Summary
Apresentamos aqui um protocolo de um modelo de onda de explosão para roedores para investigar efeitos neurobiológicos e fisiodicos de lesão cerebral traumática leve a moderada. Estabelecemos uma configuração de banco-topo, movida a gás, equipada com sensores de pressão, permitindo uma geração confiável e reprodutível de lesão cerebral traumática leve a moderada induzida por explosão.
Abstract
Lesão cerebral traumática (TCE) é um problema de saúde pública em larga escala. O TBI leve é a forma mais prevalente de neurotrauma e é responsável por um grande número de consultas médicas nos Estados Unidos. Atualmente, não há tratamentos aprovados pela FDA disponíveis para TBI. O aumento da incidência de TBI relacionado a explosões e militares acentua ainda mais a necessidade urgente de tratamentos eficazes de TCE. Portanto, novos modelos de animais pré-clínicos de TCE que recapitulam aspectos do TBI relacionado à explosão humana avançarão muito os esforços de pesquisa nos processos neurobiológicos e fisioterapológicos subjacentes ao TBI leve a moderado, bem como o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a TBI.
Aqui apresentamos um modelo confiável e reprodutível para a investigação dos efeitos moleculares, celulares e comportamentais de TBI leve a moderada induzida por explosão. Descrevemos um protocolo passo-a-passo para TBI leve de cabeça fechada e induzido por explosão em roedores usando uma configuração de bancada composta por um tubo de choque movido a gás equipado com sensores de pressão piezoelétricas para garantir condições de teste consistentes. Os benefícios da configuração que estabelecemos são seu relativo baixo custo, facilidade de instalação, facilidade de uso e capacidade de alta produtividade. Outras vantagens deste modelo TBI não invasivo incluem a escalabilidade da sobrepressão do pico da explosão e a geração de resultados reprodutíveis controlados. A reprodutibilidade e relevância deste modelo TBI tem sido avaliada em uma série de aplicações a jusante, incluindo análises neurobiológicas, neuropatológicas, neurofisiológicas e comportamentais, apoiando o uso desse modelo para a caracterização de processos subjacentes à etiologia de TCE leve a moderada.
Introduction
A lesão cerebral traumática (TCE) é responsável por mais de dois milhões de visitas hospitalares por ano apenas nos Estados Unidos. TBI leve comumente resultante de acidentes de carro, eventos esportivos ou quedas representam aproximadamente 80% de todos os casos de TCE1. O TBI leve é considerado a "doença silenciosa", pois os pacientes muitas vezes não experimentam sintomas a ver com os dias e meses seguintes ao insulto inicial, mas podem desenvolver sérias complicações relacionadas ao TCE mais tarde na vida2. Além disso, o TCE leve induzido por explosão é prevalente entre os militares e tem sido associado à disfunção crônica do CNS3,4,5,6. Devido à crescente incidência de TBI7,8 leve relacionada à explosão, a modelagem pré-clínica dos processos neurobiológicos e fisiocessiológicos associados ao TCE leve tornou-se, assim, foco no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para TCE.
Historicamente, a pesquisa da TBI tem se concentrado principalmente em formas graves de neurotrauma, apesar do número relativamente menor de casos graves de TCE humanos. Foram desenvolvidos modelos de roedores pré-clínicos para TBI humano severo, incluindo os modelos de impacto cortical controlado (CCI)9,10 e lesão de percussão fluida (FPI)11, ambos bem estabelecidos para produzir efeitos fisiodicos confiáveis12,13. Esses modelos estabeleceram as bases para o que se sabe hoje sobre neuroinflamação, neurodegeneração e reparação neuronal em TBI. Embora o conhecimento considerável da fisiopatologia do TCE tenha sido desenvolvido, atualmente não há tratamentos eficazes e aprovados pela FDA disponíveis para tce.
Mais recentemente, o foco da pesquisa de TCE foi ampliado para incluir um espectro mais amplo de patologias relacionadas ao TBI com o objetivo final de desenvolver intervenções terapêuticas eficazes. No entanto, foram estabelecidos poucos modelos pré-clínicos para TCE leve que mostraram efeitos mensuráveis, e apenas um pequeno número de estudos investigou o espectro TBI leve2,14,15. Como a URB leve é responsável pela grande maioria de todos os casos de TCE, modelos confiáveis de TCE leve são urgentemente necessários para facilitar a pesquisa sobre a etiologia e a neuropafiologia da condição humana, a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas.
Em conjunto com engenheiros biomédicos e físicos aeroespaciais, estabelecemos um modelo escalável de ondas de explosão de cabeça fechada para TBI leve a moderada. Este modelo de roedor pré-clínico foi desenvolvido especificamente para investigar os efeitos da dinâmica da força, incluindo ondas de explosão e movimento de aceleração/desaceleração, que estão associados ao TBI leve humano obtido em combate militar, eventos esportivos, acidentes de carro e quedas. À medida que as ondas de explosão se correlacionam com a dinâmica da força que causa tce-TBI leve em humanos, este modelo foi projetado para produzir uma forma de onda friedlander consistente com um impulso, que é medido como libras por polegada quadrada (psi)*milissegundo (ms). O nível de impulso é escalado para ficar abaixo das curvas de letalidade pulmonar definidas para ratos e ratos, a fim de realizar investigações pré-clínicas16,17,18. Além disso, este modelo permite a investigação de golpes e lesões contrecoup devido às rápidas forças rotacionais da cabeça do animal. Esse tipo de lesão é inerente a vários tipos de apresentações clínicas de TCE, incluindo aquelas observadas em populações militares e civis. Portanto, este modelo versátil se encaixa em uma necessidade que engloba múltiplas apresentações clínicas de TCE.
O modelo pré-clínico aqui apresentado produz alterações fisiopatológicas confiáveis e reprodutíveis associadas ao TCE clínico leve, como demonstrado por uma série de estudos anteriores17,19,20,21,22,23. Estudos com este modelo mostraram que ratos submetidos a uma onda de explosão de baixa intensidade apresentaram neuroinflamação, lesão axonal, dano microvascular, alterações bioquímicas relacionadas à lesão neuronal e déficits em plasticidade de curto prazo e excitabilidade sináptica19. No entanto, este modelo leve de TCE não induziu alterações neuropatológicas macroscópicas, incluindo danos teciduais, hemorragia, hematoma e contusão19 que têm sido comumente observados em estudos usando modelos de TCE invasivos moderados a graves10,24. Pesquisas anteriores19,21,22,23 mostraram que esse modelo pré-clínico pode ser usado para caracterizar processos neurobiológicos e fisioterápicos subjacentes à etiologia do TBI17,19,20,21,22,23. Este modelo também permite o teste de novos compostos e estratégias terapêuticas, bem como a identificação de novas metas adequadas para o desenvolvimento de intervenções eficazes do TCE19,21,22,23.
Este modelo foi desenvolvido para investigar efeitos induzidos por ondas de explosão, bem como forças rotacionais rápidas em resultados moleculares, celulares e comportamentais em roedores. Análogo ao modelo de onda de explosão apresentado aqui, vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos que tentam recapitular tbi leve a moderado usando ondas de sobrepressão movidas a gás2,14,17,25,26,27,28. Algumas das limitações de outros modelos incluem: o animal é fixado em uma maca de malha de arame e a cabeça é imobilizada após o impacto; os órgãos periféricos são expostos à onda, além do cérebro, o que cria as variáveis de confusão do politraumatismo; e os modelos são grandes e estacionários, o que limita a mudança e adaptação de parâmetros críticos a melhores condições de modelo que lembram o TBI humano.
Os benefícios desta configuração de tubo de choque movido a gás são seu custo relativo baixo para despesas de aquisição e execução, bem como facilidade de instalação e uso. Além disso, a configuração permite a operação de alto rendimento e geração de ondas de explosão reprodutíveis controladas e resultados in vivo em camundongos e ratos. A fim de controlar condições de teste consistentes (ou seja, onda de explosão constante e sobrepressão) a configuração é equipada com sensores de pressão. As vantagens deste modelo para TCE incluem a escalabilidade da gravidade da lesão e que o TCE leve é induzido por um procedimento não invasivo de cabeça fechada. O pico de sobrepressão e a lesão cerebral subsequente aumentam com membranas de poliéster mais espessas de forma escalável consistente17. A capacidade de escalar a gravidade do TCE através da espessura da membrana é uma ferramenta útil para determinar o nível, no qual medidas específicas de desfecho (por exemplo, neuroinflamação) tornam-se evidentes. Fornecendo blindagem protetora para os órgãos periféricos, também permite a investigação focada em mecanismos leves de TCE, evitando ou reduzindo variáveis de confusão de lesões sistêmicas, como lesão pulmonar ou torácica. Além disso, essa configuração permite selecionar a direção, pela qual a onda de explosão atinge/penetra a cabeça (ou seja, frente a frente, lado, superior ou inferior) e, portanto, diferentes tipos de insultos indutores de TBI podem ser investigados. O procedimento padrão para induzir TBI leve a moderada descrito aqui emprega exposição lateral para avaliar os efeitos da lesão de onda de explosão em combinação com lesão de golpe e contrecoup devido a forças rotacionais rápidas. Além disso, a fim de investigar exclusivamente lesões induzidas por explosão, a exposição de ondas de explosão de cima para baixo pode ser empregada neste modelo.
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Protocol
O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Cincinnati e da Universidade da Virgínia Ocidental. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Atenção e Uso de Animais (IACUC), e foram realizados de acordo com os princípios do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Instalação da configuração de TBI de explosão
- Adquira todas as peças de trabalho necessárias para a configuração, incluindo: tubo de choque composto por seção de aço e condutor, membrana de poliéster, parafusos de fixação, sensores de pressão, escudo de tubulação de cloreto de polivinil (PVC) para proteger órgãos periféricos, linha hidráulica de alta pressão de 9,53 mm e conexão rápida de acessórios masculinos e femininos, regulador de gás de alto fluxo e um cilindro de gás com suporte de montagem de parede (ver Figura 1A, B e Tabela de Materiais).
NOTA: As especificações da seção de driver e acionada utilizadas aqui (ver Figura 2 e Tabela de Materiais) foram estabelecidas para produzir uma onda de explosão escalonada de curta duração consistente (ver Figura 3C,D) para induzir TBI leve a moderada em camundongos. Para isso, foi selecionada uma seção de driver curto (6° taper) projetada em taper (6° taper). O comprimento e o diâmetro das seções acionadas e do driver podem ser modificados para pesquisar especificamente a onda de explosão 29,30,31,32, a onda de compressão18 ou a dinâmica da onda de choque33. Para experimentos com ratos, as dimensões do tubo de choque precisam ser adaptadas para produzir forças comparáveis de acordo com os parâmetros de escala corporal pertinentes17 (ver Tabela de Materiais). - Instale as peças de trabalho individuais da configuração em mesas de deslizamento de máquinas fixadas em uma superfície estável e fácil de limpar (de preferência aço inoxidável para uso em roedores) em espaço de laboratório aprovado para experimentos em animais.
NOTA: Os experimentos de ondas de explosão produzem um nível considerável de ruído; portanto, escolha um local dentro do espaço de laboratório absorvedor de som, onde o ruído não interferirá com outros experimentos/grupos de laboratório.- Fixar o escudo de pvc perpendicular à configuração do tubo de choque para que o corpo do roedor esteja totalmente coberto e apenas a cabeça se projeta.
NOTA: Para que o procedimento padrão induza tbi leve a moderado descrito aqui, o centro da cabeça está localizado a 5 cm da extremidade da seção acionada para camundongos. - Cilindro de gás de montagem de parede próximo à configuração de acordo com a OSHA e todas as outras normas de segurança pertinentes.
NOTA: Ar comprimido, hélio ou gás nitrogênio são comumente usados para gerar as ondas de explosão em modelos de tubos de choque de roedores. Todos os dados aqui apresentados foram gerados utilizando hélio, pois este gás produz maior sobrepressão em uma duração mais curta34, permitindo o dimensionamento adequado para sujeitos murinos.
- Fixar o escudo de pvc perpendicular à configuração do tubo de choque para que o corpo do roedor esteja totalmente coberto e apenas a cabeça se projeta.
2. Avaliação das propriedades de configuração e onda de explosão usando gravações de sensores de pressão.
- Prepare o tubo de choque.
- Corte cuidadosamente a membrana de poliéster sem dobrar e produzir fissuras, a fim de garantir uma ruptura consistente.
- Insira a membrana entre as seções acionadas e do motorista. Fixar as seções apertando os parafusos de conexão.
- Verifique se o sistema é hermético e a membrana está bem fixa entre as seções do motorista e das seções acionadas.
- Conecte o tanque de gás através de uma mangueira hidráulica de alta pressão de 9,53 mm e conecte rapidamente os acessórios ao tubo de choque
NOTA: As seções do driver e dos conduzidos são usinadas a tolerâncias precisas, a fim de permitir uma vedação completa de membrana entre as seções. Isso não permite vazamento de gás e impede o uso de qualquer forma de material de junta/o-anel e permite maior consistência na forma de onda gerada.
- Instale os sensores de pressão para monitorar as ondas de explosão (ver Figura 1C).
- Posicione um sensor de pressão na área de colocação da cabeça e três sensores na saída do tubo de choque (ver Figura 1C e 2).
- Inicie a gravação a partir de sensores de pressão, pouco antes da execução da onda de explosão. Registo os dados de onda de pressão em 500.000 quadros por segundo usando um condicionador de sinal de sensor e uma placa de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Use earmuffs aprovados pela OHSA para garantir a proteção auditiva adequada. - Abra a válvula principal do tanque de gás comprimido totalmente para permitir que o fluxo de gás produza um pico de pressão súbita e rápida.
NOTA: A sobrepressão do gás rompe a membrana de poliéster para liberar uma onda de choque que transita para uma onda de compressão dentro da seção acionada e sai do tubo na direção da área de colocação da cabeça. - Desligue o fluxo de gás imediatamente após o procedimento.
NOTA: A configuração pode ser equipada com uma válvula de retorno de mola para parar automaticamente e rapidamente o fluxo de gás. - Analise as gravações de onda de pressão usando o programa de computador escrito personalizado para determinar o pico de sobrepressão e dados gráficos. Os dados podem ser gráficos com cada sensor individualmente ou sobreposto um ao outro para demonstrar a planaridade da onda gerada (ver Figura 3C,D).
NOTA: A análise pode tecnicamente ser feita usando softwares mais facilmente disponíveis, mas devido aos grandes conjuntos de dados, esses programas têm longos atrasos na geração de parcelas.
- Estabeleça condições experimentais adequadas para o objetivo do estudo TBI designado, e confirme que o modelo produz uma onda de explosão consistente com um pico de pressão, duração e medição de impulso comparável a uma onda friedlander (ver Figura 3). Verifique esses parâmetros usando o software de computador acima mencionado.
- Calibrar a configuração repetindo as etapas 2.1.1. para 2.2.5. e use as gravações de onda de pressão para determinar se a configuração precisa de ajuste (para dados representativos ver Figura 3).
- Modifique a configuração (se necessário).
NOTA: As propriedades da onda de explosão podem ser ajustadas por pequenas modificações da configuração. Por exemplo, a distância da cabeça até o final da seção acionada impacta a força de onda de explosão no nível da cabeça. A espessura da membrana de poliéster determina o nível de sobrepressão máxima, com membranas mais grossas aumentando os níveis máximos (ver Figura 3A,B). Além disso, a configuração permite selecionar a direção pela qual a onda de explosão atinge/penetra a cabeça (ou seja, frente a frente, lado, superior ou inferior) e, portanto, diferentes aspectos podem ser investigados, como lesão de onda de explosão sozinho ou em combinação com golpe e lesão contrecoup devido a rápidas forças rotacionais. - Repita as etapas 2.1.1 a 2.2.4 para estabelecer as propriedades desejadas de onda de explosão (se necessário) e controle para reprodutibilidade.
- Repetir passos 2.1.1 a 2.2.4 com membranas de poliéster de espessura diferente para avaliar a escalabilidade da configuração (para dados representativos ver Figura 3A,B).
3. Preparação de configuração experimental e indução de TCE leve em roedores
NOTA: Transfira roedores para a área de detenção de 30 min a 1 h antes do início dos experimentos de TCE para aclimatação. Selecione a área de retenção que seja minimamente afetada pelo ruído do procedimento.
- Prepare todos os materiais necessários para o experimento e verifique a configuração para instalação adequada (por exemplo, ajuste parâmetros de acordo com o objetivo de estudo) (~5 – 10 minutos).
NOTA: A gravidade da lesão pode ser ajustada selecionando a espessura da membrana de poliéster. Com base em nossos estudos, uma espessura de membrana de 25,4 a 102 μm é utilizada para TBI leve a moderada em camundongos35. Anteriormente, utilizamos membranas com espessura de 76,2 a 127 μm para produzir TBI leve a moderada em ratos19.- Corte cuidadosamente a membrana de poliéster, insira-a entre as seções acionada e do motorista e fixe-a apertando os parafusos de conexão.
- Conecte o tanque de gás ao tubo de choque através do uso de encaixes de liberação rápida. Certifique-se de que a membrana está bem fixa entre as seções do motorista e do motorista.
- Coloque três sensores de pressão na saída do tubo de choque, com 120° de distância, para monitorar as propriedades da onda de explosão durante a indução de TBI, conforme descrito na etapa 2.2.2 e 2.2.5.
- Certifique-se de que a distância do aparelho do tubo de choque está correta para cada sujeito respectivo usando micrômetro instalado. Mantenha o posicionamento da cabeça do roedor (ou seja, posição, distância) constante dentro dos estudos para permitir uma avaliação consistente da lesão.
NOTA: Conforme indicado em 1.2.1., diferentes tipos de lesão podem ser induzidas pela seleção da direção, na qual a onda de explosão impacta a cabeça. Para o procedimento induzir tbi leve a moderada descrito aqui, o corpo é colocado perpendicular ao tubo de choque que a onda de explosão impacta o lado da cabeça. Neste cenário, a cabeça é permitida mobilidade livre e, portanto, é exposta à onda de explosão e forças rotacionais rápidas permitindo a geração de efeitos de golpe e contrecoup. - Inicie a gravação a partir dos sensores de pressão usando a interface gráfica do usuário (GUI) do software.
- Anestesia e posicionamento de roedores na configuração
- Transfira os roedores da sala de espera e induza a anestesia com 4% de isoflurano em oxigênio e mantenha com 2% de isoflurano em oxigênio para reduzir a angústia e a dor.
NOTA: Certifique-se de que o animal não está respondendo ao dedo do dedo do dedo ou ao aperto da cauda antes de prosseguir. Certifique-se de que a indução da anestesia é consistente para todos os animais experimentais, incluindo controles falsos. Este procedimento requer uma curta e baixa duração da anestesia. - Coloque o roedor totalmente anestesiado no escudo do tubo de PVC com amortecimento para proteger órgãos periféricos da onda de explosão.
NOTA: Os sujeitos de controle são anestesiados e colocados próximos à configuração, mas não estão diretamente sujeitos à onda de explosão. Certifique-se de que os controles estão sujeitos ao ruído gerado pelo tubo de choque. - Coloque a cabeça do roedor dentro da área de colocação da cabeça e apoie-a de baixo, seja por um suporte embutido diretamente no aparelho de proteção ou por uma gaze. Determine o alinhamento da cabeça de acordo com a anatomia de cada roedor individual, com o condíle occipital alinhado com a borda da proteção.
NOTA: Evite direcionar a onda de pressão diretamente para o tronco cerebral para diminuir a mortalidade. A lesão no centro respiratório do tronco cerebral e da medula espinhal cervical é conhecida por contribuir para anormalidades respiratórias e até mesmo morte em modelos de roedores de TBI36,37,38.
- Transfira os roedores da sala de espera e induza a anestesia com 4% de isoflurano em oxigênio e mantenha com 2% de isoflurano em oxigênio para reduzir a angústia e a dor.
- Exposição de roedores à onda de explosão.
- Abra rapidamente a válvula principal do tanque de gás comprimido para produzir um pico de pressão que rompe a membrana e produza uma forte explosão que confirma a geração de uma onda de pressão. A membrana será rompida visualmente quando removida após o experimento.
NOTA: Uma câmera de alta velocidade pode ser usada para capturar os efeitos de golpe e contrecoup da aceleração rotacional experimentada pelo roedor para análise posterior. - Desligue o fluxo de gás imediatamente após ouvir a explosão.
- Abra rapidamente a válvula principal do tanque de gás comprimido para produzir um pico de pressão que rompe a membrana e produza uma forte explosão que confirma a geração de uma onda de pressão. A membrana será rompida visualmente quando removida após o experimento.
- Recuperação da exposição a ondas de explosão
- Após a exposição à onda de explosão, remova o roedor do aparelho e coloque em uma superfície plana diretamente adjacente ao tubo de choque do lado.
- Monitore os sujeitos para determinar o tempo de reflexo de retardo (RRT). Use um cronômetro para registrar o tempo da exposição à onda de explosão até que recuperem o reflexo de direito inerente. (ver Figura 4A).
- Assim que os sujeitos recuperarem o reflexo de direito, coloque-os em sua respectiva gaiola doméstica, onde são monitorados para reações adversas (ou seja, convulsões, dificuldade para respirar, sangramento de um orifício corporal) pelas próximas 24 horas.
- Após o período inicial de monitoramento, os sujeitos podem ser analisados utilizando-se vários ensaios bioquímicos, neuropatológicos, neurofisiológicos e comportamentais da escolha do pesquisador (veja abaixo).
- Prepare a configuração e o espaço para o próximo experimento.
- Limpe a configuração com detergente para remover o odor.
4. Aplicações a jusante para roedores expostos a ondas de explosão/forças rotacionais e controles
NOTA: Em estudos anteriores, os efeitos do TCE leve a moderado em vários pontos de tempo após a exposição a uma onda de explosão e forças rotacionais foram avaliados em roedores utilizando aplicações a jusante, incluindo análises bioquímicas, neuropatológicas, neurofisiológicas e comportamentais19.
- Análise bioquímica
- Em pontos de tempo experimentais definidos (horas a dias pós-TBI leve), tecido de colheita (por exemplo, cérebro, sangue) para análise bioquímica utilizando protocolos padrão como descrito19.
- Utilizar tecido para análise bioquímica (ou seja, imunoblotting, ELISA, etc.) para avaliar o efeito de TCE leve em processos neurobiológicos e fisioterológicos.
- Análise neuropatológica
- Em pontos de tempo experimentais definidos (horas a dias pós-leve TBI), roedores perfumados transcardialmente com solução salina seguido de 4% de solução paraformaldeída para fixação de tecido como descrito19.
NOTA: Algumas aplicações não são compatíveis com fixação de paraformaldeído (por exemplo, coloração de prata, alguns anticorpos para imunohistoquímica). - Use tecido fixo perfumado para análises anatômicas, histológicas e moleculares para avaliar alterações neuropatológicas associadas à TCE leve, incluindo neuroinflamação, neurodegeneração e alterações neuroquímicas como descrito19.
- Em pontos de tempo experimentais definidos (horas a dias pós-leve TBI), roedores perfumados transcardialmente com solução salina seguido de 4% de solução paraformaldeída para fixação de tecido como descrito19.
- Análise neurofisiológica em fatias cerebrais
- Em pontos de tempo experimentais definidos (horas a dias pós-TBI leve), sacrificam roedores por decapitação, removem cérebro e preparam fatias cerebrais como descrito19.
- Realizar gravações eletrofisiológicas como descrito19 para avaliar o efeito de TCE leve em propriedades sinápticas basais e plasticidade sináptica.
- Análise comportamental
- Em pontos de tempo experimentais definidos (horas a dias pós-TBI leve), avalie o desempenho comportamental, incluindo função motora (por exemplo, campo aberto, rotarod, atividade locomotor; ver Figura 4D) e aprendizagem & memória (por exemplo, condicionamento do medo, labirinto barnes, labirinto de água morris).
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Representative Results
A escalabilidade da configuração da onda de explosão foi testada usando três espessuras de membrana diferentes, 25,4, 50,8 e 76,2 μm. Os níveis de pressão máxima foram avaliados na área de colocação da cabeça e na saída do aparelho do tubo de choque usando sensores de pressão piezoelétrica (ver Figura 1 & Figura 2). As pressões máximas aumentam em concordância com a espessura da membrana em ambos os locais dos sensores (Figura 3A,B), demonstrando que a pressão máxima é escalável na natureza. Esta propriedade da configuração pode ser explorada para calibrar o sistema e avaliar sua escalabilidade conforme descrito na etapa 2.3.
A fim de avaliar os efeitos do TBI induzido por explosão in vivo, camundongos adultos, de 3 meses, machos, do tipo selvagem C57Bl/6J foram expostos a ondas de explosão produzidas por esta configuração (Figura 1 & Figura 2) usando o protocolo descrito aqui. Primeiro, foram avaliados os efeitos das ondas de explosão produzidas com duas espessuras de membrana diferentes (50,8 e 76,2 μm) ou tratamento falso no tempo de retardo reflexo (RRT). A latência dos camundongos para o direito total a si mesmos (4 patas no chão) após a anestesia é determinada aqui como RRT. Os camundongos foram anestesiados usando isoflurane (anestesia consistente, curta e leve) e, em seguida, submetidos a indução TBI ou tratamento falso. Imediatamente após a lesão, os camundongos foram autorizados a se recuperar e o tempo para recuperar o reflexo direito foi registrado. Camundongos que foram expostos a uma onda de explosão produzida com a membrana de 76,2 μm apresentaram um aumento significativo no RRT em comparação com os controles falsos que foram submetidos ao mesmo procedimento de anestesia (Figura 4A), sugerindo que esta onda de explosão induz a perda de consciência. Em contraste, camundongos expostos a uma onda de explosão da membrana de 50,8 μm não apresentam aumentos significativos na RRT (Figura 4A), indicativo de forma leve de TCE. A ruptura de uma membrana de poliéster padrão de 76,2 μm resulta na rápida geração de uma onda de explosão de curta duração de aproximadamente 160 psi de sobrepressão (Figura 3C), a que o lado esquerdo do crânio do sujeito é exposto durante o procedimento experimental.
Os efeitos fisiológicos de curto prazo que ocorrem após a exposição a ondas de explosão e forças rotacionais em roedores não são atualmente bem caracterizados. Para delinear os efeitos agudos da exposição a ondas de explosão e forças rotacionais deste modelo, avaliamos a regulação da temperatura corporal do núcleo e o peso corporal. A temperatura e o peso corporal de camundongos C57Bl/6J adultos, de 3 meses de idade, do tipo selvagem masculino foram registrados após a indução de TCE. A temperatura corporal do núcleo de linha de base e o peso corporal foram registrados nos camundongos antes do procedimento tbi ou tratamento falso. A exposição a uma onda de explosão produzida com a membrana de 76,2 μm diminuiu significativamente a temperatura corporal durante a primeira hora em camundongos induzidos pelo TBI em comparação com seus controles falsos (Figura 4B), indicativo de um efeito fisiológico significativo produzido pela indução de TBI. Consistentemente, os camundongos submetidos ao TBI usando membranas de 76,2 μm apresentaram uma redução aguda, dependente do tempo, mas significativa no peso total do corpo de um dia após o TBI em comparação com a farsa (Figura 4C).
Para examinar o impacto do TCE nos desfechos comportamentais, analisou-se o efeito do TBI induzido por explosão na atividade locomotor aguda (Figura 4D). Camundongos adultos, 3 meses de idade, C57Bl/6J masculino foram submetidos à indução de TBI usando membrana de 76,2 μm ou tratamento falso e a atividade locomotor foi monitorada por 30 minutos três horas após o TBI. A exposição a uma onda de explosão produzida com a membrana de 76,2 μm resultou em uma diminuição aguda e significativa na atividade locomotora (Figura 4D).
Figura 1: Configuração do modelo de onda de explosão murina. (A-C) Imagens representativas da configuração do modelo de onda de explosão para ratos. Vista lateral da configuração (A). Vista superior da configuração (B). 1, cilindro de gás com regulador de gás de alto fluxo; Linha hidráulica de alta pressão de 9,53 mm e conexão rápida de acessórios masculinos e femininos; 3, seção do motorista do tubo de choque; 4, seção acionada do tubo de choque; 5, escudo de tubo de PVC; 6, área de colocação de cabeça; 7, membrana de poliéster. As partes individuais da configuração são instaladas em tabelas de slides da máquina, permitindo um posicionamento preciso das seções de driver (3) e de unidade (4) em relação ao sujeito submetido a indução de lesão. (C) Visão superior da configuração com colocações no sensor de pressão. Três sensores estão localizados em um plano na saída do tubo de choque, a 120 graus de distância (S1 - S3), para monitorar as propriedades da onda de explosão durante a indução do TBI. Um sensor é instalado na área de colocação da cabeça (S4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema de murine sobrepressão tubo de choque. O tubo de choque usinado com precisão é feito de aço de alta tração. O espaço interno da seção do motorista está angulado em 6 graus. O diâmetro interno do motorista e da seção acionada é de 37 mm. Superfícies de acasalamento de seções acionadas pelo motorista são usinadas com precisão para garantir a vedação completa. Todo o tubo de choque é industrialmente fixado em uma mesa de deslizamento de máquina para garantir a montagem sólida e a consistência da geração de ondas de explosão. Na saída dos orifícios de seção acionada são perfurados (em um plano, 120° de distância) para instalar os três sensores de pressão (indicados por *). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gravações de pressão da configuração de ondas de explosão murina. (A,B) A pressão máxima é escalável e depende da espessura da membrana de poliéster. Sensores de pressão foram usados para registrar pressões máximas produzidas pelo tubo de choque com gás hélio e membranas de poliéster de 25,4, 50,8 ou 76,2 μm de espessura. (A) Na área de colocação da cabeça, a pressão média de pico produzida com membranas de 25,4 μm foi de 428 ± 15,9 kPa, com membranas de 50,8 μm 637 ± 21,4 kPa e com membranas de 76,2 μm 1257 ± 40,7 kPa (SEM, n = 7-12, ANOVA unidirecional seguido do teste de comparação pós-hoc Dunnett, *** P ≤ 0,001). (B) Na saída do tubo de choque, a pressão média de pico registrada com membranas de 25,4 μm foi de 164 ± 11,7 kPa, com 50,8 μm de membranas 232 ± 11,7 kPa e com 76,2 μm de membranas 412 ± 11,0 kPa (SEM, n = 7-12, ANOVA unidirecional seguido do teste de comparação pós-hoc Dunnett, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001). (C) Gráfico representativo da gravação de pressão do sensor na área de colocação da cabeça (sensor incidente) utilizando uma membrana de 76,2 μm. A forma de onda é semelhante à de uma onda friedlander, dimensionada em tempo/duração para sujeitos murinos. (D) Gráfico representativo da gravação de pressão de 3 sensores distintos localizados no final da seção acionada para determinar a linearidade/fase da forma de onda dentro da seção acionada. Todos os três sensores (localizados a 120 graus de distância) mostram uma duração de ascensão/queda semelhante indicando que a forma de onda que sai da seção acionada é semelhante na seção transversal dentro da seção acionada. A onda de explosão foi gerada usando uma membrana de 76,2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos in vivo agudos do TBI induzido por explosão. (A) TBI moderado, mas não leve TBI aumenta o tempo de reflexo de retardo (RRT). Camundongos adultos, de 3 meses, do sexo masculino, do tipo selvagem C57Bl/6J foram submetidos a procedimentos de TCE usando o tubo de choque com gás hélio e membranas de poliéster de 50,8 ou 76,2 μm de espessura ou tratamento falso. Imediatamente após lesão ou tratamento falso, os camundongos foram autorizados a se recuperar e rrt foi registrado. A indução de TBI com 50,8 μm de membrana ou tratamento falso apresentou níveis comparáveis de RRT. Em contraste, a indução de TBI usando uma membrana de 76,2 μm aumenta a RRT, indicativo de perda de consciência induzida pela onda de explosão com a membrana de 76,2 μm (SEM, n = 4-10, Sham RRT = 35,6 ± 2,0 s, 50,8 μm de membrana RRT = 43,0 ± 4,3 s e 76,2 μm de membrana RRT = 254,0 ± 40,2 s, ANOVA unidirecional seguido pelo teste de comparação pós-hoc Dunnett, P ≤ 0,001). (B) TBI moderado reduz significativa e transitóriamente a temperatura corporal do núcleo. Camundongos adultos, 3 meses de idade, machos, tipo selvagem C57Bl/6J foram submetidos à indução de TCE com membranas de 76,2 μm ou tratamento falso. A temperatura do corpo deles foi registrada por duas horas. A temperatura do núcleo da linha de base foi registrada antes da indução do TCE. TBI induzido por explosão com membranas de 76,2 μm está associada a uma queda significativa na temperatura corporal do núcleo na primeira hora pós-TBI. (SEM, n = 10, medidas repetidas bidirecional ANOVA, seguido dos múltiplos testes de comparação de Bonferroni pós-hoc, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001). (C) TBI moderado resulta em uma redução transitória do peso corporal. Camundongos adultos, de 3 meses de idade, machos C57Bl/6J foram submetidos a procedimentos de TCE usando membranas de 76,2 μm ou tratamento falso. Posteriormente, os pesos corporais foram registrados por 5 dias. O peso corporal total foi significativamente reduzido um dia após o TBI (SEM, n = 7, medidas repetidas bidirecional ANOVA seguido dos múltiplos testes de comparação pós-hoc Bonferroni, * P ≤ 0,05). (D) TBI moderado resulta em redução aguda da atividade locomotor. Camundongos adultos, de 3 meses de idade, machos C57Bl/6J foram submetidos a procedimentos de TCE usando membranas de 76,2 μm ou tratamento falso. Três horas de atividade locomotor pós-TBI foi rastreada por 30 minutos e quantificada por meio de software de rastreamento de vídeo (SEM, n = 9-11, teste t de duas caudas não postado, ** P = 0,01). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresentamos aqui um modelo de TCE leve pré-clínico que seja econômico, fácil de configurar e executar, e permite resultados experimentais de alta produtividade, confiáveis e reprodutíveis. Este modelo fornece proteção protetora aos órgãos periféricos para permitir uma investigação focada em mecanismos leves de TCE, limitando as variáveis de confusão da lesão sistêmica. Em contraste, outros modelos de explosão são conhecidos por infligir danos aos órgãos periféricos2,39,40. Outra vantagem deste modelo é sua capacidade de entregar a onda de explosão de qualquer ângulo desejado em comparação com a posição fixa em outros modelos de explosão40. Isso permite que estudos anatômicos focados entendam melhor a vulnerabilidade cerebral.
Para estudar o TBI relacionado à explosão humana, um modelo relevante para a TBI deve produzir forças biomecânicas comparáveis às experimentadas pelos sujeitos durante a indução de TCE. Um modelo clinicamente relevante também deve induzir desfechos neurobiológicos, fisiopatológicos e comportamentais observados em indivíduos que sofrem de TCE leve. Em estudos anteriores, o modelo de onda de explosão aqui apresentado foi minuciosamente examinado17,19,21, e inúmeros aspectos biofísicos e neurobiológicos que lembram o TBI humano, incluindo dinâmica e forças de ondas de explosão, neuroinflamação, lesão axonal e danos microvasculares foram avaliados. Esses estudos forneceram evidências de que este modelo de ondas de explosão pré-clínicas para TCE produz alterações neurobiológicas e fisiodológicas confiáveis e filosofosas associadas à TBI clínica.
Além disso, com o aumento da incidência de TBI de explosão leve dentro da população militar7,8, este modelo versátil de roedores para TBI humano leve fornece aos pesquisadores uma ferramenta valiosa para investigar processos subjacentes ao TBI relacionado à explosão e explorar novas estratégias terapêuticas. Por exemplo, nosso modelo demonstra complicações neurovasculares e destaca a importância da intervenção vascular como uma abordagem terapêutica promissora22,23,35. Consistentemente, outros modelos pré-clínicos de TBI de explosão também produziram efeitos neurovasculares associados à neurodegeneração e déficits comportamentais2,25,40,41,42,43.
Com base em pesquisas anteriores19,21,22,23, estabelecemos que o modelo de onda de explosão aqui apresentado pode ser adequado para a investigação sobre a fisiopatologia e etiologia da concussão humana. A maioria dos modelos de TCE pré-clínicos não permitem o movimento da cabeça44, embora as propriedades biomecânicas associadas à aceleração/desaceleração rápida da cabeça sejam um fator preditivo para o desenvolvimento de uma concussão em humanos45,46. Consistente com o modelo aqui descrito, Goldstein e seus colegas14 mostraram que o rápido movimento da cabeça induzido pelas forças de explosão é um pré-requisito para a indução de déficits comportamentais, possivelmente devido às forças rotacionais e à tesoura. Uma melhor compreensão das alterações fisiodológicas que ocorrem no TCE leve e em resposta à concussão também ajudaria a determinar biomarcadores clínicos e identificar novos alvos para o desenvolvimento de tratamentos para TCE.
Pouco se sabe sobre as alterações fisiofisiológicas e a progressão da doença após tce-leve TBI (por exemplo, concussão repetitiva experimentada nos esportes). Este modelo pré-clínico permite o estudo da TCE leve repetitiva com pouca ou nenhuma mortalidade. Em contraste, alguns modelos de TCE infligem lesões graves e, portanto, muitas vezes é difícil, ou desumano, induzir mais lesões. Além disso, lesões graves são muitas vezes irreparáveis e a detecção de alterações fisiológicas sutis pode ser impedida. Este modelo também permite a investigação escalável de vários intervalos de lesões; um parâmetro crítico para TBI repetitivo leve que requer uma caracterização adicional. Após o TBI, é acionada uma resposta de lesão do CNS que ajuda a proteger a integridade cerebral e prevenir a morte generalizada das células neuronais. A resposta da lesão pode ser, de fato, significativamente impactada pela indução de outra lesão dentro de um curto período de tempo após a lesão inicial. Este modelo permite a investigação do intervalo de lesão, que é um aspecto importante do desenho do ensaio clínico para tbi leve repetitivo. Além disso, esse modelo escalável permite um rápido fluxo de trabalho de alto rendimento, o que facilita a investigação de múltiplos parâmetros simultaneamente, bem como a avaliação da atividade terapêutica de novas intervenções.
Uma limitação deste modelo é a incapacidade de controlar as propriedades da onda de explosão entre a saída do tubo e a cabeça do animal. Embora a onda de explosão seja turbulenta ao sair do tubo de choque, as medidas de resultado ainda são confiáveis e reprodutíveis com um posicionamento consistente da cabeça do roedor18. Por isso, é importante manter as configurações experimentais (ou seja, posição da cabeça e distância da saída do tubo de choque) constantes entre todos os estudos. Para otimizar o design e o protocolo do modelo, foram medidas dinâmicas de forma de onda entre a saída do tubo e a área de colocação da cabeça (Figura 3) e modeladas por meio de simulações numéricas18. Projetos futuros integrarão modelagem de elementos finitos para determinar como a dinâmica da força se transfere do crânio para meninges, para fluido cefalorraquidiano e, finalmente, para o tecido cerebral. A complexa interação entre dinâmica da força e biofísica e respostas fisiológicas resultantes são áreas importantes na pesquisa de TCE que até agora foram subexploradas.
Em resumo, apresentamos aqui um protocolo e um experimento visualizado de um modelo de lesão de onda de explosão que foi desenvolvido para investigar os efeitos da TBI leve. A experiência coletiva de engenheiros, médicos e cientistas biomédicos contribuiu para a otimização de sua validade biofísica/fisiológica e relevância neurobiológica. Este modelo foi validado minuciosamente e já produziu resultados significativos, especialmente na compreensão da dinâmica inicial do TBI17,19,20,21,22,23. Explorar esse modelo pré-clínico para estudar mais a TBI leve avançará significativamente nossa compreensão da fisiopatologia e etiologia do TCE e contribuirá para o desenvolvimento de novas intervenções em benefício de pacientes que sofrem de TCE.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a R. Gettens, N. St. Johns, P. Bennet e J. Robson por suas contribuições para o desenvolvimento do modelo TBI. Narsad Young Investigator Grants da Brain & Behavior Research Foundation (F.P. e M.J.R.), uma bolsa de pesquisa do Darrell K. Royal Research Fund for Alzheimer's Disease (F.P.) e um PhRMA Foundation Award (M.J.R.) apoiaram esta pesquisa. Este trabalho foi apoiado por meio de bolsas de pré-doutorado da Fundação Americana para a Educação Farmacêutica (A.F.L e B.P.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose | Eaton Aeroquip | R2-6-6-36M | Available from Grainger |
| 3/8'' Quick Connect Female Plugs | Karcher | KAR 86410440 | |
| 3/8'' Quick Connect Male Plugs | Karcher | KAR 86410440 | |
| ANY-maze video tracking software | Stoelting Co. | ANY-maze software | |
| Clear Mylar membrane | ePlastics.com | POLYCLR0.003 | http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above. |
| Compound Slide Table (X2) | Grizzly Industrial | G5757 | |
| Deadman Gas Control Ball Valve | Coneraco Inc. | 71-502-01 | "Apollo", Available from Grainger |
| Driver and driven section (murine) | own design/production | n/a | For further information please contact the authors |
| Driver and driven section (rat) | own design/production | n/a | For further information please contact the authors |
| Ear Muffs | 3M | 37274 | Available from Grainger |
| Gas Regulator - Hi Flow 3500-600-580 | Harris | 3003539 | |
| Helium Gas | AirGas | HE 300 | Tanks are available in various sizes |
| Inhalation Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Input Module | National Instruments | NI 9223 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | Ordered by veterinarian |
| Laboratory Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 50-550-352 | |
| Labview version 12.0 | National Instruments | Data Acquistion Software | |
| Magnetic Dial Indicator/Micrometer | Grizzly Industrial | G9849 | |
| MATLAB | MathWorks | Software for pressure recording analysis | |
| Oxygen Regulator | Medline | HCS8725M | |
| PC for Data Processing | Dell | ||
| Polyvinylchloride Tubing - 25.4 mm | FORMUFIT | P001FGP-WH-40x3 | |
| Pressure sensors | PCB Piezotronics | 102A05 | |
| Receiver USB Chassis | National Instruments | DAQ-9171 | |
| Sensor Signal Conditioner | PCB Piezotronics | 482C series | |
| Stainless NSF-Rated Mounting Table | Gridmann | GR06-WT2448 | |
| T Handle Allen Wrench - 3/16'' | S&K | 73310 |
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