Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bildbehandling och analys av neurofilament transport i struket Mus Tibial Nerve

Published: August 31, 2020 doi: 10.3791/61264
Automatic Translation
1, 1,2, 3,4, 1
1Department of Neuroscience, The Ohio State University, 2Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, 3Quantitative Biology Institute, Ohio University, 4Department of Physics and Astronomy, Ohio University

Summary

Vi beskriver fluorescens photoactivation metoder för att analysera axonal transport av neurofilaments i enda myelinated axons av perifera nerver från transgena möss som uttrycker en photoactivatable neurofilament protein.

Abstract

Neurofilamentproteinpolymerer rör sig längs axoner i den långsamma komponenten i axonaltransport vid genomsnittliga hastigheter på ~0,35-3,5 mm/dag. Tills nyligen studiet av denna rörelse in situ var endast möjligt med hjälp av radioisotopic puls-märkning, som tillåter analys av axonal transport i hela nerver med en tidsmässig upplösning av dagar och en rumslig upplösning av millimeter. För att studera neurofilament transport in situ med högre tidsmässiga och rumsliga upplösning, utvecklade vi en hThy1-paGFP-NFM transgenic mus som uttrycker neurofilament protein M taggade med photoactivatable GFP i nervceller. Här beskriver vi fluorescens fotoaktivering puls-escape och puls-spridning metoder för att analysera neurofilament transport i enda myelinated axoner av tibial nerver från dessa möss ex vivo. Isolerade nerv segment upprätthålls på mikroskopet skede genom perfusion med syresatt koksaltlösning och avbildas genom spinning disk confocal fluorescens mikroskopi. Violett ljus används för att aktivera fluorescensen i ett kort axonalfönster. Fluorescensen i de aktiverade och flankerande regionerna analyseras över tiden, vilket tillåter studiet av neurofilamenttransport med tidsmässig och rumslig upplösning på ordningen av minuter respektive mikrometer. Matematisk modellering kan användas för att extrahera kinetiska parametrar för neurofilament transport inklusive hastigheten, riktad bias och pausa beteende från de resulterande uppgifterna. De puls-flykt och puls-spridning metoder kan också anpassas för att visualisera neurofilament transport i andra nerver. Med utvecklingen av ytterligare transgena möss skulle dessa metoder också kunna användas för att avbilda och analysera axonaltransporten av andra cytoskeleala och cytosoliska proteiner i axoner.

Introduction

Den axonal transport av neurofilaments först visades på 1970-talet genom radioisotopisk puls-märkning1. Detta tillvägagångssätt har gett en mängd information om neurofilament transport in vivo, men det har relativt låg rumslig och tidsmässig upplösning, typiskt på storleksordningen millimeter och dagar i bästafall 2. Dessutom är radioisotopisk pulsmärkning en indirekt metod som kräver injektion och uppoffring av flera djur för att generera en enda tidskurs. Med upptäckten av fluorescerande proteiner och framsteg i fluorescensmikroskopi på 1990-talet, blev det därefter möjligt att bilden neurofilament transport direkt i odlade nervceller på en tidsskala av sekunder eller minuter och med sub-mikrometer rumslig upplösning, vilket ger mycket större insikt i mekanismen för rörelse3. Dessa studier har visat att neurofilament polymerer i axoner rör sig snabbt och periodvis i både anterograde och bakåtsträvande riktningar längs mikrotubuli spår, drivs av mikrotubuli motorproteiner. Emellertid, neurofilaments är diffraktion-begränsade strukturer bara 10 nm i diameter som vanligtvis är fördelade bortsett från sina grannar av endast tiotals nanometer; därför kan polymererna endast spåras i odlade nervceller som innehåller glest fördelade neurofilament så att de rörliga polymererna kan lösas från sina grannar4. Det är alltså för närvarande inte möjligt att spåra enstaka neurofilament i axoner som innehåller rikliga neurofilament polymerer, såsom myelinerade axoner.

För att analysera axonal transport av neurofilaments i neurofilament-rika axoner med hjälp av fluorescensmikroskopi, använder vi en fluorescens fotoaktivering puls-escape metod som vi utvecklat för att studera den långsiktiga pausa beteende neurofilaments i odlade nervceller4,5. Neurofilaments taggade med en photoactivatable fluorescerande neurofilament fusion protein aktiveras i ett kort segment av axon, och sedan graden av avgång av dessa glödtrådar från den aktiverade regionen kvantifieras genom att mäta fluorescens sönderfall över tiden. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det är en analys på befolkningsnivå av neurofilamenttransport som kan appliceras på en tidsskala av minuter eller timmar utan att behöva spåra förflyttning av enskilda neurofilamentpolymerer. Till exempel har vi använt denna metod för att analysera kinetiken hos neurofilamenttransport i myelinerande kulturer6.

Nyligen beskrev vi utvecklingen av en hThy1-paGFP-NFM transgen mus som uttrycker låga nivåer av en paGFP-taggade neurofilament protein M (paGFP-NFM) i nervceller under kontroll av den mänskliga neuron-specifika Thy1 promotorn7. Denna mus tillåter analys av neurofilament transport in situ med hjälp av fluorescens mikroskopi. I den här artikeln beskriver vi de experimentella tillvägagångssätt för att analysera neurofilament transport i myelinated axoner av tibial nerver från dessa möss med hjälp av två tillvägagångssätt. Den första av dessa tillvägagångssätt är puls-escape-metoden som beskrivs ovan. Denna metod kan generera information om neurofilamentens pausande beteende, men är blind för den riktning i vilken glödtrådarna avgår den aktiverade regionen, och tillåter därför inte mätning av nettore riktadhet och transporthastighet8. Den andra av dessa metoder är en ny pulsspridningsmetod där vi analyserar inte bara förlusten av fluorescens från den aktiverade regionen, utan också den övergående ökningen av fluorescens i två flankerande fönster genom vilka de fluorescerande glödtrådarna rör sig när de avgår den aktiverade regionen i både anterograde och bakåtsträvande riktningar. I båda inflygningarna kan parametrar för neurofilamenttransport som den genomsnittliga hastigheten, nettore riktadhet och pausningsbeteende erhållas genom att använda matematisk analys och modellering av förändringarna i fluorescensen i mätrutorna. Bild 3 illustrerar dessa två tillvägagångssätt.

Detta protokoll visar dissekering och förberedelse av nerv, aktivering och bildframställning av paGFP fluorescens, och kvantifiering av neurofilament transport från de förvärvade bilderna med hjälp av FIJI distributionspaket av ImageJ9. Vi använder tibialnerven eftersom den är lång (flera cm) och förgrenar oss inte; dock i princip någon nerv uttrycker paGFP-NFM är lämpligt för användning med denna teknik om det kan dissekeras och de-mantlade utan att skada axoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) i Ohio State University.

1. Beredning av nervsaltlösning

  1. Gör 100 mL av Breuerskoksaltlösning 10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glukos, 23,8 mM NaHCO3 i dubbeldestillerat vatten.
  2. Bubbla 95% syre/5% koldioxid (karbiogen) genom saltlösningen i minst 30 minuter före användning. Överbliven saltlösning kan återanvändas inom en vecka; måste den dock reoxygeneras före varje användning.
  3. Häll syresatt koksaltlösning i en 60 mL spruta och se till att det finns minimal luft kvar i sprutan.

2. Inledande montering av nervperfusionskammare

  1. Anslut sprutan och slangen enligt figur 1A, placera utflödesröret i en avfallskolv.
  2. Placera den yttre packningen i perfusionskammarens hölje, se till att flödesinlopps- och utloppsstolparna är i linje med hålen i packningen.
  3. Lägg den inre packningen (silikon, 100 μm tjock) på en #1,5 cirkulär täckslip (40 mm diameter), försiktigt jämna ut eventuella rynkor i packningen för att säkerställa en tät tätning. För att underlätta senare montering, placera täcklapp och packning på en pappershandduk eller uppgift torka med packningen uppåt.

3. Dissektion och förberedelse av mus tibial nerv

  1. Offra djuret genom koldioxidinandning eller en annan institutionellt godkänd metod. Starta en timer när djuret upphör med rörelse/andning, eftersom experiment endast får genomföras inom 3 timmar efter offer7.
  2. Spraya pälsen med 70% etanol och ta bort så mycket som möjligt från djurets ben och rygg med hjälp av en elektrisk rakhyvel.
  3. Med hjälp av ett par stora dissekering sax, göra en ryggskärning i huden nära mitten av ryggraden och fortsätta snittet runt den ventrala aspekten av djuret. Från detta snitt, långsamt reflektera huden från benen genom att försiktigt dra bort den från muskeln och skära fascia.
  4. Placera djuret i ryggläge på en dissektionsbricka och nåla fast alla fyra tassarna. Valfri tapp svansen för att minska rörelse ytterligare.
  5. Använda microdissection sax, göra ett snitt i lårmusklerna mitt emellan svansen och knät för att exponera ischiasnerven. Se till att nerven, som syns genom muskeln, inte skärs.
  6. Utvidga snittet dorsally och ventrally att ta bort muskeln. På samma sätt, ta bort musklerna i vaden, hålla skär grunda och korta för att undvika att skada nerv.
  7. Avlägsna muskler tills tibialnerven är fullt exponerad från den punkt där den förgrenar sig från ischiasnerven (vid knät) till hälen (Figur 2A).
    OBS: I alla steg inklusive och efter dissektion av tibial nerven, undvika onödig exponering för omgivande ljus för att minimera möjliga tillfällig aktivering av paGFP i nerven.
  8. Ta tag i tibialnerven vid den ryggradsproximala änden med ett par ttråd och skär nerven med hjälp av ett par mikrodissionsaxar. Var noga med att inte sätta spänningar på nerven, lyfta bort den från muskeln, skära några bilagor.
  9. Skär ryggraden-distala änden av tibial nerv och överföring till en liten Petri skålen av rumstemperatur syresatt saltlösning. Från denna punkt på i förfarandet, alltid vara säker på att hålla reda på de proximala och distala ändarna av nerven.
    OBS: Ett sätt att göra detta är att markera nervens distala ände med ett vinklat snitt så att konan syns.
  10. Med utgångspunkt från den proximala änden av nerven, försiktigt greppa den exponerade axon slutar med ett par mycket fin-tippade tyckor.
  11. Med ett andra par tlysen, greppa nervsaxet proximally, och långsamt dra mot den distala änden av nerven. Nervsaxan kommer att glida längs axoner med minimalt motstånd. Se till att ingen otillbörlig spänning appliceras på nerven under denna process.

4. Slutnervens perfusionskammare församling

  1. Gripa tag i den proximala änden av nerven, ta bort den från saltlösningen och lägg långsamt ner den på täcket av perfusionskammaren i den inre packningens rektangulära öppning, och bibehåll mild spänning på nerven när du lägger ner den så att den ligger rakt.
  2. Placera mikroakrinenten glida över nerven med räfflade sidan mot nerven, och riktningen av flödet parallellt med nerven. Vänd på täckplattan och mikroakvalens sammansättningen över, och placera den i perfusionskammarens hölje med mikroakduktens glidappsed till den yttre packningen. Nerven och omgivande inre packningen kommer nu att vara inklämt mellan täckslip och mikroakveduktens glidning, som är åtskilda av packningen, med täckslipen uppåt (Bild 1B).
  3. Säkra perfusionskammaren genom att placera den i metallhuset och rotera låsringen. Se till att plasthöljet är helt under alla metallklämmor och dra åt väl för att förhindra saltlösningsläckage. Överdragande kan spricka mikroakrondbanan eller täckskopet. Vänd på kammaren så att täckskydden är vänd nedåt.
  4. Tryck långsamt ned den saltlösningssprutakolven för att fylla perfusionskammaren. Håll in- och utloppsslangen, utloppskolven och sprutan förhöjd ovanför själva kammaren hela tiden under uppställning och bildbehandling. Detta undviker hävert, vilket kan införa bubblor eller orsaka fokus instabilitet på grund av undertryck i kammaren.
  5. Överför perfusionsenheten till ett inverterat mikroskopsteg och montera saltlösningssprutan i sprutans pump. Starta motorn med en lämplig hastighet för ett flöde på 0,25 mL/min. Anslut sedan och sätt på in-line lösningsvärmaren inställd på 37 °C.
  6. Anslut objektiva värmaren och satt till 37 °C, applicera olja på målsättningen, och sätt in perfusionskammaren i scenfästet.
  7. Applicera olja på kammarvärmarens dyna och fäst på perfusionskammaren. Anslut och sätt på kammarvärmaren; satt till 37 °C.
    OBS: Temperaturförändringar kan orsaka att bubblor bildas i perfusionskammaren på grund av utgasning av lösningen. Om bubblor bildas, kort öka lösningens flöde med 5-10x tills bubblor rensa kammaren.
  8. Lås in perfusionskammaren i stegadaptern och för med den objektiva oljan i kontakt med täckmarken på kammarens undersida.
    OBS: Bioptechs-kammaren med ASI-stegadapter som används här är konstruerade för en inverterad mikroskopkonfiguration.

5. Fluorescensaktivering och bildförvärv

  1. Med hjälp av belysning i Brightfield, fokusera på lagret av axoner på nervens bottenyta närmast täckunderlaget (Figur 2B). Myelinerade axoner (typiskt 1 - 6 μm i diameter hos vuxna möss) kan identifieras genom närvaron av en myelinskina, som är synlig under ljusfältsöverförda ljusbelysning utan kontrastförbättring. Schmidt-Lanterman klyftor och noder av Ranvier är också lätt uppenbara. Unmyelinated axoner är mer slanka (typiskt <1 μm diameter) och är i allmänhet närvarande i buntar (Remak buntar), där de i allmänhet är för nära apposed att lösas från varandra.
  2. Om det finns på mikroskopet, aktivera auto-fokus systemet för att upprätthålla fokus under loppet av timelapse imaging.
  3. Skaffa en brightfield referensbild. Registrera nervens orientering (ryggrad-proximala och distala ändar) med avseende på bilder.
  4. Förvärva en konfokal bild med hjälp av en 488 nm laser och ett utsläppsfilter som är lämpligt för paGFP (t.ex. 525/50 nm) för att registrera autofluorescensen före blekmedel. Håll lasereffekten låg för att minimera fotoblekning, med exponeringstid justerad i enlighet med detta för att upptäcka den svaga signalen. Som ett exempel förvärvades representativa data vid 5 % lasereffekt och 4 s exponeringar. Registrera anskaffningsinställningarna för användning i alla framtida experiment.
    OBS: Efter fotoaktivering, kommer den idealiska bildframställning inställningar producera en signal-brus-förhållande > 8 och fotobleaching på mindre än 25% av den ursprungliga signalen under loppet av 20 bilder. Axoner kan också avbildas av widefield epifluorescens mikroskopi som vi gjorde ursprungligen7, men bildkvaliteten kommer att vara sämre på grund av brist på confocality.
  5. Ställ in lasereffekten på ungefär 5x normal bildkraft och skaffa en bild med en exponeringstid på 3-4 minuter. Även om det inte är nödvändigt, är detta steg rekommenderas att bleka autofluorescens och andra källor till oönskade fluorescens för att minska bakgrundssignal och därmed maximera signal-till-buller av den fotoaktiverade fluorescens.
  6. Skaffa en bild med de inställningar som används i steg 5.4 för att spela in den pre-aktivering autofluorescens efter detta blekning steg.
  7. På brightfield bilden, rita en linje parallellt med axoner med en längd som är lika med önskad aktivering fönsterstorlek. Längden på detta fönster kommer att variera beroende på experimentella mål och parametrar, men typiska längder är 5 μm för puls-escape paradigm och 40 μm för puls-spridning paradigm.
  8. Med hjälp av denna linje som en guide ritar du en rektangulär region av intresse (ROI) över synfältet vinkelrätt mot axoner. Regionen måste omfatta alla axoner som ska photoactivated.
  9. Bestäm optimala inställningar för fotoaktivering med 405 nm belysning.
    OBS: Utför endast detta steg och delsteg före första experimentell aktivering. Under loppet av ett experiment måste samma fotoaktiveringsinställningar användas.
    1. Aktivera en region av intresse upprepade gånger med hjälp av 405 nm laserlinjen, låg lasereffekt (t.ex., 5%), och pixel dwell tid (t.ex. 40 μs), och en puls, förvärva en bild av den aktiverade GFP fluorescens efter varje aktivering. Upprepa tills fluorescensen inte längre ökar, och kvantifiera sedan fluorescensen i en region av intresse för varje bild.
    2. Rita den genomsnittliga fluorescensintensiteter kontra puls nummer. Välj efter vilket antal pulser fluorescensen inte längre ökar som det optimala antalet pulser för aktivering.
  10. Aktivera paGFP-fluorescensen regionen dras i steg 5,8 genom mönstrad excitation med 405 nm ljus. Se till att en bild förvärvas strax före och bara efter aktivering.
    OBS: Den idealiska paGFP aktiveringen kommer att producera en klart definierad region av fluorescens med skarpa gränser som finns inom ROI.
  11. Starta en 1 minut timer som aktiveringen avslutas. I slutet av 1 minut, starta förvärv av en timelapse-serie.
    OBS: Den 1 minut fördröjning är nödvändig för att möjliggöra ökningen av fluorescens som observeras efter fotoaktivering av paGFP11. För puls-spridning metoden, en 5-10 minuters förvärvsperiod med 30 andra timelapse intervall är tillräcklig för mätning av de inledande sluttningarna i centrala och flankerande fönster för att mäta hastighet och riktningslighet. För denpuls-escape metoden, en förvärvsperiod av 30-150 noterar med 5 eller 10 minimala timelapsemellanrum tillståndanalyser av det långsiktiga pausa uppförandet av filamenten
  12. Spara alla bilder som förvärvats, liksom ROI används för fluorescens aktivering.
  13. Flytta till en ny region i nerven och upprepa steg 5.1-5.11. Om den nya regionen ligger längs samma axona måste den vara minst 500 μm från den tidigare aktiverade regionen för att undvika att detektera fluorescerande neurofilament som flyttat ut ur den andra aktiverade regionen. Förvärvet av den slutliga timelapse måste avslutas före utgången av 3 timmars fönster.
    OBS: Det är möjligt att preparatet kan vara lönsamt längre än 3 timmar, men det har vi inte bekräftat. Med skickliga dissekering och förberedelse, mellan fem och åtta 10-minuters timelapse bilduppsättningar kan förvärvas inom denna 3 timmars fönster.
  14. Efter den slutliga timelapse bildserie förvärvas, stoppa flödet av saltlösning, koppla bort lösningen och kammarvärmare, och ta bort perfusion apparaten från mikroskopet skede.

6. Flatfield och darkfield bild förvärv

  1. Gör en lösning av fluorescein genom att tillsätta 250 mg fluoresceinpulver till 0,5 mL dubbelt destillerat vatten. Blanda tills det inte finns några synliga partiklar och snurra lösningen i 30 sekunder i en bordsskiva centrifug till sediment något oupplöst material. Denna lösning kan förvaras i flera månader vid 4 °C om den skyddas mot ljusexponering.
  2. Tillsätt 8 μL fluoresceinlösning på ett objektglas och applicera #1,5 täckplatta. Blot överflödig vätska, försegla med nagellack, och låt torka.
    OBS: Vid denna höga koncentration släcker fluorescerande färgämnets starka absorption den lysande strålen inom lösningen, vilket ger ett tunt plan av fluorescens vid ytan av täckfärgen som är både enhetlig och motståndskraftig mot fotoblekning på grund av snabbt diffusivt utbyte12.
  3. Placera fluoresceinglidskydd-sidan ner på inverterat mikroskop skede och justera fokus på det tunna planet av fluorescens på ytan av täckplattan. Flytta runt i bilden för att hitta ett synfält som inte innehåller luftbubblor (mörka fläckar) eller stora fluoresceinpartiklar (ljusa fläckar).
  4. Förvärva en z-stack som spänner över 6 μm med 0,2 μm intervall så att den mellersta bilden är det ursprungliga fokusplanet. Använd en kort exponeringstid (t.ex. 40 ms) eftersom fluorescensen kommer att vara mycket ljus. Denna z-stack förvärv är nödvändigt att fånga maximal fluorescens över synfältet som coverslip är sällan perfekt horisontell och planet av fluorescein fluorescens är mycket smal. Upprepa detta för totalt 25 synfält, flytta scenen med minst 20 μm i någon riktning mellan fälten.
  5. Stäng alla fönsterluckor för ljusvägar, inklusive kamerans slutare, och ställ in lasereffekten och exponeringstiden på noll. Skaffa en stapel med 100 bilder med dessa inställningar. Dessa bilder kommer att i genomsnitt generera darkfield bilden, som kommer att användas för att korrigera för mörk ström och bias offset på kameran chip.
    OBS: Streaming förvärv är ett idealiskt sätt att fånga dessa bilder.

7. Imaging glykolytiskt hämmade nerver för blekmedel korrigering

  1. Gör och syresätta en saltlösning som i steg 1; emellertid ersättning 2-deoxy-D-glukos för D-glukos och tillsätt 0,5 mM natriumjodacetat för att hämma glykolys13. Vi hänvisar till detta som "hämmande saltlösning".
  2. Upprepa steg 2-5 med hjälp av den hämmande koksaltlösningen, med en 10-30 minuters timelapse-bild inställd i steg 5.11. Tillåt 40-50 minuter efter applicering av hämmande saltlösning före bildbehandling för att säkerställa fullständig hämning av neurofilamenttransport.
    OBS: Glykolytisk hämning kommer så småningom att döda axoner så det finns ett smalt fönster av tid efter hämning i vilken att förvärva data, vanligtvis ca 30 minuter. En indikator på nivån av metabolisk hämning är flavin autofluorescens av axonal mitokondrier, som kan upptäckas i timelapse-serien på grund av de långa exponeringar som vi använder för att bilden paGFP fluorescens14. Typiskt, mitokondriellt autofluorescens kommer att öka under behandling med hämmande koksaltlösning. Om mitokondrierna börjar runda upp eller fragment, sedan upphöra bildbehandling.

8. Bildbehandling och analys med hjälp av ImageJ

  1. Flatfield och darkfield korrigering
    1. Öppna darkfield-bildstacken och i genomsnitt bilderna genom att klicka på Bild | Staplar | Z Projicera och välja Genomsnittlig intensitet i rullgardinsmenyn för att generera darkfield-bilden.
    2. Öppna fluorescein-bildstackarna i Flatfield och skapa en maximal intensitetsprojektion av varje (25 totalt) genom att klicka på Bild | Staplar | Z Projicera och välja Max intensity i rullgardinsmenyn.
    3. Kombinera de resulterande 25 maximala projektionsbilderna till en stapel genom att klicka på Bild | Staplar | Bilder till Stack. Skapa en genomsnittlig intensitetsprojektion av den här stacken genom att klicka på Bild | Staplar | Z Projekt och välja Genomsnittlig intensitet i dropdown-menyn för att generera flatfield-bilden.
    4. Subtrahera darkfield bilden från flatfield bilden genom att klicka process | Bildkalkylator, välja Subtrahera som åtgärden. Se till att alternativet med resultatet 32 bitar (float) är markerat. Resultatet är den korrigerade flatfield bilden.
    5. Mät den genomsnittliga pixelintensiteten för den korrigerade flatfieldbilden genom att först klicka på Analysera | Ställ in Mått och bocka för värderutan Mean gray och tryck sedan på 'm'-tangenten.
    6. Dela upp den korrigerade flatfieldbilden med dess genomsnittliga intensitet genom att klicka på Process | Matematik | Dividera och ange det genomsnittliga gråvärde som erhålls i steg 7.1.5. Detta kommer att producera den omvända vinna bilden.
    7. Öppna bilderna före aktivering och efter aktivering tillsammans med timelapse-bildstacken. Kombinera bilderna till en enda stapel genom att klicka på Bild | Staplar | Verktyg | Concatenate, och välj bilderna i kronologisk ordning i dropdown-menyerna. Kontrollera att alternativet Öppna som 4D-bild inte är markerat. Den resulterande stacken är den fullständiga bilduppsättningen.
    8. Upprepa steg 8.1.4 på den fullständiga bilduppsättningen, och dela sedan upp resultatet med den omvända förstärkningsbilden genom att klicka på Process | Bildkalkylator och välja Divide som operation. Detta kommer att producera den korrigerade fullständiga bilduppsättningen, där varje bild har korrigerats för den icke-likformiga i belysningsfältet och på detektorn.
  2. Justering av bildstack
    1. För att korrigera för feljustering av bilden plan i timelapse serien på grund av skede eller prov drift, installera Anpassningen av fasta regionen plugin (Supplemental File 1) genom att klicka på Plugins | Installera PlugIn, navigera till mappen som innehåller plugin-filen, och välja plugin. Starta om ImageJ efter installation av insticksprogrammet.
      OBS: Denna plugin anpassar bilder baserat på "minst kvadrat congealing" princip15.
    2. Rita en ROI på den korrigerade fullständiga bilduppsättningen som sträcker sig över flera axoner och inte sträcker sig utanför de proximala och distala gränserna för den aktiverade fluorescensen inom var och en av axoner. Regionens geometri är oviktig, men utesluter områden där strukturer ändrar form eller storlek kommer att förbättra anpassningen.
    3. Kör insticksprogrammet för justering genom att klicka på Plugins | Justering efter fast region. Insticksprogrammet placerar ett standard maximum på 2-pixel på förskjutningen mellan bildrutor, dock kan detta justeras i det inledande popup-fönstret om det finns betydande drift av provet. Justeringen kan ta flera minuter, beroende på storleken på bildstacken.
    4. Inspektera den justerade stacken visuellt för att bedöma anpassningens kvalitet. Vissa ramar kan då behöva justeras manuellt, eftersom den automatiserade justeringen kanske inte fungerar bra för stora fluktuationer i fluorescens mellan bildrutorna. Detta kan vara fulländat medan du visar en ram som måste förskjutas genom att klicka på Bild | Förvandla | Översätt. Klicka på Nej på följande popup-fönster där du frågar om hela stacken ska översättas. Använd endast heltalspixelvärden i översättning och se till att menyn dropdown interpolation är inställd på Ingen, eftersom bråkiga pixelskiftningar eller interpolation kommer att förändra data på grund av omsampling av pixelintensiteterna.
    5. Spara detta som den justerade fullständiga bilduppsättningen.
  3. Mätning av fluorescensintensiteter
    1. Rita en ROI med hjälp av vinkelverktyget på den första bildrutan i den justerade fullständiga bilduppsättningen med den första armen längs den aktiverade regionens ena kant, vinkelrätt mot axoner och den andra armen vertikal. Tryck på tangenten 'm' för att mäta vinkeln, som beskriver axosens orientering i synfältet.
    2. Ange bildernas skala så att dimensioner mäts i mikrometer genom att klicka på Analysera | Ange Skala och ange lämpliga värden.
    3. Öppna ROI-hanteraren genom att klicka på Analysera | Verktyg | ROI-chef. För puls-escape paradigm, hoppa till steg 8.3.7. För pulsspridningen fortsätter du till steg 8.3.4.
    4. Rita en kvadratisk ROI av valfria dimensioner och klicka sedan på Redigera | Urval | Ange. Se till att alternativet Skalade units enheter är markerat och ställ sedan in avkastningen på investeringen till en bredd på 15μm och en höjd som är lika med eller större än bildens höjd.
    5. Rotera avkastningen på investeringen genom den vinkel som uppmätts i steg 8.3.1 genom att klicka på Redigera | Urval | Rotera för att göra den vinkelrät mot axoner, och placera ROI med en sida längs den proximala kanten av den aktiverade regionen. Lägg till denna ROI, som vi kommer att hänvisa till som den proximala guiden ROI, till chefen genom att trycka på 't' tangenten.
    6. Dra avkastningen på investeringen för att justera mot den distala kanten av den aktiverade regionen och lägg till i ROI-hanteraren igen genom att trycka på tangenten 't'. Vi kommer att hänvisa till detta som den distala guiden ROI. Den proximala och distala guide-ROIs kommer att användas senare för att rita flankmätnings-ROIs.
    7. Välj axoner för kvantifiering, med hjälp av timelapse bildsekvensen förvärvats i steg 5.11 ovan. Denna bildsekvens är till hjälp för detta ändamål eftersom den fångar den svaga autofluorescensen av axoner, avslöjar deras morfologi utanför den aktiverade regionen.
      OBS: Axon som inte uppfyller följande kriterier undantas från analysen:
      1. Axons måste vara i fokus längs hela längden på alla mätfönster.
      2. Axons måste vara inom 5° av vinkelrätt mot aktiveringsregionens proximala och distala ändar.
      3. Axons får inte ha några invaginationer inom 5μm av de proximala och distala ändarna av aktiveringsregionen.
      4. Uteslut axoner som ändrar form synligt under avbildningens gång.
      5. Uteslut axoner som verkar ohälsosamma som framgår av frånvaron av en diskret aktiverad region i bilden efter aktivering (Figur 2C, botten), eftersom detta är ett tecken på diffusiv spridning av den aktiverade fluorescensen, vilket händer när axonen dör.
    8. Observera blekningsbild med lång exponering från steg 5.5 för autofluorescerande strukturer inom axoner. Denna fluorescens beror på flavins inom mitokondrierna16. Uteslut axoner från analys om dessa mitokondrier verkar rundade eller fragmenterade (Figur 2D, botten), i motsats till utökade, linjära strukturer (Figur 2D, topp), eftersom detta är en indikation på metabolisk nedgång.
    9. Med hjälp av proximala och distala guide ROIs skapas ovan, rita tre mätning ROIs per axoger analyseras: ett centralt fönster som omfattar axon inom 40 μm aktiverad regionen, och två flankerande fönster med bredd begränsas av flankerande fönster 15 μm ROIs och höjd begränsas av diametern på axon vid gränsen till aktivering regionen. Lägg till alla tre regioner till ROI-chefen. För glykolytiskt hämmade axoner, rita en enda region som inte är mer än 5 μm bred i mitten av den aktiverade regionen och som inte sträcker sig utanför axonet. För puls-escape-paradigmet är den aktiverade regionen endast 5 μm bred, så hela fönstret måste användas.
    10. Upprepa steg 8.3.9 för alla axoner som uppfyller kriterierna i steg 8.3.7 och 8.3.8.
    11. Ange aktiva mått till genomsnittlig pixelintensitet genom att klicka på Analysera | Ange Mått och välja alternativet Medelvärdet av grått värde. Se till att inga andra mätalternativ kontrolleras.
    12. Markera alla ROIs i fönstret ROI Manager genom att markera fönstret och trycka på 'Ctrl' + 'a'. Klicka på Mer i fönstret ROI Manager | Multi Measure för att mäta fluorescensintensiteterna. Kopiera data från resultatfönstret till ett kalkylblad för vidare analys.
    13. Ange aktiva mätningar till regionområde genom att klicka på Analysera | Ange Mått och välja alternativet Område. Se till att inga andra mätalternativ kontrolleras.
    14. Upprepa steg 8.3.12. Det är bara nödvändigt att kopiera en rad av resultaten för området, eftersom området inte varierar med tiden.

9. Photobleach korrigering

  1. I data kalkylbladet för glykolytiskt hämmade axoner subtrahera medelvärdet fluorescens av ram 1 (före aktiveringsramen) från medelvärdet fluorescens av varje bildruta börjar vid bildruta 3 (den första timelapse ramen) för en given ROI. Resultaten är det bakgrundsundertraherade hjälpmedlet.
  2. Rita data som en scatterplot med ramnummer som abscissa. Passa en exponentiell trendlinje till data från varje ROI (de flesta kalkylprogram har denna funktion) med en ekvation i form av Ae-bx. Denna ekvation är likvärdig med fotobleachingfunktionen Ft = F0 * e-tɣ där F0 är fluorescensen vid den första tidsramen i timelapse, ɣ är den exponentiella blekningshastigheten, t är tiden, och e är den naturliga logaritmen bas.
  3. Upprepa steg 9.1.1-9.1.2 för alla ROI av alla axoner från de glykolytiskt hämmade nerverna. För den mest exakta uppskattningen av fotoblekningshastigheten, använd minst 15 axoner totalt från minst 5 separata nerver. Använd medelvärdet av de exponentiella blekningshastigheterna (ɣ) från alla hämmade axoner för att korrigera de experimentella data för fotobleaching. En ny blekning kalibrering måste utföras för varje experiment eller studie, eftersom fotobleaching är beroende av bilden förvärv inställningar och laserkraft, som kan förändras över tiden.
  4. Upprepa steg 9.1.1 för alla regioner av axoner avbildade med normal saltlösning (dvs. inte glykolytiskt hämmad).
  5. Dividera varje datapunkt med e-tɣ, med hjälp av tid för t och den genomsnittliga ɣ som finns i steg 9.1.3. Dessa är de photobleach-korrigerade medel.
  6. Multiplicera varje datapunkt med området för den regionen av intresse för att hitta den totala fluorescensen i den regionen vid varje tillfälle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bild 3 visar representativa bilder från puls-flykt och puls-spridning experiment. Vi har publicerat flera studier som beskriver data som erhållits med hjälp av puls-flyktmetoden och våra metoder för analys av dessa data5,6,7,8,17. Nedan visar vi hur puls-spridning data kan ge information om riktningsgrad och hastighet av neurofilament transport, som vi inte har rapporterat tidigare.

Neurofilament transport i axon är intermittent och dubbelriktad. Denna transport kan beskrivas av den fraktion av glödtrådar som rör sig vid en viss tidpunkt i anterograde och bakåtsträvande riktningar, Equation 41 Equation 40 och respektive, och deras hastigheter i anterograde och bakåtsträvande riktningar, betecknas Equation 39 med och Equation 38 . Om vi tar den totala mängden neurofilament polymer per enhetslängd av axona Equation 37 vara , då flödena i anterograde och bakåtsträvande riktningar genom en viss region ges av

Equation 36

Och

Equation 35,

respektive, och det totala Equation 34 flusset ges av

Equation 33,

där Equation 70 har enheter μm-1, Equation 32 har enheter och har enheter Equation 31 Equation 34 Equation 30 . Eftersom flussen på en viss plats längs axogen är mängden neurofilament polymer som rör sig förbi den platsen i en tidsenhet, är det relaterat till den genomsnittliga hastigheten Equation 29 genom Equation 28 . Således kan vi skriva

Equation 27.

I ett pulsspridningsexperiment kan flusset bestämmas från avgångshastigheten för de fluorescerande neurofilamenten från den aktiverade regionen, som vi kallar det centrala fönstret. Den totala förlusten av fluorescerande neurofilament polymer från detta centrala fönster per sekund Equation 26 är summan av de förluster på grund av fluorescerande neurofilament polymerer lämnar i anterograde och bakåtsträvande riktningar, dvs.

Equation 25

Normaliserat till den initiala halten av fluorescerande neurofilamentpolymer i det centrala fönstret, dvs , var är längden på Equation 24 Equation 23 det centrala fönstret, blir denna förlusthastighet då

Equation 22

var Equation 21 är lutningen på minskningen av fluorescens i det centrala fönstret, som inledningsvis är linjär under en tidsperiod som ges av Equation 20 8. För ett 40 μm centralt fönster motsvarar detta bara tiotals sekunder. Men för fönster så här stora, övergången till exponentiell förfall fas är gradvis och lutningen är effektivt linjär i flera minuter eller mer8.

Vid tidiga tillfällen, de flankerande fönstren fånga alla neurofilament som lämnar det centrala fönstret eftersom dessa glödtrådar inte har tillräckligt med tid att passera genom de flankerande fönstren och avsluta dem på andra sidan. I detta fall, de mängder fluorescerande neurofilament polymer som lämnar det centrala fönstret anterogradely och bakåtsträvande per sekund, dvs flussen och , ges av ökningen av Equation 19 Equation 18 neurofilament innehåll och i Equation 17 de Equation 16 flankerande fönstren. Normaliserad till den ursprungliga halten av fluorescerande neurofilament polymer i det centrala fönstret, blir ökningshastigheten i de flankerande fönstren

Equation 15

Equation 14

var Equation 13 och Equation 12 är sluttningarna av ökningen av fluorescens i de proximala respektive distala flankerande fönstren.

Således kan vi uttrycka den genomsnittliga hastigheten när det gäller backarna i de flankerande fönstren, dvs.

Equation 11      (Eq. 1)

och förhållandet mellan antalet anterograde och bakåtsträvande rörliga neurofilament vad gäller förhållandet mellan dessa sluttningar, dvs.

Equation 10     (Eq. 2)

där Equation 9 och Equation 8 betecknar de takter som neurofilamenten backar från anterogradely till bakåtsträvande rörliga och vice versa8. Värdena för Equation 7 och Equation 6 kan bestämmas genom att mäta förflyttning av enskilda neurofilament i odlade nervceller, som rapporterats tidigare17. Viktigt är att uttrycket för hastigheten i Eq. 1 endast gäller vid korta tidpunkter efter aktiveringen under vilken fluorescerande neurofilament kommer in i flankfönstret men inte lämnar. Varaktigheten av detta korta tidsfönster kommer att bero på längden på de flankerande fönstren och neurofilamentrörelsens kinetik. Ju längre de flankerande fönstren, i princip, desto längre tidsfönster. Teoretiskt sett kan man testa att detta kriterium uppfylls genom att bekräfta att

Equation 5     (Eq. 3)

I motsats till uttrycket för hastigheten i Eq. 1, som ges av skillnaden mellan backarna i de flankerande fönstren, är uttrycket för riktningsligheten i Eq. 2 robust till flankerande fönsterstorlek eftersom det ges av förhållandet mellan sluttningarna i de flankerande fönstren.

Figur 3 visar representativa resultat från puls-flykt och puls-spridning experiment på myelinated axoner i tibial nerven av en 8-veckors gammal manlig mus från vår hThy1 paGFP-NFM linje på en C57Bl/6J bakgrund, med hjälp av fönsterstorlekar 5 och 40 μm, respektive. Möss som är minst 2 veckors ålder, både manliga och kvinnliga, har använts för dessa experimentella paradigm. Lämplig ålder och kön bör fastställas av forskaren beroende på vad som testas i studien. Med tiden kan man se att kanterna på de aktiverade regionerna oskärpa på grund av neurofilaments avgång i både anterograde och bakåtsträvande riktningar, vilket resulterar i förlust av fluorescens från det centrala fönstret.

För puls-escape-metoden (Figur 3A, C, E) kan fluorescensen sönderfallskinetiken i den aktiverade regionen ge information om det långsiktiga och kortsiktiga pausbeteendet8,18. För dessa experiment kan den aktiverade regionen vara kort (vi använder normalt 5 μm; se gul ruta i figur 3A). För puls-spread-metoden (Figur 3B, D, F), använder vi en längre aktiverad region (40 μm här; se gul ruta i figur 3B) för att ge en större pool av lysrörsneurofilament. Detta förlänger den tid över vilken fluorescensförhöjningen i de flankerande regionerna förblir linjär (se ovan). Den linjära domänen för denna fluorescensförhöjning i de flankerande fönstren kan också ökas genom att öka längden på dessa fönster, dock begränsas detta av synfältets storlek. Vi använde 15 μm flankerande fönster, visade i rött och grönt, för de data som visas i figur 3D.

I figur 3E,3F visas kvantifieringen av de totala fluorescensintensiteterna (dvs. summan av pixelintensiteterna) för de mätrutor som visas i figur 3C,3D respektive. För puls-escape-metoden är förfallet bifasiskt, med ett initialt exponentiellt förfall som representerar avgången av on-track neurofilaments. Detta övergår på cirka 10-20 minuter till en sekund långsammare exponentiell förfall som representerar mobilisering och avgång off-track glödtrådar8. För jämförelse med puls-spread metoden, visar vi bara en 12 minuters tid kurs i figur 3E, men vanligtvis tidsföringen av analysen måste vara längre (typiskt 30-120 minuter) för att fånga den långsiktiga pausa kinetik5,6,18. För pulsspridningsstrategin är beräkningarna av rörelsens hastighet och riktningsriktning endast beroende av sluttningarna i de flankerande fönstren. För de fönsterlängder som används här sträcker sig den linjära fasen i ca 5 minuter. Varaktigheten för detta tidsfönster av linjäritet bör bedömas genom att stegvis förkorta den tid som används för att mäta lutningen, och bestämma den punkt vid vilken lutningen inte längre ökar. Denna varaktighet kan ökas genom att öka fönsterlängderna om kamerafältet tillåter, även om fönsterlängderna bör hållas konstanta för alla axoner i ett visst experiment. Som ett exempel har vi använt de första 5 minuterna av data för att mäta backarna för de pulsspridda data i figur 3F. Detta resulterar i backar på 72 A.U./min, -594 A.U./min, och 111 A.U./min för de proximala, centrala respektive distala fönstren (A.U. = godtyckliga enheter). För att normalisera dessa värden, är de dividerat med den ursprungliga fluorescens av det centrala fönstret, vilket resulterar i priser på 0,108 %F0/min, -0,962 %F0/min och 0,173 %F0/min. Tillämpande Eq. 3 finner vi att bevarandekriteriet inte är uppfyllt, vilket tyder på att vi inte fångar upp alla fluorescenscen i de flankerande fönstren. Detta är en teknisk begränsning på grund av synfältet på vår EMCCD-kamera (82 μm x 82 μm). Kameror med sCMOS-chips, som kan ha mycket större synfält, skulle kunna tillåta användning av större flankerande fönsterstorlekar. Vi kan dock inte utesluta möjligheten att denna diskrepans mellan de centrala och flankerande sluttningarna också skulle kunna bero, åtminstone delvis, på att man underskattar omfattningen av fotobleaching (se Diskussion), vilket skulle få till följd att de positiva backarna i de flankerande fönstren underskattas och minussluttningen i det centrala fönstret överskattas.

Från kurserna i de flankerande fönstren (%F0/min) och Eq. 2 ovan, och med hjälp av värden Equation 4 på och Equation 3 17, beräknar vi Equation 2 kvoten = 2,12. Detta tyder på att 68% av filamenten rörde sig anterograde och 32% bakåtsträvande. Med hjälp av samma kurser och Eq. 1 ovan beräknar vi den genomsnittliga nettopopulationshastigheten Equation 1 = 40*(0,00173-0,00108) = 0,026 μm/min, eller 0,037 mm/dag. Radioisotopiska pulsmärkningsstudier på möss i liknande ålder har rapporterat en neurofilamentpopulationshastighet på ungefär 0,6 mm/dag i de mest proximala delarna av ischiasnerven, vilket saktar ner till 0,12 mm/dag över en sträcka på två centimeter19,20. Vår puls-spridning data samlades in i tibial nerv, ungefär en annan 2-3 centimeter distala till dessa åtgärder. Av de skäl som nämns ovan, anser vi att uppskattningen av 0,037 mm/dag är en underskattning av den sanna hastigheten. Extrapolera emellertid den rumsliga bromsa observeras av radioisotopic puls-märkning i tibial nerv denna uppskattning inte orimligt, särskilt när vi betänker att det bestämdes med hjälp av en mycket olika metodik på en mycket olika rumsliga och tidsmässiga skala.

För att visa förmåga puls-spridning metod för att upptäcka betydande skillnader mellan populationer, jämförde vi proximala och distala flankerande fönster sluttningar mätt från nerver perfunderas med både normala och hämmare koksalt. Hämning av glykolys blockerar förflyttning av neurofilament, som vi har rapporterattidigare 5,6,7. Vi kommer att diskutera senare valet av provstorlekar för experiment, dock här använde vi en nerv i normal saltlösning och två i hämmande saltlösning, på grund av begränsningen av ett förvärv fält per nerv under hämning. Figur 4A visar ett exempel timelapse från en glykolytiskt hämmad nerv, vilket visar en uppenbar minskning av transport ut ur den aktiverade regionen. Vi finner faktiskt betydligt lägre distala och proximala sluttningar (Figur 4B, p = 0,00000639 respektive 0,0121, Tukeys parvis jämförelse efter ANOVA) i nerver som behandlats med hämmande saltlösning jämfört med de som perfunderas med normal saltlösning. Vi finner också en signifikant minskning av befolkningshastigheten mellan dessa två villkor (Figur 4C, p = 0,0232, t-test med ojämlika varianser, efter F-test för lika varians med p = 0,0190).

Figure 1
Bild 1: Perfusionskammaren. (A) Diagram som visar monteringen av perfusionskammarehuset och den yttre packningen, med slangar som är anslutna till saltlösningssprutan och avfallskolven. (B) Diagram som visar monteringen av själva kammaren. Den inre packningen läggs platt ovanpå #1,5 täckslip. Nerven placeras på täcket i brunnen som skapas av den inre packningens rektangulära öppning. Mikroakronden placeras över nerven för att sandwicha nerven mellan #1,5 coverslip och mikroakron slide. Slutligen vänds smörgåsen innan montering ovanpå den yttre packningen av monteringen som visas i (A) och säkras med en låsring (visas ej). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Tibialnerven beredning. (A) Bild som visar den tibianervens placering inom benet på en mus, i vilken gluteus superficialis, biceps femoris, semitendinosus, popliteus, tibialis caudalis och flexor digitorum longusmusklerna har avlägsnats. Tibial nerv kan ses som en av tre stora grenar av sciatic nerv uppstår vid knät. (B) Schematisk av nerven i tvärsnitt i den hopmonterade kammaren, som visar olje-nedsänkningsmålet under täckmarken. Den bästa optiska kvaliteten erhålls genom att aktivera och avbilda lagret av axoner apposed till ytan av täckplattan; bildkvaliteten avtar djupare in i nerven på grund av ljusspridning. (C) Exempel på en hälsosam axon (överst), och av en ohälsosam axon (botten) omedelbart efter aktivering. Den streckade gula linjen markerar den aktiverade regionen. Den aktiverade fluorescensen har skarpa gränser i den friska axon medan i den ohälsosamma axonen sprider sig den aktiverade fluorescensen snabbt ut ur den aktiverade regionen och fyller axoin inom några sekunder. Skalstång = 10 μm. (D) Exempel på det mitokondriella utseendet i en hälsosam axon (överst) och en ohälsosam axona (botten). Mitokondrierna är synliga på grund av flavin autofluorescens16. De verkar linjära (heldragna pilspetsar) i friska axoner. I ohälsosamma axoner blir mitokondrierna först punktat (öppna pilspetsar) och därefter svagare med tiden, vilket ger en indikator på axonhälsa. Den streckade öppna pilspetsen i den friska axonet pekar på en mitokondrie som övergår från linjär till punktat. Skalstång = 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Puls-flykt och puls-spridning experiment. Exempel på pre-aktivering, efteraktivering och timelapse bilder av myelinated axoner i tibial nerven av en 8 veckor gammal mus i (A) en puls-escape experiment och (B) en puls-spridning experiment. Den föraktivering bilden är den övre panelen, med efteraktivering bilderna nedan.  Tidsstämplarna visar tiden som förflutit efter aktiveringen. De gula rutorna representerar regionen som aktiverats. Dessa aktiveringar utfördes med hjälp av 5 skanningar med en 40 μs pixel dwell tid och 5% lasereffekt. Skalstång = 10 μm. (C) Mät-ROIs (gul) för tre axoner i ett puls-utrymningsexperiment. (D) Den proximala (röda), centrala (gula) och distala (gröna) mät-ROIs för tre axoner i ett experiment med pulsspridning. Mått-ROIs för varje axon visas med fast rött (proximalt), fast gult (centralt fönster) och fast grönt (distalt fönster). (E) Plot av den genomsnittliga fluorescens kontra tid, medelvärde av de 3 axoner i C. Streckad linje är en exponentiell funktion passar till data, av formen Ft = Ae-τt, som beskrivitstidigare 7. F) Tomter av fluorescensen i centrala, distala och proximala ROIs kontra tid, genomsnitt 14 axon inklusive de tre axons i D. Lutningen beräknas från trendlinjer som passar till de första 5 minuterna av data. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Effekten av metabola inhibitorer på neurofilamenttransport. (A) Exempel på timelapse bilder av en nerv pretreated med 5.6% (w/v) 2-deoxy-glukos och 0.5 mM natriumjodoacetate att hämma glykolys och utarma cellulära ATP. Observera att de distala och proximala gränserna för de aktiverade regionerna förblir skarpa, vilket tyder på en hämning av neurofilamenttransport. Skalstång = 10 μm. (B) Kvantifiering av backarna i de distala (D) och proximala (P) flankerande fönstren (anterograde respektive bakåtsträvande), uttryckt som procent av den inledande fluorescensen i det centrala fönstret (%F0/min), från en nerv (14 axon) med hjälp av standardsalin och från två nerver (8 axoner) som förbehandlats med saltlösning som innehåller de glykolytiska hämmarna. (C) Neurofilament populationen hastigheter beräknas från sluttningar i de flankerande fönstren, visar en betydande minskning av hastigheten efter inhibitorbehandling. - p < 0.005; ** - p < 0,01; * - p < 0,05. Uppgifterna visar signifikant försämring av neurofilamenttransport i närvaro av inhibitorerna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Kompletterande Video. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Försiktighet måste tas vid analys av puls-flykt och puls-spridning experiment eftersom det finns betydande potential för införandet av fel under efterbearbetning, främst under platt-fält korrigering, bild anpassning och blekmedel korrigering. Flat-field korrigering är nödvändigt att korrigera för icke-enhetlighet i belysningen, vilket resulterar i en fall-off i intensitet över synfältet från centrum till periferi. Omfattningen av icke-enhetlighet är våglängdsberoende och därmed, bör alltid utföras vid den våglängd som ska användas för att förvärva de experimentella data. Det är viktigt att se till att den icke-likformiga i plan-fält bilden verkligen är representativ för den icke-likformighet i bilderna som skall rättas till. Pulsspridningsexperiment är särskilt sårbara för fel från felaktig plattfältskorrigering eftersom mät-ROIs sträcker sig mot periferin av bilden där intensiteten faller-off är störst.

De optimala inställningarna för paGFP-aktivering kommer att variera beroende på aktiveringsmetod och laserparametrar, och måste bestämmas empiriskt före den första bildtagningssessionen. För lite aktivering kommer att resultera i en låg signal-brus-förhållande för den aktiverade fluorescens, medan för mycket kommer att resultera i blekning av den aktiverade fluorescens eftersom både den icke-aktiverade och aktiverade paGFP kan vara upphetsad av violett ljus. För att selektivt belysa en region av intresse i bilden använder vi en Andor FRAPPA laser galvo scanner, som genererar en klart definierad region av fluorescens med skarpa gränser, som visas i representanten Resultat. Vi har också haft framgång med hjälp av en Andor Mosaic Digital membran, som är en digital micromirror enhet, med en kvicksilverbåglampa som belysning källa7. Andra alternativ är kommersiellt tillgängliga. En utmaning när du arbetar med paGFP är den fördröjda ökningen av fluorescensintensitet som händer inom 1 minut efter fotoaktiveringssteget. Denna ökning sker eftersom belysning med violett ljus orsakar en andel av de aktiverade paGFP molekyler att komma in i ett "mörkt tillstånd" från vilken de kan koppla av tillbaka på en tidskurs på tiotals sekunder11. Enligt vår erfarenhet är ökningen vanligtvis mindre än 5% med widefield excitation men kan överstiga 20% med laser excitation, vilket kan leda till en betydande underskattning av den aktiverade fluorescens. Vi står för detta genom att skaffa en andra "post-aktivering" bild av paGFP fluorescens 1 minut efter photoactivation, och sedan använda denna bild som referenspunkt för den efterföljande timelapse. Det är dock viktigt att inse att detta inte införa en annan potentiell källa till fel vid fastställandet av den ursprungliga fluorescens och sönderfall kinetik vid tidiga tidpunkter.

Ytterligare uppmärksamhet måste ägnas åt justeringen av bildstackarna. Den främsta källan till feljustering är drift eller annan rörelse av exemplaret under timelapse bild förvärv. Detta kan minimeras genom att använda innerpackningar av lämplig tjocklek och låta preparatet "bosätta sig" innan avbildning. En sådan försening kommer dock att minska den tid som finns tillgänglig för bildanskaffning eftersom förberedelserna har ett begränsat fönster av lönsamhet. Det är också viktigt att undvika justeringsalgoritmer som varp bilden eller införa sub-pixel skift, eftersom dessa förfaranden skulle sampla om pixelintensiteterna i bilden. Pulsspridningsexperiment är särskilt sårbara för fel som uppstår vid felaktig anpassning eftersom gränserna för regionen aktiverad fluorescens är relativt skarpa, och fluorescensen i denna region är betydligt högre än de flankerande oaktiverade regionerna. Även en liten feljustering av bildplanen i stacken kan resultera i stora hopp i fluorescensvärdena i de distala och proximala mätrutorna. Således är det absolut nödvändigt att bilduppsättningar är justerade ordentligt och inspekteras noggrant innan du fortsätter med analysen.

Korrigering för fotobleaching är nödvändigt för att säkerställa att förändringar i fluorescensintensitet över tiden korrekt återspeglar förändringar i mängden av fluorescerande protein. Sådana korrigeringar kan vara en betydande felkälla vid uppskattning av de absoluta fluorescensintensiteterna i de centrala och flankerande fönstren. Som fotobleaching kinetik beror på intensiteten av belysning och miljön i fluorophore, faktiska fotoblekning priser kan variera mellan sessioner och från axon till axon. Således är det nödvändigt att mäta flera axoner och genomsnitt de resulterande uppgifterna, som i sig introducerar en del fel. Det tillvägagångssätt som beskrivs ovan är att behandla nerven med glykolytiska hämmare och sedan aktivera fluorescensen i en region av intresse och spåra förlusten av fluorescensintensitet över tiden. De glykolytiska hämmarna bryter ut ATP och hämmar därmed neurofilamenttransport så att förlusten av fluorescens helt beror på fotobleaching och inte förflyttning av neurofilament ut ur den aktiverade regionen. Den genomsnittliga blekningskinetiken som bestäms på detta sätt används sedan för att korrigera de experimentella uppgifterna. Eftersom det inte är praktiskt att utföra en separat blekningskalibrering i varje bildbehandlingssession, måste en enda kalibrering tillämpas på flera sessioner spridda över många veckor. En nackdel med detta tillvägagångssätt är att det inte tar hänsyn till variationer i lasereffekt/belysningsintensitet från dag till dag, vilket därför bör övervakas. Ett alternativt tillvägagångssätt, som vi kallar "inneboende blekningskorrigering", är att uppskatta fotoblekningen genom att kvantifiera fluorescensen i mitten av den aktiverade regionen i samma timelapse-filmer som används för transportmätningarna. Om denna mätregion är centralt belägen och mycket kortare än längden på den aktiverade regionen, och sedan vid korta tidpunkter kommer alla fluorescerande neurofilament som rör sig ut ur mätregionen att ersättas av fluorescerande neurofilament som rör sig in i den. Men med tiden sannolikheten för icke-fluorescerande neurofilaments flyttar in i mätning regionen från flankerande icke-fluorescerande regioner av axon ökar, vilket leder till en överskattning av förlusten av fluorescens på grund av blekning. En fördel med detta tillvägagångssätt är att det korrigerar för blekningsegenskaperna inom samma fält, men en nackdel är att tidsfönstrets varaktighet måste bestämmas empiriskt och kommer att bero på transportens hastighet samt längden på den aktiverade regionen. Allt detta har sagts, bör det noteras att uppskattningen av riktningsgraden av neurofilament transport med vår metod är robust att bleka fel (som det är för flankerande fönsterstorlek) eftersom det ges av förhållandet mellan sluttningarna i flankerande fönster och någon blekning korrigering är en multiplikator appliceras på både täljare och nämnare i den beräkningen.

På grund av det buller som är inneboende i ett fluorescerande system och potentialen för ytterligare fel som tillkommit under de bild efterbehandlingssteg som beskrivs ovan är det viktigt att använda stora urvalsstorlekar för tillräcklig statistisk effekt. Även om det inte är möjligt att exakt bestämma befolknings medel, avvikelser och effektstorlekar före experiment, rekommenderar vi att du använder Cohen-metoden21 förutsatt en medeleffektstorlek och en alfa på 0,05. Detta resulterar i en Cohens d, vilket är skillnaden i medel dividerat med den poolade standardavvikelsen för båda populationerna, på 0,5, vilket tyder på att förvärva minst 105 prover per grupp. När detta tröskelvärde har uppnåtts kan man utföra en post hoc-kraftanalys för att omvärdera statistisk makt mot bakgrund av de faktiska befolkningsåtgärderna. Under optimala experimentella förhållanden bör det vara möjligt att få från 1-7 analyzable axoner (av 9-20 totalt axoner) per aktivering, och 5-8 aktiveringar per nerv förutsatt förvärvet av en 10-minuters timelapse per aktivering.

Transgena möss som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner riktade till mitokondrier eller vesiklar har också använts för att studera axonal transport av membranösa organeller i perifera nerver ex vivo22,23,24,25. Dessutom har Schiavo labbet utvecklat metoder för att avbilda axonal transport av bakåtsträvande rörliga membranösa organeller i axoner in vivo med hjälp av fluorescerande taggade stelkramptoxin fragment, som kan injiceras i muskeln och tas upp av motor nerv terminaler26. Men eftersom membranösa organeller kan lösas i dessa axoner genom fluorescensmikroskopi, är det möjligt att analysera hastigheten och frekvensen av deras rörelse direkt med hjälp av timelapse eller kymograph analys. De puls-flykt och puls-spridning metoder som beskrivs här utvecklades med det specifika målet att analysera kinetik neurofilament transport i dessa axoner, där enda neurofilament inte kan lösas. Detta kräver en analys på befolkningsnivå under en period av minuter eller tiotals minuter. Vi använder en transgen mus för detta ändamål, men det bör också vara möjligt att uttrycka det fotoaktiva proteinet med metoder som viral transduktion eller in utero-elektroporation. Medan fokus har varit neurofilamenttransport, kan metoderna puls-flykt och puls-spridning också anpassas för att studera förflyttning av andra cytoskeleala och cytosoliska proteiner som transporteras längs axoner i de långsamma komponenterna i axonal transport. Vi begränsar våra analyser till myelinerade axoner eftersom deras storlek och myelinskina gör att vi kan lösa dem från sina grannar. Unmyelinated axons kan inte lösas på grund av deras små kaliber och tendens att kluster i Remak buntar. Vi beskriver användningen av tibial nerver ex vivo men metoderna bör också vara tillämpliga på andra perifera nerver som är tillräckligt långa (>5 mm) och unbranched. I princip bör det också vara möjligt att anpassa dessa metoder till bild neurofilament transport in vivo (t.ex., genom att kirurgiskt exponera en nerv i en sövd mus och sedan placera musen på ett mikroskop skede).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Paula Monsma för instruktion och hjälp med confocal mikroskopi och tibial nerv dissekering och Dr Atsuko Uchida, Chloe Duger och Sana Chahande för hjälp med mus djurhållning. Detta arbete stöddes delvis av collaborative National Science Foundation Grants IOS1656784 till A.B. och IOS1656765 till P.J., och National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 och S10 OD010383 till A.B. N.P.B. stöddes av en gemenskap från Ohio State University President's Postdoctoral Scholars Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm Bioptechs 1907-1422-100 inner gasket
2-deoxy-D-glucose Sigma D6134
30mm Round Gasket w/ Holes Bioptechs 1907-08-750 outer gasket
35 x 10mm dish Thermo Fisher 153066 dissection dishes
40mm round coverslips Bioptechs 40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip BD 309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system Andor outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride Fisher C79
Coverslips Fisher 12-541-B for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution Sigma G8769
Dissecting pins Fine Science Tools 26001-70
Dissection forceps Fine Science Tools 11251-30 fine tipped forceps
Dissection microscope Zeiss 47 50 03
Dissection pan with wax Ginsberg Scientific 568859
Dissection scissors Fine Science Tools 14061-09 initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber Bioptechs 060319-2-03
Fluorescein sodium Fluka 46960
Inline solution heater Warner Instruments SH27-B
Laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20 initial dissection forceps
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Microaqueduct slide Bioptechs 130119-5
Microscope slides Fisher 12-544-3 for fluorescein slide
Microscope stage insert Applied Scientific Instrumentation I-3017
Objective heater system Okolab Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A Nikon discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective Nikon MRD01901
Potassium chloride Fisher P217
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P0662
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium iodoacetate Sigma-Aldrich I2512
Syringe pump Sage Instruments Model 355
Tubing adapter - female Small Parts Inc. 1005109
Tubing adapter - male Small Parts Inc. 1005012
Tygon tubing Bioptechs 1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15018-10 fine scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
  2. Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  3. Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
  4. Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
  5. Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
  6. Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
  7. Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
  8. Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  10. Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
  11. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  12. Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
  13. Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
  14. Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
  15. Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
  16. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
  17. Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
  18. Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
  19. Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
  20. Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
  21. Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).
  22. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  23. Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
  24. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  25. Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
  26. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).

Tags

Neurovetenskap axonal transport neurofilament fotoaktivering puls-spridning puls-escape nerv konfokalmikroskopi
Bildbehandling och analys av neurofilament transport i struket Mus Tibial Nerve
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., … More

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve. J. Vis. Exp. (162), e61264, doi:10.3791/61264 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter