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Neuroscience

Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée

Published: August 31, 2020 doi: 10.3791/61264
Automatic Translation
1, 1,2, 3,4, 1
1Department of Neuroscience, The Ohio State University, 2Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, 3Quantitative Biology Institute, Ohio University, 4Department of Physics and Astronomy, Ohio University

Summary

Nous décrivons des méthodes de photoactivation de fluorescence pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones myélinis simples des nerfs périphériques des souris transgéniques qui expriment une protéine de neurofilament photoactivatable.

Abstract

Les polymères protéiques neurofilaments se déplacent le long des axones dans la composante lente du transport axonal à des vitesses moyennes de ~0,35-3,5 mm/jour. Jusqu’à récemment, l’étude de ce mouvement in situ n’était possible qu’à l’aide de l’étiquetage radioisotopique des impulsions, ce qui permet l’analyse du transport axonal dans des nerfs entiers avec une résolution temporelle des jours et une résolution spatiale de millimètres. Pour étudier le transport de neurofilament in situ avec une résolution temporelle et spatiale plus élevée, nous avons développé une souris transgénique hThy1-paGFP-NFM qui exprime la protéine de neurofilament M marquée avec le GFP photoactivatable dans les neurones. Ici, nous décrivons la photoactivation de la fluorescence impulsion-évasion et les méthodes de propagation des impulsions pour analyser le transport neurofilament dans les axones myélins uniques des nerfs tibiaux de ces souris ex vivo. Les segments nerveux isolés sont maintenus au stade du microscope par perfusion avec saline oxygénée et photographiés par la microscopie confocale de fluorescence de disque tournant. La lumière violette est utilisée pour activer la fluorescence dans une courte fenêtre axonale. La fluorescence dans les régions activées et flanquantes est analysée au fil du temps, permettant l’étude du transport de neurofilament avec résolution temporelle et spatiale de l’ordre des minutes et des microns, respectivement. La modélisation mathématique peut être utilisée pour extraire les paramètres cinétiques du transport neurofilament, y compris la vitesse, le biais directionnel et le comportement de pause des données résultantes. Les méthodes d’évacuation des impulsions et de propagation du pouls peuvent également être adaptées pour visualiser le transport de neurofilament dans d’autres nerfs. Avec le développement de souris transgéniques supplémentaires, ces méthodes pourraient également être utilisées pour l’image et l’analyse du transport axonal d’autres protéines cytosquelettiques et cytosoliques dans les axones.

Introduction

Le transport axonal des neurofilaments a été démontré pour la première fois dans les années 1970 par l’étiquetage radioisotopique1. Cette approche a donné une mine d’informations sur le transport neurofilament in vivo, mais il a relativement faible résolution spatiale et temporelle, généralement de l’ordre des millimètres et des jours au mieux2. De plus, l’étiquetage radioisotopique des impulsions est une approche indirecte qui nécessite l’injection et le sacrifice de plusieurs animaux pour générer un cours unique. Avec la découverte de protéines fluorescentes et les progrès de la microscopie de fluorescence dans les années 1990, il est devenu par la suite possible d’imager le transport de neurofilament directement dans les neurones cultivés sur une échelle de temps de secondes ou de minutes et avec une résolution spatiale sous-micrométrique, offrant une compréhension beaucoup plus grande du mécanisme du mouvement3. Ces études ont révélé que les polymères neurofilament dans les axones se déplacent rapidement et par intermittence dans les deux directions antérogrades et rétrogrades le long des voies de microtubule, propulsés par des protéines motrices microtubules. Cependant, les neurofilaments sont des structures limitées par la diffraction à seulement 10 nm de diamètre qui sont généralement espacées de leurs voisins par seulement des dizaines de nanomètres; par conséquent, les polymères ne peuvent être suivis que dans les neurones cultivés qui contiennent des neurofilaments peu distribués afin que les polymères en mouvement puissent être résolus à partir de leurs voisins4. Ainsi, il n’est pas actuellement possible de suivre les neurofilaments simples dans les axones qui contiennent des polymères neurofilament abondants, tels que les axones myélins.

Pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones riches en neurofilament à l’aide de la microscopie de fluorescence, nous utilisons une méthode de photoactivation de la fluorescence impulsion-évasion que nous avons développée pour étudier le comportement de pause à long terme des neurofilaments dans les cellules nerveuses cultivées4,5. Les neurofilaments marqués avec une protéine de fusion de neurofilament fluorescent photoactivatable sont activés dans un court segment d’axone, puis le taux de départ de ces filaments de la région activée est quantifié en mesurant la décomposition de fluorescence au fil du temps. L’avantage de cette approche est qu’il s’agit d’une analyse au niveau de la population du transport neurofilament qui peut être appliquée sur une échelle de temps de minutes ou d’heures sans avoir besoin de suivre le mouvement des polymères neurofilament individuels. Par exemple, nous avons utilisé cette méthode pour analyser la cinétique du transport neurofilament dans les cultures myélinantes6.

Récemment, nous avons décrit le développement d’une souris transgénique hThy1-paGFP-NFM qui exprime de faibles niveaux d’une protéine de neurofilament pagFP-marquée M (paGFP-NFM) dans les neurones sous le contrôle du neurone humain spécifique Thy1 promoteur7. Cette souris permet l’analyse du transport de neurofilament in situ à l’aide de la microscopie de fluorescence. Dans cet article, nous décrivons les approches expérimentales pour analyser le transport de neurofilament dans les axones myélinés des nerfs tibiaux de ces souris utilisant deux approches. La première de ces approches est la méthode d’évacuation des impulsions décrite ci-dessus. Cette méthode peut générer des informations sur le comportement de pause des neurofilaments, mais est aveugle à la direction dans laquelle les filaments quittent la région activée, et ne permet donc pas la mesure de la directionnalité nette et la vitesse de transport8. La deuxième de ces approches est une nouvelle méthode de propagation des impulsions dans laquelle nous analysons non seulement la perte de fluorescence de la région activée, mais aussi l’augmentation transitoire de la fluorescence dans deux fenêtres latérales par lesquelles les filaments fluorescents se déplacent à mesure qu’ils quittent la région activée dans les deux directions antérogrades et rétrogrades. Dans les deux approches, les paramètres du transport de neurofilament tels que la vitesse moyenne, la directionnalité nette et le comportement de pause peuvent être obtenus en utilisant l’analyse mathématique et la modélisation des changements dans la fluorescence dans les fenêtres de mesure. La figure 3 illustre ces deux approches.

Ce protocole démontre la dissection et la préparation du nerf, l’activation et l’imagerie de la fluorescence paGFP, et la quantification du transport de neurofilament à partir des images acquises à l’aide du paquet de distribution FIJI d’ImageJ9. Nous utilisons le nerf tibial parce qu’il est long (plusieurs cm) et ne se ramifie pas; cependant, en principe tout nerf exprimant paGFP-NFM est approprié pour une utilisation avec cette technique si elle peut être disséquée et désaissée sans endommager les axones.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’État de l’Ohio.

1. Préparation de la solution saline nerveuse

  1. Faire 100 mL de la solution saline de Breuer10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glucose, 23,8 mM NaHCO3 dans de l’eau double distillée.
  2. Bullez 95% d’oxygène/5% de dioxyde de carbone (carbogén) par la solution saline pendant au moins 30 minutes avant l’utilisation. Les restes de solution saline peuvent être réutilisés en une semaine; toutefois, il doit être réoxygéné avant chaque utilisation.
  3. Verser la solution saline oxygénée dans une seringue de 60 mL et s’assurer qu’il reste peu d’air dans la seringue.

2. Assemblage initial de la chambre de perfusion nerveuse

  1. Connectez la seringue et le tube comme le montre la figure 1A,en plaçant le tube de sortie dans une fiole de déchets.
  2. Placez le joint extérieur dans le boîtier de la chambre de perfusion, en veillant à ce que l’entrée d’écoulement et les poteaux de sortie soient alignés avec les trous dans le joint.
  3. Déposer le joint intérieur (silicone, 100 μm d’épaisseur) sur un couvercle circulaire #1,5 (40 mm de diamètre), en lissant soigneusement les rides du joint pour assurer un joint serré. Pour faciliter l’assemblage ultérieur, placez le couvercle et le joint sur une serviette en papier ou l’essuie-tout avec le joint orienté vers le haut.

3. Dissection et préparation du nerf tibial de souris

  1. Sacrifiez l’animal par inhalation de dioxyde de carbone ou une autre méthode approuvée par l’institution. Démarrer une minuterie lorsque l’animal cesse de bouger/respirer, car les expériences ne doivent être menées que dans les 3 heures suivant le sacrifice7.
  2. Vaporiser la fourrure avec 70 % d’éthanol et retirer autant que possible des jambes et du dos de l’animal à l’aide d’un rasoir électrique.
  3. À l’aide d’une paire de gros ciseaux de dissection, faire une incision dorsale dans la peau près du milieu de la colonne vertébrale et continuer la coupe autour de l’aspect ventral de l’animal. À partir de cette coupe, reflètent lentement la peau des jambes en la tirant doucement loin du muscle et en coupant le fascia.
  4. Placez l’animal en position de supination sur un plateau de dissection et épinglez les quatre pattes. Épinglez éventuellement la queue pour réduire davantage le mouvement.
  5. À l’aide de ciseaux de microdésection, faire une incision dans les muscles de la cuisse à mi-chemin entre la queue et le genou pour exposer le nerf sciatique. Assurez-vous que le nerf, qui est visible à travers le muscle, n’est pas coupé.
  6. Étendre l’incision dorsalement et ventralement pour enlever le muscle. De même, enlever les muscles du mollet, en gardant les coupes peu profondes et courtes pour éviter d’endommager le nerf.
  7. Enlever les muscles jusqu’à ce que le nerf tibial soit entièrement exposé du point où il se ramifie du nerf sciatique (au genou) au talon (figure 2A).
    REMARQUE : Dans toutes les étapes, y compris et après la dissection du nerf tibial, évitez l’exposition inutile à la lumière ambiante pour minimiser l’activation accidentelle possible du paGFP dans le nerf.
  8. Saisissez le nerf tibial à l’extrémité spine-proximal avec une paire de forceps et coupez le nerf à l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection. Prendre soin de ne pas mettre de tension sur le nerf, le soulever loin du muscle, couper les attachements.
  9. Couper l’extrémité d’épine-distale du nerf tibial et transférer à un petit plat de Petri de la solution saline oxygénée à température ambiante. À partir de ce point dans la procédure, toujours être certain de garder une trace des extrémités proximales et distales du nerf.
    REMARQUE : Une façon de le faire est de marquer l’extrémité distale du nerf avec une coupe inclinée de telle sorte que le cône soit visible.
  10. À partir de l’extrémité proximale du nerf, saisir doucement l’axone exposé se termine par une paire de forceps très fine.
  11. Avec une deuxième paire de forceps, saisir la gaine nerveuse proximalement, et tirer lentement vers l’extrémité distale du nerf. La gaine nerveuse glissera le long des axones avec une résistance minimale. Assurez-vous qu’aucune tension indue n’est appliquée au nerf au cours de ce processus.

4. Assemblage final de chambre de perfusion de nerf

  1. Saisir l’extrémité proximale du nerf, l’enlever de la solution saline et le poser lentement sur le couvercle de la chambre de perfusion dans l’ouverture rectangulaire du joint intérieur, en maintenant une tension douce sur le nerf que vous le posez vers le bas de sorte qu’il se trouve droit.
  2. Placez le glissement microaqueducteur sur le nerf avec le côté rainuré face au nerf, et la direction de l’écoulement parallèle au nerf. Retournez le couvercle et l’assemblage de microaqueduct au-dessus, et placez-le dans le boîtier de chambre de perfusion avec la glissière de microaqueduct apposed au joint extérieur. Le nerf et le joint intérieur environnant seront désormais pris en sandwich entre le couvercle et la glissière microaqueducte, qui sont séparés par le joint, avec le couvercle orienté vers le haut (Figure 1B).
  3. Sécurisez la chambre de perfusion en la plaçant dans le boîtier métallique et en faisant pivoter l’anneau de verrouillage. Assurez-vous que le boîtier en plastique est entièrement sous tous les clips métalliques et bien serrer pour éviter les fuites salines. Le surtightening peut casser la glissière microaqueducte ou le couvercle. Retournez la chambre pour que le couvercle soit orienté vers le bas.
  4. Déprimer lentement le piston à seringue saline pour remplir la chambre de perfusion. Gardez l’entrée et la sortie des tubes, de la fiole de sortie et de la seringue surélevées au-dessus de la chambre elle-même en tout temps pendant l’installation et l’imagerie. Cela évite le siphonnage, qui peut introduire des bulles ou provoquer l’instabilité de mise au point en raison de la pression négative dans la chambre.
  5. Transférer l’assemblage de perfusion à un microscope inversé et monter la seringue saline dans la pompe à seringues. Démarrez le moteur à une vitesse appropriée pour un débit de 0,25 mL/min. Branchez-vous et allumez ensuite le chauffe-solution en ligne réglé à 37 °C.
  6. Connectez le chauffe-eau objectif et réglez à 37 °C, appliquez de l’huile à l’objectif et insérez la chambre de perfusion dans le support de scène.
  7. Appliquer de l’huile sur le coussin chauffant de chambre et fixer à la chambre de perfusion. Connectez-vous et allumez le chauffe-chambre; fixé à 37 °C.
    REMARQUE : Des changements de température peuvent provoquer la formation de bulles dans la chambre de perfusion en raison de l’outgazsing de la solution. Si des bulles se forment, augmentez brièvement le débit de la solution de 5 à 10 x jusqu’à ce que les bulles dégagent la chambre.
  8. Verrouillez la chambre de perfusion dans l’adaptateur de scène et ez l’huile objective en contact avec le couvercle sur le dessous de la chambre.
    REMARQUE : La chambre Bioptechs avec adaptateur de scène ASI utilisé ici est conçue pour une configuration de microscope inversé.

5. Activation de fluorescence et acquisition d’images

  1. À l’aide de l’éclairage brightfield, concentrez-vous sur la couche d’axones sur la surface inférieure du nerf le plus proche de la surface du couvercle (figure 2B). Les axones myélins (généralement de 1 à 6 μm de diamètre chez les souris adultes) peuvent être identifiés par la présence d’une gaine de myéline, qui est visible sous l’éclairage de lumière transmis par le champ lumineux sans amélioration du contraste. Schmidt-Lanterman fissures et les nœuds de Ranvier sont également facilement apparentes. Les axones non myélins sont plus minces (généralement de diamètre de 1 μm) et sont généralement présents dans les faisceaux (paquets remak), où ils sont généralement trop étroitement apposés pour être résolus les uns des autres.
  2. Si disponible au microscope, activez le système de mise au point automatique pour maintenir la concentration au cours de l’imagerie timelapse.
  3. Acquérir une image de référence brightfield. Enregistrez l’orientation du nerf (extrémités vertébrale-proximales et distales) par rapport aux images.
  4. Acquérir une image confocale à l’aide d’un laser de 488 nm et d’un filtre d’émission approprié pour le paGFP (p. ex., 525/50 nm) pour enregistrer l’autofluorescence pré-blanchiment. Maintenez la puissance laser basse pour minimiser le photobleaching, avec le temps d’exposition ajusté en conséquence pour détecter le signal faible. À titre d’exemple, des données représentatives ont été acquises à 5 % de puissance laser et à 4 s d’exposition. Enregistrez les paramètres d’acquisition à utiliser dans toutes les expériences futures.
    REMARQUE : Après la photoactivation, les paramètres d’imagerie idéaux produiront un rapport signal/bruit > 8 et un photobleaching de moins de 25 % du signal d’origine au cours de 20 images. Les axones peuvent également être photographiés par microscopie d’épifluorescence widefield comme nous l’avons fait à l’origine7, mais la qualité de l’image sera inférieure en raison du manque de confoalité.
  5. Réglez la puissance laser à environ 5 fois la puissance d’imagerie normale et acquérir une image avec un temps d’exposition de 3-4 minutes. Bien qu’elle ne soit pas essentielle, cette étape est recommandée pour blanchir l’autofluorescence et d’autres sources de fluorescence indésirable afin de réduire le signal de fond et ainsi maximiser le signal au bruit de la fluorescence photoactivée.
  6. Acquérir une image avec les paramètres utilisés à l’étape 5.4 pour enregistrer l’autofluorescence préactivation après cette étape de blanchiment.
  7. Sur l’image brightfield, tracez une ligne parallèle aux axones d’une longueur égale à la taille souhaitée de la fenêtre d’activation. La longueur de cette fenêtre varie en fonction de l’objectif et des paramètres expérimentaux, mais les longueurs typiques sont de 5 μm pour le paradigme d’évacuation des impulsions et de 40 μm pour le paradigme de propagation des impulsions.
  8. En utilisant cette ligne comme guide, dessinez une région rectangulaire d’intérêt (ROI) à travers le champ de vision perpendiculaire aux axones. La région doit englober tous les axones à photoactiver.
  9. Déterminez les paramètres optimaux pour la photoactivation avec un éclairage de 405 nm.
    REMARQUE : Effectuez uniquement cette étape et les sous-étapes avant la première activation expérimentale. Au cours d’une expérience, les mêmes paramètres de photoactivation doivent être utilisés.
    1. Activez une région d’intérêt à plusieurs reprises à l’aide de la ligne laser de 405 nm, de la faible puissance laser (p. ex., 5 %) et du temps de séjour des pixels (p. ex., 40 μs) et d’une impulsion, en acquérant une image de la fluorescence GFP activée après chaque activation. Répéter jusqu’à ce que la fluorescence n’augmente plus, puis quantifier la fluorescence dans une région d’intérêt pour chaque image.
    2. Tracer les intensités moyennes de fluorescence par rapport au nombre d’impulsions. Sélectionnez le nombre d’impulsions après lesquelles la fluorescence n’augmente plus en tant que nombre optimal d’impulsions pour l’activation.
  10. Activez la fluorescence paGFP de la région dessinée à l’étape 5.8 par excitation à motifs avec 405 nm de lumière. Assurez-vous qu’une image est acquise juste avant et juste après l’activation.
    REMARQUE : L’activation idéale du paGFP produira une région de fluorescence clairement définie avec des limites nettes contenues dans le roi.
  11. Démarrez une minuterie de 1 minute à la fin de l’activation. Au bout d’une minute, début de l’acquisition d’une série de timelapse.
    REMARQUE : Le délai de 1 minute est nécessaire pour permettre l’augmentation de la fluorescence observée après la photoactivation du paGFP11. Pour la méthode de propagation des impulsions, une période d’acquisition de 5 à 10 minutes avec des intervalles de timelapse de 30 secondes est suffisante pour mesurer les pentes initiales dans les fenêtres centrales et latérales afin de mesurer la vitesse et la directionnalité. Pour la méthode d’évacuation des impulsions, une période d’acquisition de 30 à 150 minutes avec des intervalles de timelapse de 5 ou 10 minutes permet d’analyser le comportement de pause à long terme des filaments
  12. Enregistrez toutes les images acquises, ainsi que le retour sur investissement utilisé pour l’activation de la fluorescence.
  13. Déplacez-vous vers une nouvelle région du nerf et répétez les étapes 5.1-5.11. Si la nouvelle région se trouve le long du même axone, elle doit être à au moins 500 μm de la région précédemment activée pour éviter la détection de neurofilaments fluorescents qui ont quitté l’autre région activée. L’acquisition du timelapse final doit se terminer avant la fin de la fenêtre de 3 heures.
    REMARQUE : Il est possible que la préparation soit viable pendant plus de 3 heures, mais nous ne l’avons pas confirmé. Avec la dissection et la préparation compétentes, entre cinq et huit ensembles d’image timelapse de 10 minutes peuvent être acquis dans cette fenêtre de 3 heures.
  14. Une fois la dernière série d’images en timelapse acquise, arrêtez le flux de solution saline, déconnectez la solution et les chauffe-chambres, et retirez l’appareil de perfusion du stade du microscope.

6. Acquisition d’images Flatfield et darkfield

  1. Faire une solution de fluorescéine en ajoutant 250 mg de poudre de fluorescéine à 0,5 mL d’eau double distillée. Mélanger jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de particules visibles et faire tourner la solution pendant 30 secondes dans une centrifugeuse de table pour sédimenter tout matériau non dissolved. Cette solution peut être stockée pendant plusieurs mois à 4 °C si elle est protégée contre l’exposition à la lumière.
  2. Ajouter 8 μL de solution de fluorescéine à une lame et appliquer un couvercle #1,5. Épongez l’excès de liquide, scellez avec du vernis à ongles et laissez sécher.
    REMARQUE : À cette forte concentration, la forte absorption du colorant fluoréscéin éteint le faisceau d’éclairage à l’intérieur de la solution, produisant un plan mince de fluorescence à la surface du couvercle qui est à la fois uniforme et résistant au photobleaching dû à l’échange diffusif rapide12.
  3. Placez la lame de fluorescéine sur le côté du microscope inversé et réglez l’accent sur le plan mince de fluorescence à la surface du couvercle. Déplacez-vous autour de la diapositive pour trouver un champ de vision qui ne contient pas de bulles d’air (taches sombres) ou de grandes particules de fluorescéine (taches lumineuses).
  4. Acquérir une pile z couvrant 6 μm à des intervalles de 0,2 μm de telle sorte que l’image du milieu soit le plan de mise au point d’origine. Utilisez un court temps d’exposition (p. ex., 40 ms) parce que la fluorescence sera très brillante. Cette acquisition de la pile z est nécessaire pour capturer la fluorescence maximale à travers le champ de vision car le couvercle est rarement parfaitement horizontal et le plan de fluorescence de la fluorescence de la fluorescence est très étroit. Répétez cette opération pour un total de 25 champs de vue, déplaçant la scène d’au moins 20 μm dans n’importe quelle direction entre les champs.
  5. Fermez tous les volets de chemin lumineux, y compris l’obturateur de la caméra, et réglez la puissance laser et le temps d’exposition à zéro. Acquérir une pile de 100 images avec ces paramètres. Ces images seront en moyenne pour générer l’image darkfield, qui sera utilisé pour corriger le courant sombre et le décalage de biais sur la puce de la caméra.
    REMARQUE : L’acquisition en continu est un moyen idéal de capturer ces images.

7. Imagerie glycolytiquement inhibé les nerfs pour la correction d’eau de Javel

  1. Faire et oxygéner une solution saline comme à l’étape 1; toutefois, remplacez le glucose D-2-désoxy-D et ajoutez 0,5 mM d’iodoacétate de sodium pour inhiber la glycolyse13. Nous appelons cela « saline inhibitrice ».
  2. Répétez les étapes 2 à 5 à l’aide de la solution saline inhibitrice, avec une image timelapse de 10 à 30 minutes définie à l’étape 5.11. Prévoyez 40-50 minutes après l’application de la solution saline inhibitrice avant l’imagerie afin d’assurer l’inhibition complète du transport de neurofilament.
    NOTE: L’inhibition glycolytique finira par tuer les axones de sorte qu’il ya une fenêtre étroite de temps après l’inhibition dans laquelle acquérir des données, généralement environ 30 minutes. Un indicateur du niveau d’inhibition métabolique est l’autofluorescence flavin des mitochondries axonales, qui peut être détectée dans la série timelapse en raison des longues expositions que nous utilisons pour l’image de la fluorescence paGFP14. Typiquement, l’autofluorescence mitochondriale augmentera pendant le traitement avec la solution saline inhibitrice. Si les mitochondries commencent à s’arrondir ou à se fragmenter, cessez d’être imagerie.

8. Traitement et analyse d’images à l’aide d’ImageJ

  1. Correction de terrain plat et de champ noir
    1. Ouvrez la pile d’images darkfield et moyennez les images en cliquant sur Image | Piles | Z Project et sélectionner Intensité moyenne dans le menu déroulant pour générer l’image darkfield.
    2. Ouvrez les piles d’images de champ plat de fluorescein et créez une projection d’intensité maximale de chacun (25 au total) en cliquant sur Image | Piles | Z Project et sélection de l’intensité maximale dans le menu déroulant.
    3. Combinez les 25 images de projection maximale résultantes en une seule pile en cliquant sur Image | Piles | Images à empiler. Créer une projection d’intensité moyenne de cette pile en cliquant sur Image | Piles | Z Project et sélectionner Intensité moyenne dans le menu déroulant pour générer l’image flatfield.
    4. Soustrayez l’image darkfield de l’image flatfield en cliquant sur Processus | Calculatrice d’image, en sélectionnant Soustrait comme opération. Assurez-vous que l’option de résultat 32 bits (float) est vérifiée. Le résultat est l’image corrigée flatfield.
    5. Mesurer l’intensité moyenne des pixels de l’image corrigée en cliquant d’abord sur Analyser | Définissez les mesures et vérifiez la zone valeur grise moyenne, puis appuyez sur la touche ' m'.
    6. Divisez l’image corrigée du champ plat par son intensité moyenne en cliquant sur Processus | Mathématiques | Divisez et entrez la valeur grise moyenne obtenue à l’étape 7.1.5. Cela produira l’image inverse de gain.
    7. Ouvrez les images de pré-activation et de post-activation ainsi que la pile d’images timelapse. Combinez les images en une seule pile en cliquant sur Image | Piles | Outils | Concaténate, et sélectionnez les images dans l’ordre chronologique dans les menus déroulants. Assurez-vous que l’option Ouvrir en tant qu’image 4D n’est pas sélectionnée. La pile qui en résulte est l’ensemble d’images complet.
    8. Répétez l’étape 8.1.4 sur l’ensemble d’images complet, puis divisez le résultat par l’image inverse de gain en cliquant sur Processus | Calculatrice d’image et sélection de Diviser comme opération. Cela produira l’ensemble d’images complètes corrigés,dans lequel chaque image a été corrigée pour la non-uniformité dans le domaine de l’éclairage et sur le détecteur.
  2. Alignement de la pile d’images
    1. Pour corriger le mauvais alignement des plans d’image dans la série timelapse en raison de la dérive d’étape ou d’échantillon, installez le plugin Alignement par région fixe ( Fichier supplémentaire1) en cliquant sur Plugins | Installez PlugIn, naviguez vers le dossier contenant le fichier plugin et sélectionnez le plugin. Redémarrez ImageJ après l’installation du plugin.
      REMARQUE : Ce plugin aligne les images en fonction du principe15du « moins carrés de congealing ».
    2. Dessinez un retour sur investissement sur l’ensemble d’images complètes corrigé qui s’étend sur plusieurs axones et ne s’étend pas au-delà des limites proximales et distales de la fluorescence activée dans chacun des axones. La géométrie de la région n’est pas importante, mais à l’exclusion des zones dans lesquelles les structures changent de forme ou de taille améliorera l’alignement.
    3. Exécutez le plugin d’alignement en cliquant sur Plugins | Alignement par région fixe. Le plugin place un maximum par défaut de 2 pixels sur le déplacement entre les images, mais cela peut être ajusté dans la fenêtre contextuelle initiale s’il y a une dérive significative de l’échantillon. L’alignement peut prendre plusieurs minutes, selon la taille de la pile d’images.
    4. Inspectez visuellement la pile alignée pour évaluer la qualité de l’alignement. Certains cadres peuvent alors avoir besoin d’être alignés manuellement, car l’alignement automatisé peut ne pas fonctionner bien pour de grandes fluctuations de fluorescence entre les cadres. Cela peut être accompli lors de l’affichage d’un cadre qui doit être déplacé en cliquant sur Image | Transformer | Traduire. Cliquez sur Non sur la fenêtre contextuelle suivante pour demander si la pile entière doit être traduite. Utilisez uniquement les valeurs de pixels entiers dans la traduction et assurez-vous que le menu d’interpolation déroulant est défini sur Aucun, car les décalages de pixels fractionnés ou l’interpolation modifieront les données en raison du réampling des intensités de pixels.
    5. Enregistrez-le en tant que jeu d’images complet aligné.
  3. Mesure des intensités de fluorescence
    1. Dessinez un retour sur investissement à l’aide de l’outil Angle sur le premier cadre de l’ensemble d’images complètes alignés avec le premier bras le long d’un bord de la région activée, perpendiculaire aux axones, et le deuxième bras vertical. Appuyez sur la touche « » pour mesurer l’angle, qui décrit l’orientation des axones dans le champ de vision.
    2. Définissez l’échelle des images de sorte que les dimensions soient mesurées en microns en cliquant sur Analyser | Définissez l’échelle et entrez les valeurs appropriées.
    3. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de roi. Pour le paradigme d’évasion par impulsion, passez à l’étape 8.3.7. Pour la propagation du pouls, continuez à l’étape 8.3.4.
    4. Dessinez un retour sur investissement carré de toutes les dimensions, puis cliquez sur Modifier | Sélection | Spécifier. Assurez-vous que l’option Unités mises à l’échelle units est vérifiée, puis définissez le retour sur investissement sur une largeur de 15 μm et une hauteur égale ou supérieure à la hauteur de l’image.
    5. Faites pivoter le roi par l’angle mesuré à l’étape 8.3.1 en cliquant sur Modifier | Sélection | Tournez pour le rendre perpendiculaire aux axones, et placez le roi avec un côté le long du bord proximal de la région activée. Ajoutez ce retour sur investissement, que nous appellerons le guide proximal ROI, au gestionnaire en appuyant sur la touche 't'.
    6. Faites glisser le retour sur investissement pour vous aligner sur le bord distal de la région activée et ajoutez à nouveau au gestionnaire de retour en appuyant sur la touche ' t'. Nous allons nous référer à cela comme le guide distal ROI. Les ROI de guide proximal et distal seront utilisés plus tard pour dessiner les ROI de mesure de flanc.
    7. Sélectionnez les axones pour la quantification, à l’aide de la séquence d’image timelapse acquise à l’étape 5.11 ci-dessus. Cette séquence d’image est utile à cet effet car elle capture la faible autofluorescence des axones, révélant leur morphologie en dehors de la région activée.
      REMARQUE : Les axons qui ne répondent pas aux critères suivants sont exclus de l’analyse :
      1. Les axons doivent être mis au point sur toute la longueur de toutes les fenêtres de mesure.
      2. Les axones doivent être à moins de 5° des extrémités proximales et distales de la région d’activation.
      3. Les axones ne doivent pas avoir d’invaginations à moins de 5 μm des extrémités proximales et distales de la région d’activation.
      4. Exclure les axones qui changent de forme visiblement au cours de l’imagerie.
      5. Exclure les axones qui semblent malsains comme en témoigne l’absence d’une région activée discrète dans l’image post-activation (figure 2C, en bas), car cela indique la dispersion diffuse de la fluorescence activée, qui se produit lorsque l’axone meurt.
    8. Observez l’image de blanchiment à longue exposition de l’étape 5.5 pour les structures autofluorères à l’intérieur des axones. Cette fluorescence est due aux flavins dans les mitochondries16. Exclure les axones de l’analyse si ces mitochondries semblent arrondies ou fragmentées(figure 2D, en bas), par opposition aux structures linéaires étendues(figure 2D, en haut), car il s’agit d’une indication de déclin métabolique.
    9. À l’aide du guide proximal et distal ROI créé ci-dessus, dessinez trois ROV de mesure par axon en cours d’analyse : une fenêtre centrale englobant l’axone dans la région activée de 40 μm, et deux fenêtres flanquantes avec une largeur limitée par une fenêtre de flanc de 15 μm ROIs et une hauteur limitée par le diamètre de l’axone à la frontière de la région d’activation. Ajoutez les trois régions au gestionnaire de retour sur investissement. Pour les axones inhibés glycolytiquement, dessiner une seule région qui ne mesure pas plus de 5 μm de large au milieu de la région activée et qui ne s’étend pas à l’extérieur de l’axone. Pour le paradigme d’évacuation des impulsions, la région activée n’est que de 5 μm de large, de sorte que toute la fenêtre doit être utilisée.
    10. Répétez l’étape 8.3.9 pour tous les axones qui répondent aux critères des étapes 8.3.7 et 8.3.8.
    11. Définissez les mesures actives sur l’intensité moyenne des pixels en cliquant sur Analyser | Définissez des mesures et sélectionnez l’option Valeur grise moyenne. Assurez-vous qu’aucune autre option de mesure n’est vérifiée.
    12. Sélectionnez tous les ROV de la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement en sélectionnant la fenêtre et en appuyant sur 'Ctrl' + 'a'. Dans la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Plus | Multi Mesure pour mesurer les intensités de fluorescence. Copiez les données de la fenêtre de résultats dans une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.
    13. Définissez les mesures actives sur la zone de la région en cliquant sur Analyser | Définissez des mesures et sélectionnez l’option Zone. Assurez-vous qu’aucune autre option de mesure n’est vérifiée.
    14. Répétez l’étape 8.3.12. Il suffit de copier une ligne des résultats pour la zone, car la zone ne varie pas avec le temps.

9. Correction de photobleach

  1. Dans la feuille de calcul de données pour les axones glycolytically inhibés, soustrayez la fluorescence moyenne du cadre 1 (le cadre de pré-activation) de la fluorescence moyenne de chaque image à partir du cadre 3 (le premier cadre de timelapse) pour un retour sur investissement donné. Les résultats sont les moyens soustraites en arrière-plan.
  2. Tracez les données comme un scatterplot avec les numéros de cadre comme l’abscissa. Adapter une ligne de tendance exponentielle aux données de chaque roi (la plupart des programmes de feuille de calcul ont cette fonction) avec une équation sous la forme d’Ae-bx-bx. Cette équation est équivalente à la fonction de photobleaching Ft = F0 * e-t0 où F0 est la fluorescence au premier cadre du timelapse, est le taux de blanchiment exponentiel, t est le temps, et e est la base logarithme naturelle.
  3. Répétez les étapes 9.1.1-9.1.2 pour tous les ROI de tous les axones des nerfs glycolytés inhibés. Pour l’estimation la plus précise du taux de photobleaching, utilisez au moins 15 axones au total à partir d’au moins 5 nerfs distincts. Utilisez la moyenne des taux de blanchiment exponentiels (0) de tous les axones inhibés pour corriger les données expérimentales pour le photobleaching. Un nouvel étalonnage de blanchiment doit être effectué pour chaque expérience ou étude, car le photobleaching dépend des paramètres d’acquisition d’image et de la puissance laser, qui peut changer au fil du temps.
  4. Répétez l’étape 9.1.1 pour toutes les régions d’axones photographiés avec une solution saline normale (c’est-à-dire non inhibées glycolytique).
  5. Divisez chaque point de données pare-t ,en utilisant le temps pour t et la moyenne de l’étape 9.1.3. Ce sont les moyens corrigés par photobleach.
  6. Multipliez chaque point de données par zone pour cette région d’intérêt afin de trouver la fluorescence totale dans cette région à chaque fois.

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Representative Results

La figure 3 montre des images représentatives d’expériences d’évacuation par impulsion et de propagation d’impulsions. Nous avons publié plusieurs études qui décrivent les données obtenues à l’aide de la méthode d’évacuation des impulsions et de nos méthodes d’analyse de ces données5,6,7,8,17. Ci-dessous, nous montrons comment les données de propagation des impulsions peuvent fournir des informations sur la directionnalité et la vitesse du transport de neurofilament, que nous n’avons pas signalé précédemment.

Le transport de neurofilament dans l’axone est intermittent et bidirectionnel. Ce transport peut être décrit par la fraction des filaments se déplaçant à tout moment dans les directions antérogrades et rétrogrades, Equation 41 et Equation 40 respectivement, et leurs vitesses dans les directions antérogrades et rétrogrades, notées par Equation 39 et Equation 38 . Si nous prenons la quantité totale de polymère neurofilament par unité de longueur d’axone à être Equation 37 , alors les flux dans les directions antérogrades et rétrogrades à travers une région donnée sont donnés par

Equation 36

Et

Equation 35,

respectivement, et le flux total Equation 34 est donné par

Equation 33,

où Equation 70 a des unités μm-1, Equation 32 a des unités et a des unités Equation 31 Equation 34 Equation 30 . Puisque le flux à un endroit donné le long de l’axone est la quantité de polymère neurofilament qui se déplace au-delà de cet endroit dans une unité de temps, il est lié à la vitesse moyenne Equation 29 à travers Equation 28 . Ainsi, nous pouvons écrire

Equation 27.

Dans une expérience de propagation d’impulsions, le flux peut être déterminé à partir du taux de départ des neurofilaments fluorescents de la région activée, que nous appelons la fenêtre centrale. La perte totale de polymère neurofilament fluorescent de cette fenêtre centrale par seconde Equation 26 est la somme des pertes dues aux polymères fluorescents de neurofilament laissant dans des directions antérogrades et rétrogrades, c’est-à-dire.

Equation 25

Normalisé au contenu initial du polymère de neurofilament fluorescent dans la fenêtre centrale, Equation 24 c’est-à-dire, où Equation 23 est la longueur de la fenêtre centrale, ce taux de perte devient alors

Equation 22

où Equation 21 est la pente de la diminution de la fluorescence dans la fenêtre centrale, qui est initialement linéaire pour une période donnée par Equation 20 8. Pour une fenêtre centrale de 40 μm, cela équivaut à seulement des dizaines de secondes. Cependant, pour les fenêtres de cette grande, la transition à la phase de décomposition exponentielle est progressive et la pente est effectivement linéaire pendant plusieurs minutes ou plus8.

Au début, les fenêtres latérales capturent tous les neurofilaments qui sortent de la fenêtre centrale parce que ces filaments n’ont pas assez de temps pour passer à travers les fenêtres flanquantes et les sortir de l’autre côté. Dans ce cas, les quantités de polymère de neurofilament fluorescent qui quittent la fenêtre centrale antérogradely et rétrogradement par seconde, c’est-à-dire les flux Equation 19 et , sont données par Equation 18 l’augmentation de la teneur en neurofilament Equation 17 et dans les Equation 16 fenêtres de flanc. Normalisés à la teneur initiale en polymère neurofilament fluorescent dans la fenêtre centrale, les taux d’augmentation des fenêtres latérales deviennent

Equation 15

Equation 14

où Equation 13 et sont les pentes de Equation 12 l’augmentation de la fluorescence dans les fenêtres de flanc proximal et distal, respectivement.

Ainsi, nous pouvons exprimer la vitesse moyenne en termes de pentes dans les fenêtres de flanc, c’est-à-dire

Equation 11      (Eq. 1)

et le rapport du nombre de neurofilaments en mouvement antérogrades et rétrogrades en termes de rapport de ces pentes, c’est-à-dire

Equation 10     (Eq. 2)

où Equation 9 et Equation 8 dénotent les taux auxquels les neurofilaments s’inversent de l’antérogradely au déplacement rétrograde et vice versa8. Les valeurs de Equation 7 et Equation 6 peuvent être déterminées en mesurant le mouvement des neurofilaments individuels dans les neurones cultivés, comme rapporté précédemment17. Fait important, l’expression de la vitesse dans Eq. 1 ne s’applique qu’à de courtes périodes après l’activation au cours desquelles les neurofilaments fluorescents entrent dans la fenêtre de flanc, mais ne partent pas. La durée de cette courte fenêtre de temps dépendra de la longueur des fenêtres flanquantes et de la cinétique du mouvement de neurofilament. Plus les fenêtres latérales sont longues, en principe, plus la fenêtre de temps est longue. Théoriquement, on peut vérifier que ce critère est satisfait en confirmant que

Equation 5     (Eq. 3)

Contrairement à l’expression de la vitesse dans eq. 1, qui est donnée par la différence entre les pentes dans les fenêtres de flanc, l’expression de la directionnalité dans Eq. 2 est robuste à la taille de fenêtre de flanc parce qu’il est donné par le rapport des pentes dans les fenêtres de flanc.

La figure 3 montre les résultats représentatifs d’expériences d’évacuation des impulsions et de propagation d’impulsions sur des axones myélins dans le nerf tibial d’une souris mâle âgée de 8 semaines de notre ligne paGFP-NFM hThy1 sur un fond C57Bl/6J, en utilisant des tailles de fenêtre de 5 et 40 μm, respectivement. Des souris d’au moins 2 semaines, mâles et femelles, ont été utilisées pour ces paradigmes expérimentaux. L’âge et le sexe appropriés devraient être déterminés par le chercheur en fonction de ce qui est testé dans l’étude. Au fil du temps, on peut voir que les bords des régions activées s’estompent en raison du départ des neurofilaments dans les deux directions antérogrades et rétrogrades, entraînant une perte de fluorescence de la fenêtre centrale.

Pour la méthode d’évacuation des impulsions (figure 3A, C, E), la cinétique de décomposition de fluorescence dans la région activée peut fournir des informations sur le comportement de pause à long terme et à court terme8,18. Pour ces expériences, la région activée peut être courte (nous utilisons généralement 5 μm; voir boîte jaune dans la figure 3A). Pour la méthode de propagation des impulsions (figure 3B, D, F),nous utilisons une région plus activée (40 μm ici; voir boîte jaune à la figure 3B)afin de fournir un plus grand bassin de neurofilaments fluorescents. Cela allonge le temps pendant lequel l’augmentation de la fluorescence dans les régions de flanc reste linéaire (voir ci-dessus). Le domaine linéaire de cette augmentation de fluorescence dans les fenêtres latérales peut également être augmenté en augmentant la longueur de ces fenêtres, mais cela est limité par la taille du champ de vision. Nous avons utilisé 15 fenêtres latérales μm, indiquées en rouge et vert, pour les données indiquées dans la figure 3D.

La figure 3E,3F montre la quantification des intensités totales de fluorescence (c.-à-d. la somme des intensités de pixels) pour les fenêtres de mesure indiquées respectivement à la figure 3C,3D. Pour la méthode d’évacuation des impulsions, la décomposition est biphasique, avec une première décomposition exponentielle qui représente le départ des neurofilaments sur piste. Cette transition est d’environ 10-20 minutes à une deuxième dégradation exponentielle plus lente qui représente la mobilisation et le départ des filaments hors piste8. En comparaison avec la méthode de propagation des impulsions, nous ne montrons qu’un cours de 12 minutes dans la figure 3E, mais généralement le cours du temps de l’analyse doit être plus long (généralement 30-120 minutes) pour capturer la cinétique de pause à long terme5,6,18. Pour la stratégie de propagation des impulsions, les calculs de la vitesse et de la directionnalité du mouvement ne dépendent que des pentes des fenêtres latérales. Pour les longueurs de fenêtre utilisées ici, la phase linéaire s’étend sur environ 5 minutes. La durée de cette fenêtre de temps de linéarité devrait être évaluée en raccourcissant progressivement le temps utilisé pour mesurer la pente et en déterminant le point où la pente n’augmente plus. Cette durée peut être augmentée en augmentant la longueur des fenêtres si le champ de vision de la caméra le permet, bien que les longueurs des fenêtres doivent être maintenues constantes pour tous les axones d’une expérience donnée. À titre d’exemple, nous avons utilisé les 5 premières minutes de données pour mesurer les pentes pour les données de propagation des impulsions de la figure 3F. Il en résulte des pentes de 72 A.U./min, -594 A.U./min, et 111 A.U./min pour les fenêtres proximales, centrales et distales, respectivement (A.U. = unités arbitraires). Afin de normaliser ces valeurs, elles sont divisées par la fluorescence initiale de la fenêtre centrale, ce qui entraîne des taux de 0,108 %F0/min,-0,962 %F0/minet 0,173 %F0/min.En appliquant Eq. 3 nous constatons que le critère de conservation n’est pas respecté, ce qui indique que nous ne captons pas toute la fluorescence dans les fenêtres de flanc. Il s’agit d’une limitation technique due au champ de vision de notre caméra EMCCD (82 μm x 82 μm). Les caméras avec des puces SCMOS, qui peuvent avoir des champs de vue beaucoup plus grands, pourraient permettre l’utilisation de plus grandes tailles de fenêtre de flanc. Toutefois, nous ne pouvons exclure la possibilité que cet écart entre les pentes centrales et latérales puisse également être dû, du moins en partie, à la sous-estimation de l’étendue du photobleaching (voir Discussion), qui aurait pour effet de sous-estimer les pentes positives des fenêtres latérales et de surestimer la pente négative de la fenêtre centrale.

Des taux dans les fenêtres flanquantes (%F0/min) et Eq. 2 ci-dessus, et en utilisant des valeurs de Equation 4 et Equation 3 17, nous calculons le ratio Equation 2 = 2,12. Cela indique que 68 % des filaments se déplaçaient antérograde et 32 % rétrogrades. En utilisant les mêmes taux et eq. 1 ci-dessus, nous calculons la vitesse moyenne de la population nette Equation 1 = 40*(0,00173-0,00108) = 0,026 μm/min, ou 0,037 mm/jour. Des études d’étiquetage radioisotopique sur les impulsions chez des souris d’âge similaire ont rapporté une vitesse de population de neurofilament d’environ 0,6 mm/jour dans les parties les plus proximales du nerf sciatique, ralentissant à 0,12 mm/jour sur une distance de deux centimètres19,20. Nos données de propagation d’impulsion ont été rassemblées dans le nerf tibial, approximativement un autre 2-3 centimètres distal à ces mesures. Pour les raisons mentionnées ci-dessus, nous croyons que l’estimation de 0,037 mm/jour est une sous-estimation de la vitesse réelle. Cependant, extrapolant le ralentissement spatial observé par l’étiquetage radioisotopique de pouls dans le nerf tibial cette estimation n’est pas déraisonnable, particulièrement quand nous considérons qu’elle a été déterminée utilisant une méthodologie très différente sur une échelle spatiale et temporelle très différente.

Pour démontrer la capacité de la méthode de propagation des impulsions à détecter des différences significatives entre les populations, nous avons comparé les pentes des fenêtres proximales et distales mesurées à partir de nerfs perfusés avec des salines normales et inhibitrices. L’inhibition de la glycolyse bloque le mouvement des neurofilaments, comme nous l’avons signalé précédemment5,6,7. Nous discuterons plus tard de la sélection des tailles d’échantillon pour des expériences, cependant ici nous avons employé un nerf dans la solution saline normale et deux dans la solution saline inhibitrice, en raison de la limitation d’un champ d’acquisition par nerf pendant l’inhibition. La figure 4A montre un exemple de timelapse provenant d’un nerf glycolytiquement inhibé, démontrant une réduction apparente du transport hors de la région activée. En effet, nous trouvons des pentes distales et proximales significativement plus faibles(figure 4B, p = 0,00000639 et 0,0121, respectivement, comparaison de Tukey en couple après ANOVA) dans les nerfs traités avec saline inhibitrice par rapport à ceux perfusés avec la solution saline normale. Nous constatons également une diminution significative de la vitesse de la population entre ces deux conditions(figure 4C, p = 0,0232, t-test avec des variances inégales, après test F pour une variance égale avec p = 0,0190).

Figure 1
Figure 1 : La chambre de perfusion. (A) Diagramme montrant l’assemblage du boîtier de la chambre de perfusion et du joint extérieur, avec tube relié à la seringue saline et à la fiole de déchets. (B) Diagramme montrant l’assemblage de la chambre elle-même. Le joint intérieur est posé à plat sur le dessus de la #1,5 couvercle. Le nerf est placé sur le couvercle dans le puits créé par l’ouverture rectangulaire du joint intérieur. La glissière microaqueducte est placée sur le nerf pour sandwicher le nerf entre le couvercle #1,5 et la lame microaqueduct. Enfin, le sandwich est retourné avant de monter sur le joint extérieur de l’assemblage indiqué dans (A) et fixé avec un anneau de verrouillage (non montré). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : La préparation du nerf tibial. (A) Image montrant l’emplacement du nerf tibial dans la jambe d’une souris, dans laquelle le gluteus superficialis, biceps femoris, semitendinosus, popliteus, tibialis caudalis et flexor digitorum longus muscles ont été enlevés. Le nerf tibial peut être considéré comme l’une des trois branches principales du nerf sciatique surgissant au genou. (B) Schéma du nerf en coupe transversale dans la chambre assemblée, montrant l’objectif d’immersion d’huile sous le couvercle. La meilleure qualité optique est obtenue en activant et en imaginant la couche d’axones apposé à la surface du couvercle; la qualité de l’image diminue plus profondément dans le nerf en raison de la diffusion de la lumière. (C) Exemples d’un axone sain (en haut), et d’un axone malsain (en bas) immédiatement après l’activation. La ligne jaune pointillée marque la région activée. La fluorescence activée a des limites nettes dans l’axone sain tandis que dans l’axone malsain la fluorescence activée se diffuse rapidement hors de la région activée, remplissant l’axone en quelques secondes. Barre d’échelle = 10 μm. (D) Exemples de l’aspect mitochondrial dans un axone sain (en haut) et un axone malsain (en bas). Les mitochondries sont visibles en raison de l’autofluorescenceflavin 16. Ils apparaissent linéaires (pointes de flèche solides) dans les axones sains. Dans les axones malsains, les mitochondries deviennent d’abord punctate (pointes de flèche ouvertes) puis plus faibles au fil du temps, fournissant un indicateur de la santé de l’axone. La pointe de flèche ouverte en point de départ dans l’axone sain indique qu’une mitochondrie passe du linéaire au punctate. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Expériences d’évacuation des impulsions et de propagation d’impulsions. Exemple d’images de pré-activation, de post-activation et de timelapse d’axones myélins dans le nerf tibial d’une souris de 8 semaines dans (A) une expérience d’évasion d’impulsion et (B) une expérience de propagation d’impulsions. L’image de pré-activation est le panneau supérieur, avec les images post-activation ci-dessous.  Les horodatages montrent l’heure écoulée après l’activation. Les boîtes jaunes représentent la région activée. Ces activations ont été effectuées à l’aide de 5 scans avec un temps de séjour de 40 μs pixels et 5% de puissance laser. Barres d’échelle = 10 μm. (C) Les ROI de mesure (jaune) pour trois axones dans une expérience d’échappement d’impulsion. (D) Les ROI de mesure proximaux (rouges), centraux (jaunes) et distal (verts) pour trois axones dans une expérience de propagation d’impulsions. Les RIAL de mesure pour chaque axon sont indiqués en rouge massif (proximal), jaune solide (fenêtre centrale) et vert solide (fenêtre distale). (E) Parcelle de la fluorescence moyenne par rapport au temps, moyenne des 3 axones dans la ligne C. Dashed est une fonction exponentielle adaptée aux données, de la forme Ft = Ae-τt, comme décrit précédemment7. F) Parcelles de la fluorescence dans les ROI centrales, distales et proximales par rapport au temps, moyenne de 14 axones, y compris les trois axones en D. La pente est calculée à partir des lignes de tendance adaptées aux 5 premières minutes de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : L’effet des inhibiteurs métaboliques sur le transport du neurofilament. (A) Exemple d’images timelapse d’un nerf prétraité avec 5,6% (w/v) 2-désoxy-glucose et 0,5 mM d’idoiacétate de sodium pour inhiber la glycolyse et épuiser l’ATP cellulaire. Notez que les limites distales et proximales des régions activées restent pointues, ce qui indique une inhibition du transport de neurofilament. Barre d’échelle = 10 μm. (B) Quantification des pentes dans les fenêtres latérales distales (D) et proximales (P) (antérograde et rétrogrades, respectivement), exprimée en pourcentage de fluorescence initiale dans la fenêtre centrale (%F0/min),à partir d’un nerf (14 axones) utilisant la solution saline standard et de deux nerfs (8 axones) prétraités avec des salines contenant les inhibiteurs glycolytiques. (C) Vitesses de population de neurofilament calculées à partir des pentes dans les fenêtres de flanc, montrant une diminution significative de la vitesse après traitement inhibiteur. - p < 0,005; ** - p < 0,01; * - p < 0,05. Les données montrent une déficience significative du transport de neurofilament en présence des inhibiteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Vidéo supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Il faut faire attention à l’analyse des expériences d’évacuation des impulsions et de propagation des impulsions, car il existe un risque important d’introduction d’erreurs pendant le post-traitement, principalement pendant la correction du champ plat, l’alignement de l’image et la correction de l’eau de Javel. La correction de champ plat est nécessaire pour corriger la non-uniformité dans l’éclairage, ce qui entraîne une chute de l’intensité à travers le champ de vision du centre à la périphérie. L’étendue de la non-uniformité dépend de la longueur d’onde et, par conséquent, doit toujours être effectuée à la longueur d’onde qui doit être utilisé pour l’acquisition des données expérimentales. Il est important de s’assurer que la non-uniformité dans l’image de champ plat est vraiment représentative de la non-uniformité dans les images à corriger. Les expériences de propagation des impulsions sont particulièrement vulnérables aux erreurs d’une mauvaise correction des champs plats parce que les ROI de mesure s’étendent vers la périphérie de l’image où l’intensité tombe est la plus grande.

Les paramètres optimaux d’activation paGFP varient selon la méthode d’activation et les paramètres laser, et doivent être déterminés empiriquement avant la première séance d’imagerie. Trop peu d’activation se traduira par un faible rapport signal/bruit pour la fluorescence activée, alors que trop se traduira par le blanchiment de la fluorescence activée parce que le paGFP non activé et activé peut être excité par la lumière violette. Pour éclairer sélectivement une région d’intérêt pour l’image, nous utilisons un scanner laser Galvo Andor FRAPPA, qui génère une région de fluorescence clairement définie avec des limites nettes, comme le montrent les résultats représentatifs. Nous avons également eu du succès en utilisant un diaphragme numérique Andor Mosaic, qui est un dispositif de micromirror numérique, avec une lampe à arc de mercure comme source d’éclairage7. D’autres options sont disponibles dans le commerce. Un défi lorsque vous travaillez avec paGFP est l’augmentation retardée de l’intensité de fluorescence qui se produit dans les 1 minute suivant l’étape de photoactivation. Cette augmentation se produit parce que l’éclairage avec la lumière violette provoque une proportion des molécules activées paGFP pour entrer dans un « tat niqu » à partir de laquelle ils peuvent se détendre sur un cours de temps de dizaines de secondes11. Dans notre expérience, l’augmentation est généralement inférieure à 5% avec l’excitation widefield mais peut dépasser 20% avec l’excitation laser, qui peut mener à une sous-estimation significative de la fluorescence activée. Nous en sommes responsables en acquérant une deuxième image « post-activation » de la fluorescence paGFP 1 minute après la photoactivation, puis en utilisant cette image comme point de référence pour le timelapse suivant. Cependant, il est important de reconnaître que cela introduit une autre source potentielle d’erreur dans la détermination de la fluorescence initiale et la cinétique de décomposition à des moments précoces.

Une attention supplémentaire doit être accordée à l’alignement des piles d’images. La principale source de désalignement est la dérive ou tout autre mouvement du spécimen lors de l’acquisition de l’image timelapse. Cela peut être minimisé en utilisant des joints intérieurs de l’épaisseur appropriée et en permettant à la préparation de « 'installe » avant l’imagerie. Toutefois, un tel retard réduira le temps disponible pour l’acquisition d’images puisque la préparation a une fenêtre limitée de viabilité. Il est également important d’éviter les algorithmes d’alignement qui déforment l’image ou introduisent des décalages sous-pixels, car ces procédures resamplent les intensités de pixels dans l’image. Les expériences à propagation des légumineuses sont particulièrement vulnérables aux erreurs résultant d’un alignement inadéquat parce que les frontières de la région de fluorescence activée sont relativement pointues et que la fluorescence dans cette région est significativement plus élevée que dans les régions non activées. Même un léger désalignement des plans d’image dans la pile peut entraîner de grands sauts dans les valeurs de fluorescence dans les fenêtres de mesure distale et proximale. Par conséquent, il est impératif que les ensembles d’images soient alignés correctement et inspectés soigneusement avant de procéder à l’analyse.

La correction du photobleaching est nécessaire pour s’assurer que les changements dans l’intensité de fluorescence au fil du temps reflètent avec précision les changements dans la quantité de la protéine fluorescente. De telles corrections peuvent être une source importante d’erreur dans l’estimation des intensités de fluorescence absolue dans les fenêtres centrales et latérales. Comme la cinétique de photobleaching dépend de l’intensité de l’illumination et de l’environnement du fluorophore, les taux réels de photobleaching peuvent varier entre les sessions et de l’axone à l’axone. Ainsi, il est nécessaire de mesurer plusieurs axones et de faire la moyenne des données résultantes, ce qui introduit lui-même une erreur. L’approche décrite ci-dessus consiste à traiter le nerf avec des inhibiteurs glycolytiques, puis à activer la fluorescence dans une région d’intérêt et à suivre la perte d’intensité de fluorescence au fil du temps. Les inhibiteurs glycolytiques épuisent l’ATP et inhibent ainsi le transport de neurofilament de sorte que la perte de fluorescence est entièrement due au photobleaching et non au mouvement des neurofilaments hors de la région activée. La cinétique moyenne de blanchiment déterminée de cette façon est ensuite utilisée pour corriger les données expérimentales. Comme il n’est pas pratique d’effectuer un étalonnage de blanchiment distinct à chaque séance d’imagerie, un seul étalonnage doit être appliqué à plusieurs séances réparties sur plusieurs semaines. Un inconvénient de cette approche est qu’elle ne tient pas compte des variations de puissance laser/intensité d’éclairage d’un jour à l’autre, qui devraient donc être surveillées. Une autre approche, que nous appelons « correction intrinsèque du blanchiment », consiste à estimer le photobleaching en quantifiant la fluorescence au centre de la région activée dans les mêmes films timelapse qui sont utilisés pour les mesures de transport. Si cette région de mesure est située au centre et beaucoup plus courte que la longueur de la région activée, puis à court terme, tous les neurofilaments fluorescents qui sortent de la région de mesure seront remplacés par des neurofilaments fluorescents qui s’y déplacent. Cependant, avec le temps, la probabilité que des neurofilaments non fluorescents se déplacent dans la région de mesure à partir des régions non fluorescentes de l’axone s’accroît, ce qui entraîne une surestimation de la perte de fluorescence due au blanchiment. Un avantage de cette approche est qu’elle corrige les caractéristiques de blanchiment dans ce même champ, mais un inconvénient est que la durée de la fenêtre de temps doit être déterminée empiriquement et dépendra du taux du transport ainsi que de la longueur de la région activée. Tout cela ayant été dit, il convient de noter que l’estimation de la directionnalité du transport neurofilament en utilisant notre méthode est robuste aux erreurs de blanchiment (comme c’est pour la taille des fenêtres de flanc) parce qu’il est donné par le rapport des pentes dans les fenêtres de flanc et toute correction de blanchiment est un multiplicateur appliqué à la fois le numérateur et le dénominateur dans ce calcul.

En raison du bruit inhérent à un système fluorescent et du risque d’erreur supplémentaire ajouté lors des étapes de post-traitement de l’image décrites ci-dessus, il est important d’utiliser de grandes tailles d’échantillons pour une puissance statistique suffisante. Bien qu’il ne soit pas possible de déterminer avec précision les moyens de population, les écarts et les tailles d’effet avant l’expérimentation, nous recommandons d’utiliser la méthode Cohen21 en supposant une taille d’effet moyen et un alpha de 0,05. Il en résulte un Cohen’s d, qui est la différence de moyens divisés par l’écart type mis en commun des deux populations, de 0,5, ce qui suggère d’acquérir au moins 105 échantillons par groupe. Une fois ce seuil atteint, on peut effectuer une analyse de pouvoir post hoc pour réévaluer le pouvoir statistique à la lumière des mesures réelles de la population. Dans des conditions expérimentales optimales, il devrait être possible d’obtenir à partir de 1-7 axones analysables (sur 9-20 axones totaux) par activation, et 5-8 activations par nerf en supposant l’acquisition d’un timelapse de 10 minutes par activation.

Des souris transgéniques exprimant des protéines de fusion fluorescentes destinées aux mitochondries ou aux vésicules ont également été utilisées pour étudier le transport axonal d’organites membraneux dans les nerfs périphériques ex vivo22,23,24,25. En outre, le laboratoire de Schiavo a développé des approches pour l’image du transport axonal d’organites membraneux rétrogradement en mouvement dans les axones in vivo à l’aide de fragments fluorescents de toxine tétanos, qui peuvent être injectés dans le muscle et sont pris en charge par les terminaux nerveux moteurs26. Cependant, puisque les organites membraneux peuvent être résolus dans ces axones par microscopie de fluorescence, il est possible d’analyser la vitesse et la fréquence de leur mouvement directement à l’aide de timelapse ou d’analyse de kymographe. Les méthodes d’évasion et de propagation des impulsions décrites ici ont été développées dans le but spécifique d’analyser la cinétique du transport de neurofilament dans ces axones, dans lesquels les neurofilaments simples ne peuvent pas être résolus. Cela nécessite une analyse au niveau de la population sur une période de quelques minutes ou des dizaines de minutes. Nous utilisons une souris transgénique à cette fin, mais il devrait également être possible d’exprimer la protéine photoactivable en utilisant des méthodes telles que la transduction virale ou l’électroporation in utero. Bien que l’accent ait été mis sur le transport de neurofilaments, les méthodes d’évacuation des impulsions et de propagation des impulsions peuvent également être adaptées pour étudier le mouvement d’autres protéines cytosquelettiques et cytosoliques qui sont transportées le long des axones dans les composants lents du transport axonal. Nous confinons nos analyses aux axones myélins parce que leur taille et leur gaine de myéline nous permettent de les résoudre par rapport à leurs voisins. Les axones non myélins ne peuvent pas être résolus en raison de leur petit calibre et de leur tendance à se regrouper dans des faisceaux de Remak. Nous décrivons l’utilisation des nerfs tibiaux ex vivo, mais les méthodes devraient également être applicables à d’autres nerfs périphériques qui sont suffisamment longs (>5 mm) et non ramifiés. En principe, il devrait également être possible d’adapter ces méthodes au transport de neurofilament d’image in vivo (par exemple, en exposant chirurgicalement un nerf dans une souris sous sédatifs, puis en plaçant la souris sur un stade de microscope).

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Paula Monsma pour l’instruction et l’aide à la microscopie confocale et à la dissection des nerfs tibiaux et au Dr Atsuko Uchida, Chloe Dugre et Sana Chahandele pour leur aide pour l’élevage de souris. Ce travail a été soutenu en partie par la collaboration De la National Science Foundation Grants IOS1656784 à A.B. et IOS1656765 à P.J., et national Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 et S10 OD010383 à A.B. N.P.B. a été soutenu par une bourse de l’Ohio State University President’s Postdoctoral Scholars Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm Bioptechs 1907-1422-100 inner gasket
2-deoxy-D-glucose Sigma D6134
30mm Round Gasket w/ Holes Bioptechs 1907-08-750 outer gasket
35 x 10mm dish Thermo Fisher 153066 dissection dishes
40mm round coverslips Bioptechs 40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip BD 309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system Andor outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride Fisher C79
Coverslips Fisher 12-541-B for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution Sigma G8769
Dissecting pins Fine Science Tools 26001-70
Dissection forceps Fine Science Tools 11251-30 fine tipped forceps
Dissection microscope Zeiss 47 50 03
Dissection pan with wax Ginsberg Scientific 568859
Dissection scissors Fine Science Tools 14061-09 initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber Bioptechs 060319-2-03
Fluorescein sodium Fluka 46960
Inline solution heater Warner Instruments SH27-B
Laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20 initial dissection forceps
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Microaqueduct slide Bioptechs 130119-5
Microscope slides Fisher 12-544-3 for fluorescein slide
Microscope stage insert Applied Scientific Instrumentation I-3017
Objective heater system Okolab Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A Nikon discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective Nikon MRD01901
Potassium chloride Fisher P217
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P0662
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium iodoacetate Sigma-Aldrich I2512
Syringe pump Sage Instruments Model 355
Tubing adapter - female Small Parts Inc. 1005109
Tubing adapter - male Small Parts Inc. 1005012
Tygon tubing Bioptechs 1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15018-10 fine scissors

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References

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Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée
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Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., … More

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve. J. Vis. Exp. (162), e61264, doi:10.3791/61264 (2020).

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