Summary
Vi beskriver fluorescens fotoaktivation metoder til at analysere axonal transport af neurofilamenter i enkelt myelinerede axoner af perifere nerver fra transgene mus, der udtrykker en fotoaktivatable neurofilament protein.
Abstract
Neurofilament protein polymerer bevæge sig langs axoner i den langsomme komponent af axonal transport ved gennemsnitlige hastigheder på ~ 0,35-3,5 mm / dag. Indtil for nylig studiet af denne bevægelse in situ var kun muligt ved hjælp af radioisotopisk puls-mærkning, som tillader analyse af axonal transport i hele nerver med en tidsmæssig opløsning af dage og en rumlig opløsning af millimeter. For at studere neurofilament transport in situ med højere tidsmæssig og rumlig opløsning, udviklede vi en hThy1-paGFP-NFM transgen mus, der udtrykker neurofilament protein M mærket med fotoaktivatable GFP i neuroner. Her beskriver vi fluorescens fotoaktivation puls-escape og puls-spredning metoder til at analysere neurofilament transport i enkelt myelinerede axoner af skinneben nerver fra disse mus ex vivo. Isolerede nerve segmenter opretholdes på mikroskopet fase ved perfusion med iltet saltvand og afbildet ved spinning disk konfokal fluorescens mikroskopi. Violet lys bruges til at aktivere fluorescens i et kort axonal vindue. Fluorescensen i de aktiverede og flankerende regioner analyseres over tid, hvilket gør det muligt at studere neurofilamenttransport med henholdsvis tidsmæssig og rumlig opløsning i rækkefølgen af minutter og mikron. Matematisk modellering kan bruges til at udtrække kinetiske parametre for neurofilament transport, herunder hastighed, retningsbestemt bias og pauser adfærd fra de resulterende data. Puls-escape og puls-spredning metoder kan også tilpasses til at visualisere neurofilament transport i andre nerver. Med udviklingen af yderligere transgene mus, kunne disse metoder også bruges til at afbilde og analysere axonal transport af andre cytoskeletal og cykliske proteiner i axoner.
Introduction
Den aksonale transport af neurofilamenter blev først demonstreret i 1970'erne ved radioisotopisk pulsmærkning1. Denne fremgangsmåde har givet et væld af oplysninger om neurofilament transport in vivo, men det har relativt lav rumlig og tidsmæssig opløsning, typisk i rækkefølgen af millimeter og dage i bedstefald 2. Desuden radioisotopisk puls-mærkning er en indirekte tilgang, der kræver injektion og ofring af flere dyr til at generere en enkelt tid kursus. Med opdagelsen af fluorescerende proteiner og fremskridt i fluorescensmikroskopi i 1990'erne, blev det efterfølgende muligt at billedet neurofilament transport direkte i dyrkede neuroner på en tidsskala af sekunder eller minutter og med sub-mikrometer rumlig opløsning, der giver langt større indsigt i mekanismen for bevægelse3. Disse undersøgelser har vist, at neurofilament polymerer i axoner bevæger sig hurtigt og periodisk i både anterograde og retrograd retninger langs mikrotubule spor, fremdrives af mikrotubule motorproteiner. Men neurofilaments er diffraktion-begrænsede strukturer kun 10 nm i diameter, der typisk afstand bortset fra deres naboer med kun snesevis af nanometer; derfor kan polymererne kun spores i dyrkede neuroner, der indeholder sparsomt distribuerede neurofilamenter, så de bevægelige polymerer kan løses fra deres naboer4. Således er det ikke i øjeblikket muligt at spore enkelte neurofilamenter i axoner, der indeholder rigelige neurofilament polymerer, såsom myelinerede axoner.
At analysere axonal transport af neurofilamenter i neurofilament-rige axoner ved hjælp af fluorescens mikroskopi, vi bruger en fluorescens fotoaktivation puls-escape metode, som vi udviklede til at studere den langsigtede pauser adfærd neurofilaments i dyrkede nerveceller4,5. Neurofilamenter mærket med et fotoaktivatabelt fluorescerende neurofilamentfusionsprotein aktiveres i et kort segment af axon, og derefter kvantificeres afgangshastigheden af disse filamenter fra det aktiverede område ved at måle fluorescens henfaldet over tid. Fordelen ved denne tilgang er, at det er en analyse på befolkningsniveau af neurofilamenttransport, der kan anvendes på en tidsskala af minutter eller timer uden at skulle spore bevægelsen af individuelle neurofilamentpolymerer. For eksempel har vi brugt denne metode til at analysere kinetik af neurofilament transport i myelinating kulturer6.
For nylig har vi beskrevet udviklingen af en hThy1-paGFP-NFM transgene mus, der udtrykker lave niveauer af en paGFP-mærket neurofilament protein M (paGFP-NFM) i neuroner under kontrol af den menneskelige neuron-specifikke Thy1 promotor7. Denne mus tillader analyse af neurofilament transport in situ ved hjælp af fluorescens mikroskopi. I denne artikel beskriver vi de eksperimentelle tilgange til analyse af neurofilament transport i myelinerede axoner af tibial nerver fra disse mus ved hjælp af to tilgange. Den første af disse tilgange er puls-escape metode, der er beskrevet ovenfor. Denne metode kan generere oplysninger om neurofilamenters pauseadfærd, men er blind for den retning, hvori filamenterne afviger fra det aktiverede område, og tillader derfor ikke måling af nettoretningalitet og transporthastighed8. Den anden af disse tilgange er en ny puls-spread metode, hvor vi analyserer ikke kun tab af fluorescens fra den aktiverede region, men også den forbigående stigning i fluorescens i to flankerende vinduer, hvorigennem fluorescerende filamenter bevæger sig, da de afgår den aktiverede region i både anterograde og tilbageskridt retninger. I begge tilgange, parametre for neurofilament transport såsom den gennemsnitlige hastighed, netto directionalitet og pauser adfærd kan opnås ved hjælp af matematisk analyse og modellering af ændringerne i fluorescens i målevinduerne. Figur 3 illustrerer disse to tilgange.
Denne protokol viser dissektion og forberedelse af nerve, aktivering og billeddannelse af paGFP fluorescens, og kvantificering af neurofilament transport fra de erhvervede billeder ved hjælp af FIJI distributionspakke af ImageJ9. Vi bruger tibial nerve, fordi det er lang (flere cm) og ikke gren; i princippet er enhver nerve udtrykkelig paGFP-NFM dog egnet til brug med denne teknik, hvis den kan dissekeres og affjedre uden at beskadige axonerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra The Ohio State University.
1. Fremstilling af nervesynopløsning
- Gør 100 ml af Breuer's saltvand10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4,1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glucose, 23,8 mM NaHCO3 i dobbeltdestilleret vand.
- Boble 95% ilt/5% kuldioxid (carbogen) gennem saltvandsopløsningen i mindst 30 minutter før brug. Sidesten saltvand kan genbruges inden for en uge; det skal dog genoxygenated før hver brug.
- Hæld iltet saltvand i en 60 ml sprøjte og sørg for, at der er minimal luft tilbage i sprøjten.
2. Indledende samling af nerveperfusionskammer
- Tilslut sprøjten og slangen som vist i figur 1A, hvorudstrømningsrøret anbringes i en affaldskolbe.
- Placer den ydre pakning i perfusionskammerhuset, og sikring af, at strømningsindløb og udløbspæle flugter med hullerne i pakningen.
- Læg den indre pakning (silikone, 100 μm tyk) på en #1,5 cirkulær dækslæb (40 mm diameter), omhyggeligt udjævning eventuelle rynker i pakningen for at sikre en stram forsegling. For at lette senere montering, placere coverslip og pakning på en køkkenrulle eller opgave tørre med pakningen opad.
3. Dissektion og forberedelse af musetibial nerve
- Ofre dyret ved indånding af kuldioxid eller en anden institutionelt godkendt metode. Start en timer, når dyret ophører med bevægelse/vejrtrækning, da forsøg kun må udføres inden for 3 timer efter ofringen7.
- Spray pelsen med 70% ethanol og fjern så meget som muligt fra dyrets ben og ryg ved hjælp af en elektrisk barbermaskine.
- Ved hjælp af et par store dissektion saks, lave en rygsnit i huden nær midten af rygsøjlen og fortsætte snittet omkring ventrale aspekt af dyret. Startende fra dette snit, langsomt afspejler huden fra benene ved forsigtigt at trække den væk fra musklen og skære fascia.
- Placer dyret i en liggende position på en dissektion bakke og pin alle fire poter. Eventuelt pin halen for at reducere bevægelsen yderligere.
- Ved hjælp af microdissection saks, foretage et snit i låret muskler midtvejs mellem halen og knæet for at afsløre iskiasnerven. Sørg for, at nerven, som er synlig gennem musklen, ikke skæres.
- Udvid snittet dorsally og ventrally at fjerne musklen. Tilsvarende fjerne musklerne i kalven, holde nedskæringer lavvandede og korte for at undgå at beskadige nerve.
- Fjern musklerne, indtil tibialnerven er fuldt eksponeret fra det punkt, hvor den grene fra iskiasnerven (i knæet) til hælen (Figur 2A).
BEMÆRK: I alle trin, herunder og efter dissektion af tibialnerven, undgå unødvendig udsættelse for omgivende lys for at minimere mulig utilsigtet aktivering af paGFP i nerven. - Tag fat i den tibial nerve i rygsøjlen-proksimale ende med et par scefængre og skær nerven ved hjælp af et par microdissection saks. Pas på ikke at sætte spændinger på nerven, løfte den væk fra musklen, skære eventuelle vedhæftede filer.
- Skær rygsøjlen-distale ende af tibial nerve og overførsel til en lille petriskål af stuetemperatur iltet saltvand. Fra dette punkt på i proceduren, altid være sikker på at holde styr på de proksimale og distale ender af nerven.
BEMÆRK: En måde at gøre dette på er at markere nervens distale ende med et vinklet snit, så konusen er synlig. - Startende fra den proksimale ende af nerven, forsigtigt forstå de udsatte axon ender med et par meget fint tippet spån.
- Med et andet par spån, forstå nerven kappeproksmalt, og langsomt trække mod den distale ende af nerven. Nervehænglet vil glide langs axonerne med minimal modstand. Sørg for, at der ikke påføres unødig spænding i nerven under denne proces.
4. Endelig nerve perfusion kammer samling
- Gribe den proksimale ende af nerven, fjerne det fra saltvand og langsomt lægge det ned på coverslip af perfusion kammer i den rektangulære åbning af den indre pakning, opretholde blid spænding på nerven, som du lægger det ned, så det ligger lige.
- Placer mikroakvædukten glide over nerven med den rillede side vender mod nerven, og retningen af flow parallelt med nerven. Vend coverslip og mikroakvædukt samling over, og placere den i perfusion kammerhus med mikroakvædukt dias apposed til den ydre pakning. Nerven og den omgivende indre pakning vil nu blive klemt inde mellem coverslip og mikroakvædukt dias, som er adskilt af pakningen, med coverslip opad (Figur 1B).
- Fastgør perfusionskammeret ved at placere det i metalhuset og dreje låseringen. Sørg for, at plasthuset er helt under alle metalclips, og stram godt for at forhindre saltvandslækage. Overtightening kan knække mikroakvædukten dias eller coverslip. Vend kammeret over, så dæksprækket vender nedad.
- Langsomt trykke saltvand sprøjte stemplet til at fylde perfusion kammer. Hold indløbs- og udløbsslangen, udløbskolben og sprøjten hævet over selve kammeret på alle tidspunkter under opstilling og billeddannelse. Dette undgår opsugning, som kan indføre bobler eller forårsage fokus ustabilitet på grund af undertryk i kammeret.
- Overfør perfusionsenheden til et omvendt mikroskoptrin, og monter saltvandssprøjten i sprøjtepumpen. Motoren startes med en passende hastighed med en strømningshastighed på 0,25 ml/min. Tilslut og tænd derefter for in-line opløsningsvarmeren indstillet til 37 °C.
- Tilslut målvarmeren og sæt til 37 °C, anvende olie til målet, og indsæt perfusion kammer i scenen mount.
- Påfør olie på kammervarmeren pad og fastgør til perfusion kammer. Tilslut og tænd for kammervarmeren; til 37 °C.
BEMÆRK: Temperaturændringer kan medføre, at der dannes bobler i perfusionskammeret på grund af udgasning af opløsningen. Hvis der dannes bobler, skal opløsningsstrømningshastigheden kortvarigt øges med 5-10x, indtil boblerne rydder kammeret. - Lås perfusionskammeret ind i trinadapteren og bring den objektive olie i kontakt med dækslæbet på undersiden af kammeret.
BEMÆRK: Bioptechs kammer med ASI fase adapter, der anvendes her er designet til en omvendt mikroskop konfiguration.
5. Fluorescens aktivering og erhvervelse af billeder
- Brug brightfield belysning, fokusere på lag af axoner på den nederste overflade af nerven tættest på coverslip overflade (Figur 2B). Myelinerede axoner (typisk 1 - 6 μm i diameter hos voksne mus) kan identificeres ved tilstedeværelsen af en myelinskede, som er synlig under brightfield transmitteret lysbelysning uden kontrastforbedring. Schmidt-Lanterman kløfter og oder af Ranvier er også let synlige. Unmyelinerede axoner er mere slanke (typisk <1 μm diameter) og er generelt til stede i bundter (Remak bundter), hvor de generelt er for tæt apposed at blive løst fra hinanden.
- Hvis det er tilgængeligt på mikroskopet, skal du aktivere autofokussystemet for at bevare fokus i løbet af timelapse-billeddannelse.
- Få et brightfield-referencebillede. Optag nervens orientering (rygsøjle-proksimale og distale ender) med hensyn til billeder.
- Der anskaffes et konfokalt billede ved hjælp af en 488 nm laser og et emissionsfilter, der er egnet til paGFP (f.eks. 525/50 nm), til registrering af autofluorescensen før blegemiddel. Hold lasereffekten lav for at minimere fotobleaching, hvor eksponeringstiden justeres i overensstemmelse hermed for at registrere det svage signal. Som et eksempel, repræsentative data blev erhvervet på 5% laser magt og 4 s eksponeringer. Post anskaffelsesindstillingerne til brug i alle fremtidige eksperimenter.
BEMÆRK: Efter fotoaktivering vil de ideelle billedindstillinger give et signal-støj-forhold > 8 og fotobleaching på mindre end 25 % af det oprindelige signal i løbet af 20 billeder. Axonerne kan også afbildes af widefield epifluorescens mikroskopi, som vi gjorde oprindeligt7,men billedkvaliteten vil være ringere på grund af manglende konfocality. - Indstil lasereffekten til ca. 5 x normal billedeffekt, og anskaf et billede med en eksponeringstid på 3-4 minutter. Selvom det ikke er vigtigt, anbefales dette trin at blege autofluorescens og andre kilder til uønsket fluorescens for at reducere baggrundssignalet og dermed maksimere signal-til-støj af den fotoaktiverede fluorescens.
- Anskil et billede med de indstillinger, der bruges i trin 5.4, til at registrere automatisk aktivering efter dette blegningstrin.
- Tegn en linje parallelt med axonerne med en længde, der er lig med den ønskede aktiveringsvinduesstørrelse, på brightfield-billedet. Længden af dette vindue vil variere afhængigt af det eksperimentelle mål og parametre, men typiske længder er 5 μm for puls-escape paradigme og 40 μm for puls-spredning paradigme.
- Ved hjælp af denne linje som en vejledning, tegne en rektangulær region af interesse (ROI) på tværs af synsfeltet vinkelret på axonerne. Regionen skal omfatte alle de axoner, der skal fotoaktiveres.
- Bestem de optimale indstillinger for fotoaktivering med 405 nm belysning.
BEMÆRK: Udfør kun dette trin og undertrin før første eksperimentel aktivering. I løbet af et eksperiment skal der bruges de samme fotoaktivationsindstillinger.- Aktiver en interesseregion gentagne gange ved hjælp af 405 nm laserlinje, lav laser effekt (f.eks 5%), og pixel dvæle tid (f.eks 40 μs), og en puls, erhverve et billede af den aktiverede GFP fluorescens efter hver aktivering. Gentag indtil fluorescens ikke længere stiger, og derefter kvantificere fluorescens i et område af interesse for hvert billede.
- De gennemsnitlige fluorescensintensiteter i forhold til pulsnummeret afbildes. Vælg antallet af impulser, hvorefter fluorescens ikke længere stiger som det optimale antal impulser til aktivering.
- Aktiver den paGFP fluorescens regionen trukket i trin 5.8 ved mønstret excitation med 405 nm lys. Sørg for, at et billede er erhvervet lige før og lige efter aktivering.
BEMÆRK: Den ideelle paGFP aktivering vil producere et klart defineret område af fluorescens med skarpe grænser, der er indeholdt i investeringsafkastet. - Start en 1 minut timer som aktiveringen er færdig. I slutningen af 1 minut, begynde erhvervelse af en timelapse serie.
BEMÆRK: Forsinkelsen på 1 minut er nødvendig for at muliggøre den stigning i fluorescens, der observeres efter fotoaktivering af paGFP11. For pulsspredningsmetoden er en anskaffelsesperiode på 5-10 minutter med 30 sekunders timelapse-intervaller tilstrækkelig til måling af de første skråninger i de centrale og flankerende vinduer for at måle hastighed og retningsbestemthed. For pulse-escape-metoden tillader en anskaffelsesperiode på 30-150 minutter med 5 eller 10 minutters timelapse-intervaller analyse af filamentets langsigtede pauseadfærd - Gem alle de indtagne billeder samt det investeringsafkast, der bruges til fluorescensaktivering.
- Flyt til en ny region af nerve og gentag trin 5.1-5.11. Hvis den nye region er langs samme axon, skal det være mindst 500 μm fra det tidligere aktiverede område for at undgå påvisning af fluorescerende neurofilamenter, der flyttede ud af den anden aktiverede region. Anskaffelsen af den endelige timelapse skal afsluttes inden udgangen af 3 timers vinduet.
BEMÆRK: Det er muligt, at præparatet kan være levedygtigt i mere end 3 timer, men det har vi ikke bekræftet. Med dygtige dissektion og forberedelse, mellem fem og otte 10-minutters timelapse billedsæt kan erhverves inden for denne 3 timers vindue. - Efter den endelige timelapse billedserie er erhvervet, stoppe strømmen af saltvand, afbryde opløsningen og kammervarmere, og fjerne perfusion apparat fra mikroskop fase.
6. Flatfield og Darkfield billede erhvervelse
- Lav en opløsning af fluorescein ved at tilsætte 250 mg fluoresceinpulver til 0,5 ml dobbelt destilleret vand. Der blandes, indtil der ikke er synlige partikler, og opløsningen drejes i 30 sekunder i en bordpladecentrifuge for at sedimentere uopløst materiale. Denne opløsning kan opbevares i flere måneder ved 4 °C, hvis den er beskyttet mod lyseksponering.
- Der tilsættes 8 μL fluoresceinopløsning på et dias og påføres en #1,5 dækslet. Blot overskydende væske, forsegle med neglelak, og lad det tørre.
BEMÆRK: Ved denne høje koncentration slukker fluoresceinfarvens stærke absorption lysstrålen i opløsningen og frembringer et tyndt fluorescensplan på dækslets overflade, som er både ensartet og modstandsdygtig over for fotobleaching på grund af hurtig diffusiv udveksling12. - Placer fluorescein dias coverslip-side ned på den omvendte mikroskop fase og justere fokus på det tynde plan fluorescens på overfladen af coverslip. Flyt rundt på diaset for at finde et synsfelt, der ikke indeholder luftbobler (mørke pletter) eller store fluoresceinpartikler (lyse pletter).
- Ansk af en z-stack, der spænder over 6 μm med 0,2 μm-intervaller, så det midterste billede er det oprindelige fokusplan. Brug en kort eksponeringstid (f.eks. 40 ms), fordi fluorescensen vil være meget lys. Denne z-stack erhvervelse er nødvendig for at fange den maksimale fluorescens på tværs af synsfeltet som coverslip er sjældent perfekt vandret og planet fluorescein fluorescens er meget smal. Gentag dette for i alt 25 synsfelter, hvor stadiet flyttes med mindst 20 μm i en hvilken som helst retning mellem felterne.
- Luk alle lysstiskodder, herunder kameralukkeren, og indstil lasereffekten og eksponeringstiden til nul. Anskjne en stak på 100 billeder med disse indstillinger. Disse billeder vil blive gennemsnit for at generere darkfield billede, som vil blive brugt til at korrigere for mørk strøm og bias offset på kameraet chip.
BEMÆRK: Streaming erhvervelse er en ideel måde at fange disse billeder.
7. Billeddannelse glykolytisk hæmmede nerver til blegemiddelkorrektion
- Lav og oxygener en saltvandsopløsning som i trin 1; dog erstatte 2-deoxy-D-glucose for D-glucose og tilsættes 0,5 mM natrium iodoacetat for at hæmme glykolyse13. Vi kalder dette "hæmmende saltvand".
- Gentag trin 2-5 ved hjælp af det hæmmende saltvand med et 10-30 minutters timelapse-billede sat i trin 5.11. Tillad 40-50 minutter efter påføring af hæmmende saltvand før billeddannelse for at sikre fuldstændig hæmning af neurofilamenttransport.
BEMÆRK: Glykolytisk hæmning vil i sidste ende dræbe axonerne, så der er et smalt vindue af tid efter hæmning til at erhverve data, typisk omkring 30 minutter. En indikator for niveauet af metabolisk hæmning er flavin autofluorescens af axonal mitokondrier, som kan påvises i timelapse serien på grund af de lange eksponeringer, som vi bruger til at billedet paGFP fluorescens14. Typisk, mitokondrielle autofluorescens vil stige under behandling med hæmmende saltvand. Hvis mitokondrier begynder at runde op eller fragmentere, så ophøre billeddannelse.
8. Billedbehandling og -analyse ved hjælp af ImageJ
- Flatfield og darkfield korrektion
- Åbn darkfield-billedstakken, og æst billederne ved at klikke på Billede | Stakke | Z Projekt og valg af gennemsnitlig intensitet i rullemenuen for at generere darkfield-billedet.
- Åbn fluorescein flatfield-billedstakkene, og opret en maksimal intensitetsprojektion af hver (25 i alt) ved at klikke på Billede | Stakke | Z Projekt og valg af Max Intensitet i rullemenuen.
- Kombiner de resulterende 25 maksimale projektionsbilleder i én stak ved at klikke på Billede | Stakke | Billeder, der skal stables. Opret en gennemsnitlig intensitetsprojektion af denne stak ved at klikke på Billede | Stakke | Z Projekt og valg af gennemsnitlig intensitet i rullemenuen for at generere flatfield-billedet.
- Træk darkfield-billedet fra flatfield-billedet ved at klikke på Proces | Billedberegner, vælge Subtraktion som handlingen. Sørg for, at 32-bit (float) resultatindstillingen er markeret. Resultatet er det korrigerede flatfield-billede.
- Mål den gennemsnitlige pixelintensitet for det korrigerede flatfield-billede ved først at klikke på Analysér | Angiv målinger, og kontrol af feltet Middelgrå værdi, og tryk derefter på 'm'-tasten.
- Divider det korrigerede flatfield-billede med dets gennemsnitlige intensitet ved at klikke på Proces | Matematik | Divider og indtastning af den gennemsnitlige grå værdi, der er opnået i trin 7.1.5. Dette vil producere den omvendte gevinst billede.
- Åbn billederne forud for aktivering og efter aktivering sammen med timelapse-billedstakken. Kombiner billederne i en enkelt stak ved at klikke på Billede | Stakke | Redskaber | Sammenkæde , ogvælg billederne i kronologisk rækkefølge i rullemenuerne. Sørg for, at indstillingen Åbn som 4D-billede ikke er valgt. Den resulterende stak er det fulde billede sæt.
- Gentag trin 8.1.4 på det fulde billedsæt, og divider derefter resultatet med det omvendte forstærkningsbillede ved at klikke på Proces | Billedberegner og vælg Del som handlingen. Dette vil producere det korrigerede fulde billede sæt, hvor hvert billede er blevet korrigeret for den manglende ensartethed i området for belysning og på detektoren.
- Justering af billedstak
- Hvis du vil rette op på forskydning af billedfly i timelapse-serien på grund af trin- eller prøvedrift, skal du installere justeringen med fast regionsplugin (Supplerende fil 1) ved at klikke på Plugins | Installer PlugIn, navigere til den mappe, der indeholder plugin-filen, og vælge plugin. Genstart ImageJ efter installation af plugin.
BEMÆRK: Dette plugin justerer billeder baseret på princippet om "mindst kvadrater, der forener"15. - Tegn et investeringsafkast på det korrigerede fulde billedsæt, der spænder over flere axoner og ikke strækker sig ud over de proksimale og distale grænser for den aktiverede fluorescens i hver af axonerne. Regionens geometri er uden betydning, men ikke områder, hvor strukturer ændrer form eller størrelse, vil forbedre tilpasningen.
- Kør justeringsplugin ved at klikke på Plugins | Justering efter fast område. Plugin placerer en standard 2-pixel maksimum på forskydning mellem rammer, men dette kan justeres i den oprindelige pop-up-vindue, hvis der er betydelig drift af prøven. Justeringen kan tage flere minutter, afhængigt af størrelsen på billedstakken.
- Undersøg den justerede stak visuelt for at vurdere kvaliteten af justeringen. Nogle rammer skal derefter justeres manuelt, da den automatiske justering muligvis ikke fungerer godt for store udsving i fluorescens mellem rammer. Dette kan opnås, mens du ser en ramme, der skal flyttes ved at klikke på Billede | Transformering | Oversæt. Klik på Nej på følgende pop op-pop op og spørger, om hele stakken skal oversættes. Brug kun heltalspixelværdier i oversættelse, og sørg for, at rullemenuen til interpolation er indstillet til Ingen, da fraktioneret pixelskift eller interpolation vil ændre dataene på grund af gensampling af pixelintensiteterne.
- Gem dette som det justerede fulde billedsæt.
- Hvis du vil rette op på forskydning af billedfly i timelapse-serien på grund af trin- eller prøvedrift, skal du installere justeringen med fast regionsplugin (Supplerende fil 1) ved at klikke på Plugins | Installer PlugIn, navigere til den mappe, der indeholder plugin-filen, og vælge plugin. Genstart ImageJ efter installation af plugin.
- Måling af fluorescensintensiteter
- Tegn et investeringsafkast ved hjælp af vinkelværktøjet på den første ramme af det justerede fulde billedsæt med den første arm langs den ene kant af det aktiverede område, vinkelret på axonerne og den anden arm lodret. Tryk på 'm' for at måle vinklen, som beskriver retningen af axonerne i synsfeltet.
- Indstil billedernes skala, så dimensionerne måles i mikron ved at klikke på Analysér | Angiv Skaler og angiv de relevante værdier.
- Åbn roi-lederen ved at klikke på Analysér | Redskaber | Roi Manager. For puls-escape paradigme, springe til trin 8.3.7. For puls-spredning, fortsætte til trin 8.3.4.
- Tegn et kvadratisk investeringsafkast af alle dimensioner, og klik derefter på Rediger | Udvælgelse | Angiv. Sørg for, at indstillingen Skalerede units enheder er markeret, og indstil derefter investeringsafkastet til en bredde på 15 μm og en højde, der er lig med eller større end billedets højde.
- Roter investeringsafkastet med den vinkel, der blev målt i trin 8.3.1, ved at klikke på Rediger | Udvælgelse | Roter for at gøre den vinkelret på axonerne, og placer investeringsafkastet med den ene side langs den proksimale kant af det aktiverede område. Tilføj dette investeringsafkast, som vi refererer til som den proksimale guide ROI, til lederen ved at trykke på 't' tasten.
- Træk investeringsafkastet for at justere det distale kant af det aktiverede område, og føj til roi-lederen igen ved at trykke på tasten "t". Vi vil henvise til dette som den distale vejledning ROI. De proksimale og distale styre-RO'er vil senere blive brugt til at tegne de flankerende måle-ROI'er.
- Vælg axoner til kvantificering ved hjælp af den timelapse-billedsekvens, der er opnået i trin 5.11 ovenfor. Dette billede sekvens er nyttigt til dette formål, fordi det fanger den svage autofluorescens af axoner, afslører deres morfologi uden for den aktiverede region.
BEMÆRK: Axoner, der ikke opfylder følgende kriterier, er udelukket fra analysen:- Axonerne skal være i fokus langs hele længden af alle målevinduer.
- Axonerne skal være inden for 5° vinkelret på de proksimale og distale ender af aktiveringsområdet.
- Axoner må ikke have invaginationer inden for 5 μm af aktiveringsområdets proksimale og distale ender.
- Ekskluder axoner, der ændrer form synligt i løbet af billeddannelse.
- Ekskluder axoner, der forekommer usunde, hvilket fremgår af fraværet af et diskret aktiveret område i billedet efter aktiveringen (Figur 2C, nederst), da dette er tegn på diffusiv spredning af den aktiverede fluorescens, hvilket sker, når axonen dør.
- Overhold langtidseksponering blegning billede fra trin 5,5 for autofluorescerende strukturer i axoner. Denne fluorescens skyldes flavins inden for mitokondrier16. Ekskluder axoner fra analyse, hvis disse mitokondrier forekommer afrundede eller fragmenterede (Figur 2D, bund), i modsætning til udvidede, lineære strukturer (Figur 2D, top), da dette er en indikation af metabolisk tilbagegang.
- Ved hjælp af de proksimale og distale styre-RO'er, der er oprettet ovenfor, tegnes tre måle-RO'er pr. axon, der analyseres: et centralt vindue, der omfatter akslen i det aktiverede område på 40 μm, og to flankerende vinduer med bredde begrænset af flankerende vindue 15 μm ROI'er og højde begrænset af axonens diameter ved aktiveringsområdets kant. Føj alle tre områder til roi-chefen. For glykolytisk hæmmede axoner tegnes der et enkelt område, der ikke er mere end 5 μm bredt midt i det aktiverede område, og som ikke strækker sig uden for axonen. For puls-escape paradigme, den aktiverede region er kun 5 μm bred, så hele vinduet skal anvendes.
- Trin 8.3.9 gentages for alle aksler, der opfylder kriterierne i trin 8.3.7 og 8.3.8.
- Angive aktive målinger til gennemsnitlig pixelintensitet ved at klikke på Analysér | Angiv målinger, og vælg indstillingen Middelgrå værdi. Sørg for, at ingen andre måleindstillinger er markeret.
- Marker alle ROI'er i vinduet ROI Manager ved at markere vinduet og trykke på 'Ctrl' + 'a'. Klik på Mere i vinduet ROI Manager | Multi Foranstaltning til måling af fluorescensintensiteten. Kopier dataene fra resultatvinduet til et regneark for at få yderligere analyse.
- Angive aktive målinger til områdeområde ved at klikke på Analysér | Angiv målinger og vælg indstillingen Område. Sørg for, at ingen andre måleindstillinger er markeret.
- Gentag trin 8.3.12. Det er kun nødvendigt at kopiere en række af resultaterne for området, da området ikke varierer med tiden.
9. Photobleach korrektion
- I dataregnearket for glykolytisk hæmmede axoner trækkes den gennemsnitlige fluorescens af ramme 1 (foraktiveringsrammen) fra den gennemsnitlige fluorescens for hver ramme, der starter ved ramme 3 (den første timelapse-ramme) for en given ROI. Resultaterne er de baggrundsrubtrakte midler.
- Plot dataene som en scatterplot med rammen numre som abscissa. Tilpas en eksponentiel tendenslinje til dataene fra hvert investeringsafkast (de fleste regnearksprogrammer har denne funktion) med en ligning i form af Ae-bx. Denne ligning svarer til photobleaching funktion Ft = F0 * e-tɣ hvor F0 er fluorescens på den første ramme af timelapse, ɣ er eksponentiel blegning sats, t er det tid, og e er den naturlige logaritme base.
- Gentag trin 9.1.1-9.1.2 for alle ROI'er af alle axoner fra glykolytisk hæmmede nerver. For det mest nøjagtige skøn over fotobleaching sats, bruge mindst 15 axoner i alt fra mindst 5 separate nerver. Brug gennemsnittet af de eksponentielle blegningshastigheder (ɣ) fra alle hæmmede axoner til at korrigere de eksperimentelle data for fotobleaching. Der skal udføres en ny blegningskalibrering for hvert eksperiment eller hver undersøgelse, fordi fotobleaching afhænger af indstillingerne for billedopkøb og lasereffekten, som kan ændre sig med tiden.
- Trin 9.1.1 gentages for alle områder af axoner, der er afbildet med normalt saltvand (dvs. ikke glykolytisk hæmmet).
- Divider hvert datapunkt mede-tɣ, ved hjælp af tid til t og den gennemsnitlige ɣ, der findes i trin 9.1.3. Disse er de fotobleach-korrigerede midler.
- Multiplicer hvert datapunkt med området for den pågældende region for at finde den totale fluorescens i det pågældende område hver gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser repræsentative billeder fra eksperimenter med pulsflugt og pulsspredning. Vi har offentliggjort flereundersøgelser,der beskriver data opnået ved hjælp af pulse-escape-metoden og vores metoder til analyse af disse data5,6,,7,8,17. Nedenfor viser vi, hvordan de puls-spread data kan give oplysninger om retningsalitet og hastighed af neurofilament transport, som vi ikke har rapporteret tidligere.
Neurofilament transport i axon er intermitterende og tovejs. Denne transport kan beskrives ved den del af filamenter, der bevæger sig på et givet tidspunkt i henholdsvis anterograde og tilbageskridt, 
og deres hastigheder i 
anterograde- og tilbageskridtretningen, betegnet 
af og 
. Hvis vi tager den samlede mængde neurofilament polymer pr enhed længde axon at 
være, så fluxes i anterograd og tilbageskridt retninger gennem en given region er givet ved
Og
,
henholdsvis, og den samlede 
flux er givet ved
,
hvor 
har enheder μm-1, 
har enheder og har enheder 
. Da flux på et givet sted langs axon er mængden af neurofilament polymer, der bevæger sig forbi denne placering i en tidsenhed, det er relateret til den gennemsnitlige 
hastighed gennem 
. Således kan vi skrive
.
I et puls-spredning eksperiment flux kan bestemmes fra afgang af fluorescerende neurofilamenter fra den aktiverede region, som vi kalder det centrale vindue. Det samlede tab af fluorescerende neurofilament polymer fra dette centrale vindue per sekund 
er summen af de tab, der skyldes fluorescerende neurofilament polymerer forlader i anterograde og tilbageskridt retninger, dvs.
Normaliseret til det oprindelige indhold af fluorescerende neurofilament polymer i det centrale vindue, 
dvs.
hvor 
er hældningen af faldet i fluorescens i det centrale vindue, som i første omgang er lineær i en periode givet af 
8. For et 40 μm centralt vindue svarer dette til kun snesevis af sekunder. Men for vinduer denne store, overgangen til den eksponentielle henfald fase er gradvis, og hældningen er effektivt lineær i flere minutter eller mere8.
På tidlige tidspunkter fanger de flankerende vinduer alle de neurofilamenter, der forlader det centrale vindue, fordi disse filamenter ikke har tilstrækkelig tid til at passere gennem de flankerende vinduer og forlade dem på den anden side. I dette tilfælde er de mængder fluorescerende neurofilament polymer, der forlader det centrale vindue anterogradely og retrograd per sekund, dvs fluxes og , er givet ved stigningen i 
neurofilament indhold og i 
de 
flankerende vinduer. Normaliseret til det oprindelige indhold af fluorescerende neurofilament polymer i det centrale vindue, satserne for stigning i de flankerende vinduer bliver
hvor 
og 
er skråningerne af stigningen i fluorescens i de proksimale og distale flankerende vinduer, henholdsvis.
Således kan vi udtrykke den gennemsnitlige hastighed i form af skråninger i de flankerende vinduer, dvs.
(Eq. 1)
og forholdet mellem antallet af prærograde og retrograds bevægelige neurofilamenter med hensyn til forholdet mellem disse skråninger, dvs.
(Eq. 2)
hvor 
og 
betegner de satser , hvormed neurofilamenter vender fra anterogradely til tilbageskridt bevæger sig og omvendt8. Værdierne af 
og kan bestemmes ved at måle bevægelsen af individuelle 
neurofilamenter i dyrkede neuroner, som rapporteret tidligere17. Det er vigtigt, at udtrykket for hastigheden i Eq. 1 kun gælder på korte tidspunkter efter aktivering, hvor fluorescerende neurofilamenter kommer ind i flankeringsvinduet, men ikke forlader. Varigheden af denne korte tid vindue vil afhænge af længden af de flankerende vinduer og kinetik af neurofilament bevægelse. Jo længere de flankerende vinduer, i princippet, jo længere tidsvinduet. Teoretisk set kan man teste, at dette kriterium er opfyldt ved at bekræfte, at
(Eq. 3)
I modsætning til udtrykket for hastigheden i Eq. 1, som er givet ved forskellen mellem skråningerne i de flankerende vinduer, er udtrykket for retningsbestemthed i Eq. 2 robust til flankerende vinduesstørrelse, fordi det er givet ved forholdet mellem skråningerne i de flankerende vinduer.
Figur 3 viser repræsentative resultater fra puls-escape og puls-spread eksperimenter på myelinerede axoner i tibial nerve af en 8-ugers gammel mandlig mus fra vores hThy1 paGFP-NFM linje på en C57Bl/6J baggrund, ved hjælp af vinduesstørrelser på henholdsvis 5 og 40 μm. Mus på mindst 2 uger, både mandlige og kvindelige, har været anvendt til disse eksperimentelle paradigmer. Den relevante alder og køn bør bestemmes af forskeren afhængigt af, hvad der testes i undersøgelsen. Over tid kan det ses, at kanterne af de aktiverede regioner sløre på grund af afgang af neurofilamenter i både anterograde og tilbageskridt retninger, hvilket resulterer i tab af fluorescens fra det centrale vindue.
For puls-escape-metoden (Figur 3A, C, E) kan fluorescensforfaldkinetik i det aktiverede område give oplysninger om den langsigtede og kortsigtede pauseadfærd8,18. Til disse eksperimenter kan det aktiverede område være kort (vi bruger typisk 5 μm; se gul boks i figur 3A). For pulsspredningsmetoden (Figur 3B, D, F) bruger vi et længere aktiveret område (40 μm her; se gul boks i figur 3B)for at give en større pulje af fluorescerende neurofilamenter. Dette forlænger den tid, hvormed fluorescensstigningen i de flankerende regioner forbliver lineær (se ovenfor). Den lineære domæne af denne fluorescens stigning i de flankerende vinduer kan også øges ved at øge længden af disse vinduer, men dette er begrænset af størrelsen af synsfeltet. Vi brugte 15 μm flankerende vinduer, vist med rødt og grønt, til de data, der er vist i figur 3D.
Figur 3E,3F viser kvantificeringen af de samlede fluorescensintensiteter (dvs. summen af pixelintensiteterne) for de målevinduer, der er vist i henholdsvis figur 3C,3D. For puls-escape-metoden er henfaldet bifasisk, med et indledende eksponentielt forfald, som repræsenterer afgangen af on-track neurofilamenter. Dette overgange på omkring 10-20 minutter til en anden langsommere eksponentiel forfald, der repræsenterer mobilisering og afgang af off-track filamenter8. Til sammenligning med puls-spread-metoden viser vi kun et 12 minutters tidskursus i figur 3E, men normalt skal analyseforløbet være længere (typisk 30-120 minutter) for at fange den langsigtede pause med kinetik5,6,18. For puls-spread strategi, er beregningerne af hastigheden og retningsgraden af bevægelsen kun afhængig af skråninger i de flankerende vinduer. For de vindueslængder, der anvendes her, strækker den lineære fase sig i ca. 5 minutter. Varigheden af dette tidsvindue af linearitet bør vurderes ved gradvist at forkorte den tid, der bruges til at måle hældningen, og bestemme det punkt, hvor hældningen ikke længere stiger. Denne varighed kan øges ved at øge vindueslængderne, hvis kamerasynsfeltet tillader det, selvom vindueslængderne skal holdes konstante for alle aksler i et givet eksperiment. Som et eksempel har vi brugt de første 5 minutter af data til at måle skråningerne for puls-spread data i figur 3F. Dette resulterer i skråninger på henholdsvis 72 A.U./min./min., -594 A.U./min. og 111 A.U./min. for de proksimale, centrale og distale vinduer (A.U. = vilkårlige enheder). For at normalisere disse værdier divideres de med den indledende fluorescens i det centrale vindue, hvilket resulterer i hastigheder på 0,108 %F0/min, -0,962 %F0/min og 0,173 %F0/min. Anvendelsen af Eq. 3 finder vi, at bevaringskriteriet ikke er opfyldt, hvilket indikerer, at vi ikke opfanger al fluorescens i de flankerende vinduer. Dette er en teknisk begrænsning på grund af synsfeltet på vores EMCCD kamera (82 μm x 82 μm). Kameraer med sCMOS chips, som kan have meget større synsfelter, kunne tillade brug af større flankerende vinduesstørrelser. Vi kan imidlertid ikke udelukke, at denne uoverensstemmelse mellem de centrale og flankerende skråninger også, i det mindste delvist, kan undervurdere omfanget af fotobleaching (se diskussion), hvilket ville have den virkning, at de positive skråninger i de flankerende vinduer undervurderes, og at den negative hældning i det centrale vindue overvurderes.
Fra satserne i de flankerende vinduer (%F0/min) og Eq. 2 ovenfor, og ved hjælp af 
værdier på og 
17, beregner vi forholdet 
= 2,12. Dette indikerer, at 68% af filamenterne bevægede sig anterograd og 32% tilbageskridt. Ved hjælp af de samme satser og Eq. 1 ovenfor beregner vi den gennemsnitlige 
nettopopulationhastighed = 40*(0,00173-0,00108) = 0,026 μm/min eller 0,037 mm/dag. Radioisotopiske puls-mærkning undersøgelser i mus af samme alder har rapporteret en neurofilament befolkning hastighed på ca 0.6 mm/dag i de mest proksimale dele af iskiasnerven, aftagende til 0.12 mm/dag over en afstand på to centimeter19,20. Vores puls-spredning data blev indsamlet i tibial nerve, omkring en anden 2-3 centimeter distalt for disse foranstaltninger. Af ovennævnte grunde mener vi, at skønnet på 0,037 mm/dag er en undervurdering af den sande hastighed. Men, ekstrapolere den rumlige opbremsning observeret ved radioisotopisk puls-mærkning i tibial nerve dette skøn ikke urimeligt, især når vi mener, at det blev bestemt ved hjælp af en meget anderledes metode på en meget anderledes rumlig og tidsmæssig skala.
For at demonstrere pulsspredningsmetodens evne til at påvise signifikante forskelle mellem populationer sammenlignede vi de proksimale og distale flankerende vinduesskråninger målt fra nerver, der perfunderes med både normale og inhibitorsaliner. Hæmning af glykolyse blokerer bevægelse af neurofilamenter, som vi tidligere har rapporteret5,,6,,7. Vi vil senere diskutere udvælgelsen af prøvestørrelser til eksperimenter, men her brugte vi en nerve i normalt saltvand og to i hæmmende saltvand på grund af begrænsningen af et erhvervelsesfelt pr. nerve under hæmning. Figur 4A viser et eksempel timelapse fra en glykolytisk hæmmet nerve, der viser en tilsyneladende reduktion i transport ud af det aktiverede område. Faktisk finder vi betydeligt lavere distale og proksimale skråninger(Figur 4B, p = 0,00000639 og 0,0121, henholdsvis Tukey's parvis sammenligning efter ANOVA) i nerver behandlet med hæmningsisk saltvand versus dem perfunderes med normal saltvand. Vi finder også et betydeligt fald i befolkningshastigheden mellem disse to betingelser (Figur 4C, p = 0,0232, t-test med ulige varianser, efter F-test for lige varians med p = 0,0190).
Figur 1: Perfusionskammeret. a) Diagram, der viser samlingen af perfusionskammerhuset og den ydre pakning med slange tilsluttet saltvandssprøjten og affaldskolben. BB) Diagram, der viser samlingen af selve kammeret. Den indre pakning er lagt fladt oven på #1,5 coverslip. Nerven er placeret på coverslip i godt skabt af den rektangulære åbning af den indre pakning. Mikroakvædukt dias er placeret over nerven til sandwich nerven mellem #1,5 coverslip og mikroakvædukten dias. Endelig er sandwich vendt før montering på toppen af den ydre pakning af samlingen vist i (A) og sikret med en låsering (ikke vist). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Den tibial nerve forberedelse. (A)Billede, der viser placeringen af tibial nerve i benet af en mus, hvor gluteus superficialis, biceps femoris, semitendinosus, popliteus, tibialis caudalis og flexor digitorum longus muskler er blevet fjernet. Den tibial nerve kan ses som en af tre store grene af iskiasnerven opstår i knæet. (B) Skematisk af nerven i tværsnit i det samlede kammer, der viser olie-nedsænkning mål under dækslæbet. Den bedste optiske kvalitet opnås ved at aktivere og billeddannelse lag axons apposed til overfladen af coverslip; billedkvaliteten falder dybere ind i nerven på grund af lyssprænde. (C)Eksempler på en sund axon (top), og af en usund axon (bund) umiddelbart efter aktivering. Den stiplede gule linje markerer det aktiverede område. Den aktiverede fluorescens har skarpe grænser i den sunde axon, mens de aktiverede fluorescens diffusering i den usunde aksoni hurtigt ud af det aktiverede område fylder axonen på få sekunder. Skalabar = 10 μm. (D)Eksempler på mitokondrielt udseende i en sund axon (øverst) og en usund axon (bund). Mitokondrierne er synlige på grund af flavin autofluorescence16. De vises lineær (solid pilespidser) i sunde axoner. I usunde axoner, mitokondrier først bliver punktformig (åbne pilespidser) og derefter svagere over tid, hvilket giver en indikator for axon sundhed. Den stiplede åbne pilespids i den sunde axon peger på en mitokondrion overgang fra lineær til punktformig. Skalabar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksperimenter med pulsflugt og pulsspredning. Eksempel på præ-aktivering, post-aktivering og timelapse billeder af myelinerede axoner i tibial nerve af en 8 uger gammel mus i (A) en puls-escape eksperiment og (B) en puls-spredning eksperiment. Foraktiveringsbilledet er det øverste panel med billederne efter aktivering nedenfor. Tidsstempler viser den tid, der er gået efter aktiveringen. De gule bokse repræsenterer det aktiverede område. Disse aktiveringer blev udført ved hjælp af 5 scanninger med en 40 μs pixel dvæle tid og 5% laser magt. Skalastænger = 10 μm. CC) Mål-ROI'erne (gul) for tre axoner i et puls-escape-eksperiment. dD) De proksimale (røde), centrale (gule) og distale (grønne) måle-ROI'er for tre aksler i et pulsspredningseksperiment. Målingen ROI'er for hver axon er vist i konstant rød (proksimale), massiv gul (central vindue) og massivt grønt (distalt vindue). (E) Plot af den gennemsnitlige fluorescens versus tid, gennemsnit af de 3 axoner i C. Stiplede linje er en eksponentiel funktion passer til data, af formularen Ft = Ae-τt, som beskrevet tidligere7. F) Parceller af fluorescens i det centrale, distale og proksimalske ROI versus tid, gennemsnit på 14 axoner, herunder de tre axoner i D. Hældningen beregnes ud fra tendenslinjer, der passer til de første 5 minutter af dataene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Virkningen af metaboliske hæmmere på neurofilamenttransport. (A)Eksempel på timelapse billeder af en nerve forbehandlet med 5,6% (w / v) 2-deoxy-glucose og 0,5 mM natrium iodoacetat til at hæmme glykolyse og nedbryder cellulære ATP. Bemærk, at de distale og proksimale grænser for de aktiverede regioner forbliver skarpe, hvilket indikerer en hæmning af neurofilamenttransport. Skalabar = 10 μm.( B) Kvantificering af skråningerne i de distale (D) og proksimale (P) flankerende vinduer (henholdsvis anterograd og retrograd), udtrykt som procent af den oprindelige fluorescens i det centrale vindue (%F0/min), fra en nerve (14 axoner) ved hjælp af standard saltvand og fra to nerver (8 axoner) forbehandlet med saltvand, der indeholder glykolytiske hæmmere. c) Neurofilamentpopulationens hastigheder beregnet ud fra skråninger i de flankerende vinduer, hvilket viser et betydeligt fald i hastigheden efter inhibitorbehandling. - p < 0,005; ** - p < 0,01; * - p < 0,05. Dataene viser signifikant svækkelse af neurofilament transport i nærvær af hæmmere. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der skal gøres opmærksom på analysen af eksperimenter med pulse-escape og pulsspredning, da der er et betydeligt potentiale for at indføre fejl under efterbehandlingen, hovedsagelig under flat-field-korrektionen, billedjusteringen og blegemiddelkorrektionen. Flat-field korrektion er nødvendig for at korrigere for manglende ensartethed i belysningen, hvilket resulterer i en fall-off i intensitet på tværs af synsfeltet fra centrum til periferi. Omfanget af ikke-ensartethed er bølgelængdeafhængig og bør derfor altid udføres ved den bølgelængde, der skal anvendes til at erhverve forsøgsdataene. Det er vigtigt at sikre, at den manglende ensartethed i fladfeltbilledet virkelig er repræsentativ for den manglende ensartethed i de billeder, der skal rettes. Pulsspredningsforsøg er særligt sårbare over for fejl fra forkert flat-field-korrektion, fordi mål-RO'erne strækker sig mod periferien af billedet, hvor intensiteten falder af.
De optimale paGFP-aktiveringsindstillinger varierer efter aktiveringsmetode og laserparametre og skal bestemmes empirisk før den første billedbehandling. For lidt aktivering vil resultere i et lavt signal-støj-forhold for den aktiverede fluorescens, mens for meget vil resultere i blegning af den aktiverede fluorescens, fordi både den ikke-aktiverede og aktiverede paGFP kan ophidses af violet lys. For selektivt at belyse en region af interesse for billedet, bruger vi en Andor FRAPPA laser galvo scanner, som genererer en klart defineret region af fluorescens med skarpe grænser, som vist i de repræsentative resultater. Vi har også haft succes ved hjælp af en Andor Mosaic Digital Membran, som er en digital micromirror enhed, med en kviksølv bue lampe som belysning kilde7. Andre muligheder er kommercielt tilgængelige. En udfordring, når du arbejder med paGFP, er den forsinkede stigning i fluorescensintensiteten, der sker inden for 1 minut efter fotoaktivationstrinnet. Denne stigning opstår, fordi belysning med violet lys får en del af de aktiverede paGFP molekyler til at indtaste en "mørk tilstand", hvorfra de kan slappe af tilbage på et tidsforløb påsnesevis af sekunder 11. Det er vores erfaring, at stigningen er normalt mindre end 5% med widefield excitation, men kan overstige 20% med laser excitation, hvilket kan føre til en betydelig undervurdering af den aktiverede fluorescens. Vi tegner os for dette ved at erhverve en anden "post-aktivering" billede af paGFP fluorescens 1 minut efter fotoaktivering, og derefter bruge dette billede som referencepunkt for den efterfølgende timelapse. Men, Det er vigtigt at erkende, at dette ikke indføre en anden potentiel kilde til fejl ved fastsættelsen af den oprindelige fluorescens og henfald kinetik i de tidlige tider.
Der skal lægges yderligere vægt på justeringen af billedstakkene. Den vigtigste kilde til forskydning er afdrift eller anden bevægelse af prøven under timelapse image erhvervelse. Dette kan minimeres ved hjælp af indre pakninger af passende tykkelse og gør det muligt for præparatet at "bosætte sig i" før billeddannelse. En sådan forsinkelse vil dog reducere den tid, der er til rådighed til erhvervelse af image, da præparatet har et begrænset vindue af rentabilitet. Det er også vigtigt at undgå justeringsalgoritmer, der fordjæder billedet eller introducerer underpixelskift, da disse procedurer vil gensample pixelintensiteterne i billedet. Eksperimenter med pulsspredning er særligt sårbare over for fejl, der skyldes forkert tilpasning, fordi grænserne for den aktiverede fluorescensregion er relativt skarpe, og fluorescensen i denne region er betydeligt højere end de flankerende ikke-aktiverede regioner. Selv en lille forskydning af billedflyene i stakken kan resultere i store spring i fluorescensværdierne i de distale og proksimale målevinduer. Det er derfor bydende nødvendigt, at billedsæt justeres korrekt og inspiceres omhyggeligt, før de fortsætter med analysen.
Korrektion for fotobleaching er nødvendig for at sikre, at ændringer i fluorescensintensiteten over tid nøjagtigt afspejler ændringer i mængden af fluorescerende protein. Sådanne korrektioner kan være en væsentlig kilde til fejl ved vurderingen af de absolutte fluorescensintensiteter i de centrale og flankerende vinduer. Da fotobleaching kinetik afhænger af intensiteten af belysning og miljøet af fluorophore, faktiske fotobleaching satser kan variere mellem sessioner og fra axon til axon. Det er derfor nødvendigt at måle flere axoner og gennemsnitlige de resulterende data, som i sig selv introducerer nogle fejl. Den fremgangsmåde, der er beskrevet ovenfor, er at behandle nerven med glykolytiske hæmmere og derefter aktivere fluorescens i en region af interesse og spore tab af fluorescens intensitet over tid. De glykolytiske hæmmere nedbryder ATP og hæmmer dermed neurofilamenttransport, således at tabet af fluorescens udelukkende skyldes fotobleaching og ikke bevægelse af neurofilamenter ud af den aktiverede region. Den gennemsnitlige blegning kinetik bestemmes på denne måde bruges derefter til at korrigere de eksperimentelle data. Da det ikke er praktisk at udføre en separat blegning kalibrering i hver billedbehandling session, en enkelt kalibrering skal anvendes på flere sessioner spredt over mange uger. En ulempe ved denne fremgangsmåde er, at den ikke tager højde for variationer i lasereffekt/belysningsintensitet fra dag til dag, som derfor bør overvåges. En alternativ tilgang, som vi kalder "iboende blegning korrektion", er at vurdere photobleaching ved at kvantificere fluorescens i midten af den aktiverede region i samme timelapse film, der anvendes til transport målinger. Hvis denne måleregion er centralt beliggende og meget kortere end længden af den aktiverede region, og derefter på korte tidspunkter enhver fluorescerende neurofilamenter, der flytter ud af målingen regionen vil blive erstattet af fluorescerende neurofilamenter, der bevæger sig ind i det. Med tiden øges sandsynligheden for, at ikke-fluorescerende neurofilamenter bevæger sig ind i måleområdet fra flankerende ikke-fluorescerende regioner af axonen, hvilket fører til en overvurdering af tab af fluorescens på grund af blegning. En fordel ved denne fremgangsmåde er, at den korrigerer for blegningsegenskaberne inden for samme område, men en ulempe er, at tidsvinduets varighed skal bestemmes empirisk og afhænger af transporthastigheden samt længden af det aktiverede område. Alt dette er blevet sagt, skal det bemærkes, at vurderingen af retningsgraden af neurofilament transport ved hjælp af vores metode er robust til blegning fejl (som det er for flankerende vindue størrelse), fordi det er givet ved forholdet mellem skråninger i de flankerende vinduer og enhver blegning korrektion er en multiplikator anvendes til både tæller og nævner i denne beregning.
På grund af den støj, der er indbygget i et lysstofrør, og risikoen for yderligere fejl, der er tilføjet under de ovenfor beskrevne billedopbearbejdningstrin, er det vigtigt at anvende store stikprøvestørrelser for tilstrækkelig statistisk effekt. Selvom det ikke er muligt præcist at bestemme populationsmidler, afvigelser og effektstørrelser før eksperimenter, anbefaler vi at brugeCohen-metoden 21 under forudsætning af en medium effektstørrelse og en alfa på 0,05. Dette resulterer i en Cohen's d, hvilket er forskellen i midler divideret med den samlede standard afvigelse af begge populationer, på 0,5, hvilket tyder på at erhverve mindst 105 prøver pr gruppe. Når denne tærskel er nået, kan man foretage en post hoc-effektanalyse for at revurdere den statistiske effekt i lyset af de faktiske befolkningsforanstaltninger. Under optimale eksperimentelle forhold, bør det være muligt at opnå fra 1-7 analyzable axoner (ud af 9-20 samlede axoner) pr aktivering, og 5-8 aktiveringer pr nerve under forudsætning af erhvervelse af en 10-minutters timelapse per aktivering.
Transgene mus, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner rettet mod mitokondrier eller vesikler, er også blevet anvendt til at studere aksonal transport af membranøse organeller i perifere nerver ex vivo22,23,24,25. Desuden har Schiavo lab udviklet tilgange til billede axonal transport af retrograd flytter membranøs organeller i axoner in vivo ved hjælp af fluorescerende mærkede stivkrampe toksin fragmenter, som kan injiceres i musklen og er taget op af motornerveterminaler26. Da membranøse organeller kan løses i disse axoner ved fluorescensmikroskopi, er det dog muligt at analysere hastigheden og hyppigheden af deres bevægelser direkte ved hjælp af timelapse eller kymograph analyse. De puls-escape og puls-spredning metoder, der er beskrevet her blev udviklet med det specifikke mål at analysere kinetik af neurofilament transport i disse axoner, hvor enkelt neurofilamenter ikke kan løses. Dette kræver en analyse på befolkningsniveau over en periode på minutter eller snesevis af minutter. Vi bruger en transgen mus til dette formål, men det bør også være muligt at udtrykke det fotoaktiverede protein ved hjælp af metoder som viral transduktion eller i livmoderelektronikation. Mens fokus har været neurofilament transport, puls-escape og puls-spredning metoder kan også tilpasses til at studere bevægelsen af andre cytoskeletal og cytosolic proteiner, der transporteres langs axoner i den langsomme komponenter af aksonal transport. Vi begrænser vores analyser til myelinerede axoner, fordi deres størrelse og myelin kappe giver os mulighed for at løse dem fra deres naboer. Umyelinerede axoner kan ikke løses på grund af deres lille kaliber og tendens til at klynge i Remak bundter. Vi beskriver brugen af tibial nerver ex vivo, men metoderne bør også gælde for andre perifere nerver, der er tilstrækkelig lange (> 5 mm) og ugrenede. I princippet bør det også være muligt at tilpasse disse metoder til billedneurofilamenttransport in vivo (f.eks. ved kirurgisk at udsætte en nerve i en beroliget mus og derefter placere musen på et mikroskop).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Paula Monsma for instruktion og bistand med konfokale mikroskopi og tibial nerve dissektion og Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger og Sana Chahande for hjælp med mus ærholdning. Dette arbejde blev delvist støttet af det kollaborative National Science Foundation Grants IOS1656784 til A.B. og IOS1656765 til PJ, og National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 og S10 OD010383 til A.B. N.P.B. blev støttet af et stipendium fra Ohio State University President's Postdoctoral Scholars Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
