraktive funksjonene drevet anvendelsen av LAMP i brede patogendeteksjonsområder, inkludert in vitro diagnostikk9,dyresykdomdiagnostikk10,og mat- og miljøtesting11. Spesielt har en TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberculosis) blitt anbefalt av WHO som en gyldig erstatningstest for sputum-smøremikroskopi for lungetuberkulosediagnoser i perifere innstillinger12. LAMP søknad utvider også utover mikrobiell identifikasjon for å omfatte påvisning av allergener, dyrearter, narkotikaresistens, genmodifiserte organismer, og plantevernmidler13.
Ikke-oidal Salmonella er et zoonotisk patogen av betydelig matsikkerhet og folkehelsebekymring over hele verden14. Det har også blitt identifisert som en viktig mikrobiell fare i mat for dyr (det vil si animalsk mat)15,16. For å forhindre salmonellasykdommer/utbrudd fra forurenset mat og animalsk mat, er det viktig å ha raske, pålitelige og robuste metoder for testing av Salmonella i en rekke matriser. I løpet av det siste tiåret har det blitt gjort en betydelig innsats internasjonalt på utvikling og anvendelse av Salmonella LAMP-analyser i et bredt spekter av matmatriser, som nylig ble oppsummert i en omfattende gjennomgang8. Flere Salmonella LAMP-analyser, inkludert den som presenteres her, har fullført multilaboratorivalidering etter veletablerte internasjonaleretningslinjer 17,18,19,20.
Vår Salmonella LAMP analyse spesifikt rettet mot Salmonella invasjon genet invA (GenBank tiltredelse nummer M90846)21 og er rask, pålitelig og robust i flere mat matriser4,22,23,24,25,26. Metoden er validert i seks dyrematmat matriser i en precollaborativstudie 26 og i tørr hundemat i en multi-laboratorie samarbeidsstudie19. Som et resultat har Salmonella LAMP-metoden presentert her nylig blitt innlemmet i US Food and Drug Administration (FDA) bakteriologisk analytisk manual (BAM) Kapittel 5 Salmonella27 for å tjene to formål, en som en rask screeningmetode for tilstedeværelse av Salmonella i animalsk mat og to som en pålitelig bekreftelsesmetode for presumptiv Salmonella isolert fra alle matvarer.
Vi har presentert her en enkel, rask, spesifikk og følsom LAMP-metode for screening og bekreftelse av Salmonella i henholdsvis animalsk mat og ren kultur. Med bekvemmeligheten av en isotermisk masterblanding som inneholder fire viktige reagenser, og en klar til bruk, in-house forberedt primer blanding, montering av en LAMP reaksjon krever bare noen få pipettering trinn (Figur 1). Den totale kjøretiden inkludert forsterkning og glødefaser er mindre enn 38 min (figur 2A, B og figur 3A, B). Positive resultater overvåkes via sanntidsfluorescens (figur 2C og figur 3C,D) og kan oppdages så tidlig som 5 min26. Glødefasen fungerer som en ekstra bekreftelse på LAMP spesifisitet siden bare prøver med riktig Tm (rundt 90 °C) rapporteres som positive (figur 2D,E og figur 3E−G). Sensitiviteter av 1 Salmonellacelle i ren kultur og < 1 CFU/25 g i animalsk mat er rapportert tidligere26.
Siden LAMP er ganske effektiv og genererer en stor mengde DNA1,er det avgjørende at beste laboratoriepraksis brukes til å forhindre krysskontaminering, som kan omfatte fysisk å skille områdene for å forberede LAMP-hovedblandingen og legge til DNA-maler, unngå å generere aerosoler, bruke filterpipettespisser, bytte hansker ofte og avstå fra å åpne LAMP-reaksjonsrør etter forsterkning.
Spesifisiteten til denne Salmonella LAMP-metoden ble tidligere testet ved hjelp av 300 bakteriestammer (247 Salmonella av 185 serovars og 53ikke-Salmonella)og viste seg å være 100%spesifikke 26. Spesielt ble det observert betydelige forskjeller i Tmax mellom de to Salmonella-artene, S. enterica og Salmonella bongori,og blant S. enterica underarter, spesielt subsp. arizonae (IIIa)26. Likevel var disse fortsatt gyldige positive resultater i henhold til reglene for tolkning av LAMP-resultater. I vår multi-laboratorie samarbeidsstudie i tørr hundemat som involverte 14 analytikere19,ble prøver som hadde inkonsekvente resultater i dupliserte LAMP-løp av og til observert. Disse involverte vanligvis prøver med forsinkede positive resultater (Tmaks > 15 min). Gjentatte kjøringer uavhengig av hverandre løste vanligvis problemet. Mer sjelden observerte vi prøver med riktige Tm, men ingen eller uregelmessige Tmaksverdier (< 5 min). Dette var vanligvis forårsaket av luftbobler i reaksjonsrøret.
Gjennom hele livssyklusen til LAMP-metodeutvikling, evaluering, precollaborativ studie og multilaborativ validering har vi observert høy toleranse for LAMP til hemmere i ulike dyremat- eller matmatriker ogkulturmedier 4,19,22,23,24, som fremhever metodens robusthet og samarbeider en rekke andre studier på global skala8. Dette er overlegen sammenlignet med PCR eller sanntid PCR, som vanligvis krever en intern forsterkningskontroll for å sikre at negative resultater ikke skyldes matrisehemming28. Videre viste LAMP lignende (eller overlegen) spesifisitet og følsomhet sammenlignet med PCR eller sanntids-PCR i de aller fleste studier8. Kostnaden for LAMP reagenser er på ca $ 1 per reaksjon. LAMP-instrumentene som brukes i denne protokollen er små, lite vedlikehold og bærbare. De kan håndtere alle isotermiske forsterkningsmetode som bruker måldeteksjon ved fluorescensmåling, LAMP inkludert. Ved hjelp av LAMP-programvaren kan omfattende rapporter genereres i flere formater (pdf, tekst og bilde).
Metodevalidering er et kritisk trinn før en ny metode kan tas i bruk for rutinemessig bruk. Det er bemerkelsesverdig at LAMP-protokollen som rapporteres her, har fullført multilaboratorivalidering19. Med den nylige inkorporeringen av denne LAMP-protokollen i USDAs BAM kapittel 5 Salmonella27,forventes det at metoden vil få mye bredere bruk, både som en rask screeningmetode i animalsk mat og som en pålitelig bekreftelsesmetode for presumptive Salmonella isolerer fra alle matkategorier.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker medlemmer av FDAs mikrobiologi metoder validering subcommittee (MMVS) og Bakteriological Analytical Manual (BAM) Council for kritisk gjennomgang Salmonella LAMP metode validering studier.
Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |