Summary
我们在这里提出了啮齿动物冲击波模型的方案，以研究轻度至中度创伤性脑损伤的神经生物学和病理生理学影响。我们建立了一个气体驱动的台式设置，配备了压力传感器，允许可靠和可重复地产生爆炸引起的轻度至中度创伤性脑损伤。
Abstract
创伤性脑损伤（TBI）是一个大规模的公共卫生问题。轻度TBI是最常见的神经创伤形式，在美国占了大量的医疗就诊。目前没有FDA批准的治疗TBI的治疗方法。与军事相关的爆炸诱发的TBI的发病率增加，进一步突出了对有效TBI治疗的迫切需要。因此，新的临床前TBI动物模型概括了人类爆炸相关TBI的各个方面，将大大推进对轻度至中度TBI的神经生物学和病理生理过程的研究工作，以及开发TBI的新型治疗策略。
在这里，我们提出了一个可靠的，可重复的模型，用于研究轻度至中度原始细胞诱导的TBI的分子，细胞和行为影响。我们描述了一种分步方案，用于啮齿动物中闭合头部，爆炸引起的轻度TBI，使用由配备压电压力传感器的气体驱动减震管组成的台式设置，以确保一致的测试条件。我们建立的设置的好处是其相对低成本，易于安装，易于使用和高吞吐量容量。这种非侵入性TBI模型的其他优点包括爆炸峰超压的可扩展性和可控可重复结果的产生。该TBI模型的可重复性和相关性已在许多下游应用中进行了评估，包括神经生物学，神经病理学，神经生理学和行为分析，支持使用该模型来表征轻度至中度TBI病因背后的过程。
Introduction
仅在美国，创伤性脑损伤（TBI）每年就诊超过200万次。通常由车祸、体育赛事或跌倒引起的轻度 TBI 约占所有 TBI 病例的 80%1。轻度 TBI 被认为是“无声的疾病”，因为患者在初始损伤后的几天和几个月内通常不会出现明显的症状，但在以后的生活中可能会出现严重的 TBI 相关并发症2。此外，爆炸诱发的轻度TBI在服兵中普遍存在，并且与慢性中枢神经系统功能障碍有关3，4，5，6。由于与原始细胞相关的轻度 TBI7，8 发病率上升，与轻度 TBI 相关的神经生物学和病理生理过程的临床前建模因此成为开发 TBI 新型治疗干预措施的重点。
从历史上看，TBI研究主要集中在严重形式的神经创伤上，尽管严重的人类TBI病例数量相对较少。已经开发了用于重度人类TBI的临床前啮齿动物模型，包括受控皮质冲击（CCI）9，10 和液体叩诊损伤（FPI）11 模型，这两种模型都已得到充分验证，可产生可靠的病理生理学效应12，13。这些模型为今天已知的TBI中的神经炎症，神经变性和神经元修复奠定了基础。虽然已经对TBI的病理生理学有了相当多的了解，但目前还没有有效的，FDA批准的治疗TBI的治疗方法。
最近，TBI研究的重点已经扩大到包括更广泛的TBI相关病理学，最终目标是开发有效的治疗干预措施。然而，很少有针对轻度 TBI 的临床前模型被建立出来，显示出可测量的效果，只有少数研究调查了轻度 TBI 谱2，14，15。由于轻度TBI占所有TBI病例的绝大多数，因此迫切需要可靠的轻度TBI模型来促进对人类病因和神经病理生理学的研究，以开发新的治疗策略。
我们与生物医学工程师和航空航天物理学家一起，为轻度至中度TBI建立了可扩展的闭头冲击波模型。这种临床前啮齿动物模型专门用于研究力动力学的影响，包括爆炸波和加速/减速运动，这些影响与在军事战斗，体育赛事，车祸和跌倒中获得的人类轻度TBI有关。由于爆炸波与导致人类轻度TBI的力动力学相关，因此该模型旨在产生具有脉冲的一致弗里德兰德波形，其测量单位为磅/平方英寸（psi）*毫秒（ms）。将脉冲水平缩放至低于小鼠和大鼠定义的肺致死率曲线，以便进行临床前检查16，17，18。此外，该模型允许调查由于动物头部的快速旋转力引起的政变和撞击损伤。这种损伤是几种类型的临床TBI表现所固有的，包括在军事和平民人群中观察到的那些。因此，这种多功能模型符合包含TBI的多种临床表现的需求。
这里介绍的临床前模型产生了与临床轻度TBI相关的可靠且可重复的病理生理学变化，如先前的许多研究所证明的那样17，19，20，21，22，23。使用该模型的研究表明，遭受低强度冲击波的大鼠表现出神经炎症，轴突损伤，微血管损伤，与神经元损伤相关的生化变化以及短期可塑性和突触兴奋性缺陷19。然而，这种轻度TBI模型没有诱发任何宏观神经病理学变化，包括组织损伤，出血，血肿和挫伤19 ，这在使用中度至重度侵袭性TBI模型的研究中很常见10，24。先前的研究19，21，22，23 表明，该临床前模型可用于表征轻度和中度TBI病因的神经生物学和病理生理过程17，19，20，21，22，23。 该模型还允许测试新的治疗化合物和策略，以及确定用于开发有效TBI干预措施的新型，合适的靶标19，21，22，23。
该模型的开发是为了研究爆炸波以及快速旋转力对啮齿动物分子，细胞和行为结果的影响。与此处介绍的冲击波模型类似，已经开发了许多临床前模型，这些模型试图使用气体驱动的超压波来概括轻度至中度TBI2，14，17，25，26，27，28。其他模型的一些局限性包括：动物固定在金属丝网上，头部在撞击时固定;除了大脑之外，外围器官还暴露于波中，这产生了多发性创伤的混杂变量;并且模型很大且静止，这限制了关键参数的变化和调整，以更好地模拟人类TBI的条件。
这种台式气体驱动减震管设置的优点是其相对较低的购置和运行费用成本，以及易于安装和使用。此外，该设置允许在小鼠和大鼠中进行高通量操作并产生受控的可重复冲击波和 体内 结果。为了控制一致的测试条件（即恒定的冲击波和超压），该设置配备了压力传感器。该模型对TBI的优点包括损伤严重程度的可扩展性以及使用非侵入性闭合头手术诱导轻度TBI。峰值超压和随后的脑损伤随着聚酯膜的增厚以一致的可扩展方式增加17。通过膜厚度调整TBI严重程度的能力是确定特定结局指标（例如，神经炎症）变得明显的水平的有用工具。为外周器官提供保护性屏蔽，还可以通过避免或减少全身损伤（如肺或胸损伤）的混杂变量，重点检查轻度TBI机制。此外，这种设置允许选择方向，通过该方向，爆炸波撞击/穿透头部（即正面，侧面，顶部或下方），因此可以调查不同类型的TBI诱导侮辱。这里描述的诱导轻度至中度TBI的标准程序采用侧面暴露来评估冲击波损伤与快速旋转力引起的政变和痉挛损伤的影响。此外，为了专门研究爆炸引起的伤害，可以在该模型中采用自上而下的冲击波暴露。
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Protocol
该协议遵循辛辛那提大学和西弗吉尼亚大学的动物护理指南。所有涉及动物的程序均由 机构动物护理和使用委员会 （IACUC）批准，并根据“ 实验动物护理和使用指南”的原则进行。
1. 安装抛丸TBI设置
- 获取设置所需的所有工作部件，包括：由钢制驱动和驱动部分组成的减震管，聚酯膜，固定螺栓，压力传感器，聚氯乙烯（PVC）管道护罩以保护外围器官，9.53 mm高压液压管路和快速连接公母附件，高流量气体调节器和带壁挂支架的气瓶（见 图1A，B 和 材料表）。
注：此处使用的驱动和驱动部分的规格（见 图2 和 材料表）已经建立，以产生一致的短持续时间缩放冲击波（见 图3C，D），以诱导小鼠轻度至中度TBI。为此，选择了锥度设计（6°锥度）短驱动器部分。可以修改从动段和驱动段的长度和直径，以专门研究冲击波29、30、31、32、压缩波18或冲击波动力学33。对于大鼠实验，需要调整减震管的尺寸，以根据保留相关的身体缩放参数17 产生可比的力（见 材料表）。 - 将装置的各个工作部件安装在机器滑动台上，这些滑动台固定在经批准用于动物实验的实验室空间中稳定，易于清洁的表面上（最好是用于啮齿动物的不锈钢）。
注：冲击波实验会产生相当程度的噪声;因此，选择吸音实验室空间内的位置，噪音不会干扰其他实验/实验室组。- 将PVC管护罩垂直于防震管装置固定，以便啮齿动物的身体被完全覆盖，只有头部突出。
注意：对于此处描述的诱导轻度至中度TBI的标准程序，头部的中心位于小鼠驱动部分末端5厘米处。 - 壁挂式气瓶，靠近设置，符合OSHA和所有其他相关安全法规。
注：在啮齿动物冲击管型号中，压缩空气、氦气或氮气通常用于产生爆炸波。这里提供的所有数据都是使用氦气生成的，因为这种气体在较短的持续时间内产生更高的超压34，从而允许小鼠受试者进行适当的缩放。
- 将PVC管护罩垂直于防震管装置固定，以便啮齿动物的身体被完全覆盖，只有头部突出。
2. 使用压力传感器记录评估设置和冲击波属性。
- 准备减震管。
- 小心地切割聚酯膜，不要弯曲并产生裂缝，以确保一致的破裂。
- 将薄膜插入从动部分和驱动器部分之间。通过拧紧连接螺栓固定各部分。
- 检查系统是否气密，并且膜在驱动器和驱动部分之间是否紧密固定。
- 通过 9.53 mm 高压液压软管连接气罐，并将附件快速连接到减震管
注：驱动器和从动部分加工成精确的公差，以便在各部分之间提供膜的完全密封。这允许没有气体泄漏，并排除使用任何形式的垫片/O形圈材料，并允许在生成的波形中具有更高的一致性。
- 安装压力传感器以监测爆炸波（见 图1C）。
- 将一个压力传感器放置在头部放置区域，将三个传感器放置在减震管的出口处（见 图1C 和 2）。
- 在执行冲击波之前，从压力传感器开始记录。使用传感器信号调理器和数据采集板以每秒500，000帧的速度记录压力波数据（见 材料表）。
注意：佩戴OHSA批准的耳罩，以确保足够的听力保护。 - 完全打开压缩气罐的主阀，让气流产生突然、快速的压力峰值。
注意：气体超压使聚酯膜破裂，释放冲击波，冲击波在驱动部分内转变为压缩波，并沿着头部放置区域的方向离开管子。 - 手术后立即关闭气流。
注：该装置可配备弹簧复位阀，以自动快速停止气体流量。 - 使用自定义的书面计算机程序分析压力波记录，以确定峰值超压和图形数据。数据可以与每个传感器单独绘制或相互叠加，以显示所产生波的平面性（见 图3C，D）。
注：从技术上讲，可以使用更易于使用的软件进行分析，但由于数据集较大，这些程序在生成绘图方面存在长时间的延迟。
- 建立足以实现指定TBI研究目标的实验条件，并确认该模型产生一致的冲击波，其峰值过压，持续时间和脉冲测量与弗里德兰德波相当（见 图3）。使用上述计算机软件验证这些参数。
- 通过重复步骤 2.1.1 来校准设置。到 2.2.5。并使用压力波记录来确定设置是否需要调整（有关代表性数据，请参见 图3）。
- 修改设置（如果需要）。
注：抛波属性可通过对设置进行细微修改进行调整。例如，头部到驱动部分末端的距离会影响头部水平的冲击波力。聚酯膜的厚度决定了峰超压的水平，较厚的膜增加峰水平（见 图3A，B）。此外，该设置允许选择冲击波撞击/穿透头部的方向（即正面，侧面，顶部或下方），因此可以研究不同的方面，例如单独或与政变和由于快速旋转力引起的冲击波伤害相结合。 - 重复步骤2.1.1至2.2.4，以确定所需的冲击波特性（如果需要）并控制再现性。
- 使用不同厚度的聚酯膜重复步骤2.1.1至2.2.4，以评估设置的可扩展性（代表性数据见 图3A，B）。
3. 啮齿动物轻度TBI的实验设置和诱导的准备
注意：在TBI实验开始前30分钟至1小时将啮齿动物转移到保持区域以适应环境。选择受手术噪音影响最小的保持区域。
- 准备实验所需的所有材料，并检查设置是否正确安装（例如，根据研究目的调整参数）（〜5 - 10分钟）。
注意：损伤严重程度可以通过选择聚酯膜的厚度来调整。根据我们的研究，25.4至102μm的膜厚度用于小鼠的轻度至中度TBI35。我们以前使用过厚度为76.2至127μm的膜在大鼠中产生轻度至中度的TBI19。- 小心地切割聚酯膜，将其插入从动部分和驱动器部分之间，并通过拧紧连接螺栓固定。
- 通过使用快速释放接头将气罐连接到减震管。确保膜在驱动器和驱动部分之间紧密固定。
- 在冲击管的出口处放置三个压力传感器，相距120°，以监测TBI感应过程中的冲击波特性，如步骤2.2.2和2.2.5中所述。
- 使用安装的千分尺确保每个受试者与冲击管设备末端的距离正确。在研究中保持啮齿动物头部的位置（即位置，距离）恒定，以便进行一致的损伤评估。
注意：如1.2.1.所述，通过选择冲击波撞击头部的方向可以引起不同类型的伤害。对于这里描述的诱导轻度至中度TBI的程序，身体垂直于冲击管放置，冲击波撞击头部的侧面。在这种设置下，头部被允许自由移动，因此暴露在冲击波和快速旋转力下，从而产生政变和抵抗效果。 - 使用软件的图形用户界面（GUI）从压力传感器启动记录。
- 在设置中麻醉和定位啮齿动物
- 将啮齿动物从储藏室转移出来，用氧气中的4%异氟醚诱导麻醉，并在氧气中保持2%的异氟醚，以减少痛苦和疼痛。
注意：在继续操作之前，请确保动物对脚趾或尾巴的夹击没有反应。确保所有实验动物的麻醉诱导是一致的，包括假对照。该手术需要低水平和短的麻醉时间。 - 将完全麻醉的啮齿动物放在带有缓冲垫的PVC管罩中，以保护外围器官免受冲击波的影响。
注意：对照对象被麻醉并放置在设置附近，但不直接受到冲击波的影响。确保控制装置受到减震管产生的噪音的影响。 - 将啮齿动物的头部放置在头部放置区域内，并通过直接内置于屏蔽装置中的支撑物或纱布垫从下方支撑它。根据每个啮齿动物的解剖结构确定头部对齐，枕髁与保护性屏蔽的边缘对齐。
注意：避免将压力波直接指向脑干以降低死亡率。已知脑干和颈椎脊髓呼吸中枢的损伤会导致TBI36，37，38啮齿动物模型中的呼吸异常甚至死亡。
- 将啮齿动物从储藏室转移出来，用氧气中的4%异氟醚诱导麻醉，并在氧气中保持2%的异氟醚，以减少痛苦和疼痛。
- 啮齿动物暴露于冲击波。
- 快速打开压缩气罐的主阀，产生压力峰值，使膜破裂，并产生响亮的爆炸，确认压力波的产生。实验后，膜在取下时会视觉破裂。
注意：高速相机可用于捕获啮齿动物所经历的旋转加速的政变和加速效应，以进行进一步分析。 - 听到爆炸后立即关闭气流。
- 快速打开压缩气罐的主阀，产生压力峰值，使膜破裂，并产生响亮的爆炸，确认压力波的产生。实验后，膜在取下时会视觉破裂。
- 从冲击波暴露中恢复
- 在冲击波暴露后，将啮齿动物从设备上取出，并放置在紧邻其侧面的冲击管的平坦表面上。
- 监测受试者以确定正确的反射时间（RRT）。使用秒表记录从冲击波暴露到它们恢复固有的矫正反射的时间。（见 图4A）。
- 一旦受试者恢复矫正反射，就将他们放在各自的家庭笼子里，在接下来的24小时内监测他们的不良反应（即癫痫发作，呼吸困难，从身体口出血）。
- 在初始监测期之后，可以使用研究人员选择的各种生化，神经病理学，神经生理学和行为测定法对受试者进行分析（见下文）。
- 为下一个实验准备设置和空间。
- 用洗涤剂清洁设置以去除异味。
4. 暴露于冲击波/旋转力和控制力的啮齿动物的下游应用
注意：在以前的研究中，使用下游应用（包括生化，神经病理学，神经生理学和行为分析）评估啮齿动物在暴露于冲击波和旋转力后不同时间点的轻度至中度TBI的影响19。
- 生化分析
- 在定义的实验时间点（轻度TBI后数小时至数天），使用所述的标准方案采集组织（例如脑，血液）进行生化分析19。
- 使用组织进行生化分析（即免疫印迹，ELISA等）以评估轻度TBI对神经生物学和病理生理过程的影响。
- 神经病理学分析
- 在定义的实验时间点（轻度TBI后数小时至数天），用生理盐水溶液经心电泳灌注啮齿动物，然后使用4%多聚甲醛溶液固定组织，如上所述19。
注意：某些应用与多聚甲醛固定不兼容（例如，银染，一些用于免疫组织化学的抗体）。 - 使用灌注的固定组织进行解剖学、组织学和分子分析，以评估与轻度 TBI 相关的神经病理学变化，包括所述的神经炎症、神经变性和神经化学变化19。
- 在定义的实验时间点（轻度TBI后数小时至数天），用生理盐水溶液经心电泳灌注啮齿动物，然后使用4%多聚甲醛溶液固定组织，如上所述19。
- 脑切片中的神经生理学分析
- 在定义的实验时间点（轻度TBI后数小时至数天），通过斩首牺牲啮齿动物，移除大脑并准备大脑切片，如上所述19。
- 执行所述的电生理学记录19 ，以评估轻度TBI对基础突触特性和突触可塑性的影响。
- 行为分析
- 在定义的实验时间点（轻度TBI后数小时至数天），评估行为表现，包括运动功能（例如，开放场地，旋转，运动活动;见 图4D）和学习和记忆（例如，恐惧调节，巴恩斯迷宫，莫里斯水迷宫）。
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Representative Results
使用三种不同的膜厚度（25.4，50.8和76.2μm）测试了冲击波设置的可扩展性。使用压电压力传感器评估头部放置区域和冲击管设备出口处的峰值压力水平（见 图1 和 图2）。峰值压力与两个传感器位置的膜厚度一致（图3A，B），表明峰值压力本质上是可扩展的。可以利用安装程序的此属性来校准系统并评估其可伸缩性，如步骤 2.3 中所述。
为了评估原始细胞诱导的TBI 在体内的影响，使用此处描述的协议将成年，3个月大，雄性，野生型C57Bl / 6J小鼠暴露于该装置产生的爆炸波（图1 和 图2）。首先，评估了两种不同膜厚度（50.8和76.2μm）或假处理产生的冲击波对扶正反射时间（RRT）的影响（图4A）。小鼠在麻醉后完全纠正自己的潜伏期（4只爪子在地面上）在这里确定为RRT。使用异氟醚（一致，短和轻度麻醉）麻醉小鼠，然后接受TBI诱导或假治疗。受伤后，立即允许小鼠恢复并记录恢复矫正反射的时间。与接受相同麻醉程序的假对照组相比，暴露于76.2μm膜产生的冲击波的小鼠的RRT显着增加（图4A），表明这种冲击波诱导意识丧失。相比之下，暴露于来自50.8μm膜的冲击波的小鼠在RRT中没有显着增加（图4A），表明轻度TBI形式。标准76.2μm聚酯膜的破裂导致快速产生约160 psi超压的短持续时间冲击波（图3C），在实验过程中受试者颅骨的左侧暴露在该冲击波中。
啮齿动物暴露于冲击波和旋转力后发生的短期生理效应目前尚未得到很好的描述。为了从该模型中描绘出冲击波暴露和旋转力的急性影响，我们评估了核心体温调节和体重。记录TBI诱导后成年，3个月大，雄性野生型C57Bl / 6J小鼠的体温和体重。在TBI手术或假治疗之前记录小鼠的基线核心体温和体重。与假对照相比，暴露于76.2μm膜产生的冲击波在TBI诱导的小鼠的第一个小时内显着降低了体温（图4B），表明TBI诱导产生的显着生理效应。一致地，与假的相比，使用76.2μm膜接受TBI的小鼠在TBI后一天表现出急性，时间依赖性但总重量显着降低（图4C）。
为了检查TBI对行为结局的影响，分析了原始细胞诱导的TBI对急性运动活动的影响（图4D）。成人，3个月大，雄性C57Bl / 6J小鼠使用76.2μm膜或假处理进行TBI诱导，并在TBI后3小时监测运动活动30分钟。暴露于76.2μm膜产生的冲击波导致运动活动急剧显着降低（图4D）。
图1：小鼠冲击波模型的设置。 （A-C）小鼠冲击波模型设置的代表性图像。设置的侧视图 （A）。设置的顶视图 （B）。1、气瓶带高流量气体调节器;2、9.53mm高压液压管路及快速连接公母附件;3、驱动部分的减震管;4、驱动断面减震管;5、聚氯乙烯管屏蔽;6、头部放置面积;7、聚酯膜。设置的各个部分安装在机器滑动台上，允许精确定位驾驶员（3）和驱动部分（4）与受伤诱导的受试者的关系。（C） 带有压力传感器放置的设置俯视图。三个传感器位于减震管出口处的一个平面上，相距120度（S1 - S3），以监测TBI感应期间的冲击波特性。一个传感器安装在头部放置区域（S4）。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：小鼠超压冲击管示意图。 精密加工的减震管由高强度钢制成。驱动器部分的内部空间呈6度角。驱动器和从动部分的内径为37 mm。驱动驱动部分的配合面经过精密加工，以确保完全密封。整个减震管以工业方式夹紧在机器滑台上，以确保牢固的安装和爆炸波产生的一致性。在从动部分的出口处钻孔（在一个平面上，相距120°）以安装三个压力传感器（由*表示）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：来自小鼠冲击波设置的压力记录。 （A，B）峰值压力是可扩展的，取决于聚酯膜的厚度。压力传感器用于记录具有25.4，50.8或76.2μm厚度的氦气和聚酯膜的冲击管产生的峰值压力。（A）在头部放置区域，25.4 μm膜产生的平均峰值压力为428±15.9 kPa，50.8 μm膜637±21.4 kPa，76.2 μm膜1257±40.7 kPa（SEM， n = 7-12，单向方差分析，然后是事后Dunnett比较测试，*** P ≤0.001）。（B）在冲击管出口处，用25.4μm膜记录的平均峰值压力为164±11.7 kPa，50.8μm膜232±11.7 kPa和76.2μm膜412±11.0 kPa（SEM， n = 7-12，单因子方差分析，然后进行事后Dunnett比较测试，** P ≤0.01，*** P ≤0.001）。（C）使用76.2μm膜从头部放置区域（入射传感器）处的传感器记录压力的代表性图表。波形类似于弗里德兰德波，在小鼠受试者的时间/持续时间上缩放。（D）来自位于从动部分末端的3个不同传感器的压力记录的代表性图表，以确定从动部分内波形的线性度/相位。所有三个传感器（相距120度）都显示出相似的上升/下降持续时间，表明离开被驱动部分的波形在从动部分内的横截面相似。使用76.2μm膜产生冲击波。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：原始细胞诱导的TBI的急性 体内 效应。（A） 中度 TBI，但不是轻度 TBI 会增加矫正反射时间 （RRT）。成年，3个月大，雄性，野生型C57Bl / 6J小鼠使用具有50.8或76.2μm厚度的氦气和聚酯膜的休克管进行TBI程序或假处理。在受伤或假治疗后，立即允许小鼠恢复并记录RRT。使用50.8μm膜或假处理进行TBI诱导表现出相当水平的RRT。相反，使用76.2μm膜的TBI诱导会增加RRT，表明76.2μm膜的冲击波引起的意识丧失（SEM， n = 4-10，Sham RRT = 35.6 ±2.0 s，50.8μm膜RRT = 43.0±4.3 s和76.2 μm膜RRT = 254.0±40.2 s，单向方差分析，然后是事后Dunnett的比较测试， P ≤ 0.001）。（B）中度TBI显着和短暂降低核心体温。将成人，3个月大，雄性，野生型C57Bl / 6J小鼠用76.2μm膜或假处理进行TBI诱导。他们的核心体温被记录了两个小时。在TBI诱导之前记录基线核心体温。具有76.2μm膜的爆炸诱导的TBI与TBI后第一小时内核心体温的显着下降有关。（SEM， n = 10， 双向重复测量方差分析， 然后是事后 Bonferroni 的多重比较检验， ** P ≤ 0.01， *** P ≤ 0.001）。（C）中度TBI导致体重短暂减轻。成人，3个月大，雄性C57Bl / 6J小鼠使用76.2μm膜或假处理进行TBI程序。随后，体重记录5天。TBI后一天总体重显着降低（SEM， n = 7，双向重复测量方差分析，然后进行事后Bonferroni的多重比较测试，* P ≤0.05）。（D）中度TBI导致运动活动急剧减少。成人，3个月大，雄性C57Bl / 6J小鼠使用76.2μm膜或假处理进行TBI程序。TBI后三小时的运动活动被跟踪30分钟，并使用视频跟踪软件进行量化（SEM， n = 9-11，未配对的双尾 t-检验，** P = 0.01）。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
我们在这里提出了一种临床前轻度TBI模型，该模型具有成本效益，易于设置和执行，并允许高通量，可靠和可重复的实验结果。该模型为外周器官提供保护性屏蔽，以便对轻度TBI机制进行重点研究，同时限制全身损伤的混杂变量。相比之下，已知其他爆炸模型会对外围器官造成损害2，39，40。与其他抛丸型号的固定位置相比，该型号的另一个优点是它能够从任何所需角度传递冲击波40。这允许进行集中的解剖学研究，以更好地了解大脑的脆弱性。
为了研究与人类爆炸相关的TBI，TBI的相关模型应产生与受试者在TBI诱导期间所经历的生物力学力相当的生物力学力。临床相关模型还应诱导在患有轻度TBI的受试者中观察到的神经生物学，病理生理学和行为结果。在以前的研究中，这里提出的冲击波模型已经过彻底检查17，19，21，并且已经评估了许多让人联想到人类TBI的生物物理和神经生物学方面，包括冲击波动力学和力，神经炎症，轴突损伤和微血管损伤。这些研究提供了证据，证明这种用于TBI的临床前冲击波模型产生了与临床TBI相关的可靠且可重复的神经生物学和病理生理学变化。
此外，随着军事人群中轻度爆炸性TBI发病率的增加7，8，这种针对轻度人类TBI的多功能啮齿动物模型为研究人员提供了一种有价值的工具，可以研究与爆炸相关的TBI背后的过程并探索新的治疗策略。例如，我们的模型展示了神经血管并发症，并强调了血管干预作为一种有前途的治疗方法的重要性22，23，35。一致地，原始TBI的其他临床前模型也产生了与神经变性和行为缺陷相关的神经血管效应2，25，40，41，42，43。
基于先前的研究19，21，22，23，我们已经确定这里介绍的冲击波模型可能非常适合研究人类脑震荡的病理生理学和病因学。大多数临床前TBI模型不允许头部运动44 ，尽管与快速头部加速/减速相关的生物力学特性是人类脑震荡发展的预测因素45，46。与本文描述的模型一致，Goldstein及其同事14 表明，由爆炸力引起的快速头部运动是诱导行为缺陷的先决条件，可能是由于旋转力和剪切力。更好地了解轻度TBI和脑震荡中发生的病理生理变化也将有助于确定临床生物标志物并确定开发TBI治疗方法的新靶点。
对于重复性轻度 TBI（例如，运动中经历的重复性脑震荡）后的病理生理学变化和疾病进展知之甚少。该临床前模型允许研究重复性轻度TBI，几乎没有死亡率。相比之下，一些TBI模型造成严重伤害，因此通常很难或不人道地诱发进一步的伤害。此外，严重损伤通常是无法修复的，并且可能无法检测到细微的生理变化。该模型还允许对各种伤害间期进行可扩展的调查;需要进一步表征的重复性轻度 TBI 的关键参数。TBI后，会触发中枢神经系统损伤反应，有助于保护大脑完整性并防止广泛的神经元细胞死亡。事实上，在初始损伤后的短时间内，另一次损伤的诱导可能会对损伤反应产生显著影响。该模型允许研究损伤间期，这是重复性轻度TBI临床试验设计的一个重要方面。此外，这种可扩展的模型允许快速的高通量工作流程，这有助于同时研究多个参数，以及评估新干预措施的治疗活性。
该模型的一个局限性是无法控制管出口和动物头部之间的冲击波的性质。虽然冲击波在从冲击管中退出时是湍流的，但结果测量仍然可靠且可重复，啮齿动物头部的位置一致18。因此，在所有研究之间保持实验设置（即头部位置和与冲击管出口的距离）恒定非常重要。为了优化模型设计和协议，测量了管出口和磁头放置区域之间的波形动力学（图3），并使用数值模拟进行了建模18。未来的项目将整合有限元建模，以确定力动力学如何从颅骨转移到脑膜，到脑脊液，最后进入脑组织。力动力学和生物物理学的复杂相互作用以及由此产生的生理反应是迄今为止尚未得到充分探索的TBI研究中的重要领域。
综上所述，我们在这里提出了一个协议和爆炸波损伤模型的可视化实验，该模型是为研究轻度TBI的影响而开发的。工程师，医生和生物医学科学家的集体经验有助于优化其生物物理/生理有效性和神经生物学相关性。该模型已经过彻底验证，并且已经产生了有意义的结果，特别是在理解轻度TBI的早期动力学方面17，19，20，21，22，23。利用这种临床前模型进一步研究轻度TBI将显着提高我们对TBI的病理生理学和病因的理解，并有助于开发新的干预措施，使患有TBI的患者受益。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢R. Gettens，N. St. Johns，P. Bennet和J. Robson对TBI模型的发展所做的贡献。来自大脑与行为研究基金会（F.P.和M.J.R.）的NARSAD青年研究员资助，来自Darrell K. Royal阿尔茨海默病研究基金会（F.P.）的研究资助和PhRMA基金会奖（M.J.R.）支持这项研究。这项工作得到了美国药物教育基金会（A.F.L和B.P.L.）的博士前奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose | Eaton Aeroquip | R2-6-6-36M | Available from Grainger |
| 3/8'' Quick Connect Female Plugs | Karcher | KAR 86410440 | |
| 3/8'' Quick Connect Male Plugs | Karcher | KAR 86410440 | |
| ANY-maze video tracking software | Stoelting Co. | ANY-maze software | |
| Clear Mylar membrane | ePlastics.com | POLYCLR0.003 | http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above. |
| Compound Slide Table (X2) | Grizzly Industrial | G5757 | |
| Deadman Gas Control Ball Valve | Coneraco Inc. | 71-502-01 | "Apollo", Available from Grainger |
| Driver and driven section (murine) | own design/production | n/a | For further information please contact the authors |
| Driver and driven section (rat) | own design/production | n/a | For further information please contact the authors |
| Ear Muffs | 3M | 37274 | Available from Grainger |
| Gas Regulator - Hi Flow 3500-600-580 | Harris | 3003539 | |
| Helium Gas | AirGas | HE 300 | Tanks are available in various sizes |
| Inhalation Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Input Module | National Instruments | NI 9223 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | Ordered by veterinarian |
| Laboratory Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 50-550-352 | |
| Labview version 12.0 | National Instruments | Data Acquistion Software | |
| Magnetic Dial Indicator/Micrometer | Grizzly Industrial | G9849 | |
| MATLAB | MathWorks | Software for pressure recording analysis | |
| Oxygen Regulator | Medline | HCS8725M | |
| PC for Data Processing | Dell | ||
| Polyvinylchloride Tubing - 25.4 mm | FORMUFIT | P001FGP-WH-40x3 | |
| Pressure sensors | PCB Piezotronics | 102A05 | |
| Receiver USB Chassis | National Instruments | DAQ-9171 | |
| Sensor Signal Conditioner | PCB Piezotronics | 482C series | |
| Stainless NSF-Rated Mounting Table | Gridmann | GR06-WT2448 | |
| T Handle Allen Wrench - 3/16'' | S&K | 73310 |
References
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