Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Loop-Опосредованное изотермальное усиление для скрининга сальмонеллы в пище животных и подтверждение сальмонеллы от культурной изоляции

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61239
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Veterinary Medicine, U.S. Food and Drug Administration

Summary

Опосредованное петлей изотермальное усиление (LAMP) является изотермальным тестом на усиление нуклеиновой кислоты (iNAAT), который вызвал широкий интерес в области обнаружения патогенов. Здесь мы представляем мультилабораторно-проверенный протокол Salmonella LAMP как быстрый, надежный и надежный метод скрининга сальмонеллы в пище животных и подтверждения предполагаемой изоляции сальмонеллы от культурной изоляции.

Abstract

Опосредованное петлей изотермальное усиление (LAMP) стало мощным тестом на усиление нуклеиновой кислоты для быстрого обнаружения многочисленных бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных агентов. Сальмонеллы является бактериальным патогеном во всем мире проблемы безопасности пищевых продуктов, в том числе продуктов питания для животных. Представлено здесь является несколько лабораторных проверенных Salmonella LAMP протокол, который может быть использован для быстрого проверки животных пищи на наличие загрязнения сальмонеллой, а также может быть использован для подтверждения предполагаемого salmonella изолятов, восстановленных из всех категорий продуктов питания. Анализ LAMP специально нацелен на ген нашествия сальмонеллы(invA)и является быстрым, чувствительным и весьма специфическим. Шаблон ДНК готовятся из обогащения бульонов животной пищи или чистой культуры предполагаемых изолятов сальмонеллы. Смесь реагентов LAMP готовится путем объединения изотермальной смеси мастера, грунтовки, шаблона ДНК и воды. Анализ LAMP работает при постоянной температуре 65 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Положительные результаты отслеживаются с помощью флуоресценции в режиме реального времени и могут быть обнаружены уже через 5 минут. Анализ LAMP демонстрирует высокую толерантность к ингибиторам в животных пищевых продуктов или культуры среды, выступающей в качестве быстрого, надежного, надежного, экономически эффективного и удобного метода для скрининга и подтверждения сальмонеллы. Метод LAMP недавно был включен в Бактериологическое аналитическое руководство Управления по пищевым продуктам и лекарственным продуктам США (BAM) Глава 5.

Introduction

Петля опосредованное изотермальное усиление (LAMP) является новым изотермальным тестом на усиление нуклеиновой кислоты (iNAAT), изобретенным в 2000 году группой японскихученых 1. Путем формирования целевой структуры ДНК стволовой петли на начальных этапах, LAMP использует прядь-вытесняя полимеразу дна эффективно усилить этот стартовый материал квази-экспоненциально, в результате чего10 9 копий цели менее чем за 1 ч1. По сравнению с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), широко используемой NAAT, LAMP обладает рядом преимуществ. Во-первых, реакции LAMP проводятся в изотермальных условиях. Это устраняет необходимость в сложном тепловом велосипеде. Во-вторых, LAMP очень терпимо относится к культурным СМИ и биологическимвеществам 2 с надежностью, продемонстрированой как для клинических, таки для пищевых применений 3,4. Это упрощает подготовку образца и сводит к минимуму ложные отрицательныерезультаты 5. В-третьих, LAMP является подложкой для нескольких платформ обнаружения, таких как мутность, колориметрия, биолюминесценция, флуоресценция, имикрофлюиды 6. В-четвертых, LAMP является весьма конкретным, поскольку он использует четыре-шесть специально разработанных грунтовок для целевой шесть-восемьконкретных регионов 1,7. В-пятых, LAMP является сверхчувствительным и многочисленные исследования сообщили о своей превосходной чувствительности к ПЦР или в режиме реального времени PCR8. Наконец, LAMP быстрее со многими анализами в настоящее время принятие 30 мин стандартного времени, в то время как ПЦР типа анализы обычно принимают 1'2 ч8.

Эти привлекательные особенности подпитывали применение LAMP в широких областях обнаружения патогенов, включая диагностику в пробирке 9,диагностику болезней животных 10,а также пищевые и экологическиеиспытания 11. Примечательно, что TB-LAMP (LAMP для микобактерий туберкулеза) был рекомендован ВОЗ в качестве действительного теста замены для микроскопии мокроты мазка для диагностики туберкулеза легких в периферическихусловиях 12. Приложение LAMP также выходит за рамки микробной идентификации, чтобы включить обнаружение аллергенов, видов животных, лекарственной устойчивости, генетически модифицированных организмов и пестицидов13.

Нетифоидная сальмонелла является зоонозным патогеном существенной безопасности пищевых продуктов и общественного здравоохранения озабоченность во всем мире14. Он также был определен в качестве важной микробной опасности в пище для животных (т.е. животногопитания) 15,16. Для предотвращения болезней сальмонеллы / вспышек от загрязненной пищи человека и продуктов животного происхождения, крайне важно иметь быстрые, надежные и надежные методы для тестирования сальмонеллы в различных матриц. В последнее десятилетие, значительные усилия были предприняты на международном уровне по разработке и применению сальмонеллы LAMP анализы в широком спектре пищевых матриц, как недавно обобщены в обширномобзоре 8. Несколько анализов Salmonella LAMP, в том числе один представленный здесь, успешно завершили много лабораторной проверки после устоявшихся международныхруководящих принципов 17,18,19,20.

Наша salmonella LAMP анализ конкретно цели salmonella вторжения гена invA (GenBank присоединения номер M90846)21 и является быстрым, надежным и надежным в нескольких матрицпищи 4,22,23,24,25,26. Метод был проверен в шести матриц корма для животных в предварительном исследовании26 и в сухой корм для собак в многолабораторном совместном исследовании19. В результате, метод Salmonella LAMP представленный здесь недавно был включен в Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) Бактериологическое аналитическое руководство (BAM) Глава 5 Сальмонеллы27 служить двум целям, один как метод быстрого скрининга на наличие сальмонеллы в животной пище и два в качестве надежного метода подтверждения предполагаемой сальмонеллы изолированы от всех продуктов питания.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Лампа реакции смесь содержит полимеразы ДНК, буфер, MgSO4, dNTPs, грунтовки, шаблон ДНК, и вода. Первые четыре реагента содержатся в изотермальной смеси мастера(Таблица материалов). Праймеры предварительно смешиваются в доме, чтобы стать грунтовки смеси (10x). Шаблоны ДНК могут быть подготовлены из бульонов обогащения образцов животной пищи для скрининга или из культур предполагаемых изолятов сальмонеллы для целей подтверждения. Кроме того, положительный контроль (ДНК, извлеченная из любых справочных штаммов сальмонеллы, например, Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) и отсутствие шаблонного контроля (NTC; стерильная молекулярная вода) включены в каждый запуск LAMP.

1. Подготовка шаблонов ДНК

  1. Чтобы подготовить шаблоны ДНК из обогащения пищи животных, следуйте этим шагам.
    1. Асептически весят 25 г образца корма для животных (например, сухой корм для кошек, сухой корм для собак, корма для крупного рогатого скота, корма для лошадей, корма для домашних птиц и корма для свиней) в стерильный фильтровальную сумку(Таблица материалов),или эквивалент. Поместите сумку в большой контейнер или стойку для поддержки во время инкубации.
    2. Добавьте 225 мл стерильной буферной пептоновой воды (BPW). Хорошо перемешать с закрученного и краткого ручного массажа. Дайте постоять при комнатной температуре 60 ± 5 мин.
    3. Хорошо перемешать, закрученных и определить рН с тестовой бумагой. Отрегулируйте рН, при необходимости, до 6,8 ± 0,2 со стерильным 1 N NaOH или 1 N HCl. Инкубация при 35 ± 2 КК для 24 ± 2 ч.
    4. Хорошо перемешать, закрученного мешок, содержащий бульоны обогащения животной пищи. Перенесите 1 мл с фильтрованной стороны сумки в трубку с микроцентрифугом. Вортекс кратко.
    5. Извлекайте ДНК с помощью реагента дляподготовки образца (Таблицаматериалов) следующим образом.
      1. Центрифуга на 900 х г в течение 1 мин, чтобы удалить крупные частицы и передачи супернатанта в новую трубку микроцентрифуг.
      2. Центрифуга на 16000 х г в течение 2 мин и отказаться от супернатанта.
      3. Приостановить гранулы в 100 мкл реагента подготовки образца и нагреть при температуре 100 ± 1 градус по Цельсию в течение 10 мин в сухом тепловом блоке.
      4. Охладить до комнатной температуры и хранить образцы экстрактов ДНК при температуре -20 градусов по Цельсию.
  2. Чтобы подготовить шаблоны ДНК из предполагаемых культур сальмонеллы, следуйте этим шагам.
    1. Получить предполагаемый salmonella изолирует от культурной изоляции во всех продуктах питания после БАМ FDA Глава 5 Сальмонеллы раздел D: Изоляция сальмонеллы27.
    2. Прививка предполагаемых изолятов сальмонеллы на неселективной агарной пластине (например, агар крови, питательный агар и триптихейный соевый агар) и инкубировать при 35 ± 2 градусов по Цельсию на 24 ± 2 ч.
    3. Перенесите несколько одиночных колоний в 5 мл соевого бульона триптикейс (TSB) или бульона для инфузии сердца головного мозга (BHI) и инкубировать при 35 ± 2 кк на 16 ± 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть необязательным, если предполагаемая культура сальмонеллы является чистой. В этом случае шаблоны ДНК можно подготовить, приостановив несколько одиночных колоний в 5 мл TSB и нагрев 500 МКЛ подвески при температуре 100 ± 1 градус по Цельсию в течение 10 минут в сухом тепловом блоке. Продолжить с шагом 5 ниже.
    4. Перенесите 500 МКЛ ночной культуры в трубку микроцентрифуга и нагрейте при температуре 100 ± 1 градус по Цельсию в течение 10 минут в сухом тепловом блоке.
    5. Охладить до комнатной температуры и хранить изолятные экстракты ДНК при температуре -20 градусов по Цельсию.
  3. Чтобы подготовить положительный контроль ДНК, следуйте аналогичным шагам, как выше для подготовки шаблонов ДНК из предполагаемых культур сальмонеллы с одним дополнительным шагом разбавления.
    1. Прививка S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) или любые справочные штаммы сальмонеллы на неселективной агарной пластине (например, агар крови, питательный агар и триптикейк соевого агара) и инкубировать при 35 ± 2 КК в течение 24 ± 2 ч.
    2. Перенесите несколько одиночных колоний на 5 мл бульона TSB или BHI и инкубировать при 35 ± 2 кк для 16 ± 2 ч, чтобы достичь 109 CFU/mL.
    3. Серийно разбавляют ночную культуру в 0,1% пептоновой воды, чтобы получить 107 CFU/mL.
    4. Перенесите 500 МКЛ этого разбавления в трубку микроцентрифуга и нагрейте при температуре 100 ± 1 градус по Цельсию в течение 10 минут в сухом тепловом блоке.
    5. Охладить до комнатной температуры и хранить положительный контроль ДНК при температуре -20 градусов по Цельсию.

2. Подготовка грунтового микса (10x)

  1. Получить коммерчески синтезированные праймеры LAMP (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF и Sal4-LB) со стандартной очисткой опреснивания(таблица 1).
Название праймера Описание Последовательность (5'-3') Длина (bp)
Sal4-F3 Вперед внешняя грунтовка ГААКГТГТКГГАГТК 18
Sal4-B3 Обратная внешняя грунтовка CGGCAATAGCGTCACCTT 18
Sal4-FIP Вперед внутренний грунтовка GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG 38
Sal4-BIP Обратная внутренняя грунтовка GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC 38
Sal4-LF Петля вперед грунтовка TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG 25
Sal4-LB Петля назад грунтовка AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG 21

Таблица 1: LAMP грунтовки для скрининга сальмонеллы в животной пище и подтверждения сальмонеллы от культурной изоляции. Праймеры разработаны на основе последовательности Salmonella invA (GenBank присоединения номер M90846).

  1. Подготовьте фондовые растворы каждой грунтовоща (100 МКМ) путем регидратации грунтовок с соответствующим количеством стерильной воды молекулярного класса. Хорошо смешайте вихрем в течение 10 с и хранить при -20 градусов по Цельсию (-80 градусов по Цельсию для долгосрочного хранения).
  2. Подготовка грунтовка смесь (10x) в соответствии с листом (Таблица 2). Добавьте соответствующие объемы растворов грунтовки и стерильной воды молекулярного класса в микроцентрифугную трубку. Смешайте все реагенты хорошо вихрем в течение 10 с.
Компонент Стоковая конт. (МКМ) Праймер микс conc. (МК) Объем (КЛ)
Праймер Sal4-F3 100 1 10
Праймер Sal4-B3 100 1 10
Праймер Sal4-FIP 100 18 180
Sal4-BIP грунтовка 100 18 180
Sal4-LF грунтовка 100 10 100
Праймер Sal4-LB 100 10 100
Вода молекулярного класса N/A N/A 420
Общая N/A N/A 1000

Таблица 2: Лист для подготовки смеси lamp грунтовка (10x). Праймеры перечислены в таблице 1.

  1. Aliquot 10x грунтовка смесь до 500 мкл на микроцентрифуг трубки и хранить при -20 градусов по Цельсию.

3. Сборка реакции LAMP

ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения перекрестного загрязнения настоятельно рекомендуется физически отделить области, используемые для подготовки мастер-микс LAMP и добавления шаблонов ДНК. Рисунок 1 является диаграммой LAMP.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая диаграмма рабочего процесса Salmonella LAMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

  1. Подготовка и запуск установки
    1. Чистая скамейка с изопропанолом и ДНК- и DNase-унизительным раствором(Таблица материалов). Чистые пипетки и держатели трубчатых полос(Таблица материалов)с раствором ДНК- и деградирующего DNase.
    2. Оттепель изотермальной смеси мастер, грунтовка смесь (10x), молекулярного класса воды, положительный контроль ДНК, и ДНК шаблоны при комнатной температуре.
    3. Включите инструмент LAMP (Таблицаматериалов) и коснитесьэкрана открытия, чтобы получить доступ к домашнему экрану. Следуйте этим шагам, чтобы создать запуск.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна модель инструмента LAMP имеет 2 блока (A и B) с 8 образцами в каждом блоке, а другая модель имеет один блок, который вмещает 8образцов (Таблица материалов).
      1. Нажмите LAMP-Anneal и выберите Редактировать, чтобы ввести образец информации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Профиль запуска LAMP по умолчанию состоит из усиления при 65 градусов по Цельсию в течение 30 минут и аннеальной фазы от 98 градусов по Цельсию до 80 градусов по Цельсию с 0,05 градусов по Цельсию за секунду.
      2. Нажмите на каждую строку образца, чтобы активировать курсор и ввести соответствующую информацию образца, используя значок блока AB, чтобы переключаться между двумя блоками инструмента LAMP.
      3. Нажмите значок Check, когда вся информация образца была введена.
        ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, настройка запуска (термин "Профиль", который содержит выборку информации вместе с профилем запуска LAMP по умолчанию) может быть сохранена для более длительного использования. Нажмите на значок Сохранить и дать профилю уникальное имя. При тестировании этого же набора образцов в следующий раз можно начать новый запуск с помощью сохраненного профиля. Нажмите на значок Folder в левом нижнем углу домашнего экрана и выберите профиль для загрузки сохраненных профилей.
  2. Сборка реакции LAMP
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании обоих блоков приборов LAMP (A и B, в общей сложности 16 образцов), подготовить мастер-микс LAMP для 18 образцов. При использовании только одного блока приборов LAMP (всего 8 образцов) подготовьте мастер-микс LAMP для 10 образцов. Для других номеров выборки соответствующим образом отрегулируйте громкость с учетом потерь труб. Всегда включите положительный контроль и NTC в каждом запуске LAMP. Рекомендуется дублировать тестирование каждого образца в независимых пробегах LAMP.
    1. Подготовка мастер-микс LAMP в соответствии с листом(таблица 3). Добавить соответствующие объемы изотермальной смеси мастера, грунтовки смеси и молекулярного класса воды в микроцентрифуг трубки и вихрь мягко в течение 3 с. Центрифуга кратко.
    2. Поместите полосу трубки в держатель полосы и распределите 23 л смеси мастера LAMP для каждой хорошо.
    3. Vortex все шаблоны ДНК и центрифуги кратко. Добавьте 2 МКЛ шаблона ДНК к соответствующему хорошо и крышка плотно.
    4. Снимите полосу трубки с держателя и Флик запястье, чтобы убедиться, что все реагенты объединились в нижней части трубки.
    5. Загрузите полосу трубки в блок инструмента LAMP (ы), обеспечивая безопасность колпачков перед закрытием крышки.
Компонент Рабочий конт. Окончательная реакция конт. Объем на образец (ОЛ) Объем для 18 образцов (ОЛ) Объем для 10 образцов (ОЛ)
ISO-001 изотермальная мастер-микс 1,67x 1x 15 270 150
Смесь праймера 10x 1x 2.5 45 25
Вода молекулярного класса N/A N/A 5.5 99 55
Мастер микс субтотал N/A N/A 23 414 230
Шаблон ДНК N/A N/A 2 N/A N/A

Таблица 3: Лист для подготовки смеси реакции LAMP. Смесь грунтовки (10x) готовится в соответствии с таблицей 2 с использованием фондовых решений грунтовок, перечисленных в таблице 1.

4. ЛАМП Run

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время запуска LAMP показания флуоресценции приобретаются с помощью канала FAM. Значения времени до пика(Tmax;min) определяются автоматически инструментом для точки времени, когда соотношение флуоресценции достигает максимального значения кривой скорости усиления. Т м (КК) — это температура плавления/анны конечного усиленного продукта.

  1. Нажмите на значок Run в правом верхнем правом верхнем справа от экрана и выберите блок (ы), содержащий полосу трубки (ы), чтобы начать запуск LAMP.
  2. Дополнительно, в то время как реакция продолжается, нажмите Температура, Усиление, и Аннеал вкладок, чтобы увидеть динамические изменения различных параметров во время запуска LAMP.
  3. Как только запуск завершен, нажмите вкладки Amplification и Anneal, чтобы увидеть полное усиление и аннеальные кривые и коснитесь вкладки Результаты для просмотра результатов.
  4. По желанию, для хранения записей, записывают номер запуска, расположенный в левом верхнем левом верхнем слева от экрана, используя формат "инструментальный серийный номер number_run", например, "GEN2-2209-0030".

5. Интерпретация результатов LAMP

ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты LAMP можно просматривать на панели приборов LAMP непосредственно и/или с помощью программного обеспечения LAMP(Таблица материалов).

  1. Чтобы интерпретировать результаты LAMP на панели приборов, следуйте этим шагам.
    1. Нажмите значок Folder в левом нижнем углу домашнего экрана и выберите журнал, чтобы перейти к местоположению файла, чтобы загрузить lamp перспективе интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Lamp работает организованы по дате, начиная с года.
    2. Соблюдайте пять вкладок, связанных с каждым запуском: Профиль, Температура , Усиление, Аннеал, и результаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладки профиля и температуры показывают запрограммированные и фактические температуры, соответственно, в образцах скважин по мере продолжения реакции LAMP. Вкладки Amplification и Anneal показывают показания флуоресценции и изменения флуоресценции во время усиления и аннеальных фаз, соответственно. Вкладка Результаты показывает табкулярное представление результатов LAMP.
    3. Нажмите на вкладку Результаты, чтобы наблюдать за результатами LAMP для каждой хорошо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть три колонки (Ну, усиление, и Аннеал). Столбец "Усиление" показывает значения времени до пика(Tmax; min:sec) для каждого образца ("Ну") и столбец "Anneal" показывает температуру плавления/анны(Tm; C) для любого усиленного продукта в этом хорошо.
    4. Интерпретируйте результаты LAMP и сообщайте окончательные результаты LAMP следующим образом.
      1. Сначала изучите контрольные скважины. Ну NTC должен иметь чистый Tмакс в то время как Tm может быть либо пустым (как модели инструмента LAMP) или LT; 83 C (только для модели инструмента LAMP с двумя блоками). Положительный контроль хорошо должен иметь Tмакс между 5 и 10 мин и Tм около 90 градусов по Цельсию.
      2. Изучите пробные скважины. Все образцы с правильным Тм (примерно 90 градусов по Цельсию) и Tmax (от 5 до 30 мин) считаются положительными для сальмонеллы.
      3. Сообщите окончательные результаты LAMP на основе результатов дублирующихся запусков. Если дубликаты трасс имеют последовательные результаты, можно будет узнать окончательные результаты LAMP. Если дублирующиеся запуски несовместимы, повторите оба прогона самостоятельно. Если результаты по-прежнему несовместимы, образец следует считать предполагаемым положительным для сальмонеллы и должны пройти через подтверждение культуры.
  2. Чтобы интерпретировать результаты LAMP с помощью программного обеспечения, следуйте этим шагам.
    1. Нажмите на значок компьютера на левой панели и перейдите к местоположению файла, чтобы загрузить работать LAMP интерес.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютер с установленным программным обеспечением не должен быть подключен к инструменту LAMP для анализа результатов LAMP, т.е. доступен удаленный доступ. Пробеги LAMP организованы по дате.
    2. Соблюдайте семь вкладок, связанных с каждым запуском: Профиль ,Температура , Усиление , Скорость усиления, Аннеал, Аннеал производная, и результат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подобно представлению панели приборов, вкладки Профиль и Температура показывают запрограммированные и фактические температуры, соответственно, в образцах скважин по мере продолжения реакции LAMP. Коэффициент усиления/усиления и вкладки Anneal/Anneal Derivative показывают показания флуоресценции или изменения флуоресценции во время фаз усиления и аннеальной фазы, соответственно. Вкладка Результаты показывает табличное представление результатов LAMP, которые немного отличаются от вида панели приборов.
    3. Нажмите на вкладку Amplification Rate, чтобы просмотреть графическое отображение соотношения флуоресценции по времени. Нажмите на значок Настройки в правом верхнем правом верхнем справа от экрана и отрегулируйте коэффициент порога обнаружения пика с 0,020 до 0,010.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корректировка необходима для обеспечения того, чтобы все действительные пики были идентифицированы, а результаты, полученные с помощью программного обеспечения, совпадают с результатами, отображаемыми на панели приборов.
    4. Нажмите на вкладку Result, чтобы наблюдать за результатами LAMP для каждой колодец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть четыре столбца (Имя графика, Ну номер, Ну имя, и пиковое значение). Верхняя часть столбца "Peak Value" показывает "Amp Time"(Tmax; min:sec) для каждого образца ("Ну имя"), в то время как нижняя часть показывает "Anneal Derivative"(Tm; C) для любого усиленного продукта в том, что хорошо.
    5. Интерпретировать результаты LAMP и сообщить окончательные результаты LAMP следующие аналогичные шаги, как при использовании панели приборов с одним исключением, что NTC хорошо и другие отрицательные образцы должны иметь пустой Tм, как lamp настройки программного обеспечения устранить эти Tм Lt; 83 кк результаты. Аналогичным образом, все образцы с правильным Тм (примерно 90 градусов по Цельсию) и Tмакс (между 5'30 мин) считаются положительными для сальмонеллы.

Representative Results

На рисунке 2 и рисунке 3 показаны репрезентативные графики/таблицы LAMP, отображаемые на обеих платформах. В этом запуске LAMP образцы S1 to S6 являются 10-кратными серийными разбавлениями S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 в диапазоне от 1,1 х 106 CFU до 11 CFU за реакцию. Положительный контроль S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) на 1,7 х 104 CFU на реакцию и NTC молекулярного класса воды.

Как показано на рисунке 2E и рисунок 3G, как NTC и PC скважины являются действительными контроля. NTC хорошо имеет пустой Tмакс в то время как Tм является lt; 83 КК на панели приборов LAMP и пустой в программном обеспечении LAMP, предлагая отрицательный результат. PC хорошо имеет Tмакс 7 мин 45 сек и Tм из 90 градусов по Цельсию на обеих платформах, что свидетельствует о положительном результате. Образцы S1 до S6 имеют Tмакс между 6 мин 30 сек и 12 мин 15 сек, все время Salmonella-положительный.

После дублирования проб одного и того же набора lamp для этих образцов сообщаются окончательные результаты LAMP. Этот репрезентативный запуск LAMP показывает, что LAMP успешно обнаруживает сальмонеллу с широким диапазоном концентраций в образцах.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты LAMP отображаются на панели приборов LAMP. (A)Вкладка Профиль показывает запрограммированный температурный профиль. (B) Вкладка Температура показывает фактические температуры в образца скважин, как LAMP реакция продолжается. (C)Вкладка усиления показывает показания флуоресценции во время усиления LAMP. (D)Вкладка Anneal показывает изменения в флуоресценции (производной) во время аннеальной фазы. (E) Вкладка Результаты показывает табллярное представление результатов LAMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные результаты LAMP, просмотренные в программном обеспечении LAMP. (A)Вкладка Профиль показывает запрограммированный температурный профиль. (B) Вкладка Температура показывает фактические температуры в образца скважин, как LAMP реакция продолжается. (C)Вкладка усиления показывает показания флуоресценции во время усиления LAMP. (D)Вкладка Скорость усиления показывает изменения в флуоресценции (коэффициент флуоресценции) во время усиления LAMP. (E) Вкладка Anneal показывает показания флуоресценции во время аннеальной фазы. (F)Вкладка Anneal Derivative показывает изменения в флуоресценции (производной) во время аннеальной фазы. (G) Вкладка Результат показывает табулированное представление результатов LAMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Мы представили здесь простой, быстрый, конкретный и чувствительный метод LAMP для скрининга и подтверждения сальмонеллы в пище животных и чистой культуре, соответственно. С удобством изотермальной смеси мастер, который содержит четыре ключевых реагентов, и готовый к использованию, в доме подготовлен грунтовка смесь, сборка реакции LAMP требует лишь несколько шагов трубы (Рисунок 1). Общее время времени времени времени, включая усиление и аннеальные фазы, составляет менее 38 мин(рисунок 2A,B и рисунок 3A,B). Положительные результаты отслеживаются с помощью флуоресценциив режиме реального времени (рисунок 2C и рисунок 3C,D)и могут быть обнаружены уже в 5мин 26. Аннеальная фаза служит дополнительным подтверждением специфичности LAMP, так как только образцы с правильным Tm (около 90 градусов по Цельсию) сообщаются как положительные(рисунок 2D,E и рисунок 3E'G). Чувствительность 1 клетка сальмонеллы в чистой культуре и Lt; 1 CFU/25 г в животной пище были зарегистрированы ранее26.

Как LAMP является довольно эффективным и генерирует большое количествоДНК 1, очень важно, чтобы лучшие лабораторные практики используются для предотвращения перекрестного загрязнения, которые могут включать в себя физическое разделение областей для подготовки LAMP мастер смеси и добавления шаблонов ДНК, избегая генерации аэрозолей, используя фильтр пипетки советы, изменение перчатки часто, и воздерживаться от открытия ЛАМП реакции труб после усиления.

Специфика этого метода Salmonella LAMP ранее была протестирована с использованием 300 бактериальных штаммов (247 сальмонеллы 185 серов и 53 не-сальмонеллы ) и продемонстрировала, что 100% конкретные26. Примечательно, что значительные различия в Tmax наблюдались между двумя видами сальмонеллы, S. enterica и Salmonella bongori, а также среди подвидов S. enterica, особенно subsp. arizonae (IIIa)26. Тем не менее, они по-прежнему являются действительными положительными результатами по правилам интерпретации результатов LAMP. В нашем многолабораторном совместном исследовании в сухом корме для собак, в которомприняли участие 14 аналитиков 19, образцы, имеющие несовместимые результаты в дублировать LAMP работает иногда наблюдается. Они обычно участвуют образцы с задержкойположительных результатов (Tмакс йgt; 15 мин). Повторение обоих запусков самостоятельно обычно решает проблему. Реже мы наблюдали образцы с правильным T m,но нет или нерегулярные значения Tmax (lt; 5 мин). Обычно это было вызвано пузырьками воздуха в реакционной трубке.

На протяжении всего жизненного цикла разработки метода LAMP, оценки, преколлаборативного исследования и многолабораторной проверки, мы наблюдали высокую толерантность LAMP к ингибиторам в различных животных пищевых или пищевыхматриц и культурных средств массовойинформации 4,19,22,23,24, подчеркивая надежность метода и сотрудничая многочисленные другие исследования в глобальноммасштабе 8. Это выше по сравнению с ПЦР или ПЦР в режиме реального времени, что обычно требует внутреннего контроля усиления, чтобы гарантировать, что отрицательные результаты не из-за матричногоингибирования 28. Кроме того, LAMP продемонстрировал аналогичную (или превосходящий) специфичность и чувствительность по сравнению с ПЦР или ПЦР в режиме реального времени в подавляющем большинствеисследований 8. Стоимость реагентов LAMP составляет около $ 1 за реакцию. Инструменты LAMP, используемые в этом протоколе, являются небольшими, низким уровнем обслуживания и портативными. Они могут обрабатывать любой изотермальный метод усиления, который использует целевое обнаружение путем измерения флуоресценции, LAMP включены. Используя программное обеспечение LAMP, всеобъемлющие отчеты могут быть сгенерированы в нескольких форматах (pdf, текст и изображение).

Проверка метода является критическим шагом, прежде чем новый метод может быть принят для регулярного использования. Примечательно, что протокол LAMP, о котором сообщается здесь, успешно завершил многобораторную проверку19. С недавним включением этого протокола LAMP в БАМ США Глава 5 Сальмонеллы27, ожидается,что метод получит гораздо более широкое использование, как как метод быстрого скрининга в животной пище и в качестве надежного метода подтверждения для предполагаемого salmonella изолирует от всех категорий продуктов питания.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Мнения, выраженные в этой рукописи, являются мнениями авторов и не обязательно отражают официальную политику Министерства здравоохранения и социальных служб, Управления по санитарной защите пищевых продуктов и медикаментов США или правительства США. Ссылка на любые коммерческие материалы, оборудование или процесс каким-либо образом не является утверждением, одобрением или рекомендацией Управления по продуктам питания и лекарственным путем.

Acknowledgments

Авторы благодарят членов FDA микробиологии Методы проверки подкомитета (MMVS) и бактериологических аналитических Руководство (BAM) Совета для критического рассмотрения сальмонеллы LAMP метод проверки исследований.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain heart infusion (BHI) broth BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 299070 Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Buffered peptone water (BPW) BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 218105 Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.
DNA AWAY Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 7010 Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.
Genie Explorer software OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom Version 2.0.6.3 Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.
Genie II or Genie III (LAMP instrument) OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom GEN2-02 or GEN3-02 A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.
Genie strip OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom OP-0008 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl.
Genie strip holder OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom GBLOCK Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA SA48-500 Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Heat block Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 88-860-022 Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction.
Incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 3960 Standard laboratory incubator.
ISO-001 isothermal master mix OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom ISO-001 An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).
Isopropanol Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA A416 Disinfects work surfaces.
LAMP primers Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA Custom LAMP primers with detailed information in Table 1.
Microcentrifuge Eppendorf North America, Hauppauge, NY 22620207 MiniSpin plus personal microcentrifuge.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 05-408-129 Standard microcentrifuge tubes.
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AM9938 Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA SS266-1 Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA R01202 Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Peptone water BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 218071 Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.
Pipettes and tips Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA Pipet Lite LTS series Standard laboratory pipettes and tips.
PrepMan Ultra sample preparation reagent Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4318930 A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.
Salmonella reference strain LT2 ATCC, Manassas, VA 700720 Salmonella reference strain used as positive control.
Trypticase soy broth (TSB) BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 211768 Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Vortex mixer Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY SI-0236 Standard laboratory vortex mixer.
Whirl-pak filter bag Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI B01318 Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
  2. Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
  3. Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
  4. Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
  5. Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
  6. Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
  7. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  8. Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
  9. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
  10. Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
  11. Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
  12. WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
  13. Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110 (2016).
  14. WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
  15. FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
  16. FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
  17. Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
  18. D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
  19. Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562 (2019).
  20. D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
  21. Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
  22. Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
  23. Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
  24. Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
  25. Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112 (2016).
  26. Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
  27. Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
  28. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).

Tags

Биология Выпуск 159 петля-опосредованное изотермальное усиление Сальмонеллы молекулярный метод скрининг животная пища подтверждение
Loop-Опосредованное изотермальное усиление для скрининга сальмонеллы <em>в пище</em> животных и подтверждение <em>сальмонеллы от культурной</em> изоляции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Domesle, K. J., Young, S. R., Yang,… More

Domesle, K. J., Young, S. R., Yang, Q., Ge, B. Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation. J. Vis. Exp. (159), e61239, doi:10.3791/61239 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter