Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التصوير والتحليل لنقل الليفية العصبية في العصب الذبي الماوس المخزّن

Published: August 31, 2020 doi: 10.3791/61264
Automatic Translation
1, 1,2, 3,4, 1
1Department of Neuroscience, The Ohio State University, 2Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, 3Quantitative Biology Institute, Ohio University, 4Department of Physics and Astronomy, Ohio University

Summary

نحن نصف أساليب التفكيك الضوئي الفلورية لتحليل النقل المحوري للاعصاب في محاور عصبية واحدة من الأعصاب النخاعية من الفئران المحورة وراثيا التي تعبر عن بروتين الليفية العصبية تنشيطية ضوئية.

Abstract

البوليمرات البروتين العصبية تتحرك على طول محاور في عنصر بطيء من النقل المحوري في متوسط سرعة ~ 0.35-3.5 مم / يوم. حتى وقت قريب كانت دراسة هذه الحركة في الموقع ممكنة فقط باستخدام وضع العلامات النبضية الإشعاعية ، والتي تسمح بتحليل النقل المحوري في الأعصاب الكاملة مع دقة زمنية للأيام ودقة مكانية من ملليمترات. لدراسة نقل الاعصاب في الموقع مع ارتفاع دقة الزمان والمكانية، وضعنا ماوس hThy1-paGFP-NFM المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتين العصبي M الموسومة مع GFP تنشيطها في الخلايا العصبية. هنا نصف التضاء الضوئي تنشيط نبض الهروب والنبض انتشار أساليب لتحليل نقل neurofilament في محاور النخاعية واحدة من الأعصاب التيبية من هذه الفئران السابقين vivo. يتم الحفاظ على أجزاء العصب المعزولة على مرحلة المجهر عن طريق التسريب مع المالحة المؤكسجة وصورة عن طريق المجهر الفلوري الدوار القرص. يستخدم الضوء البنفسجي لتنشيط الفلوريس في نافذة قصيرة محور عصبي. يتم تحليل الفلوريس في المناطق المنشطة والحاصرة بمرور الوقت ، مما يسمح بدراسة نقل الليفية العصبية مع دقة زمنية ومكانية على ترتيب الدقائق والميكرنات ، على التوالي. يمكن استخدام النمذجة الرياضية لاستخراج المعلمات الحركية لنقل الاعصاب بما في ذلك السرعة والتحيز الاتجاهي والسلوك التوقف من البيانات الناتجة. ويمكن أيضاً تكييف طرق الهروب النبضي وانتشار النبض لتصور نقل الليفية العصبية في الأعصاب الأخرى. مع تطور فئران إضافية محورة وراثيا، يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب لتصوير وتحليل النقل المحوري للبروتينات الأخرى من الهيتوليات العظمية والبوليتوسولية في المحاور.

Introduction

وقد تجلى النقل المحوري للأعصاب لأول مرة في 1970s بواسطة الملصقات النبضية الإشعاعية1. وقد أسفرت هذه المقاربة عن ثروة من المعلومات حول نقل الاعصاب في الجسم الحي، ولكن لديها دقة مكانية وزمنية منخفضة نسبيا ، وعادة ما تكون على ترتيب ملليمترات وأيام في أحسن الأحوال2. وعلاوة على ذلك، فإن وضع العلامات بالنبض الإشعاعي هو نهج غير مباشر يتطلب حقن وتضحية متعددة لتوليد دورة زمنية واحدة. مع اكتشاف البروتينات الفلورسنت والتقدم في المجهر الفلوريس في 1990s، أصبح في وقت لاحق من الممكن لتصوير نقل neurofilament مباشرة في الخلايا العصبية المستزرعة على مقياس زمني من ثوان أو دقائق ومع شبه ميكرومتر التحليل المكاني، مما يوفر رؤية أكبر بكثير في آلية الحركة3. وقد كشفت هذه الدراسات أن البوليمرات العصبية في المحاور تتحرك بسرعة وبشكل متقطع في كل من الاتجاهات التيروغرادية والرجعية على طول المسارات ميكروتوب، مدفوعا البروتينات الحركية ميكروتوبول. ومع ذلك، الليفية العصبية هي هياكل محدودة الانعراج فقط 10 نانومتر في القطر التي عادة ما تكون متباعدة بعيدا عن جيرانها من قبل عشرات فقط من نانومتر; لذلك، لا يمكن تتبع البوليمرات إلا في الخلايا العصبية المستزرعة التي تحتوي على الليفية العصبية الموزعة بشكل غير قليل بحيث يمكن حل البوليمرات المتحركة من جيرانها4. وهكذا، فإنه ليس من الممكن في الوقت الحاضر لتتبع النخاع العصبي واحد في محاور عصبية تحتوي على البوليمرات العصبية وفيرة، مثل المحاور النخاعية.

لتحليل النقل المحوري للأعصاب في المحاور العصبية الغنية باستخدام المجهر الفلوريسنس ، نستخدم أسلوب الفلوريسينيشن الضوئي نبض الهروب التي وضعناها لدراسة السلوك التوقف على المدى الطويل من neurofilaments في الخلايا العصبية المستزرعة4،5. يتم تنشيط الليفية العصبية الموسومة ببروتين انصهار الفلورية الفلورية القابلة للفكّاق الضوئي في جزء قصير من محور عصبي ، ومن ثم يتم تحديد معدل مغادرة تلك الشعيرات من المنطقة المنشطة من خلال قياس اضمحلال الفلوريسانس بمرور الوقت. وميزة هذا النهج هو أن تحليل مستوى السكان لنقل الليفية العصبية التي يمكن تطبيقها على مقياس زمني للدقائق أو ساعات دون الحاجة إلى تتبع حركة البوليمرات الليفية العصبية الفردية. على سبيل المثال، استخدمنا هذه الطريقة لتحليل حركية نقل الاعصاب في الثقافات myelinating6.

في الآونة الأخيرة، وصفنا تطوير فأر hThy1-paGFP-NFM المعدلة وراثياً الذي يعبر عن مستويات منخفضة من بروتين الليفيلامين العصبي paGFP الموسومة M (paGFP-NFM) في الخلايا العصبية تحت سيطرة الإنسان العصبية الخاصة Thy1 المروج7. يسمح هذا الفأر بتحليل نقل الاعصاب في الموقع باستخدام المجهر المفلور. في هذه المقالة، نحن وصف النهج التجريبية لتحليل نقل النخاع العصبي في المحاور النخاعية من الأعصاب التيبية من هذه الفئران باستخدام نهجين. وأول هذه الأساليب هو طريقة الهروب النبضي الموصوفة أعلاه. هذه الطريقة يمكن أن تولد معلومات حول السلوك التوقف من neurofilaments، ولكن أعمى عن الاتجاه الذي خيوط مغادرة المنطقة المنشط، وبالتالي لا يسمح قياس اتجاه صافي وسرعة النقل8. والثاني من هذه الأساليب هو طريقة جديدة لانتشار النبض الذي نحلل فيه ليس فقط فقدان الفلوريسنس من المنطقة المنشطة، ولكن أيضا الزيادة العابرة في الفلوريسنس في نافذتين يحيطان بهما تتحرك خيوط الفلورسنت من خلالها وهي تغادر المنطقة المنشطة في الاتجاهين المتنثين والرجعي. في كلا النهجين، يمكن الحصول على معلمات نقل الليفية العصبية مثل متوسط السرعة والاتجاه الصافي وسلوك التوقف باستخدام التحليل الرياضي والنمذجة للتغيرات في الفلورس في نوافذ القياس. ويوضح الشكل 3 هذين النهجين.

هذا البروتوكول يدل على تشريح وإعداد العصب، وتفعيل وتصوير الفلوري paGFP، وتحديد كمي من نقل الليفية العصبية من الصور المكتسبة باستخدام حزمة توزيع فيجي من ImageJ9. نستخدم العصب التيبالي لأنه طويل (عدة سم) ولا يتفرع؛ ومع ذلك، من حيث المبدأ أي العصب التعبير عن paGFP-NFM مناسب للاستخدام مع هذه التقنية إذا كان يمكن تشريحها و de-غماد دون إتلاف محاور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت على جميع الأساليب المذكورة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) من جامعة ولاية أوهايو.

1. إعداد محلول ملحي العصب

  1. جعل 100 مل من محلول بريوير10:98 mM NaCl، 1 mM KCl، 2 mM KH2PO4، 1 mM MgSO4، 1.5 mM CaCl2، 5.6٪ D-glucose، 23.8 mM Nahco3 في الماء المقطر المزدوج.
  2. فقاعة 95٪ الأكسجين/ 5٪ ثاني أكسيد الكربون (كاربوجين) من خلال محلول ملحي لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. يمكن إعادة استخدام بقايا المالحة في غضون أسبوع واحد; ومع ذلك، يجب أن يكون reoxygenated قبل كل استخدام.
  3. صب ملحي أكسجين في حقنة 60 مل وضمان أن هناك الحد الأدنى من الهواء المتبقي في الحقنة.

2. الجمعية الأولية لغرفة الضخ العصبي

  1. توصيل الحقنة والأنابيب كما هو مبين في الشكل 1A، ووضع أنبوب تدفق في قارورة النفايات.
  2. وضع طوقا الخارجي في السكن غرفة الضخ، وضمان أن يتم محاذاة مدخل تدفق ومخارج الوظائف مع الثقوب في طوقا.
  3. وضع طوقا الداخلية (سيليكون، 100 ميكرومتر سميكة) على غطاء دائري #1.5 (قطرها 40 مم)، وصقل بعناية أي التجاعيد في طوقا لضمان ختم ضيق. لتسهيل التجميع في وقت لاحق، ضع غطاء الأغطية والحشاء على منشفة ورقية أو مسح المهمة مع طوقا تواجه ما يصل.

3. تشريح وإعداد العصب الوبيبي الماوس

  1. التضحية بالحيوان عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون أو طريقة أخرى معتمدة من الناحية المؤسسية. بدء جهاز توقيت عندما يتوقف الحيوان الحركة / التنفس، كما يجب أن يتم إجراء التجارب فقط في غضون 3 ساعات من التضحية7.
  2. رش الفراء مع 70٪ الإيثانول وإزالة أكبر قدر ممكن من الساقين الحيوان والظهر باستخدام شفرة حلاقة كهربائية.
  3. باستخدام زوج من مقص التشريح كبيرة، وجعل شق الظهرية في الجلد بالقرب من منتصف العمود الفقري ومواصلة قطع حول الجانب البطني للحيوان. بدءا من هذا القطع، تعكس ببطء الجلد من الساقين عن طريق سحب بلطف بعيدا عن العضلات وقطع اللفافة.
  4. وضع الحيوان في موقف supine على صينية تشريح ودبوس جميع الكفوف الأربعة. اختياريا دبوس الذيل للحد من الحركة أكثر.
  5. باستخدام مقص microdissection، وجعل شق في عضلات الفخذ في منتصف الطريق بين الذيل والركبة لفضح العصب الوركي. تأكد من أن العصب، الذي هو مرئي من خلال العضلات، لا قطع.
  6. تمديد شق الظهري وبطينلي لإزالة العضلات. وبالمثل، إزالة عضلات العجل، والحفاظ على تخفيضات الضحلة وقصيرة لتجنب إتلاف العصب.
  7. إزالة العضلات حتى يتعرض العصب التيبالية تماما من النقطة حيث فروع من العصب الوركي (في الركبة) إلى كعب (الشكل 2A).
    ملاحظة: في جميع الخطوات بما في ذلك وبعد تشريح العصب التيبالي، تجنب التعرض غير الضروري للضوء المحيط لتقليل التنشيط العرضي المحتمل لpaGFP في العصب.
  8. فهم العصب التيبالي في نهاية العمود الفقري القريب مع زوج من ملقط وقطع العصب باستخدام زوج من مقص microdissection. الحرص على عدم وضع التوتر على العصب، ورفعه بعيدا عن العضلات، وقطع أي مرفقات.
  9. قطع نهاية العمود الفقري- مجرد من العصب التيبالي ونقلها إلى طبق بيتري صغير من درجة حرارة الغرفة المالحة المؤكسجة. من هذه النقطة في الإجراء، تكون دائما على يقين من تتبع نهايات قريبة وبعد من العصب.
    ملاحظة: إحدى الطرق للقيام بذلك هي وضع علامة على نهاية العصب بزاوية قطع بحيث يكون التفتق مرئياً.
  10. بدءا من نهاية قريبة من العصب، فهم بلطف محور عصبي المكشوفة ينتهي مع زوج من ملقط غرامة جدا.
  11. مع زوج الثاني من ملقط، فهم العصب اغتماً وكيلاً، وسحب ببطء نحو نهاية العصب البعيدة. سوف تنزلق مُدْدِع العصب على طول المحاور مع الحد الأدنى من المقاومة. ضمان عدم تطبيق أي توتر لا مبرر له على العصب خلال هذه العملية.

4. العصب النهائي ينفوسيون مجلس غرفة

  1. استيعاب الطرف القريب من العصب، وإزالته من المالحة ووضع ببطء على غطاء غرفة القذف داخل فتحة مستطيلة من طوقا الداخلية، والحفاظ على التوتر لطيف على العصب كما كنت وضعها إلى أسفل بحيث تقع على التوالي.
  2. ضع الشريحة الدقيقة فوق العصب مع الجانب المُقَدَّر الذي يواجه العصب، واتجاه التدفق بالتوازي مع العصب. الوجه الغطاء وتجميع microaqueduct أكثر، ووضعها داخل السكن غرفة الضخ مع الشريحة microaqueduct apposed إلى طوقا الخارجي. الآن سوف تقع العصب والطوقة الداخلية المحيطة بين غطاء وشريحة microaqueduct، والتي يتم فصلها من قبل طوقا، مع غطاء مواجهة حتى (الشكل 1B).
  3. تأمين غرفة الضخ عن طريق وضعها في السكن المعدني وتناوب حلقة القفل. تأكد من أن السكن البلاستيكي هو بالكامل تحت كل مقاطع معدنية وتشديد جيدا لمنع تسرب المالحة. قد الإفراط في كسر الشريحة microaqueduct أو coverslip. اقلب الغرفة حتى يكون الغطاء متقابلاً لأسفل.
  4. الاكتئاب ببطء المكبس حقنة المالحة لملء غرفة الضخ. الحفاظ على مدخل ومأخذ أنابيب، وقارورة منفذ وحقنة مرتفعة فوق الغرفة نفسها في جميع الأوقات أثناء الإعداد والتصوير. هذا يتجنب السلب، والتي يمكن أن أعرض فقاعات أو يسبب عدم الاستقرار التركيز بسبب الضغط السلبي في الغرفة.
  5. نقل الجمعية perfusion إلى مرحلة المجهر المقلوب وجبل حقنة المالحة في مضخة الحقنة. بدء تشغيل المحرك بسرعة مناسبة لمعدل تدفق 0.25 مل / دقيقة. ثم قم بتوصيل وتشغيل سخان الحل في خط تعيين إلى 37 درجة مئوية.
  6. توصيل سخان الهدف وتعيين إلى 37 درجة مئوية، وتطبيق النفط على الهدف، وإدراج غرفة الضخ في جبل المرحلة.
  7. تطبيق النفط على وسادة سخان الغرفة وإرفاقها إلى غرفة الضخ. الاتصال وتشغيل سخان الغرفة؛ تعيين إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تتسبب التغيرات في درجة الحرارة في تكوين فقاعات في غرفة الضخ بسبب التفريغ من الحل. إذا شكل فقاعات، زيادة لفترة وجيزة معدل تدفق الحل من قبل 5-10x حتى فقاعات مسح الغرفة.
  8. قفل غرفة الضخ في محول المرحلة وجلب النفط الهدف في اتصال مع الأغطية على الجانب السفلي من الغرفة.
    ملاحظة: غرفة Bioptechs مع محول المرحلة ASI المستخدمة هنا مصممة لتكوين المجهر مقلوب.

5. تقنية تقنية الفلورس و الاستحواذ على الصور

  1. باستخدام الإضاءة في الملعب المشرق، والتركيز على طبقة من محاور على السطح السفلي من العصب الأقرب إلى سطح الغطاء (الشكل 2B). يمكن تحديد المحاور النخاعية (عادة 1 - 6 ميكرومتر في القطر في الفئران البالغة) من خلال وجود غمد المايلين ، الذي يمكن رؤيته تحت الإضاءة الخفيفة المنتقلة إلى brightfield دون تعزيز التباين. كما أن شقوق شميت- لانترمان والعقد من رانفييه واضحة بسهولة. المحاور غير المُحَلَمة هي أكثر سليحاً (عادةً < 1 ميكرومتر قطر) وهي موجودة بشكل عام في حزم (حزم Remak)، حيث تكون عموماً قريبة جداً من أن تحل من بعضها البعض.
  2. إذا كان متوفرًا على المجهر، قم بتنشيط نظام التركيز التلقائي للحفاظ على التركيز خلال فترة تصوير فترة اليلة.
  3. الحصول على صورة مرجع حقل مشرق. تسجيل اتجاه العصب (العمود الفقري وينتهي القريبة وينتهي) فيما يتعلق بالصور.
  4. الحصول على صورة confocal باستخدام ليزر 488 نانومتر ومرشح الانبعاثات المناسبة لpaGFP (على سبيل المثال، 525/50 نانومتر) لتسجيل الفلورورس قبل التبييض. حافظ على انخفاض طاقة الليزر لتقليل حجم الإضاءة الضوئية، مع ضبط وقت التعرض وفقًا لذلك للكشف عن الإشارة الخافتة. على سبيل المثال، تم الحصول على بيانات تمثيلية بنسبة 5٪ قوة ليزر و 4 التعرض s. سجل إعدادات الامتلاك للاستخدام في جميع التجارب المستقبلية.
    ملاحظة: بعد التنشيط الضوئي، سوف تنتج إعدادات التصوير المثالية نسبة الإشارة إلى الضوضاء > 8 وphotobleaching أقل من 25٪ من الإشارة الأصلية على مدار 20 صورة. يمكن أيضا أن تكون صور محاور بواسطة المجهر واسعة epifluorescence كما فعلنا أصلا7، ولكن جودة الصورة ستكون أدنى بسبب عدم وجود confocality.
  5. تعيين قوة الليزر إلى ما يقرب من 5x القدرة التصوير الطبيعي والحصول على صورة مع وقت التعرض من 3-4 دقائق. على الرغم من أنه ليس ضروريًا ، إلا أنه يوصى بهذه الخطوة لتبييض الفلوروستور وغيرها من مصادر الفلورا غير المرغوب فيها من أجل تقليل إشارة الخلفية وبالتالي تحقيق أقصى قدر من الإشارة إلى الضوضاء للفلوروست المعطل.
  6. الحصول على صورة مع الإعدادات المستخدمة في الخطوة 5.4 لتسجيل الفلورس التلقائي قبل التنشيط بعد هذه الخطوة التبييض.
  7. على الصورة brightfield، رسم خط موازي لمحور عصبي مع طول يساوي حجم نافذة التنشيط المطلوب. ويختلف طول هذه النافذة تبعا للهدف التجريبي والمعلمات، ولكن الأطوال النموذجية هي 5 ميكرومتر لنموذج الهروب النبضي و 40 ميكرومترا لنموذج انتشار النبض.
  8. باستخدام هذا الخط كدليل، رسم منطقة مستطيلة من الفائدة (ROI) عبر مجال عرض عمودي على المحاور. ويجب أن تشمل المنطقة جميع المحاور التي يتعين تنشيطها ضوئيا.
  9. تحديد الإعدادات المثلى لتنشيط الصور مع إضاءة 405 نانومتر.
    ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة والخطوات الفرعية فقط قبل التنشيط التجريبي الأول. يجب استخدام نفس إعدادات تنشيط الصور أثناء التجربة.
    1. تنشيط منطقة ذات أهمية مرارا وتكرارا باستخدام خط الليزر 405 نانومتر، وانخفاض قوة الليزر (على سبيل المثال، 5٪)، وبكسل يسكن الوقت (على سبيل المثال، 40 ميكروغرام)، ونبض واحد، والحصول على صورة من الفلوريس GFP تنشيط بعد كل تنشيط. كرر حتى الفلوريسين لم يعد يزيد، ومن ثم كمي الفلوريس في منطقة ذات فائدة لكل صورة.
    2. رسم كثافة الفلوريسين متوسط مقابل عدد نبض. حدد عدد النبضات التي لم تعد بعدها الفلورسنس تزيد كالعدد الأمثل للبقولات للتنشيط.
  10. تنشيط paGFP fluorescence المنطقة رسمها في الخطوة 5.8 بواسطة الإثارة منقوشة مع ضوء 405 نانومتر. تأكد من أن يتم الحصول على صورة فقط قبل وبعد التنشيط.
    ملاحظة: سوف ينتج التنشيط المثالي paGFP منطقة محددة بوضوح من الفلوريسنس مع حدود حادة واردة في عائد الاستثمار.
  11. بدء مؤقت 1 دقيقة كما ينتهي التنشيط. في نهاية دقيقة واحدة، ابدأ في الحصول على سلسلة فترة زمنية.
    ملاحظة: تأخير دقيقة واحدة ضروري للسماح لزيادة في الفلوريسانس التي لوحظت بعد تنشيط photoation paGFP11. بالنسبة لطريقة انتشار النبض، تكون فترة الاقتناء التي تستغرق 5-10 دقائق مع فترات زمنية زمنية ثانية 30 كافية لقياس المنحدرات الأولية في النوافذ المركزية والضوافية لقياس السرعة والاتجاه. بالنسبة لطريقة الهروب النبضي، فإن فترة الاستحواذ من 30-150 دقيقة مع فواصل زمنية زمنية مدتها 5 أو 10 دقائق تسمح بتحليل سلوك الإيقاف المؤقت طويل الأجل للخيوط
  12. حفظ جميع الصور المكتسبة، فضلا عن العائد على الاستثمار المستخدمة لتفعيل fluorescence.
  13. الانتقال إلى منطقة جديدة من العصب وكرر الخطوات 5.1-5.11. إذا كانت المنطقة الجديدة على طول نفس المحور المحوري، يجب أن يكون 500 ميكرومتر على الأقل من المنطقة التي تم تنشيطها سابقاً لتجنب اكتشاف الفلورسنت العصبية التي انتقلت من المنطقة الأخرى المنشطة. يجب أن ينتهي الحصول على فترة زمنية نهائية قبل نهاية نافذة 3 ساعات.
    ملاحظة: من الممكن أن يكون الإعداد قابلاً للتطبيق لأكثر من 3 ساعات، ولكننا لم نؤكد ذلك. مع تشريح بارعة والتحضير، يمكن الحصول على ما بين خمس وثمانية 10 دقائق 10-timelapse مجموعات الصور ضمن هذه النافذة 3 ساعات.
  14. بعد الحصول على سلسلة الصور الوقتية النهائية ، ووقف تدفق المالحة ، وقطع الحل وسخانات الغرفة ، وإزالة جهاز التسريب من مرحلة المجهر.

6. فلاتفيلد والغامد فيلد الحصول على صورة

  1. جعل حل من الفلوريسين بإضافة 250 ملغ من مسحوق الفلوريسين إلى 0.5 مل من الماء المقطر مزدوجة. اخلطي حتى لا تكون هناك جسيمات مرئية وتدور الحل لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي من المنضدة إلى رواسب أي مادة غير محلولة. ويمكن تخزين هذا الحل لعدة أشهر عند 4 درجة مئوية إذا كان محمياً من التعرض للضوء.
  2. إضافة 8 μL من محلول الفلوريسين إلى شريحة وتطبيق #1.5 coverlip. لطخة السائل الزائد، وختم مع طلاء الأظافر، والسماح لتجف.
    ملاحظة: في هذا التركيز العالي، وامتصاص قوي من صبغة الفلورسين يطفئ شعاع مضيئة داخل الحل، وإنتاج مستوى رقيقة من الفلوريسنس على سطح الغطاء الذي هو على حد سواء موحدة ومقاومة لphotobleaching بسبب التبادل السريعنشري 12.
  3. ضع شريحة الفلوريسين على جانب الزل على مرحلة المجهر المقلوب وضبط التركيز على المستوى الرفيع من الفلوريسين على سطح الغطاء. التحرك في جميع أنحاء الشريحة للعثور على مجال الرؤية التي لا تحتوي على فقاعات الهواء (البقع الداكنة) أو جزيئات الفلورسين كبيرة (النقاط المضيئة).
  4. الحصول على z-المكدس تمتد 6 μm في فواصل 0.2 μm بحيث الصورة الوسطى هي المستوى التركيز الأصلي. استخدام وقت التعرض قصيرة (على سبيل المثال، 40 مللي ثانية) لأن الفلوريسين سوف تكون مشرقة جدا. هذا الاكتساب z-المكدس ضروري لالتقاط الفلورية القصوى عبر مجال الرؤية حيث أن الغطاء نادراً ما يكون أفقيًا تمامًا و الطائرة من الفلورسين fluorescein ضيقة للغاية. كرر هذا لما مجموعه 25 حقلاً من الرؤية، تحريك المرحلة على الأقل 20 ميكرومتر في أي اتجاه بين الحقول.
  5. أغلق جميع مصاريع مسار الضوء، بما في ذلك مصراع الكاميرا، واضبط طاقة الليزر ووقت التعرض إلى الصفر. احصل على 100 صورة مع هذه الإعدادات. وسيتم متوسط هذه الصور لتوليد صورة darkfield ، والتي سيتم استخدامها لتصحيح التيار المظلم والتحيز إزاحة على رقاقة الكاميرا.
    ملاحظة: إن عملية الحصول على البث هي طريقة مثالية لالتقاط هذه الصور.

7. التصوير الأعصاب التي تمنع glycolytically لتصحيح التبييض

  1. جعل وأوكسيجين محلول ملحي كما في الخطوة 1؛ ومع ذلك استبدال 2-deoxy-D-الجلوكوز لD-الجلوكوز وإضافة 0.5 mM يودواسيتات الصوديوم لمنع تحلل13. ونحن نشير إلى هذا بأنه "ملح مثبط".
  2. كرر الخطوات 2-5 باستخدام ملح ملحي المثبطة، مع صورة الفاصل الزمني 10-30 دقيقة في الخطوة 5.11. السماح 40-50 دقيقة بعد تطبيق المالحة المثبطة قبل التصوير لضمان تثبيط كامل من نقل الاعصاب.
    ملاحظة: سوف يؤدي تثبيط الجليكوليك في نهاية المطاف إلى قتل محاور عصبية بحيث يكون هناك نافذة ضيقة من الوقت بعد تثبيط التي للحصول على البيانات، وعادة حوالي 30 دقيقة. مؤشر على مستوى تثبيط الأيض هو autofluorescence فلافين من الميتوكوندريا محور عصبي، والتي يمكن الكشف عنها في سلسلة timelapse بسبب التعرض الطويل الذي نستخدمه لتصوير الفلوراس14paGFP . عادة، سوف تزداد الفلورية الذاتية الميتوكوندريا أثناء العلاج مع المالحة المثبطة. إذا بدأت الميتوكوندريا في تقريب أو تفتيت، ثم وقف التصوير.

8. معالجة الصور وتحليلها باستخدام ImageJ

  1. تصحيح فيلد و Darkfield
    1. فتح المكدس صورة الحقول المظلمة ومتوسط الصور عن طريق النقر على صورة | مداخن | Z Project وتحديد متوسط الكثافة في القائمة المنسدلة لإنشاء صورة الحقول الداكنة.
    2. فتح مكدسات الصور flatfield الفلوريسين وإنشاء إسقاط أقصى كثافة من كل (25 في المجموع) عن طريق النقر على صورة | مداخن | Z المشروع وتحديد الحد الأقصى كثافة في القائمة المنسدلة.
    3. الجمع بين الناتجة 25 الصور الإسقاط الأقصى في كومة واحدة عن طريق النقر على صورة | مداخن | الصور إلى المكدس. إنشاء إسقاط متوسط كثافة هذه المجموعة من خلال النقر على صورة | مداخن | Z المشروع وتحديد متوسط كثافة من القائمة المنسدلة لتوليد صورة مسطحة.
    4. طرح صورة darkfield من صورة فيلد من خلال النقر على عملية | صورة حاسبة، تحديد طرح كـ العملية. تأكد من تحديد الخيار الناتج 32 بت (عائم). والنتيجة هي تصحيح صورة الحقول المسطحة.
    5. قياس متوسط كثافة بكسل للصورة مسطحة تصحيحها عن طريق النقر أولا تحليل | تعيين القياسات والتحقق من المربع قيمة الرمادي المتوسط، ثم الضغط على مفتاح 'm'.
    6. تقسيم صورة مسطحة تصحيحها من خلال كثافة متوسط عن طريق النقر على عملية | الرياضيات | تقسيم و إدخال متوسط قيمة الرمادية التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.1.5. وهذا سوف ينتج صورة الكسب العكسي.
    7. افتح صور ما قبل التنشيط وما بعد التنشيط مع رزمة صور فترة هاته. دمج الصور في كومة واحدة من خلال النقر على صورة | مداخن | أدوات | قم بسلسلة، وحدد الصور بترتيب زمني من القوائم المنسدلة. تأكد من عدم تحديد الخيار فتح صورة كـ 4D. المكدس الناتج هو مجموعة الصور الكاملة.
    8. كرر الخطوة 8.1.4 على مجموعة الصور الكاملة، ثم تقسيم النتيجة على الصورة كسب عكسي عن طريق النقر فوق عملية | صورة الحاسبة وتحديد تقسيم العملية. وهذا سوف تنتج مجموعة الصورة الكاملة المصححة، والتي تم تصحيح كل صورة لعدم التوحيد في مجال الإضاءة وعلى كاشف.
  2. محاذاة مكدس الصور
    1. لتصحيح لاتواؤم من الطائرات صورة في سلسلة timelapse بسبب المرحلة أو عينة الانجراف، تثبيت محاذاة حسب المنطقة الثابتة البرنامج المساعد(ملف إضافي 1) عن طريق النقر على الإضافات | تثبيت PlugIn، والانتقال إلى المجلد الذي يحتوي على ملف البرنامج المساعد، واختيار البرنامج المساعد. إعادة تشغيل ImageJ بعد تثبيت البرنامج المساعد.
      ملاحظة: هذا البرنامج المساعد محاذاة الصور على أساس "المربعات الأقل congealing" مبدأ15.
    2. رسم عائد على مجموعة الصورة الكاملة المصححة التي تمتد عدة محاور عصبية ولا تتجاوز الحدود القريبة والهية للفلوروس المنشط داخل كل من المحاور. هندسة المنطقة غير مهم، ولكن باستثناء المناطق التي هياكل تغيير الشكل أو الحجم سوف يحسن المحاذاة.
    3. تشغيل البرنامج المساعد المحاذاة عن طريق النقر على الإضافات | المحاذاة حسب المنطقة الثابتة. البرنامج المساعد يضع الافتراضي 2 بكسل كحد أقصى على النزوح بين الإطارات، ولكن هذا قد يتم ضبطها في إطار منبثقة الأولية إذا كان هناك انحراف كبير من العينة. قد تستغرق المحاذاة عدة دقائق، استناداً إلى حجم مكدس الصور.
    4. فحص المكدس المحاذى بشكل مرئي لتقييم جودة المحاذاة. قد تحتاج بعض الإطارات إلى محاذاة يدوياً، حيث قد لا تعمل المحاذاة التلقائية بشكل جيد للتقلبات الكبيرة في الفلورس بين الإطارات. قد يتم إنجاز ذلك أثناء عرض إطار يجب أن يتم تحويلها بالنقر على صورة | تحويل | ترجمة. انقر فوق لا على الإطار المنبثق التالي يسأل ما إذا كان يجب ترجمة المكدس بأكمله. استخدم قيم البكسل الصحيحة فقط في الترجمة وتأكد من تعيين قائمة الاستيفاء المنسدلة إلى لا شيء، حيث أن إزاحات البكسل الكسري أو الاستيفاء ستغير البيانات بسبب إعادة تشكيل كثافة البيكسل.
    5. حفظ هذا كـ مجموعة الصور الكاملة المحاذية.
  3. قياس شدة الفلور
    1. رسم عائد الاستثمار باستخدام أداة زاوية على الإطار الأول من مجموعة الصورة الكاملة الانحياز مع الذراع الأول على طول حافة واحدة من المنطقة تنشيط، عمودي على محاور، والذراع الثانية عمودي. اضغط على مفتاح 'm' لقياس الزاوية، الذي يصف اتجاه المحاور في مجال الرؤية.
    2. تعيين مقياس الصور بحيث يتم قياس الأبعاد في ميكرونين بالنقر تحليل | تعيين مقياس وإدخال القيم المناسبة.
    3. افتح مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار. للحصول على نموذج الهروب النبض، انتقل إلى الخطوة 8.3.7. لانتشار النبض، تابع الخطوة 8.3.4.
    4. رسم عائد استثمار مربع لأية أبعاد، ثم انقر فوق تحرير | اختيار | حدد. تأكد من أن يتم تحديد الخيار وحدات تحجيم ثم قم بتعيين عائد الاستثمار إلى عرض 15μm وارتفاع يساوي أو أكبر من ارتفاع الصورة.
    5. تدوير العائد على الاستثمار حسب الزاوية التي تقاس في الخطوة 8.3.1 بالنقر على تحرير | اختيار | قم بالتدوير لجعلها عمودية على المحاور، ووضع عائد الاستثمار مع جانب واحد على طول الحافة القريبة للمنطقة المنشطة. أضف عائد الاستثمار هذا، الذي سنشير إليه على أنه دليل الاستثمار القريب، إلى المدير بالضغط على مفتاح "t".
    6. اسحب عائد الاستثمار للمحاذاة مع الحافة البعيدة للمنطقة التي تم تنشيطها وإضافتها إلى مدير عائد الاستثمار مرة أخرى عن طريق الضغط على مفتاح 't'. وسوف نشير إلى هذا على أنه دليل العائد على الاستثمار. سيتم استخدام دليل تقريبي وهدّي ROIs في وقت لاحق لرسم قياس ROIs المرافق.
    7. حدد المحاور المحورية لتحديد كمي، وذلك باستخدام تسلسل صورة timelapse المكتسبة في الخطوة 5.11 أعلاه. هذا التسلسل صورة مفيدة لهذا الغرض لأنه يلتقط ضعف autofluorescence من محاور عصبية، والكشف عن مورفولوجيا خارج المنطقة المنشطة.
      ملاحظة: يتم استبعاد Axons التي لا تفي بالمعايير التالية من التحليل:
      1. يجب أن تكون أجهزة أكسون في التركيز على طول جميع نوافذ القياس.
      2. يجب أن تكون أجهزة أكسونس في حدود 5° عمودي على نهايات قريبة وهاتية من منطقة التنشيط.
      3. يجب أن لا يكون لدى أكسونات الاجتنافات داخل 5μm من نهايات قريبة وهاتية من منطقة التنشيط.
      4. استبعاد المحاور التي تغير شكل واضح أثناء التصوير.
      5. استبعاد محاور عصبية تبدو غير صحية كما يتضح من عدم وجود منطقة نشطة منفصلة في صورة ما بعد التنشيط(الشكل 2C، أسفل) ، لأن هذا يدل على التشتت الناشري للفلورسينسي المنشط ، والذي يحدث عندما يموت المحور المحوري.
    8. مراقبة التعرض الطويل تبييض الصورة من الخطوة 5.5 لهياكل ذاتية الفلورة داخل محاور. هذا الفلوريسنس ويرجع ذلك إلى فلافينز داخل الميتوكوندريا16. استبعاد محاور من التحليل إذا كانت هذه الميتوكوندريا تظهر مدورة أو مجزأة(الشكل 2D، أسفل) ، بدلا من تمديد ، والهياكل الخطية(الشكل 2D، أعلى) ، وهذا هو مؤشر على انخفاض الأيض.
    9. باستخدام دليل قريب وهد ROIs التي تم إنشاؤها أعلاه، رسم ثلاثة قياس ROIs لكل محور عصبي يجري تحليلها: نافذة مركزية تشمل محور عصبي داخل المنطقة تنشيط 40 ميكرومتر، واثنين من النوافذ الجناحة مع العرض مقيدة نافذة 15 μm ROIs يحيط والارتفاع مقيدة بقطر محور عصبي على حدود منطقة التنشيط. أضف جميع المناطق الثلاث إلى مدير عائد الاستثمار. بالنسبة لمحورات العجلة المثبطة للجليكليكيا، ارسم منطقة واحدة لا يزيد عرضها عن 5 ميكرومتر في وسط المنطقة المنشطة ولا تمتد خارج محور الدوران. بالنسبة لنموذج الهروب النبضي، فإن المنطقة المنشطة لا تتجاوز 5 ميكرومتر، لذا يجب استخدام النافذة بأكملها.
    10. كرر الخطوة 8.3.9 لكافة المحاور التي تفي بمعايير الخطوتين 8.3.7 و 8.3.8.
    11. تعيين القياسات النشطة إلى متوسط كثافة البكسل بالنقر على تحليل | تعيين القياسات وتحديد الخيار متوسط قيمة رمادية. تأكد من عدم التحقق من خيارات القياس الأخرى.
    12. حدد كل ROIs في إطار مدير العائد على الاستثمار عن طريق تحديد النافذة والضغط على 'Ctrl' + 'a'. في إطار مدير ROI، انقر على المزيد | قياس متعدد لقياس شدة الفلوريسين. نسخ البيانات من نافذة النتائج إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
    13. تعيين القياسات النشطة إلى منطقة المنطقة بالنقر فوق تحليل | تعيين القياسات وتحديد الخيار المنطقة. تأكد من عدم التحقق من خيارات القياس الأخرى.
    14. كرر الخطوة 8.3.12. من الضروري فقط نسخ صف واحد من النتائج للمنطقة ، حيث لا تختلف المنطقة معًا.

9. تصحيح فوتبلاش

  1. في جدول البيانات لمحورات عصبيات مثبّتة الغليك، اطرح متوسط الفلورية للإطار 1 (إطار ما قبل التنشيط) من متوسط الفلوريكل لكل إطار بدءاً من الإطار 3 (إطار فترة زمنية أولى) لعائد الاستثمار معين. النتائج هي الخلفية طرح الوسائل.
  2. رسم البيانات كـ scatterplot مع أرقام الإطار كما abscissa. احتواء خط اتجاه أسي للبيانات من كل عائد استثمار (معظم برامج جداول البيانات لها هذه الوظيفة) مع معادلة في شكل Ae-bx. هذه المعادلة هي ما يعادل وظيفة photobleaching Ft = F0 *e-tɣ حيث F0 هو الفلوريس في الإطار الأول من المهلة، ɣ هو معدل التبييض الأسي، t هو الوقت، و e هو قاعدة اللوغاريتم الطبيعية.
  3. كرر الخطوات 9.1.1-9.1.2 لجميع ROIs من جميع المحاور من الأعصاب المثبطة جليكوليكلي. للحصول على تقدير أدق لمعدل الاحتراق الضوئي، استخدم ما لا يقل عن 15 محورًا عصبيًا في المجموع من 5 أعصاب منفصلة على الأقل. استخدام متوسط معدلات التبييض الأسية (ɣ) من جميع المحاور المثبطة لتصحيح البيانات التجريبية لphotobleaching. يجب إجراء معايرة تبييض جديدة لكل تجربة أو دراسة ، لأن التحسس الضوئي يعتمد على إعدادات الحصول على الصور وقوة الليزر ، والتي يمكن أن تتغير بمرور الوقت.
  4. كرر الخطوة 9.1.1 لجميع مناطق محاور عصبية مصوّرة بالملحة العادية (أي لا تمنع الغليكوليكي بشكل جِلاي).
  5. قم بتقسيم كل نقطة بيانات علىtɣهـ ، باستخدام الوقت لـ t ومتوسط ɣ الموجود في الخطوة 9.1.3. هذه هي وسائل تصحيح photobleach.
  6. ضرب كل نقطة بيانات في المنطقة التي تهم المنطقة للعثور على الفلورس الكلي في تلك المنطقة في كل مرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 3 صورا تمثيلية من تجارب الهروب النبضي وانتشار النبض. وقد نشرنا العديد من الدراسات التي تصف البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة الهروب النبضي وطرقنا لتحليل تلك البيانات5و66و77و88و17., وفيما يلي، نعرض كيف يمكن لبيانات انتشار النبض أن تسفر عن معلومات عن اتجاه وسرعة نقل الليفية العصبية، وهو ما لم نبلغ عنه من قبل.

نقل الاعصاب في محور عصبي متقطعة وثنائية الاتجاه. ويمكن وصف هذا النقل من خلال جزء من خيوط تتحرك في أي وقت من الأوقات في الاتجاهين anterograde ورجعية، Equation 41 وعلى Equation 40 التوالي، وسرعاتها في الاتجاهين anterograde ورجعية، التي تدل Equation 39 عليها Equation 38 و. إذا كنا نأخذ الكمية الإجمالية من البوليمر العصبي لكل طول وحدة من محور عصبي لتكون Equation 37 ، ثم يتم إعطاء التدفقات في الاتجاهين anterograde والرجعية من خلال منطقة معينة من قبل

Equation 36

و

Equation 35,

على التوالي، ويتم إعطاء تدفق الإجمالي Equation 34 من قبل

Equation 33,

حيث Equation 70 لديها وحدات μm-1، Equation 32 لديه وحدات ولها وحدات Equation 31 Equation 34 Equation 30 . وبما أن التدفق في موقع معين على طول محور عصبي هو كمية من البوليمر العصبي الذي يتحرك بعد ذلك الموقع في وحدة من الزمن ، ويرتبط متوسط السرعة Equation 29 من خلال Equation 28 . وهكذا، يمكننا أن نكتب

Equation 27.

في تجربة انتشار النبض يمكن تحديد التدفق من معدل مغادرة الفلورسنت العصبية من المنطقة المنشطة ، والتي نشير إليها باسم النافذة المركزية. والفقدان الكلي لمبولير الفلورسنت العصبي من هذه النافذة المركزية في الثانية Equation 26 هو مجموع الخسائر الناجمة عن بوليمرات الفلورسنت العصبية التي تغادر في اتجاهين التروسغرادي والرجعي، أي.

Equation 25

تطبيع إلى المحتوى الأولي من البوليمر الفلورسنت العصبي في النافذة المركزية، Equation 24 أي، أين Equation 23 هو طول النافذة المركزية، يصبح هذا معدل الخسارة ثم

Equation 22

حيث Equation 21 هو ميل الانخفاض في الفلوريس في النافذة المركزية، والتي هي في البداية خطية لفترة زمنية مع Equation 20 8. بالنسبة للنافذة المركزية 40 ميكرومتر، وهذا يعادل عشرات الثواني فقط. ومع ذلك ، بالنسبة للنوافذ بهذا الحجم ، يكون الانتقال إلى مرحلة الاضمحلال الأسي تدريجيًا والمنحدر خطيًا بشكل فعال لعدة دقائق أو أكثر8.

في العصور المبكرة، والنوافذ يحيط التقاط جميع neurofilaments التي تخرج من النافذة المركزية لأن هذه خيوط لم يكن لديك الوقت الكافي لتمرير من خلال النوافذ المرافقة والخروج منها على الجانب الآخر. في هذه الحالة ، يتم إعطاء كميات من البوليمر العصبي الفلوري التي تترك النافذة المركزية بشكل عصبي و رجعي في الثانية ، أي التدفقات Equation 19 و ، من خلال الزيادة في محتوى Equation 18 الليفية Equation 17 العصبية وفي النوافذ Equation 16 المرافقة. تطبيع إلى المحتوى الأولي من البوليمر العصبي فلوريسنت في النافذة المركزية، ومعدلات الزيادة في النوافذ المرافقة تصبح

Equation 15

Equation 14

حيث Equation 13 Equation 12 هي والمنحدرات من الزيادة في الفلوريسنس في النوافذ محيطة ويقونة، على التوالي.

وهكذا، يمكننا التعبير عن متوسط السرعة من حيث المنحدرات في النوافذ المرافقة، أي.

Equation 11      (Eq. 1)

ونسبة عدد الاعصاب المتحركة والرجعية من حيث نسبة هذه المنحدرات، أي.

Equation 10     (Eq. 2)

حيث Equation 9 Equation 8 ويعني معدلات التي neurofilaments عكس من anterogradely إلى تتحرك بالعكس والعكس بالعكس8. ويمكن تحديد قيم Equation 7 ويمكن Equation 6 قياس حركة الاعصاب الفردية في الخلايا العصبية المستزرعة، كما ذكرت سابقا17. الأهم من ذلك ، فإن التعبير عن السرعة في Eq. 1 ينطبق فقط في أوقات قصيرة بعد التنشيط خلالها الفلورسنت neurofilaments تدخل النافذة الجناحية ولكن لا تترك. مدة هذه الفترة الزمنية القصيرة سوف تعتمد على طول النوافذ المرافقة وحركة العصبية. كلما طالت النوافذ المُحيطة، من حيث المبدأ، كلما طالت النافذة الزمنية. نظريا، يمكن للمرء أن اختبار أن يتم استيفاء هذا المعيار من خلال التأكد من أن

Equation 5     (Eq. 3)

على النقيض من التعبير عن السرعة في مكافئ 1، الذي يعطى من خلال الفرق بين المنحدرات في النوافذ المرافقة، والتعبير عن الاتجاه في Eq. 2 قوي إلى حجم النافذة المحاطة لأنه يعطى بنسبة المنحدرات في النوافذ المرافقة.

ويبين الشكل 3 النتائج التمثيلية من تجارب الهروب النبضي وانتشار النبض على المحاور النخاعية المُوَحَكة في العصب التيبّي للفأر الذكر البالغ من العمر 8 أسابيع من خط hThy1 paGFP-NFM على خلفية C57Bl/6J، باستخدام أحجام النوافذ البالغة 5 و40 ميكرومترًا، على التوالي. وقد استخدمت الفئران من عمر 2 أسابيع على الأقل، سواء الذكور والإناث، لهذه النماذج التجريبية. يجب أن يحدد الباحث السن والجنس المناسبين حسب ما يجري اختباره في الدراسة. مع مرور الوقت، يمكن أن ينظر إلى أن حواف المناطق تنشيط طمس بسبب رحيل الاعصاب في كل من الاتجاهين التيروغرادي والرجعي، مما أدى إلى فقدان الفلوريسنس من النافذة المركزية.

لطريقة النبض والهروب (الشكل 3A, C, E) ، يمكن أن ينتج عن حركية التحلل الفلوري في المنطقة المنشطة معلومات عن السلوك التوقف طويل الأجل وقصير الأجل8،18. بالنسبة لهذه التجارب، يمكن أن تكون المنطقة المنشطة قصيرة (نستخدم عادة 5 ميكرومتر؛ انظر المربع الأصفر في الشكل 3A). لطريقة انتشار النبض(الشكل 3B, D, F),نستخدم منطقة أطول تنشيط (40 ميكرومتر هنا؛ انظر المربع الأصفر في الشكل 3B)من أجل توفير مجموعة أكبر من الفلورسنت الليفية. وهذا يطيل الوقت الذي تظل فيه الزيادة المفلورة في المناطق الأجنحة خطية (انظر أعلاه). المجال الخطي لهذه الزيادة في الفلوريسنس في النوافذ المرافقة يمكن أيضا أن تزيد من خلال زيادة طول هذه النوافذ، ولكن هذا محدود من حجم مجال الرؤية. استخدمنا 15 μm يحيط النوافذ، ويظهر باللونين الأحمر والأخضر، للبيانات المعروضة في الشكل 3D.

ويبين الشكل 3هاء،3 واو القياس الكمي لشدة الفلورس (أي مجموع كثافة البكسل) لنوافذ القياس المبينة في الشكل 3C، 3D على التوالي. لطريقة النبض والهروب الاضمحلال هو ثنائي الطور، مع اضمحلال أسي الأولي الذي يمثل رحيل الليفية العصبية على المسار الصحيح. هذا التحولات في حوالي 10-20 دقيقة إلى ثاني أبطأ تسوس الأسي الذي يمثل تعبئة ورحيل خيوط خارج المسار8. للمقارنة مع طريقة انتشار النبض، نعرض فقط 12 دقيقة في دورة الوقت الشكل 3E، ولكن عادة ما يكون الوقت من التحليل يجب أن يكون أطول (عادة 30-120 دقيقة) لالتقاط المدى الطويل التوقف حركية5،6،18. بالنسبة لاستراتيجية انتشار النبض، تعتمد حسابات سرعة الحركة واتجاهها فقط على المنحدرات في النوافذ المرافقة. بالنسبة لأطوال النوافذ المستخدمة هنا، تمتد المرحلة الخطية لمدة 5 دقائق. وينبغي تقييم مدة هذه النافذة الزمنية للطول الخطي بتقصير الوقت المستخدم في قياس الميل، وتحديد النقطة التي لم يعد الميل يزيد فيها. يمكن زيادة هذه المدة بزيادة أطوال النافذة إذا كان مجال الكاميرا يسمح، على الرغم من أن أطوال الإطار يجب أن تكون ثابتة لكافة المحاور في تجربة معينة. على سبيل المثال، استخدمنا أول 5 دقائق من البيانات لقياس المنحدرات لبيانات انتشار النبض في الشكل 3F. وينتج عن ذلك منحدرات من 72 A.U./min، -594 A.U./min، و111 A.U./min للنوافذ القريبة والمركزية والقاصة، على التوالي (A.U. = الوحدات التعسفية). من أجل تطبيع هذه القيم، يتم تقسيمها بواسطة الفلوريس الأولي للنافذة المركزية، مما يؤدي إلى معدلات 0.108% F0/min، -0.962% F0/min و 0.173% F0/min. تطبيق Eq. 3 نجد أن معيار الحفظ لم يتم الوفاء به، مما يدل على أننا لا نلتقط كل الفلوريسنس في النوافذ المرافقة. وهذا هو القيد التقني نظراً لمجال الرؤية لدينا EMCCD الكاميرا (82 μm x 82 μm). الكاميرات مع رقائق sCMOS، والتي يمكن أن يكون لها مجالات أكبر بكثير من الرؤية، يمكن أن تسمح باستخدام أحجام أكبر نافذة الجناحة. ومع ذلك، لا يمكننا استبعاد إمكانية أن يكون هذا التناقض بين المنحدرات الوسطى والمنحدرات المرافقة راجعاً أيضاً، على الأقل جزئياً، إلى التقليل من شأن مدى التطوّر الضوئي (انظر المناقشة)، الأمر الذي من شأنه أن يؤدي إلى التقليل من شأن المنحدرات الإيجابية في النوافذ المرافقة والمبالغة في تقدير المنحدر السلبي في النافذة المركزية.

من المعدلات في النوافذ المرافقة (% F0/min) و Eq. 2 أعلاه، وباستخدام قيم Equation 4 و Equation 3 17، نحسب النسبة Equation 2 = 2.12. وهذا يشير إلى أن 68٪ من الخيوط كانت تتحرك anterograde و 32٪ إلى الوراء. باستخدام نفس المعدلات والمكافات 1 أعلاه، نحسب متوسط صافي سرعة السكان Equation 1 = 40*(0.00173-0.00108) = 0.026 ميكرومتر/دقيقة، أو 0.037 مم/يوم. وقد أفادت دراسات وضع العلامات النبضية الإشعاعية في الفئران من عمر مماثل عن سرعة سكانية عصبية تبلغ حوالي 0.6 مم/يوم في الأجزاء القريبة من العصب الوركي، وتتباطأ إلى 0.12 مم/يوم على مسافة سنتيمترين19،20. تم جمع بيانات انتشار النبض لدينا في العصب التيبالي، ما يقرب من 2-3 سم آخر من هذه التدابير. للأسباب المذكورة أعلاه، ونحن نعتقد أن تقدير 0.037 مم / يوم هو بخس للسرعة الحقيقية. ومع ذلك، فإن استقراء التباطؤ المكاني الذي لوحظ بواسطة وضع العلامات النبضية الإشعاعية في العصب التيببي هذا التقدير ليس غير معقول، خاصة عندما نرى أنه تم تحديده باستخدام منهجية مختلفة جدا على نطاق مكاني وزمني مختلف جدا.

وللتدليل على قدرة طريقة انتشار النبض على اكتشاف الاختلافات الكبيرة بين السكان، قارنا منحدرات النوافذ القريبة والقريبة المحاطة التي تقاس من الأعصاب المُحاطة بكل من السالين الطبيعي والمثبط. تثبيط تحلل كتلة حركة التحلل العصبي، كما أبلغنا سابقا5،6،7. سنناقش في وقت لاحق اختيار أحجام العينة للتجارب، ولكن هنا استخدمنا عصب واحد في المالحة العادية واثنين في المالحة المثبطة، وذلك بسبب الحد من حقل اقتناء واحد لكل عصب أثناء تثبيط. ويبين الشكل 4A مثالاً على الوقت من العصب المثبطة للجليكجليك، مما يدل على انخفاض واضح في النقل خارج المنطقة المنشطة. في الواقع، نجد منحدرات أقل بكثير وقريبة(الشكل 4B،ع = 0.00000639 و 0.0121، على التوالي، مقارنة توكي زوج بعد ANOVA) في الأعصاب تعامل مع المالحة المثبطة مقابل تلك التي تُطعّم بالملوحة العادية. كما نجد انخفاضاً كبيراً في سرعة السكان بين هذين الشرطين(الشكل 4C،p = 0.0232، t-test مع الفروق غير المتكافئة، بعد اختبار F للتباين المتساوي مع p = 0.0190).

Figure 1
الشكل 1: غرفة الضخ. (أ) رسم بياني يبين تجميع غرفة الضخ و طوقا خارجيا، مع أنابيب متصلة بالمحاقن المالحة وقارورة النفايات. (ب) رسم بياني يبين تجميع الغرفة نفسها. يتم وضع طوقا الداخلية شقة على رأس #1.5 coverslip. يتم وضع العصب على غطاء في البئر التي تم إنشاؤها من قبل افتتاح مستطيلة من طوقا الداخلية. يتم وضع الشريحة microaqueduct على العصب لشطيرة العصب بين #1.5 coverlip وشريحة microaqueduct. وأخيرا، يتم قلب شطيرة قبل تصاعد على رأس طوقا الخارجي من الجمعية هو مبين في (A) وتأمينها مع قفل حلقة (غير مبين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد العصب التيبالي. (أ)صورة تبين موقع العصب التيبالي داخل ساق الماوس، حيث تم إزالة عضلات الرأسية الغليوتية السطحية، والفيموري، وsedendinosus، وpbiliteus، وcaudalis tibialis وعضلات الفلوس ذات الرقمين المرن. يمكن النظر إلى العصب التيبالية على أنه واحد من ثلاثة فروع رئيسية من العصب الوركي الناشئة في الركبة. (B) تخطيطي من العصب في المقطع العرضي في غرفة تجميعها، وتبين الهدف النفط الغمر تحت الغطاء. يتم الحصول على أفضل نوعية بصرية عن طريق تفعيل وتصوير طبقة من محاور عصبية apposed على سطح الغطاء; جودة الصورة تنخفض أعمق في العصب بسبب تشتت الضوء. (C) أمثلة على محور عصبي صحي (أعلى) ، ومحور عصبي غير صحي (أسفل) مباشرة بعد التنشيط. الخط الأصفر المتقطع يمثل المنطقة التي تم تنشيطها. الفلورس المنشط له حدود حادة في محور عصبي صحي في حين أنه في محور عصبي غير صحي الفلورس المنشط ينتشر بسرعة من المنطقة المنشطة، وملء محور عصبي في غضون ثوان. شريط مقياس = 10 ميكرومتر. (D) أمثلة على ظهور الميتوكوندريا في محور عصبي صحي (أعلى) ومحور عصبي غير صحي (أسفل). الميتوكوندريا مرئية بسبب الفلافين autofluorescence16. تظهر هذه المكونات الخطية (رؤوس الأسهم الصلبة) في محاور عصبية صحية. في المحاور غير الصحية ، والميتوكوندريا تصبح أولا punctate (فتح رؤوس الأسهم) ، ثم بعد ذلك fainter مع مرور الوقت ، وتوفير مؤشر على صحة محور عصبي. يشير رأس السهم المفتوح المتقطع في محور عصبي صحي إلى انتقال الميتوكوندريون من خطي إلى دقيق. شريط مقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تجارب الهروب النبضي وانتشار النبض. مثال على ما قبل التنشيط، ما بعد التنشيط والصور timelapse من المحاور النخاعية في العصب التيبى من 8 أسابيع من العمر الماوس في (A) تجربة نبض الهروب و (B) تجربة انتشار النبض. صورة ما قبل التنشيط هي اللوحة العلوية، مع صور ما بعد التنشيط أدناه.  تظهر الطوابع الزمنية الوقت المنقضي بعد التنشيط. تمثل المربعات الصفراء المنطقة التي تم تنشيطها. وقد تم تنفيذ هذه التنشيطات باستخدام 5 عمليات مسح مع 40 بكسل وقت يسكن و 5٪ قوة الليزر. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. (C) قياس ROIs (أصفر) لثلاثة محاور في تجربة الهروب النبض. (د)قياس الـ ROIs (الأحمر) أو الوسطي (الأصفر) أو الأصفر (الأخضر) لثلاث محاور في تجربة انتشار النبض. يتم عرض قياس ROIs لكل محور عصبي باللون الأحمر الصلب (القريب)، والأصفر الصلب (النافذة المركزية) والأخضر الصلب (نافذة القاصي). (E) مؤامرة من الفلوريسنس المتوسط مقابل الوقت، متوسط المحاور 3 في خط C. Dashed هو وظيفة الأسي تناسب البيانات، من النموذج Ft = Ae-τt، كما هو موضح سابقا7. و) المؤامرات من الفلورانس في وسط، وقريبة ROIs مقابل الوقت، متوسط 14 محاور بما في ذلك محاور عصبية ثلاثة في D. يتم حساب المنحدر من خطوط الاتجاه التي تناسب أول 5 دقائق من البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تأثير مثبطات الأيض على نقل الليفية العصبية. (أ)مثال على الصور timelapse من العصب قبل المعالجة مع 5.6٪ (ث / الخامس) 2-deoxy-الجلوكوز و 0.5 mM الصوديوم iodoacetate لمنع تحلل الغلاء ونضوب ATP الخلوية. لاحظ أن الحدود البعيدة والقريبة للمناطق المنشطة تظل حادة، مما يدل على تثبيط نقل الليفية العصبية. شريط مقياس = 10 ميكرومتر.(ب)القياس الكمي للمنحدرات في النوافذ الخراجية (D) وقريبة (P) التي تحيط (anterograde و retrograde على التوالي)، التي تم التعبير عنها في نسبة مئوية من الفلورس في النافذة المركزية (%F0/min)،من عصب واحد (14 محوراً) باستخدام محلول ملحي قياسي ومن أعصابين (8 محاور) مُسبقة مع الملح الملحي الذي يحتوي على مثبطات الغليكوليك. (C)السرعات السكانية العصبية المحتسبة من المنحدرات في النوافذ المرافقة، مما يدل على انخفاض كبير في السرعة بعد العلاج بالمثبطات. - p < 0.005; ** - ف < 0.01; * - ص < 0.05. وتظهر البيانات ضعف كبير في نقل الاعصاب في وجود مثبطات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويجب توخي الحذر في تحليل تجارب الهروب النبضي وانتشار النبض لأن هناك إمكانية كبيرة لإدخال الخطأ أثناء المعالجة اللاحقة، ولا سيما أثناء التصحيح في الميدان المسطح، ومحاذاة الصور، وتصحيح التبييض. تصحيح الحقل المسطح ضروري لتصحيح عدم التوحيد في الإضاءة ، مما يؤدي إلى سقوط في كثافة عبر مجال الرؤية من المركز إلى المحيط. ومدى عدم التوحيد يعتمد على الطول الموجي، وبالتالي ينبغي أن يتم دائماً على طول الموجة الذي سيستخدم في الحصول على البيانات التجريبية. من المهم التأكد من أن عدم التوحيد في صورة الحقل المسطح يمثل حقا عدم التوحيد في الصور التي سيتم تصحيحها. تجارب انتشار النبض معرضة بشكل خاص للخطأ من تصحيح الحقل المسطح غير السليم لأن قياس ROIs يمتد نحو محيط الصورة حيث تكون شدة السقوط أكبر.

تختلف إعدادات التنشيط الأمثل paGFP حسب أسلوب التنشيط ومعلمات الليزر، ويجب تحديدها تجريبيًا قبل جلسة التصوير الأولى. سوف يؤدي التنشيط القليل جداً إلى نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة لفلوريسنس المنشط، في حين أن الكثير من النتائج سوف يؤدي إلى تبييض الفلورسينت المنشط لأن كلاً من paGFP غير المنشط والمفعول يمكن أن يكون متحمسًا بالضوء البنفسجي. لإضاءة انتقائية منطقة من الاهتمام في الصورة، ونحن نستخدم الماسح الضوئي أندور FRAPPA ليزر galvo، الذي يولد منطقة محددة بوضوح من التألق مع حدود حادة، كما هو مبين في النتائج التمثيلية. لقد كان لدينا أيضا النجاح باستخدام الحجاب الحاجز الرقمي الفسيفساء Andor، وهو جهاز micromirror الرقمية، مع مصباح قوس الزئبق كمصدر الإضاءة7. خيارات أخرى متاحة تجاريا. وهناك تحد عند العمل مع paGFP هو الزيادة المتأخرة في كثافة الفلوريسين التي تحدث في غضون 1 دقيقة بعد خطوة التنشيط الضوئي. تحدث هذه الزيادة لأن الإضاءة مع الضوء البنفسجي يسبب نسبة من الجزيئات paGFP تنشيط للدخول في "حالة مظلمة" التي يمكن أن الاسترخاء مرة أخرى على مدى زمني من عشرات الثواني11. في تجربتنا، وزيادة عادة ما تكون أقل من 5٪ مع الإثارة widefield ولكن يمكن أن تتجاوز 20٪ مع الإثارة بالليزر، والتي يمكن أن تؤدي إلى التقليل من شأن كبير من الفلورسينكين المنشط. نحن نحاسب على ذلك عن طريق الحصول على صورة ثانية "بعد التنشيط" لـ paGFP fluorescence بعد دقيقة واحدة من التنشيط الضوئي ، ثم استخدام هذه الصورة كنقطة مرجعية للمهلة اللاحقة. ومع ذلك، من المهم أن ندرك أن هذا لا يدخل مصدرا محتملا آخر للخطأ في تحديد الفلور الأولية و حركة الاضمحلال في أوقات مبكرة.

يجب إيلاء اهتمام إضافي لمحاذاة مكدسات الصورة. المصدر الرئيسي للانساد هو الانجراف أو حركة أخرى للعينة أثناء الحصول على صورة الوقت. ويمكن التقليل من هذا باستخدام الحشيات الداخلية من سمك المناسبة والسماح للتحضير "في تسوية" قبل التصوير. ومع ذلك ، فإن أي تأخير من هذا القبيل يقلل من الوقت المتاح للحصول على الصور لأن الإعداد له نافذة محدودة من البقاء. من المهم أيضا تجنب خوارزميات المحاذاة التي تشوه الصورة أو إدخال تحولات بكسل الفرعية، كما أن هذه الإجراءات إعادة تشكيل كثافة بكسل في الصورة. والتجارب التي تُنْشر النبض معرضة بشكل خاص للأخطاء الناجمة عن المحاذاة غير السليمة لأن حدود منطقة الفلورس المنشط حادة نسبياً، كما أن الفلورانس في هذه المنطقة أعلى بكثير من المناطق غير المفعّلة. حتى عدم محاذاة طفيفة من الطائرات صورة في المكدس يمكن أن يؤدي إلى قفزات كبيرة في القيم الفلورية في الإطارات قياس القعدة وقريبة. وبالتالي، من الضروري أن يتم محاذاة مجموعات الصور بشكل صحيح وتفتيشها بعناية قبل الشروع في التحليل.

تصحيح لphotobleaching ضروري لضمان أن التغيرات في كثافة الفلوريسنس مع مرور الوقت تعكس بدقة التغيرات في كمية البروتين الفلورسنت. ويمكن أن تكون هذه التصحيحات مصدرا هاما للخطأ في تقدير شدة الفلورا المطلقة في النوافذ المركزية والنوافذ المرافقة. كما حركية الإضاءة الضوئية تعتمد على شدة الإضاءة والبيئة من الفلوروفور، يمكن أن تختلف معدلات الإضاءة الفعلية بين الدورات ومن محور عصبي إلى محور عصبي. وبالتالي، فمن الضروري لقياس محاور متعددة ومتوسط البيانات الناتجة، والتي هي نفسها إدخال بعض الخطأ. النهج المذكور أعلاه هو علاج العصب مع مثبطات جليكوليك ومن ثم تنشيط الفلوريسنس في منطقة ذات فائدة وتتبع فقدان كثافة الفلوريسنس مع مرور الوقت. مثبطات الغليكوليك تستنفد ATP وبالتالي تمنع نقل الليفية العصبية بحيث يكون فقدان الفلوريسين يرجع بالكامل إلى التنضيح وليس حركة الليفيات العصبية خارج المنطقة المنشطة. ثم يتم استخدام متوسط حركية التبييض المحددة بهذه الطريقة لتصحيح البيانات التجريبية. بما أنه ليس من العملي إجراء معايرة تبييض منفصلة في كل جلسة تصوير، يجب تطبيق معايرة واحدة على جلسات متعددة موزعة على عدة أسابيع. ومن عيوب هذا النهج أنه لا يفسر الاختلافات في كثافة الطاقة الليزرية/الإضاءة من يوم إلى يوم، وهو ما ينبغي مراقبته. وهناك نهج بديل، نشير إليه باسم "تصحيح التبييض الجوهري"، هو تقدير الوضوح الضوئي عن طريق قياس الفلورسين في وسط المنطقة المنشطة في نفس أفلام الوقت التي تستخدم لقياسات النقل. إذا كانت منطقة القياس هذه في موقع مركزي وأقصر بكثير من طول المنطقة المنشطة ، ثم في أوقات قصيرة سيتم استبدال أي اعصاب فلورية تنتقل من منطقة القياس بـ الليفيات العصبية الفلورية التي تنتقل إليها. ومع ذلك، مع مرور الوقت، يزيد احتمال انتقال الليفية العصبية غير الفلورية إلى منطقة القياس من المناطق غير الفلورية من محور التركيز، مما يؤدي إلى المبالغة في تقدير فقدان الفلوريسنس بسبب التبييض. وميزة هذا النهج هي أنه يصحح خصائص التبييض داخل هذا المجال نفسه، ولكن العيب هو أن مدة النافذة الزمنية يجب أن تحدد تجريبيا وستتوقف على معدل النقل وكذلك على طول المنطقة المنشطة. كل هذا وقد قيل ، تجدر الإشارة إلى أن تقدير اتجاه النقل العصبي باستخدام طريقتنا قوي لأخطاء التبييض (كما هو الحال بالنسبة لحجم النافذة المحاطة) لأنه يتم من خلال نسبة المنحدرات في النوافذ المرافقة وأي تصحيح للتبييض هو مضاعف يطبق على كل من البسط والمقام في تلك العملية الحسابية.

نظرا للضوضاء الكامنة في نظام الفلورسنت واحتمال حدوث خطأ إضافي يضاف خلال خطوات ما بعد المعالجة الصورة المذكورة أعلاه، من المهم استخدام أحجام عينة كبيرة لقوة إحصائية كافية. وفي حين أنه ليس من الممكن تحديد الوسيلة السكانية، والانحرافات وأحجام التأثير بدقة قبل التجريب، فإننا نوصي باستخدام طريقة كوهين21 بافتراض أن يكون حجم التأثير المتوسط وألفاً 0.05. وهذا يؤدي إلى دكوهين ، وهو الفرق في وسائل مقسومة على الانحراف المعياري المجمع لكلا السكان ، من 0.5 ، مما يشير إلى الحصول على ما لا يقل عن 105 عينات لكل مجموعة. وبمجرد بلوغ هذه العتبة، يمكن للمرء أن يجري تحليلاً بعد مخصصاً للطاقة لإعادة تقييم القوة الإحصائية في ضوء التدابير السكانية الفعلية. في ظل الظروف التجريبية المثلى، ينبغي أن يكون من الممكن الحصول على من 1-7 محاور قابلة للتحليل (من أصل 9-20 محاور إجمالية) لكل تنشيط، و5-8 تنشيط لكل عصب على افتراض الحصول على 10 دقائق من الوقت لكل تنشيط.

كما استخدمت الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات الانصهار الفلورية التي تستهدف الميتوكوندريا أو حويصلات لدراسة النقل المحوري للعضيات الميكبرانية في الأعصاب الطرفية السابقة vivo22,23,24,25. وبالإضافة إلى ذلك، وضعت مختبر شيافو نهج لتصوير النقل المحوري لتحريك برجعية organelles membranous في محاور عصبية في vivo باستخدام شظايا السم الكزاز الموسومة بالفلورسنت، والتي يمكن حقنها في العضلات ويتم تناولها من قبل محطات الأعصاب الحركية26. ومع ذلك، بما أنه يمكن حل العضيات المُمَرَسة في هذه المحاور بواسطة المجهر المفلور، فمن الممكن تحليل سرعة وتواتر حركتها مباشرة باستخدام تحليل اللاسة الزمنية أو التحليل الكيميائي. وقد تم تطوير أساليب الهروب النبضي وانتشار النبض الموصوفة هنا بهدف محدد هو تحليل حركية نقل الليفية العصبية في هذه المحاور ، والتي لا يمكن فيها حل الليفيات العصبية الفردية. وهذا يتطلب تحليلاً على مستوى السكان على مدى دقائق أو عشرات الدقائق. نحن نستخدم فأرًا محورًا لهذا الغرض ، ولكن يجب أيضًا أن يكون من الممكن التعبير عن البروتين القابل للتكد ٍ في التصوير الضوئي باستخدام طرق مثل التهيّل الفيروسي أو في الإلكتروبورات الرحمية. في حين أن التركيز كان نقل الليفية العصبية، يمكن أيضا أن تكون تكييفها وسيلة الهروب النبضي والنبضية لتتناسب مع دراسة حركة البروتينات الأخرى من الهيك الهيكلية والخليوسيلية التي يتم نقلها على طول محاور في المكونات البطيئة من نقل محور عصبي. نحن نحصر تحليلاتنا على المحاور المحورية المنخاعية لأن حجمها وغلم المايلين يسمح لنا بحلها من جيرانها. لا يمكن حل المحاور غير المُلَكَمة بسبب صغر عيارها وميلها إلى التجمع في حزم Remak. نحن وصف استخدام الأعصاب التيبية السابقين vivo ولكن ينبغي أن تكون أساليب أيضا قابلة للتطبيق على الأعصاب الطرفية الأخرى التي هي طويلة بما فيه الكفاية (> 5 ملم) وغير مفّر. من حيث المبدأ، ينبغي أيضا أن يكون من الممكن تكييف هذه الأساليب لنقل الصورة العصبية في الجسم الحي (على سبيل المثال، عن طريق تعريض جراحيا العصب في فأر مخدر ومن ثم وضع الماوس على مرحلة المجهر).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويود أصحاب البلاغ أن يشكروا بولا مونسما على التعليم والمساعدة في المجهر المجهري والتشريح العصبي التابي، والدكتور أتسوكو أوشيدا، وكلوي دوجر، وصناء شانده للمساعدة في تربية الفار. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المؤسسة الوطنية للعلوم التعاونية IOS1656784 إلى A.B. و IOS1656765 إلى P.J.، والمعاهد الوطنية لمنح الصحة R01 NS038526، P30 NS104177 وS10 OD010383 إلى A.B. N.P.B. تم دعمها من قبل زمالة من برنامج جامعة ولاية أوهايو للعلماء ما بعد الدكتوراه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm Bioptechs 1907-1422-100 inner gasket
2-deoxy-D-glucose Sigma D6134
30mm Round Gasket w/ Holes Bioptechs 1907-08-750 outer gasket
35 x 10mm dish Thermo Fisher 153066 dissection dishes
40mm round coverslips Bioptechs 40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip BD 309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system Andor outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride Fisher C79
Coverslips Fisher 12-541-B for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution Sigma G8769
Dissecting pins Fine Science Tools 26001-70
Dissection forceps Fine Science Tools 11251-30 fine tipped forceps
Dissection microscope Zeiss 47 50 03
Dissection pan with wax Ginsberg Scientific 568859
Dissection scissors Fine Science Tools 14061-09 initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber Bioptechs 060319-2-03
Fluorescein sodium Fluka 46960
Inline solution heater Warner Instruments SH27-B
Laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20 initial dissection forceps
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Microaqueduct slide Bioptechs 130119-5
Microscope slides Fisher 12-544-3 for fluorescein slide
Microscope stage insert Applied Scientific Instrumentation I-3017
Objective heater system Okolab Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A Nikon discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective Nikon MRD01901
Potassium chloride Fisher P217
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P0662
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium iodoacetate Sigma-Aldrich I2512
Syringe pump Sage Instruments Model 355
Tubing adapter - female Small Parts Inc. 1005109
Tubing adapter - male Small Parts Inc. 1005012
Tygon tubing Bioptechs 1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15018-10 fine scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
  2. Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  3. Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
  4. Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
  5. Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
  6. Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
  7. Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
  8. Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  10. Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
  11. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  12. Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
  13. Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
  14. Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
  15. Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
  16. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
  17. Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
  18. Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
  19. Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
  20. Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
  21. Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).
  22. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  23. Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
  24. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  25. Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
  26. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).

Tags

علم الأعصاب، الإصدار 162، النقل المحوري، الليفية العصبية، تنشيط ضوئي، انتشار النبض، الهروب النبضي، العصب، المجهر confocal
التصوير والتحليل لنقل الليفية العصبية في العصب الذبي الماوس المخزّن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., … More

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve. J. Vis. Exp. (162), e61264, doi:10.3791/61264 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter