Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lusgemedieerde isothermale versterking voor het screenen van salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van Salmonella uit cultuurisolatie

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61239
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Veterinary Medicine, U.S. Food and Drug Administration

Summary

Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) die brede belangstelling heeft getrokken voor het detectieveld van ziekteverwekkers. Hier presenteren we een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol als een snelle, betrouwbare en robuuste methode voor het screenen van Salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van vermoedelijke Salmonella uit cultuurisolatie.

Abstract

Lusgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is naar voren gekomen als een krachtige nucleïnezuurversterkingstest voor de snelle detectie van tal van bacteriële, schimmel-, parasitaire en virale middelen. Salmonella is een bacteriële ziekteverwekker van wereldwijd voedselveiligheidsprobleem, inclusief voedsel voor dieren. Hier wordt een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol gepresenteerd dat kan worden gebruikt om diervoeding snel te screenen op de aanwezigheid van Salmonella-besmetting en kan ook worden gebruikt om vermoedelijke Salmonella-isolaten te bevestigen die uit alle voedselcategorieën zijn teruggewonnen. De LAMP-test richt zich specifiek op het Salmonella-invasiegen (invA) en is snel, gevoelig en zeer specifiek. Template DNAs worden bereid uit verrijkingsbouillons van dierlijk voedsel of pure culturen van vermoedelijke Salmonella-isolaten. Het LAMP-reagensmengsel wordt bereid door een isothermische hoofdmix, primers, DNA-sjabloon en water te combineren. De LAMP-test wordt gedurende 30 minuten uitgevoerd bij een constante temperatuur van 65 °C. Positieve resultaten worden gecontroleerd via real-time fluorescentie en kunnen al vanaf 5 minuten worden gedetecteerd. De LAMP-test vertoont een hoge tolerantie voor remmers in dierlijk voedsel of kweekmedium en dient als een snelle, betrouwbare, robuuste, kosteneffectieve en gebruiksvriendelijke methode voor het screenen en bevestigen van Salmonella. De LAMP-methode is onlangs opgenomen in het Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5 van de Amerikaanse Food and Drug Administration.

Introduction

Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een nieuwe isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) uitgevonden in 2000 door een groep Japanse wetenschappers1. Door de vorming van een doelspecifieke stamlus-DNA-structuur tijdens de eerste stappen, gebruikt LAMP een strengverdringende DNA-polymerase om dit uitgangsmateriaal quasi-exponentieel efficiënt te versterken, wat resulteert in 109 kopieën van het doel in minder dan 1 h1. In vergelijking met polymerasekettingreactie (PCR), een veelgebruikte NAAT, heeft LAMP verschillende voordelen. Ten eerste worden LAMP-reacties uitgevoerd onder isothermale omstandigheden. Dit verdoezelen de noodzaak van een geavanceerd thermisch fietsinstrument. Ten tweede is LAMP zeer tolerant ten opzichte van kweekmedia en biologische stoffen2 met robuustheid die is aangetoond voor zowel klinische als voedseltoepassingen3,4. Dit vereenvoudigt de monstervoorbereiding en minimaliseert valse negatieve resultaten5. Ten derde is LAMP vatbaar voor meerdere detectieplatforms, zoals troebelheid, colorimetrie, bioluminescentie, fluorescentie en microfluïdica6. Ten vierde is LAMP zeer specifiek omdat het vier tot zes speciaal ontworpen primers gebruikt om zich te richten op zes tot acht specifieke regio 's1,7. Ten vijfde, LAMP is ultragevoelig en talrijke studies hebben gemeld zijn superieure gevoeligheid voor PCR of real-time PCR8. Ten slotte is LAMP sneller met veel tests die nu een standaardlooptijd van 30 minuten aannemen, terwijl PCR-achtige tests meestal 1−2 uur8nemen.

Deze aantrekkelijke kenmerken voedden de toepassing van LAMP in brede pathogene detectiegebieden, met inbegrip van in vitro diagnostiek 9, dierziektediagnostiek10, en voedsel - en milieutests11. Met name een TB-LAMP (LAMP voor Mycobacterium tuberculosis) is door de WHO aanbevolen als een geldige vervangingstest voor sputum-smear microscopie voor longtuberculosediagnoses in perifere omgevingen12. Lamp-toepassing breidt zich ook verder uit dan microbiële identificatie met de detectie van allergenen, diersoorten, medicijnresistentie, genetisch gemodificeerde organismen en pesticiden13.

Niet-tyfus salmonella is een zoönotische ziekteverwekker van aanzienlijke voedselveiligheid en volksgezondheidszorg wereldwijd14. Het is ook geïdentificeerd als een belangrijk microbieel gevaar in levensmiddelen voor dieren (d.w.z. dierlijk voedsel)15,16. Om salmonellaziekten/uitbraken door besmet menselijk voedsel en dierlijk voedsel te voorkomen, is het absoluut noodzakelijk om snelle, betrouwbare en robuuste methoden te hebben om Salmonella in verschillende matrices te testen. In het afgelopen decennium zijn internationaal aanzienlijke inspanningen geleverd voor de ontwikkeling en toepassing van Salmonella LAMP-tests in een breed scala aan voedselmatrices, zoals onlangs samengevat in een uitgebreide review8. Verschillende Salmonella LAMP-tests, waaronder de hier gepresenteerde, hebben met succes multilaboratoriumvalidatie voltooid volgens de gevestigde internationale richtlijnen17,18,19,20.

Onze Salmonella LAMP-test richt zich specifiek op het Salmonella-invasiegen invA (GenBank-toetredingsnummer M90846)21 en is snel, betrouwbaar en robuust in meerdere voedselmatrices4,22,23,24,25,26. De methode is gevalideerd in zes dierlijke voedselmatrices in een precollaboratieve studie26 en in droog hondenvoer in een samenwerkingsstudie met meerderelaboratoria 19. Als gevolg hiervan is de hier gepresenteerde Salmonella LAMP-methode onlangs opgenomen in het Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5 Salmonella27 van de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) om twee doelen te dienen, een als een snelle screeningmethode voor de aanwezigheid van Salmonella in dierlijk voedsel en twee als een betrouwbare bevestigingsmethode voor vermoedelijke Salmonella geïsoleerd van alle voedingsmiddelen.

Protocol

OPMERKING: Een LAMP-reactiemix bevat DNA-polymerase, buffer, MgSO4,dNTPs, primers, DNA-sjabloon en water. De eerste vier reagentia zijn opgenomen in een isothermische hoofdmix(Materialentabel). Primers worden in eigen huis voorgemengd om een primermix (10x) te worden. DNA-sjablonen kunnen worden bereid uit verrijkingsbouillons van dierlijke voedselmonsters voor screeningsdoeleinden of uit culturen van vermoedelijke Salmonella-isolaten voor bevestigingsdoeleinden. Bovendien zijn bij elke LAMP-run een positieve controle (DNA geëxtraheerd uit salmonellareferentiestammen, bijvoorbeeld Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) en een no template control (NTC; steriel moleculair water) opgenomen.

1. Voorbereiding van DNA-sjablonen

  1. Volg deze stappen om DNA-sjablonen van voedselverrijkingen voor dieren te bereiden.
    1. Weeg 25 g dierlijk voedselmonster (bijv. droog kattenvoer, droog hondenvoer, veevoer, paardenvoer, pluimveevoer en varkensvoer) in een steriele filterzak(Materialentabel),of gelijkwaardig. Plaats de zak in een grote container of rek voor ondersteuning tijdens de incubatie.
    2. Voeg 225 ml steriel gebufferd peptonwater (BPW) toe. Meng goed door wervelende en korte handmassage. Laat 60 ± 5 minuten op kamertemperatuur staan.
    3. Meng goed door te wervelen en bepaal de pH met een testpapier. Stel de pH zo nodig in op 6,8 ± 0,2 met steriele 1 N NaOH of 1 N HCl. Incubeer bij 35 ± 2 °C gedurende 24 ± 2 uur.
    4. Meng goed door de zak met dierlijke voedselverrijkingsbouillons te wervelen. Breng 1 ml van de gefilterde kant van de zak over in een microcentrifugebuis. Vortex kort.
    5. Haal DNA uit met behulp van een monsterpreparaatreagens (Materialentabel) als volgt.
      1. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 900 x g om grote deeltjes te verwijderen en supernatant over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis.
      2. Centrifugeer gedurende 2 minuten op 16.000 x g en gooi supernatant weg.
      3. Hang de pellet in 100 μL van het monsterbereidingsreagens en verwarm op 100 ± 1 °C gedurende 10 minuten in een droog hitteblok.
      4. Koel af tot kamertemperatuur en bewaar dna-monsters bij -20 °C.
  2. Volg deze stappen om DNA-sjablonen van vermoedelijke Salmonella-culturen voor te bereiden.
    1. Verkrijg vermoedelijke Salmonella-isolaten uit kweekisolatie in alle voedingsmiddelen na BAM Chapter 5 Salmonella section D: Isolation of Salmonella27van de FDA .
    2. Inenten vermoedelijke Salmonella-isolaten op een niet-selectieve agarplaat (bijv. bloedagar, voedingsagar en trypticase soja-agar) en incuberen bij 35 ± 2 °C gedurende 24 ± 2 uur.
    3. Breng meerdere enkele kolonies over op 5 ml trypticase sojabouillon (TSB) of hersenhartinfusie (BHI) bouillon en incubeer bij 35 ± 2 °C gedurende 16 ± 2 uur.
      OPMERKING: Deze stap kan optioneel zijn als de vermoedelijke Salmonella-cultuur zuiver is. In dat geval kunnen DNA-sjablonen worden voorbereid door meerdere enkele kolonies in 5 ml TSB op te schorten en 500 μL van de suspensie gedurende 10 minuten op 100 ± 1 °C te verwarmen in een droog warmteblok. Ga verder met stap 5 hieronder.
    4. Breng 500 μL van de nachtcultuur over in een microcentrifugebuis en verwarm op 100 ± 1 °C gedurende 10 minuten in een droog hitteblok.
    5. Koel af tot kamertemperatuur en bewaar isolaat-DNA-extracten bij -20 °C.
  3. Om positief controle-DNA voor te bereiden, volgt u vergelijkbare stappen als hierboven voor het voorbereiden van DNA-sjablonen uit vermoedelijke Salmonella-culturen met één extra verdunningsstap.
    1. Inenten S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) of salmonella referentiestammen op een niet-selectieve agarplaat (bijv. bloedagar, voedingsagar en trypticase soja-agar) en incuberen bij 35 ± 2 °C gedurende 24 ± 2 uur.
    2. Breng meerdere enkele kolonies over op 5 ml TSB- of BHI-bouillon en incubeer bij 35 ± 2 °C gedurende 16 ± 2 uur om ~ 109 CFU / ml te bereiken.
    3. Verdun de nachtcultuur in 0,1% peptonwater om ~ 107 CFU / ml te verkrijgen.
    4. Breng 500 μL van deze verdunning over in een microcentrifugebuis en verwarm op 100 ± 1 °C gedurende 10 minuten in een droog warmteblok.
    5. Koel af tot kamertemperatuur en bewaar positief controle-DNA bij -20 °C.

2. Bereiding van primermix (10x)

  1. Verkrijg commercieel gesynthetiseerde LAMP primers (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF en Sal4-LB) met standaard ontzoutingszuivering(tabel 1).
Primernaam Beschrijving Opeenvolging (5'-3') Lengte (bp)
Sal4-F3 Voorwaartse buitenprimer GAACGTGTCGCGGAAGTC 18
Sal4-B3 Achterwaartse buitenprimer CGGCAATAGCGTCACCTT 18
Sal4-FIP Voorwaartse binnenprimer GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG 38
Sal4-BIP Achterwaartse binnenprimer GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC 38
Sal4-LF Loop voorwaarts primer TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG 25
Sal4-LB Lus achterwaartse primer AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG 21

Tabel 1: LAMP-primers voor het screenen van Salmonella in diervoeding en het bevestigen van Salmonella uit cultuurisolatie. De primers zijn ontworpen op basis van de Salmonella invA-reeks (GenBank-toetredingsnummer M90846).

  1. Bereid voorraadoplossingen van elke primer (100 μM) door de primer te rehydrateren met de juiste hoeveelheid steriel moleculair water. Meng goed door vortexing voor 10 s en bewaar bij -20 °C (-80 °C voor langdurige opslag).
  2. Bereid de primermix (10x) volgens een werkblad (tabel 2). Voeg de juiste volumes primervoorraadoplossingen en steriel water van moleculaire kwaliteit toe aan een microcentrifugebuis. Meng alle reagentia goed door vortexing gedurende 10 s.
Component Voorraad conc. (μM) Primermix conc. (μM) Volume (μL)
Sal4-F3 primer 100 1 10
Sal4-B3 primer 100 1 10
Sal4-FIP primer 100 18 180
Sal4-BIP primer 100 18 180
Sal4-LF primer 100 10 100
Sal4-LB primer 100 10 100
Moleculair water N/a N/a 420
Totale N/a N/a 1000

Tabel 2: Werkblad voor het bereiden van de LAMP primer mix (10x). De primers staan vermeld in tabel 1.

  1. Aliquot de 10x primer mix tot 500 μL per microcentrifuge tube en bewaren bij -20 °C.

3. Montage van een LAMP-reactie

OPMERKING: Om kruisbesmetting te voorkomen, wordt het ten zeerste aanbevolen om de gebieden die worden gebruikt voor het bereiden van de LAMP-mastermix fysiek te scheiden en DNA-sjablonen toe te voegen. Figuur 1 is een LAMP-diagram.

Figure 1
Figuur 1: Een schematisch schema van de Salmonella LAMP workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Voorbereiding en uitvoering
    1. Schone bank met isopropanol en een DNA- en DNase-afbrekende oplossing(Materialentabel). Reinig pipetten en buisstriphoudersmetde DNA- en DNase-vernederende oplossing.
    2. Ontdooi de isothermische hoofdmix, primermix (10x), moleculair water, positief controle-DNA en DNA-sjablonen bij kamertemperatuur.
    3. Schakel het LAMP-instrument(Materialentabel) inen tik op het openingsscherm om toegang te krijgen tot het startscherm. Volg deze stappen om een uitvoering te maken.
      OPMERKING: Een model van het LAMP-instrument heeft 2 blokken (A en B) met 8 monsters in elk blok en een ander model heeft een enkel blok dat plaats biedt aan 8 monsters(Materialentabel).
      1. Tik op LAMP+Anneal en selecteer Bewerken om voorbeeldinformatie in te voeren.
        OPMERKING: Het standaard LAMP-uitvoeringsprofiel bestaat uit versterking bij 65 °C gedurende 30 minuten en een gloeifase van 98 °C tot 80 °C met 0,05 °C aftakking per seconde.
      2. Tik op elke voorbeeldrij om de cursor te activeren en relevante voorbeeldinformatie in te voeren, met behulp van het AB-blokpictogram om te schakelen tussen de twee LAMP-instrumentblokken.
      3. Tik op het pictogram Controleren wanneer alle voorbeeldgegevens zijn ingevoerd.
        OPMERKING: Optioneel kan de uitvoeringsinstelling (ook wel 'Profiel' genoemd, die voorbeeldinformatie bevat samen met het standaard LAMP-uitvoeringsprofiel) worden opgeslagen voor later gebruik. Tik op het pictogram Opslaan en geef het profiel een unieke naam. Wanneer u de volgende keer dezelfde set voorbeelden test, kan een nieuwe uitvoering worden gestart met behulp van het opgeslagen profiel. Tik op het pictogram Map linksonder in het startscherm en selecteer Profiel om opgeslagen profielen te laden.
  2. LAMP-reactieassemblage
    OPMERKING: Wanneer u beide LAMP-instrumentblokken (A en B, in totaal 16 monsters) gebruikt, bereidt u de LAMP-hoofdmix voor op 18 monsters. Als u slechts één LAMP-instrumentenblok (in totaal 8 monsters) gebruikt, bereidt u de LAMP-hoofdmix voor op 10 monsters. Voor andere monsternummers past u het volume dienovereenkomstig aan om pipetverlies op te vangen. Neem altijd een positieve controle en een NTC op in elke LAMP-run. Duplicaattests van elk monster in onafhankelijke LAMP-uitvoeringen worden aanbevolen.
    1. Bereid de LAMP-hoofdmix volgens een werkblad(tabel 3). Voeg de juiste volumes van de isothermische mastermix, primermix en moleculair water toe aan een microcentrifugebuis en vortex zachtjes gedurende 3 s. Centrifuge kort.
    2. Plaats de buisstrip in de striphouder en verdeel 23 μL van de LAMP-hoofdmix over elke put.
    3. Vortex alle DNA sjablonen en centrifugeren kort. Voeg 2 μL DNA-sjabloon toe aan de juiste put en sluit goed aan.
    4. Verwijder de buisstrip van de houder en tik op de pols om er zeker van te zijn dat alle reagentia zich aan de onderkant van de buis hebben samengevoegd.
    5. Plaats de buisstrip in het LAMP-instrumentenblok(en), zodat de doppen goed vastzitten voordat u het deksel sluit.
Component Werken conc. Laatste reactie conc. Volume per monster (μL) Volume voor 18 monsters (μL) Volume voor 10 monsters (μL)
ISO-001 isothermische mastermix 1.67x 1x 15 270 150
Primer mix 10x 1x 2.5 45 25
Moleculair water N/a N/a 5.5 99 55
Mastermix subtotaal N/a N/a 23 414 230
DNA-sjabloon N/a N/a 2 N/a N/a

Tabel 3: Werkblad voor het bereiden van de LAMP-reactiemix. De primermix (10x) wordt bereid volgens tabel 2 met behulp van voorraadoplossingen van primers die in tabel 1zijn vermeld .

4. LAMP-uitvoering

OPMERKING: Tijdens een LAMP-run worden fluorescentiemetingen verkregen via het FAM-kanaal. De tijd-piekwaarden (Tmax; min) worden automatisch bepaald door het instrument voor het tijdspunt wanneer de fluorescentieverhouding de maximale waarde van de versterkingssnelheidscurve bereikt. De Tm (°C) is de smelt-/gloeitemperatuur van het uiteindelijke versterkte product.

  1. Klik op het pictogram Uitvoeren rechtsboven in het scherm en selecteer de blokken met buisstrip(s) om de LAMP-uitvoering te starten.
  2. Optioneel, terwijl de reactie wordt uitgevoerd, tikt u op de tabbladen Temperatuur, Versterkingen Gloeien om dynamische wijzigingen van verschillende parameters te zien tijdens de LAMP-uitvoering.
  3. Zodra de uitvoering is voltooid, tikt u op de tabbladen Versterking en Gloeien om volledige versterkings- en gloeicurven te zien en tikt u op het tabblad Resultaten om de resultaten weer te geven.
  4. Optioneel, voor het bijhouden van records, registreert u het uitvoeringsnummer linksboven in het scherm, met behulp van de indeling van "instrument serial number_run number", bijvoorbeeld "GEN2-2209_0030.".

5. Interpretatie van LAMP-resultaten

OPMERKING: LAMP-resultaten kunnen rechtstreeks en/of met behulp van een LAMP-software(Materialentabel)op het LAMP-instrumentenpaneel worden bekeken.

  1. Volg deze stappen om lampresultaten op het instrumentenpaneel te interpreteren.
    1. Tik op het pictogram Map linksonder in het startscherm en selecteer Logboek om naar de bestandslocatie te navigeren om de LAMP-run van belang te laden.
      OPMERKING: De LAMP-runs zijn georganiseerd op datum, te beginnen met het jaar.
    2. Observeer de vijf tabbladen die aan elke uitvoering zijn gekoppeld: Profiel, Temperatuur, Versterking, Gloeienen Resultaten.
      OPMERKING: De tabbladen Profiel en Temperatuur tonen respectievelijk geprogrammeerde en werkelijke temperaturen in de monsterputten terwijl de LAMP-reactie plaatsvindt. De tabbladen Amplificatie en Gloeien tonen fluorescentiemetingen en veranderingen in fluorescentie tijdens respectievelijk de amplificatie- en gloeifasen. Op het tabblad Resultaten ziet u een tabelweergave van de LAMP-resultaten.
    3. Tik op het tabblad Resultaten om lampresultaten voor elke put te bekijken.
      OPMERKING: Er zijn drie kolommen (Well, Amplification en Anneal). De kolom "Versterking" toont de tijd-tot-piekwaarden (Tmax; min:sec) voor elk monster ("Goed") en de kolom "Gloeien" toont de smelt-/gloeitemperaturen (Tm; °C) voor elk versterkt product in die put.
    4. Interpreteer de LAMP-resultaten en rapporteer de definitieve LAMP-resultaten als volgt.
      1. Onderzoek eerst de controleputten. De NTC-put moet blanco Tmax hebben, terwijl Tm ofwel leeg kan zijn (beide LAMP-instrumentmodellen) of < 83 °C (alleen voor het LAMP-instrumentmodel met twee blokken). De positieve controleput moet Tmax tussen 5 en 10 min en Tm rond 90 °C hebben.
      2. Onderzoek de monsterputten. Alle monsters met de juiste Tm (ongeveer 90 °C) en Tmax (tussen 5−30 min) worden als positief beschouwd voor Salmonella.
      3. Rapporteer definitieve LAMP-resultaten op basis van resultaten van dubbele uitvoeringen. Als de dubbele uitvoeringen consistente resultaten hebben, kunnen de uiteindelijke LAMP-resultaten worden gerapporteerd. Als dubbele uitvoeringen inconsistent zijn, herhaalt u beide uitvoeringen onafhankelijk. Als de resultaten nog steeds inconsistent zijn, moet het monster als vermoedelijk positief voor Salmonella worden beschouwd en moet het een kweekbevestiging ondergaan.
  2. Volg deze stappen om LAMP-resultaten te interpreteren met behulp van de software.
    1. Klik op het computerpictogram in het linkerpaneel en navigeer naar de bestandslocatie om de LAMP-run van belang te laden.
      OPMERKING: De computer waarop de software is geïnstalleerd, hoeft niet op het LAMP-instrument te worden aangesloten om lampresultaten te analyseren, d.w.z. externe toegang is beschikbaar. De LAMP-runs zijn georganiseerd op datum.
    2. Let op de zeven tabbladen die aan elke run zijn gekoppeld: Profiel, Temperatuur, Amplificatie, Amplificatiesnelheid, Gloei -, Gloeiderivaaten Resultaat.
      OPMERKING: Net als bij de weergave van het instrumentenpaneel tonen de tabbladen Profiel en Temperatuur respectievelijk geprogrammeerde en werkelijke temperaturen in de monsterputten naarmate de LAMP-reactie vordert. De tabbladen Amplification/Amplification Rate en Anneal/Anneal Derivative tonen fluorescentiemetingen of veranderingen in fluorescentie tijdens respectievelijk de amplificatie- en gloeifasen. Het tabblad Resultaten toont een tabelweergave van de LAMP-resultaten die enigszins afwijken van de weergave van het instrumentenpaneel.
    3. Tik op het tabblad Versterkingssnelheid om een grafische weergave van de fluorescentieverhoudingen op tijd weer te geven. Klik op het pictogram Instelling rechtsboven in het scherm en pas de "Peak Detection Threshold Ratio" aan van 0,020 tot 0,010.
      OPMERKING: De aanpassing is nodig om ervoor te zorgen dat alle geldige pieken worden geïdentificeerd en de resultaten die met behulp van de software worden verkregen, overeenkomen met de resultaten die op het instrumentenpaneel worden weergegeven.
    4. Tik op het tabblad Resultaat om de LAMP-resultaten voor elke put te bekijken.
      OPMERKING: Er zijn vier kolommen (grafieknaam, bronnummer, bronnaam en piekwaarde). Het bovenste gedeelte van de kolom "Piekwaarde" toont "Amp Time" (Tmax; min:sec) voor elk monster ("Well Name") terwijl het onderste gedeelte "Anneal Derivative" (Tm; °C) toont voor elk versterkt product in die put.
    5. Interpreteer de LAMP-resultaten en rapporteer de definitieve LAMP-resultaten volgens vergelijkbare stappen als bij het gebruik van het instrumentenpaneel, met één uitzondering dat de NTC-put en andere negatieve monsters lege Tm moeten hebben, omdat de LAMP-software-instellingen die Tm < 83 °C-resultaten elimineren. Evenzo worden alle monsters met de juiste Tm (ongeveer 90 °C) en Tmax (tussen 5−30 min) als positief beschouwd voor Salmonella.

Representative Results

Figuur 2 en figuur 3 tonen representatieve LAMP-grafieken/-tabellen die op beide platforms worden weergegeven. In deze LAMP-run zijn de monsters S1 tot en met S6 10-voudige seriële verdunningen van S. enterica serovar Infantis ATCC 51741, variërend van 1,1 x 106 CFU tot 11 CFU per reactie. Positieve controle is S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) bij 1,7 x 104 KVE per reactie en NTC is water van moleculaire kwaliteit.

Zoals weergegeven in figuur 2E en figuur 3G,zijn zowel NTC- als pc-putten geldige bedieningselementen. De NTC-put heeft blanco Tmax terwijl Tm < 83 °C op het LAMP-instrumentenpaneel staat en leeg in de LAMP-software, wat een negatief resultaat suggereert. De pc goed heeft Tmax van 7 min 45 sec en Tm van ~ 90 °C op beide platforms, wat een positief resultaat suggereert. De monsters S1 tot en met S6 hebben een maximum van 6 min 30 sec en 12 min 15 sec, allemaal salmonella-positief.

Na dubbele uitvoeringen van dezelfde reeks monsters worden de definitieve LAMP-resultaten voor deze monsters gerapporteerd. Deze representatieve LAMP-run toont aan dat LAMP salmonella met succes detecteert met een breed scala aan concentraties in de monsters.

Figure 2
Figuur 2: Representatieve LAMP-resultaten weergegeven op het LAMP-instrumentenpaneel. (A) Het tabblad Profiel toont het geprogrammeerde temperatuurprofiel. (B) Het tabblad Temperatuur toont de werkelijke temperaturen in de monsterputten naarmate de LAMP-reactie vordert. (C) Het tabblad Versterking toont fluorescentiemetingen tijdens lampversterking. (D) Het tabblad Gloeien toont veranderingen in fluorescentie (derivaat) tijdens de gloeifase. (E) Het tabblad Resultaten toont een tabelweergave van de LAMP-resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve LAMP-resultaten bekeken in de LAMP-software. (A) Het tabblad Profiel toont het geprogrammeerde temperatuurprofiel. (B) Het tabblad Temperatuur toont de werkelijke temperaturen in de monsterputten naarmate de LAMP-reactie vordert. (C) Het tabblad Versterking toont fluorescentiemetingen tijdens lampversterking. (D) Het tabblad Versterkingssnelheid toont veranderingen in fluorescentie (fluorescentieverhouding) tijdens lampversterking. (E) Het tabblad Gloeien toont fluorescentiemetingen tijdens de gloeifase. (F) Het tabblad Gloeiderivaat toont veranderingen in fluorescentie (derivaat) tijdens de gloeifase. (G) Het tabblad Resultaat toont een tabelweergave van de LAMP-resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

We hebben hier een eenvoudige, snelle, specifieke en gevoelige LAMP-methode gepresenteerd voor het screenen en bevestigen van Salmonella in respectievelijk dierlijk voedsel en pure cultuur. Met het gemak van een isothermische hoofdmix die vier belangrijke reagentia bevat, en een kant-en-klare, in-house bereide primermix, vereist het monteren van een LAMP-reactie slechts een paar pipettingstappen (figuur 1). De totale looptijd inclusief versterkings- en gloeifasen is minder dan 38 min (figuur 2A,B en figuur 3A,B). Positieve resultaten worden gecontroleerd via real-time fluorescentie(figuur 2C en figuur 3C,D) en kunnen al worden gedetecteerd vanaf 5 min26. De gloeifase dient als een extra bevestiging van de specificiteit van de LAMP, aangezien alleen monsters met de juiste Tm (ongeveer 90 °C) als positief worden gerapporteerd (figuur 2D,E en figuur 3E−G). Gevoeligheden van 1 Salmonellacel in zuivere cultuur en < 1 KVE/25 g in dierlijk voedsel zijn eerder gemeld26.

Omdat LAMP vrij effectief is en een grote hoeveelheid DNA1genereert, is het van cruciaal belang dat de beste laboratoriumpraktijken worden gebruikt om kruisbesmetting te voorkomen, waaronder het fysiek scheiden van de gebieden voor het bereiden van de LAMP-hoofdmix en het toevoegen van DNA-sjablonen, het vermijden van het genereren van aerosolen, het gebruik van filterpipetpunten, het vaak wisselen van handschoenen en het onthouden van het openen van LAMP-reactiebuizen na versterking.

De specificiteit van deze Salmonella LAMP-methode werd eerder getest met behulp van 300 bacteriestammen (247 Salmonella van 185 serovars en 53niet-Salmonella) en bleek 100% specifiek te zijn26. Met name werden significante verschillen in Tmax waargenomen tussen de twee Salmonella-soorten, S. enterica en Salmonella bongori, en tussen S. enterica-ondersoorten, met name subsp. arizonae (IIIa)26. Niettemin waren dit nog steeds geldige positieve resultaten volgens de regels voor de interpretatie van LAMP-resultaten. In onze multilaboratorium samenwerkingsstudie in droog hondenvoer waarbij 14 analisten19betrokken waren, werden af en toe monsters waargenomen met inconsistente resultaten in dubbele LAMP-runs. Het ging meestal om monsters met vertraagde positieve resultaten(Tmax > 15 min). Als u beide uitvoeringen onafhankelijk herhaalt, is het probleem meestal opgelost. Meer zelden observeerden we monsters met de juiste Tm maar geen of onregelmatige Tmax waarden (< 5 min). Dit werd meestal veroorzaakt door luchtbellen in de reactiebuis.

Gedurende de levenscyclus van lamp methode ontwikkeling, evaluatie, precollaboratieve studie, en multi-laboratorium validatie, hebben we waargenomen hoge tolerantie van LAMP voor remmers in verschillende dierlijke voedsel of voedsel matrices en cultuur media4,19,22,23,24,het benadrukken van de robuustheid van de methode en het samenwerken van tal van andere studies op een wereldwijde schaal8. Dit is superieur in vergelijking met PCR of real-time PCR, die meestal een interne versterkingscontrole vereist om ervoor te zorgen dat negatieve resultaten niet te wijten zijn aan matrixremming28. Voorts vertoonde LAMP in de overgrote meerderheid van de studies een vergelijkbare (of superieure) specificiteit en gevoeligheid in vergelijking met PCR of real-time PCR8. De kosten van LAMP-reagentia bedragen ongeveer $ 1 per reactie. De LAMP-instrumenten die in dit protocol worden gebruikt, zijn klein, onderhoudsarm en draagbaar. Ze kunnen omgaan met elke isothermale versterkingsmethode die doeldetectie gebruikt door fluorescentiemeting, inclusief LAMP. Met behulp van de LAMP-software kunnen uitgebreide rapporten in meerdere formaten worden gegenereerd (pdf, tekst en afbeelding).

Methodevalidatie is een kritieke stap voordat een nieuwe methode kan worden gebruikt voor routinematig gebruik. Het is opmerkelijk dat het hier gerapporteerde LAMP-protocol de validatie met meerdere laboratoria met succes heeft voltooid19. Met de recente opname van dit LAMP-protocol in bam hoofdstuk 5 Salmonella27van de Amerikaanse FDA , wordt verwacht dat de methode veel breder zal worden gebruikt, zowel als een snelle screeningmethode in diervoeding als als een betrouwbare bevestigingsmethode voor vermoedelijke Salmonella-isolaten uit alle voedselcategorieën.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben. De meningen in dit manuscript zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs het officiële beleid van het Ministerie van Volksgezondheid en Menselijke Diensten, de Amerikaanse Food and Drug Administration of de Amerikaanse regering. Verwijzing naar commerciële materialen, apparatuur of processen vormt op geen enkele manier goedkeuring, goedkeuring of aanbeveling door de Food and Drug Administration.

Acknowledgments

De auteurs danken leden van de FDA's Microbiology Methods Validation Subcommittee (MMVS) en Bacteriological Analytical Manual (BAM) Council voor het kritisch beoordelen van Salmonella LAMP-methodevalidatiestudies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain heart infusion (BHI) broth BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 299070 Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Buffered peptone water (BPW) BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 218105 Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.
DNA AWAY Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 7010 Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.
Genie Explorer software OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom Version 2.0.6.3 Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.
Genie II or Genie III (LAMP instrument) OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom GEN2-02 or GEN3-02 A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.
Genie strip OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom OP-0008 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl.
Genie strip holder OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom GBLOCK Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA SA48-500 Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Heat block Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 88-860-022 Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction.
Incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 3960 Standard laboratory incubator.
ISO-001 isothermal master mix OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom ISO-001 An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).
Isopropanol Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA A416 Disinfects work surfaces.
LAMP primers Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA Custom LAMP primers with detailed information in Table 1.
Microcentrifuge Eppendorf North America, Hauppauge, NY 22620207 MiniSpin plus personal microcentrifuge.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 05-408-129 Standard microcentrifuge tubes.
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AM9938 Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA SS266-1 Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA R01202 Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Peptone water BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 218071 Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.
Pipettes and tips Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA Pipet Lite LTS series Standard laboratory pipettes and tips.
PrepMan Ultra sample preparation reagent Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4318930 A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.
Salmonella reference strain LT2 ATCC, Manassas, VA 700720 Salmonella reference strain used as positive control.
Trypticase soy broth (TSB) BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 211768 Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Vortex mixer Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY SI-0236 Standard laboratory vortex mixer.
Whirl-pak filter bag Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI B01318 Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
  2. Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
  3. Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
  4. Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
  5. Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
  6. Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
  7. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  8. Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
  9. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
  10. Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
  11. Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
  12. WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
  13. Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110 (2016).
  14. WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
  15. FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
  16. FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
  17. Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
  18. D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
  19. Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562 (2019).
  20. D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
  21. Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
  22. Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
  23. Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
  24. Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
  25. Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112 (2016).
  26. Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
  27. Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
  28. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).

Tags

Biologie lusgemedieerde isothermale versterking Salmonella,moleculaire methode screening dierlijk voedsel bevestiging
Lusgemedieerde isothermale versterking voor het screenen van <em>salmonella</em> in dierlijk voedsel en het bevestigen van <em>Salmonella</em> uit cultuurisolatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Domesle, K. J., Young, S. R., Yang,… More

Domesle, K. J., Young, S. R., Yang, Q., Ge, B. Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation. J. Vis. Exp. (159), e61239, doi:10.3791/61239 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter