Summary
루프 매개 이소성 증폭(LAMP)은 병원체 검출 분야에 대한 폭넓은 관심을 받고 있는 이더스말 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 여기서, 우리는 동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 추정 살모넬라를 확인하는 신속하고 신뢰할 수 있고 강력한 방법으로 다연구소 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
루프 매개 이더스말 증폭(LAMP)은 수많은 세균성, 곰팡이, 기생및 바이러스 성 제제의 신속한 검출을 위한 강력한 핵산 증폭 시험으로 부상하고 있다. 살모넬라는 동물을 위한 음식을 포함하여 세계적인 음식 안전 관심사의 세균성 병원체입니다. 여기에 제시된 다중 실험실 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜은 살모넬라 오염의 존재를 위해 동물 사료를 신속하게 선별하는 데 사용될 수 있으며 모든 식품 범주에서 회수된 추정 살모넬라 분리를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. LAMP 분석은 특히 살모넬라 침략유전자(invA)를대상으로 하며 신속하고 민감하며 매우 특이적입니다. 템플릿 DNA는 동물 사료의 농축 국물 또는 추정 살모넬라 분리의 순수한 문화에서 제조됩니다. LAMP 시약 혼합물은 이더스 말 마스터 믹스, 프라이머, DNA 템플릿 및 물을 결합하여 제조됩니다. LAMP 분석은 30 분 동안 65 °C의 일정한 온도에서 실행됩니다. 긍정적인 결과는 실시간 형광을 통해 감시되고 5 분 일찍 검출될 수 있습니다. LAMP 분석법은 동물성 식품 또는 배양 배지의 억제제에 대한 높은 내성을 나타내며, 살모넬라를선별하고 확인하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있고 견고하며 비용 효율적이며 사용자 친화적인 방법으로 사용된다. LAMP 방법은 최근 미국 식품의약국의 세균분석 매뉴얼(BAM) 제5장에 통합되었습니다.
Introduction
루프 매개 이더스말 증폭(LAMP)은 일본 과학자1의그룹에 의해 2000년에 발명된 새로운 이더실 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 초기 단계에서 표적 특이적 줄기 루프 DNA 구조의 형성을 통해 LAMP는 가닥 변위 DNA 폴리머라아제를 사용하여 이 시작 물질준기하수수체를 효율적으로 증폭시켜 1h1미만의 표적109카피를 생성한다. 널리 사용되는 NAAT인 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 비교하여 LAMP는 몇 가지 장점을 가지고 있습니다. 첫째, 램프 반응은 이소성 조건하에서 수행됩니다. 이것은 정교한 열 사이클링 장비의 필요성을 없애. 둘째, LAMP는 임상 및 식품 응용 분야3,4모두에 대해 입증된 견고성을 갖춘 배양 매체 및 생물학적 물질2에 매우관대하다. 이렇게 하면 샘플 준비를 단순화하고 잘못된 음수 결과5를최소화합니다. 셋째, LAMP는 탁도, 색도, 생물발광, 형광, 및미세유체6와같은 다중 검출 플랫폼에 순종한다. 넷째, LAMP는 특별히 설계된 프라이머 4~6개에 사용하여 6~8개의 특정 영역1,7을대상으로 하기 때문에 매우 특이적이다. 다섯째, LAMP는 매우 민감하며 수많은 연구에서 PCR 또는 실시간 PCR8에대한 우수한 민감성을 보고했습니다. 마지막으로, LAMP는 PCR 형 분석이 일반적으로 1-2 h8을취하는 동안 30 분 표준 런타임을 채택하는 많은 분석으로 빠릅니다.
이러한 매력적인 특징은 체외 진단9,동물질환 진단10,식품 및 환경 검사11을포함한 광범위한 병원체 검출 영역에서 LAMP의 적용을 촉진시켰다. 특히, 결핵결핵을 위한결핵(LAMP)은 WHO가 말초 설정에서 폐결핵 진단을 위한 가래-얼룩 현미경검사에 대한 유효한 대체 시험으로서 추천되었다(12) LAMP 응용 프로그램은 또한 알러지 유발 물질, 동물 종, 약물 내성, 유전자 변형 유기체 및 살충제13의검출을 포함하도록 미생물 식별을 넘어 확장됩니다.
nontyphoidal 살모넬라는 전 세계적으로14의실질적인 식품 안전 및 공중 보건 문제의 동물성 병원체입니다. 또한 동물(즉, 동물성 식품)15,16을위한 식품의 중요한 미생물 위험으로 확인되었다. 살모넬라 병/발병이 오염된 인간 음식과 동물 사료로부터 발생하지 않도록 하기 위해 다양한 행렬에서 살모넬라를 테스트하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있으며 강력한 방법을 갖는 것이 필수적입니다. 지난 10 년 동안, 최근 광범위한 검토8에요약된 바와 같이, 다양한 식품 행렬에서 살모넬라 LAMP 에세이의 개발 및 적용에 국제적으로 상당한 노력이 이루어졌습니다. 여기에 제시된 것을 포함하여 몇몇 살모넬라 LAMP 소는,잘 확립된 국제 지침17,18,19,20에따라 다중 실험실 검증을 성공적으로 완료했습니다.
당사의 살모넬라 램프 분석은 특별히 살모넬라 침공 유전자 invA(GenBank 가입 번호 M90846)21을 대상으로 하며, 여러 식품 행렬4,22,23,24,25,26에서빠르고 신뢰할 수 있고 견고하다. 이 방법은 사전 협업 연구26및 다연구소 협력 연구에서 건식 개사료(19)에서6개의 동물사료 행렬에서 검증되었다. 그 결과, 여기에 제시된 살모넬라 램프 방법은 최근 미국 식품의약국(FDA)의 세균성 분석 매뉴얼(BAM) 제5장 살모넬라(27)에 통합되어 동물식품에 살모넬라의 존재에 대한 신속한 검진 방법으로, 2개는 모든 식품에서 분리된 살모넬라를 위한 신뢰할 수 있는 확인 방법으로 사용된다.
Protocol
참고: LAMP 반응 믹스에는 DNA 폴리머라제, 완충, MgSO4,dNTP, 프라이머, DNA 템플릿 및 물이 포함됩니다. 처음 네 시약은 이더스 말 마스터 믹스(재료의 표)에포함되어 있습니다. 프라이머는 사내에서 미리 섞여 프라이머 믹스(10x)가 됩니다. DNA 템플릿은 스크리닝 목적을 위해 동물 성 식품 샘플의 농축 국물 또는 확인 목적으로 분리된 추정 살모넬라 의 배양으로부터 제조될 수 있습니다. 또한, 임의의 살모넬라 기준 균주에서 추출된 DNA(예를 들어, 살모넬라 엔테리카 세로바 티피무륨 ATCC 19585 [LT2]) 및 템플릿 제어(NTC; 멸균 분자등급 수)가 모든 LAMP 실행에 포함된다.
1. DNA 템플릿 준비
- 동물 성 식품 농축에서 DNA 템플릿을 준비하려면 다음 단계를 따르십시오.
- 무균 동물 사료 샘플 25 g (예를 들어, 마른 고양이 사료, 마른 개 사료, 가축 사료, 말 사료, 가금류 사료 및 돼지 사료)를 멸균 필터 백(재료 의 표)또는 동등한 무게. 가방을 큰 용기 나 랙에 넣어 인큐베이션 중에 지원을 합니다.
- 멸균 버퍼드 펩톤 워터(BPW)의 225mL를 추가합니다. 소용돌이와 간단한 손 마사지로 잘 섞으세요. 실온에서 60± 5분 동안 방치하십시오.
- 소용돌이에 잘 섞어서 pH를 테스트 용지로 결정합니다. pH를 조정하면 멸균 1 N NaOH 또는 1 N HCl. 인큐베이터35 ± 2°C에서 24± 2h로 6.8 ± 0.2로 조정하십시오.
- 동물 성 식품 농축 국물을 포함하는 가방을 소용돌이에 의해 잘 섞는다. 가방의 여과된 측에서 마이크로센심분리기 튜브로 1mL를 옮길 수 있습니다. 소용돌이가 짧게.
- 샘플 준비시약(재료표)을이용하여 DNA를 추출하여 다음과 같이 추출한다.
- 900 x g의 원심분리기는 1분 동안 큰 입자를 제거하고 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 상류체를 전달합니다.
- 원심 분리기 는 16,000 x g에서 2 분 동안 및 상류부를 폐기하십시오.
- 100 μL의 샘플 준비 시약및 100± 1°C에서 10분 동안 건조 한 열 블록에서 펠릿을 일시 중단한다.
- 실온으로 냉각하고 샘플 DNA 추출물을 -20 °C에서 저장합니다.
- 추정 살모넬라 문화에서 DNA 템플릿을 준비하려면, 다음 단계를 따르십시오.
- FDA의 BAM 챕터 5 살모넬라 섹션 D: 살모넬라 27의격리에 따라 모든 식품에서 문화 격리로부터 분리된 추정 살모넬라를 얻습니다.
- 비선택적 식기 접시(예: 혈액 식천, 영양 천 및 트립티케이스 대두 천)에 접종한 추정 살모넬라를 24± 2h에 35± 2°C로 분리한다.
- 트라이피케이스 대두국(TSB) 또는 뇌심장주입(BHI) 국물(BHI) 국물(BHI) 국물및 배양량의 5mL로 의 한 가지 단일 콜로니를 16 ± 2h에 35± 2°C로 이송한다.
참고: 이 단계는 추정 살모넬라 문화가 순수한 경우 선택 사항이 될 수 있습니다. 이 경우 DNA 템플릿은 TSB 5mL에서 여러 단일 콜로니를 일시 중단하고 건조한 열 블록에서 10분 동안 100± 1°C에서 서스펜션의 500 μL을 가열하여 제조할 수 있다. 아래 5단계로 계속하십시오. - 야간 배양물의 500 μL을 미세원심분리기로 옮기고 100± 1°C에서 10분 동안 건조한 열블록에서 가열한다.
- 실온으로 냉각하고 -20 °C에서 DNA 추출물을 분리 저장합니다.
- 양성 대조군 DNA를 준비하려면, 하나의 여분의 희석 단계로 추정 살모넬라 문화에서 DNA 템플릿을 준비하기 위해 위와 유사한 단계를 따르십시오.
- 접종 S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) 또는 비선택적 한천 플레이트에 살모넬라 기준 균주 (예를 들어, 혈액 한천, 영양 천, 및 트립티 케이스 대두 한천) 및 24 ± 2 hh에 대한 35 ± 2 °C에서 배양.
- TSB 또는 BHI 국물의 5mL에 여러 단일 콜로니를 전송하고 ~109 CFU / mL에 도달하기 위해 16 ± 2 h에 대한 35 ± 2 ° C에서 배양한다.
- 107 CFU/mL을 얻기 위해 0.1% 펩톤 워터로 야간 배양을 연속적으로 희석시.
- 이 희석의 500 μL을 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 100 ± 1°C에서 건조한 열 블록에서 10분 동안 가열합니다.
- 실온으로 식히고 -20 °C에서 양성 제어 DNA를 저장합니다.
2. 프라이머 믹스 준비 (10x)
- 표준 탈염정제(표 1)를통해 상업적으로 합성된 LAMP 프라이머(Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF 및 살4-LB)를 획득한다.
| 프라이머 이름 | 설명 | 시퀀스 (5'-3') | 길이(bp) |
| 살4-F3 | 포워드 외부 프라이머 | 가아크GTCGCGGAAGTC | 18 |
| 살4-B3 | 뒤로 바깥쪽 프라이머 | CGGCAA타그CGTCACCTT | 18 |
| 살4-FIP | 포워드 내부 프라이머 | GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGGGATGGATGCCCGG | 38 |
| 살4-BIP | 뒤로 안쪽 프라이머 | GCGAACGGGGCGAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC | 38 |
| 살4-LF | 루프 포워드 프라이머 | TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG | 25 |
| 살4-LB | 루프 뒤로 프라이머 | 아가아가아그CCAGCTTACTTACG | 21 |
표 1: 동물 사료에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 살모넬라를 확인하기 위한 LAMP 프라이머. 프라이머는 살모넬라 invA 시퀀스(GenBank 가입 번호 M90846)를 기반으로 설계되었습니다.
- 각 프라이머(100 μM)의 스톡 용액을 적절한 양의 멸균 분자 등급물로 프라이머를 재수화하여 준비합니다. 10s에 대해 소용돌이를 가하여 잘 섞고 -20 °C (장기 보관을 위한 -80 °C)에서 보관하십시오.
- 워크시트(표2)에따라 프라이머 믹스(10x)를 준비한다. 적당한 양의 프라이머 스톡 솔루션과 멸균 분자 등급의 물을 미세 원심 분리기 튜브에 추가합니다. 10 초 동안 소용돌이를 통해 모든 시약을 잘 섞습니다.
| 구성 요소 | 스톡 콘C. (μM) | 프라이머 믹스 콘( μM) | 부피(μL) |
| 살4-F3 프라이머 | 100 | 1 | 10 |
| 살4-B3 프라이머 | 100 | 1 | 10 |
| 살4-FIP 프라이머 | 100 | 18 | 180 |
| 살4-BIP 프라이머 | 100 | 18 | 180 |
| 살4-LF 프라이머 | 100 | 10 | 100 |
| 살4-LB 프라이머 | 100 | 10 | 100 |
| 분자 등급 물 | N/A | N/A | 420 |
| 총 | N/A | N/A | 1000 |
표 2: LAMP 프라이머 믹스(10x)를 준비하기 위한 워크시트입니다. 프라이머는 표 1에나열됩니다.
- 10x 프라이머 믹스를 마이크로센심분리기 튜브당 500 μL로 혼합하여 -20°C에 보관합니다.
3. 램프 반응의 조립
참고: 교차 오염을 방지하기 위해 LAMP 마스터 믹스를 준비하고 DNA 템플릿을 추가하는 데 사용되는 영역을 물리적으로 분리하는 것이 좋습니다. 도 1은 LAMP 다이어그램입니다.
그림 1: 살모넬라 램프 워크플로우의 회로도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 준비 및 실행 설정
- 이소프로파놀과 DNA 및 DNase 분해 용액(재료의 표)을가진 깨끗한 벤치. DNA 및 DNase 분해 용액을 가진 깨끗한 파이펫 및 튜브 스트립 홀더(재료 테이블).
- 실온에서 이더스말 마스터 믹스, 프라이머 믹스(10x), 분자등급 물, 양성 대조군 DNA 및 DNA 템플릿을 해동한다.
- LAMP 기기(재료표)를켜고 오프닝 화면을 탭하여 홈 화면에 액세스합니다. 다음 단계를 수행하여 실행을 만듭니다.
참고: LAMP 기기의 한 모델은 각 블록에 8개의 샘플이 있는 2블록(A 및 B)을 가지고 있으며, 다른 모델에는 8개의샘플(재료 표)을수용하는 단일 블록이 있습니다.- LAMP+Anneal을 탭하고 편집을 선택하여 샘플 정보를 입력합니다.
참고: 기본 램프 실행 프로파일은 65°C에서 30분 동안 증폭되고 초당 0.05°C 감소가 있는 98°C에서 80°C로 음막상으로 구성됩니다. - 각 샘플 행을 탭하여 커서를 활성화하고 AB 블록 아이콘을 사용하여 두 LAMP 기기 블록 사이를 전환하여 관련 샘플 정보를 입력합니다.
- 모든 샘플 정보를 입력한 경우 확인 아이콘을 누릅니다.
참고: 선택적으로 실행 설정(기본 LAMP 실행 프로필과 함께 샘플 정보가 포함된 "Profile"이라고 불릴 수 있음)은 나중에 사용할 수 있습니다. 저장 아이콘을 탭하고 프로필에 고유한 이름을 지정합니다. 다음번에는 동일한 샘플 집합을 테스트할 때 저장된 프로파일을 사용하여 새 실행을 시작할 수 있습니다. 홈 화면 왼쪽 하단의 폴더 아이콘을 탭하고 프로필을 선택하여 저장된 프로파일을 로드합니다.
- LAMP+Anneal을 탭하고 편집을 선택하여 샘플 정보를 입력합니다.
- 램프 반응 어셈블리
참고: LAMP 계기 블록(A 및 B, 총 16개의 샘플)을 모두 사용하는 경우 18개의 샘플에 대해 LAMP 마스터 믹스를 준비합니다. 하나의 LAMP 계기 블록(총 8개 샘플)만 사용하는 경우 10개의 샘플에 대해 LAMP 마스터 믹스를 준비합니다. 다른 샘플 번호의 경우, 파이펫팅 손실을 수용하기 위해 그에 따라 볼륨을 조정합니다. 항상 모든 LAMP 실행에 긍정적 인 제어 및 NTC를 포함합니다. 독립적인 LAMP 실행에서 각 샘플의 중복 테스트를 권장합니다.- 워크 시트(표 3)에따라 LAMP 마스터 믹스를 준비합니다. 미세원심분리기 튜브와 소용돌이에 미세원심분리기 튜브와 소용돌이에 적당한 볼륨을 추가하여 3s 원심분리기를 간단히 사용한다.
- 튜브 스트립을 스트립 홀더에 놓고 LAMP 마스터 믹스의 23 μL을 각 웰에 분배합니다.
- 모든 DNA 템플릿과 원심분리기를 간략하게 소용돌이시다. 적절한 우물에 DNA 템플릿 2 μL을 추가하고 단단히 캡합니다.
- 모든 시약이 튜브 의 바닥에 풀이 있는지 확인하기 위해 홀더에서 튜브 스트립을 제거하고 손목을 플릭합니다.
- 튜브 스트립을 LAMP 계기 블록에 적재하여 뚜껑을 닫기 전에 캡이 안전하게 고정되도록 합니다.
| 구성 요소 | 작업 conc. | 최종 반응 conc. | 샘플당 부피(μL) | 18개의 시료(μL)의 부피 | 10개의 시료(μL)의 부피 |
| ISO-001 이더스말 마스터 믹스 | 1.67x | 1x | 15 | 270 | 150 |
| 프라이머 믹스 | 10x | 1x | 2.5 | 45 | 25 |
| 분자 등급 물 | N/A | N/A | 5.5 | 99 | 55 |
| 마스터 믹스 서브토탈 | N/A | N/A | 23 | 414 | 230 |
| DNA 템플릿 | N/A | N/A | 2 | N/A | N/A |
표 3: LAMP 반응 믹스를 준비하기 위한 워크시트입니다. 프라이머 믹스(10x)는 표 1에나열된 프라이머의 스톡 솔루션을 사용하여 표 2에 따라 제조된다.
4. 램프 실행
참고: LAMP 실행 중 FAM 채널을 사용하여 형광 판독값을 획득합니다. 시간-피크 값(Tmax;min)은 형광 비율이 증폭 속도 곡선의 최대 값에 도달할 때 계측기에 의해 자동으로 결정됩니다. T m(°C)은 최종 증폭 제품의 용융/어닐링 온도입니다.
- 화면 오른쪽 상단에 있는 실행 아이콘을 클릭하고 튜브 스트립이 포함된 블록을 선택하여 LAMP 실행을 시작합니다.
- 선택적으로 반응이 진행되는 동안 온도, 증폭및 Anneal 탭을 탭하여 LAMP 실행 중에 다양한 매개 변수의 동적 변화를 확인합니다.
- 실행이 완료되면 증폭 및 Anneal 탭을 탭하여 완전한 증폭 및 막음 곡선을 확인하고 결과 탭을 탭하여 결과를 봅니다.
- 선택적으로 레코드 보관의 경우 "계기 연일 number_run 번호"와 같은 "GEN2-2209_0030"의 형식을 사용하여 화면 왼쪽 상단에 있는 실행 번호를 기록합니다.
5. 램프 결과의 해석
참고: LAMP 결과는 LAMP 기기 패널에서 직접 및/또는 LAMP소프트웨어(재료 표)를사용하여 볼 수 있습니다.
- 계기판에서 LAMP 결과를 해석하려면 다음 단계를 따르십시오.
- 홈 화면 왼쪽 하단의 폴더 아이콘을 탭하고 로그를 선택하여 파일 위치로 이동하여 LAMP 관심 있는 실행을 로드합니다.
참고: 램프 실행은 연도부터 날짜별로 구성됩니다. - 각 실행과 관련된 다섯 개의 탭을 관찰합니다: 프로파일, 온도, 증폭, 각막및 결과.
참고: 프로파일 및 온도 탭은 램프 반응이 진행됨에 따라 샘플 우물에서 프로그래밍된 실제 온도를 각각 표시합니다. 증폭 및 Anneal 탭은 각각 증폭 및 막음 단계 동안 형광 수치와 형광의 변화를 보여줍니다. 결과 탭에는 LAMP 결과의 표 모양보기가 표시됩니다. - 결과 탭을 탭하여 각 웰에 대한 LAMP 결과를 관찰합니다.
참고: 세 개의 열(음, 증폭 및 담넬)이 있습니다. "증폭" 컬럼은 각 샘플("Well")에 대한 피크값(Tmax; min:sec)을 나타내며"Anneal" 컬럼은 잘 증폭된 모든 제품에 대해 용융/아닐링온도(Tm;°C)를 나타낸다. - LAMP 결과를 해석하고 최종 LAMP 결과를 다음과 같이 보고합니다.
- 먼저 컨트롤 웰을 검사합니다. NtC 우물은 빈 Tmax가 있어야 하며 Tm은 빈(LAMP 계기 모델 모두) 또는 83°C(두 블록이 있는 LAMP 기기 모델의 경우)일 수 있습니다. 양수 컨트롤은 T 최대가 5분에서 10분 사이이고 90°C 전후의Tm이 있어야 합니다.
- 샘플 우물을 검사합니다. 올바른 Tm(약 90°C)과 T 최대(5-30분 사이)를 가진 모든 샘플은 살모넬라에대해 양성으로 간주됩니다.
- 중복 실행 결과를 기반으로 최종 LAMP 결과를 보고합니다. 중복 실행에 일관된 결과가 있는 경우 최종 LAMP 결과를 보고할 수 있습니다. 중복 실행이 일치하지 않는 경우 두 실행 모두 독립적으로 실행반복합니다. 결과가 여전히 일치하지 않는 경우, 샘플은 살모넬라에 대한 추정 양성으로 간주되어야하며 문화 확인을 거쳐야합니다.
- 홈 화면 왼쪽 하단의 폴더 아이콘을 탭하고 로그를 선택하여 파일 위치로 이동하여 LAMP 관심 있는 실행을 로드합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 LAMP 결과를 해석하려면 다음 단계를 따르십시오.
- 왼쪽 패널의 컴퓨터 아이콘을 클릭하고 파일 위치로 이동하여 LAMP 실행 관심 있는 로드합니다.
참고: 소프트웨어가 설치된 컴퓨터는 LAMP 결과를 분석하기 위해 LAMP 계측기에 연결할 필요가 없으며, 즉 원격 액세스를 사용할 수 있습니다. LAMP 실행은 날짜별로 구성됩니다. - 각 실행과 관련된 일곱 개의 탭을 관찰합니다: 프로파일, 온도, 증폭, 증폭 속도, 담막, 막음 유도체및 결과.
참고: 계측기 패널 뷰와 마찬가지로 프로파일 및 온도 탭은 램프 반응이 진행됨에 따라 샘플 우물에서 각각 프로그래밍된 온도와 실제 온도를 표시합니다. 증폭/증폭속도 및담낭/담낭 유도탭은 각각 증폭 및 음막단계 동안 형광량의 형광 수치 또는 변화를 보여준다. 결과 탭에는 계기판 뷰와 약간 다른 LAMP 결과의 표 모양뷰가 표시됩니다. - 증폭 속도 탭을 탭하여 시간별로 형광 비율의 그래픽 디스플레이를 볼 수 있습니다. 화면 오른쪽 상단에 있는 설정 아이콘을 클릭하고 "최대 감지 임계값 비율"을 0.020에서 0.010으로 조정합니다.
참고: 모든 유효한 피크를 식별하고 소프트웨어를 사용하여 얻은 결과가 계측기 패널에 표시된 것과 일치하는지 확인하기 위해 조정이 필요합니다. - 결과 탭을 탭하여 각 웰에 대한 LAMP 결과를 관찰합니다.
참고: 네 개의 열이 있습니다(그래프 이름, 음 번호, 음 이름 및 피크 값)이 있습니다. "피크 값" 컬럼의 상단 부분은 각 샘플("음이름")에 대해 "Amp Time"(Tmax; min:sec)을 나타내고 하단 부분은 "음막 유도체"(Tm; °C)를 나타내며, 그 우물의 모든 증폭 된 제품에 대해 "음막 유도체"(Tm; °C)를 나타낸다. - LAMP 결과를 해석하고 NTC와 다른 음의 샘플이 램프 소프트웨어 설정이 Tm & 83°C 결과를 제거하기 때문에 다른 음수 샘플이 빈 Tm을 가져야 한다는 점을 제외하고, 계측기 패널을 사용할 때와 유사한 단계에 따라 최종 LAMP 결과를 보고합니다. 마찬가지로, 정확한 Tm(약 90°C)과 T 최대(5-30분 사이)를 가진 모든 샘플은 살모넬라에대해 양성으로 간주됩니다.
- 왼쪽 패널의 컴퓨터 아이콘을 클릭하고 파일 위치로 이동하여 LAMP 실행 관심 있는 로드합니다.
Representative Results
그림 2 및 그림 3은 두 플랫폼에 표시된 대표 램프 그래프/테이블을 표시합니다. 이 LAMP 실행에서, 샘플 S1 에서 S6은 반응당 1.1 x 106 CFU에서 11 CFU에 이르기까지 S. enterica 세로바 인판티스 ATCC 51741의 10 배 직렬 희석이다. 양성 대조군은 반응당 1.7 x 104 CFU에서 S. 엔테리카 세로바 티피무륨 ATCC 19585(LT2)이며 NTC는 분자등급 수이다.
도 2E 및 도 3G에도시된 바와 같이 NTC 및 PC 웰은 모두 유효한 컨트롤입니다. NTC 우물은 빈 T맥스를 가지고 있으며,Tm은 LAMP 계기판에 83°C이고 LAMP 소프트웨어의 공백은 부정적인 결과를 시사합니다. PC우물은 두 플랫폼에서 7분 45초, Tm의 Tm을 모두 플랫폼에 90°C로 가지고 있어 긍정적인 결과를 시사한다. 샘플 S1 에서 S6까지의 T최대값은 6분 30초에서 12분 15초 사이이며, 모두 살모넬라양성입니다.
동일한 샘플 집합의 중복 된 실행에 따라 이러한 샘플에 대해 최종 LAMP 결과가 보고됩니다. 이 대표적인 LAMP 실행은 LAMP가 샘플에서 광범위한 농도로 살모넬라를 성공적으로 감지한다는 것을 보여줍니다.
그림 2: LAMP 계기판에 표시된 대표적인 램프 결과. (A) 프로파일 탭에는 프로그래밍된 온도 프로파일이 표시됩니다. (B) 온도 탭은 램프 반응이 진행됨에 따라 샘플 우물의 실제 온도를 나타낸다. (C) 증폭 탭은 램프 증폭 시 형광 측정값을 나타낸다. (D) 멸막 탭은 멸음 단계 동안 형광(유도체)의 변화를 나타낸다. (E) 결과 탭에는 LAMP 결과의 표 모양이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LAMP 소프트웨어에서 볼 수 있는 대표적인 램프 결과. (A) 프로파일 탭에는 프로그래밍된 온도 프로파일이 표시됩니다. (B) 온도 탭은 램프 반응이 진행됨에 따라 샘플 우물의 실제 온도를 나타낸다. (C) 증폭 탭은 램프 증폭 시 형광 측정값을 나타낸다. (D) 증폭 속도 탭은 램프 증폭 시 형광(형광비)의 변화를 나타낸다. (E) 담낭 탭은 막음 단계 동안 형광 측정값을 나타낸다. (F) 절전막 유도체 탭은 막음 단계 동안 형광(유도체)의 변화를 나타낸다. (G) 결과 탭에는 LAMP 결과의 표 모양뷰가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
동물성 음식과 순수한 문화에서 살모넬라를 선별하고 확인하는 간단하고 신속하고 구체적이며 민감한 LAMP 방법을 소개했습니다. 4개의 키 시약이 포함된 이더스말 마스터 믹스의 편리함과 함께, 기성용, 사내 준비된 프라이머 믹스, LAMP 반응을 조립하려면 몇 개의 파이펫팅단계(도 1)만필요하다. 증폭 및 음막 단계를 포함한 총 실행 시간은 38분 미만입니다(그림2A, B 및 도 3A, B). 양수 결과는 실시간 형광(도2C 및 도 3C,D)을통해 모니터링되며 5분26분으로조기에 검출될 수 있다. 멸음 단계는 정확한 Tm(약 90°C)을 가진 샘플만 양성(도2D, E 및 도 3E−G)으로보고되기 때문에 LAMP 특이성의 추가 확인 역할을 한다. 순수한 배양에서 살모넬라 세포 1개 및 동물사료의 CFU/25 g1의 민감성은 이전에26개에보고되었다.
LAMP는 매우 효과적이며 다량의 DNA1을생성하기 때문에, 최고의 실험실 관행은 가로등 마스터 믹스를 준비하고 DNA 템플릿을 추가하기 위한 영역을 물리적으로 분리하고, 에어로졸 생성을 피하고, 필터 파이펫 팁을 사용하고, 장갑을 자주 변경하고, 증폭 후 LAMP 반응 튜브를 열지 않도록 하는 것을 포함하는 교차 오염을 방지하는 데 가장 좋은 실험실 관행을 사용하는 것이 중요합니다.
본 살모넬라 LAMP 방법의 특이성은 이전에 300개의 세균균종(185개의 세로바르의 살모넬라 247개 및 53개의비살모넬라)을사용하여 시험하고 100% 특이적26인것으로 나타났다. 특히, T맥스의 현저한 차이는 두 살모넬라종, S. 엔테리카와 살모넬라 봉고리,그리고 S. 엔테리카 아종, 특히 아취종(IIIa)26종사이에서 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 이들은 여전히 LAMP 결과를 해석하기위한 규칙에 따라 유효한 긍정적 인 결과였다. 14명의분석가19명이참여한 건식 개 사료에 대한 다연구소 협력 연구에서 중복 램프 런에서 일관되지 않은 결과를 갖는 샘플이 때때로 관찰되었습니다. 이들은 일반적으로 지연된 양성 결과를 가진 견본을 관련시켰습니다(Tmax > 15 분). 두 실행 모두 독립적으로 반복하여 일반적으로 문제를 해결했습니다. 더 드물게 정확한Tm을 가진 샘플을 관찰했지만 불규칙한 T최대 값(< 5분)이 없습니다. 이것은 일반적으로 반응 관에 있는 기포에 기인했습니다.
LAMP 방법의 수명주기 전반에 걸쳐 다양한 동물성 식품 또는 식품 매트릭스 및 배양 매체4,19,22,23,24에서램프의 억제제에 대한 높은 관용을 관찰하여, 방법의 견고성을 강조하고 글로벌 스케일8에대한 수많은 다른 연구를 협력하였다. 이는 일반적으로 부정적인 결과가 매트릭스억제(28)로인한 것이 아님을 보장하기 위해 내부 증폭 제어가 필요한 PCR 또는 실시간 PCR에 비해 우수하다. 또한, LAMP는 대부분의 연구에서 PCR 또는 실시간 PCR에 비해 유사한(또는 우수한) 특이성 및민감도를 입증하였다 8. LAMP 시약의 비용은 반응 당 약 $1입니다. 이 프로토콜에 사용되는 LAMP 계측기는 작고 유지 보수가 적으며 휴대용입니다. 그들은 형광 측정, LAMP 포함에 의해 표적 검출을 사용하는 모든 이체 증폭 방법을 처리 할 수 있습니다. LAMP 소프트웨어를 사용하면 포괄적인 보고서를 여러 형식(pdf, 텍스트 및 이미지)으로 생성할 수 있습니다.
메서드 유효성 검사는 일상적인 사용을 위해 새 메서드를 채택하기 전에 중요한 단계입니다. 여기에 보고된 LAMP 프로토콜이 다중 실험실 유효성검사(19)를성공적으로 완료했다는 점은 주목할 만하다. 최근 미국 FDA의 BAM 챕터 5 살모넬라27에이 LAMP 프로토콜이 통합됨에 따라 동물사료의 신속한 선별 방법과 모든 식품 범주에서 분리된 추정 살모넬라 분리를 위한 신뢰할 수 있는 확인 방법으로 훨씬 더 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다. 이 원고에 표현 된 견해는 저자의 견해이며 반드시 보건 복지부, 미국 식품 의약국 또는 미국 정부의 공식 정책을 반영하지 는 않습니다. 식품의약품안전청의 승인, 보증 또는 권고에 따라 상업적 재료, 장비 또는 공정에 대한 언급은 어떠한 방식으로도 구성되지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 살모넬라 LAMP 방법 검증 연구를 비판적으로 검토하기 위한 FDA의 미생물학 방법 검증 소위원회 (MMVS) 및 세균성 분석 매뉴얼 (BAM) 위원회의 회원들에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
| DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
| Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
| Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
| Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
| Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
| Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
| Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
| ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
| LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
| Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
| Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
| Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
| PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
| Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
| Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
| Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |
References
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