Summary
光活性化可能なニューロフィラメントタンパク質を発現するトランスジェニックマウス由来の末梢神経の単一ミリン化軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析する蛍光光活性化法について説明する。
Abstract
ニューロフィラメントタンパク質ポリマーは、軸索輸送の遅い成分の軸索に沿って、平均速度が0.35~3.5mm/日で移動します。最近まで、この動きの研究は、放射性同位体パルス標識を使用してのみ可能でした, これは、日の時間分解能とミリメートルの空間分解能と神経全体の軸索輸送の分析を可能にします.より高い時間的および空間的分解能を有するインサイチュにおけるニューロフィラメント輸送を研究するために、ニューロンにおける光活性化可能なGFPでタグ付けされたニューロフィラメントタンパク質Mを発現するhThy1-paGFP-NFMトランスジェニックマウスを開発した。ここでは、これらのマウス ex vivoから脛骨神経の単一のミリン化軸索における神経フィラメント輸送を解析するための蛍光光活性化パルスエスケープおよびパルス拡散法について説明する。単離された神経セグメントは、酸素化生理食類を灌流することにより顕微鏡ステージ上に維持され、ディスク共焦点蛍光顕微鏡を紡糸することによって画像化される。バイオレットライトは短軸窓で蛍光を活性化するために使用されます。活性化領域と横回し領域の蛍光は時間の経過とともに分析され、分およびミクロンのオーダーで時間的および空間的解像度を伴うニューロフィラメント輸送の研究が可能になる。数学的モデリングは、結果データから速度、方向バイアス、一時停止行動を含むニューロフィラメント輸送の運動パラメータを抽出するために使用できます。パルスエスケープ法およびパルス拡散法は、他の神経におけるニューロフィラメント輸送を可視化するためにも適応することができる。追加のトランスジェニックマウスの開発により、これらの方法は、軸索中の他の細胞骨格および細胞質タンパク質の軸索輸送を画像化し、分析するためにも使用することができる。
Introduction
ニューロフィラメントの軸索輸送は、1970年代にラジオアイソトピックパルス標識1によって初めて実証された。このアプローチは 、インビボでのニューロフィラメント輸送に関する豊富な情報を生み出したが、空間的および時間的解像度が比較的低く、通常はミリメートルと最高の日の順序で2.また、ラジオアイソトピックパルス標識は、単一の時間経過を生成するために複数の動物の注入と犠牲を必要とする間接的なアプローチです。1990年代に蛍光タンパク質の発見と蛍光顕微鏡の進歩により、その後、培養ニューロン内のニューロフィラメント輸送を数秒または数分の時間スケールで直接画像化し、マイクロメートル以下の空間分解能を用いて、動きのメカニズムに関するより大きな洞察を得るようになりました3。これらの研究は、軸索中のニューロフィラメントポリマーが微小管運動タンパク質によって推進される微小管トラックに沿って前向きおよび逆行方向の両方で迅速かつ断続的に移動することを明らかにした。しかし、ニューロフィラメントは直径わずか10nmの回折限定構造であり、通常は数十ナノメートルの間だけ隣人と離れている。したがって、ポリマーは、移動ポリマーが隣人から解決できるように、まばらに分布した神経フィラメントを含む培養ニューロン内でのみ追跡することができる4。したがって、現在では、ミエリン軸索のような豊富なニューロフィラメントポリマーを含む軸索中の単一の神経フィラメントを追跡することは不可能である。
蛍光顕微鏡を用いた神経フィラメント豊富軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析するために、培養神経細胞,4,5における神経フィラメントの長期休止挙動を研究するために開発した蛍光光活性化パルスエスケープ法を用いた。4光活性化可能な蛍光ニューロフィラメント融合タンパク質でタグ付けされたニューロフィラメントは、軸索の短いセグメントで活性化され、その後、活性化領域からのそれらのフィラメントの出発速度は、時間の経過に伴う蛍光の減衰を測定することによって定量化されます。このアプローチの利点は、個々のニューロフィラメントポリマーの動きを追跡することなく、数分または数時間の時間スケールで適用することができるニューロフィラメント輸送の集団レベルの分析であるということです。例えば、この方法を用いて、ミエリン化培養6におけるニューロフィラメント輸送の運動を分析した。
最近、ヒトニューロン特異的Thy1プロモーター7の制御下にあるニューロンにおいて、paGFPタグ付きニューロフィラメントタンパク質M(paGFP-NFM)の低レベルを発現するhThy1-paGFP-NFMトランスジェニックマウスの開発について説明した。このマウスは蛍光顕微鏡を用いたその場所でのニューロフィラメント輸送の分析を可能にする。本稿では、2つのアプローチを用いて、これらのマウスから脛骨神経のミエリン軸索におけるニューロフィラメント輸送を分析するための実験的アプローチについて述べた。これらのアプローチの最初は、上記のパルスエスケープ方式です。この方法は、ニューロフィラメントの一時停止挙動に関する情報を生成することができるが、フィラメントが活性化領域を出発する方向に盲目であり、したがって正味方向および輸送速度8の測定を可能にしない。第2のアプローチは、活性化領域からの蛍光の損失だけでなく、蛍光フィラメントが前向きおよび逆行方向の両方で活性化領域を出発する際に蛍光が移動する2つの側面窓における蛍光の一過性増加を分析する新しいパルス拡散法である。どちらのアプローチでも、測定窓における蛍光変化の数学的分析とモデリングを用いて、平均速度、正味方向性および一時停止行動などのニューロフィラメント輸送のパラメータを得ることができる。 図 3 は、これら 2 つのアプローチを示しています。
このプロトコルは、神経の解剖および調製、paGFP蛍光の活性化および画像化、およびImageJ9のFIJI配布パッケージを用いて取得した画像からのニューロフィラメント輸送の定量を示す。それは長い(数cm)であり、分岐しないので、私たちは脛骨神経を使用します。しかし、原理的にpaGFP-NFMを発現する神経は、軸索を損傷することなく解剖し脱整えることができる場合、この技術で使用するのに適している。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、オハイオ州立大学の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 神経生理液の調製
- ブロイアーの生理食音10の100 mLを作る:98 mM NaCl、1 mM KCl、2 mM KH2PO4、1mM MgSO 4、1.5 mM CaCl2、5.6%D-グルコース、23.8 mM NaHCO3を二重蒸留水で。4
- 95%の酸素/5%炭酸ガス(カルボゲン)を使用前に少なくとも30分間、生理食液を通して泡立てます。残った生理的な生理物は1週間以内に再利用できます。ただし、各使用前に再酸素化する必要があります。
- 60 mLのシリンジに酸素化した生理食音を注ぎ、シリンジに残っている空気が最小限であることを確認します。
2. 神経灌流室の初期集合
- 図1Aに示すように、シリンジとチューブを接続し、流出管を廃棄物フラスコに入れます。
- 外側のガスケットを灌流室ハウジングに入れ、フロー入口と出口ポストがガスケットの穴に合わせられるようにします。
- 内側のガスケット(シリコーン、厚さ100μm)を#1.5円形カバースリップ(直径40mm)に置き、ガスケットのシワを慎重に平滑化して密閉します。後で組み立てやすくするために、ペーパータオルの上にカバースリップとガスケットを置くか、ガスケットを上に向けて拭きます。
3. マウス脛骨神経の解剖と準備
- 二酸化炭素吸入または別の制度的に承認された方法によって動物を犠牲にする。実験は犠牲7の3時間以内に行われなければならないので、動物が動き/呼吸を停止したときにタイマーを開始します。
- 毛皮に70%のエタノールをスプレーし、電気カミソリを使用して動物の足からできるだけ取り除き、戻ります。
- 大きな解剖はさみを使用して、背骨の真ん中付近の皮膚に背部切開を行い、動物の腹側の側面の周りに切り傷を続ける。このカットから始めて、筋肉からそっと引き離し、筋膜を切断することによって、脚からゆっくりと皮膚を反射します。
- 動物を解剖トレイの上の上の上の上の上に置き、4つの足をすべてピン留めします。必要に応じて、さらに動きを減らすために尾を固定します。
- マイクロディションハサミを使用して、尾と膝の中間の太ももの筋肉を切開して坐骨神経を露出させます。筋肉を通して見える神経が切れないようにしてください。
- 筋肉を取り除くために、心筋と腹腔内の切開を延長します。同様に、ふくらはぎの筋肉を取り除き、神経を傷つけることを避けるために切り傷を浅く短く保ちます。
- 脛骨神経が坐骨神経(膝)からかかとに分岐する点から完全に露出するまで筋肉を取り除く(図2A)。
注:脛骨神経の解剖を含む、および続くすべてのステップでは、神経中のpaGFPの可能な偶発的な活性化を最小限に抑えるために、周囲光への不必要な暴露を避けてください。 - 脊椎近位端の脛骨神経を鉗子でつかみ、マイクロディクショレンハサミを使って神経を切る。神経に緊張を入れないように注意し、筋肉から離れて持ち上げ、添付ファイルを切断します。
- 脛骨神経の背骨遠端を切り取り、室温酸素化生理食前の小さなペトリ皿に移します。手順のこの時点から、常に神経の近位および遠位の端を追跡することを確認してください。
注: これを行う 1 つの方法は、テーパが見えるように斜めのカットで神経の遠位の端をマークします。 - 神経の近位端から始めて、露出した軸索の端を非常に細かい鉗子でそっとつかむ。
- 鉗子の第二のペアで、近位の神経鞘をつかみ、ゆっくりと神経の遠位の端に向かって引っ張る。神経鞘は、最小限の抵抗で軸索に沿ってスライドします。このプロセス中に過度の緊張が神経に適用されないようにしてください。
4. 最終神経灌流チャンバーアセンブリ
- 神経の近位端をつかんで、生理食布地から取り出し、内側のガスケットの長方形の開口部内の灌流室のカバースリップにゆっくりと置き、まっすぐに横たわるように神経に穏やかな緊張を保つ。
- 神経に面した溝のある側で、神経の上にマイクロ水道管スライドを置き、そして、神経に平行に流れる方向を置きます。カバースリップとマイクロ水道アセンブリを裏返し、外側のガスケットに割り当てるマイクロ水道管スライドで灌流室ハウジング内に置きます。神経と周囲の内部ガスケットは、カバースリップとガスケットで分離されたマイクロ水道スライドの間に挟まれ、カバースリップは上向きです(図1B)。
- 金属ハウジングに入れ、ロックリングを回転させることで、灌流チャンバーを固定します。プラスチックハウジングがすべての金属クリップの下にあることを確認し、生理食動物の漏れを防ぐためによく締めます。過度に締め付けは、マイクロ水道のスライドやカバースリップをクラックすることができます。カバースリップが下向きになるようにチャンバーをひっくり返します。
- 生理食糸注射器プランジャーをゆっくりと落ち込ませ、灌流チャンバーを満たします。インレットと出口チューブ、アウトレットフラスコ、シリンジを常に設定とイメージング中にチャンバー自体の上に高く保ちます。これは、気泡を導入したり、チャンバー内の負圧による焦点不安定を引き起こす可能性のあるサイフォンを回避します。
- 灌流アセンブリを反転した顕微鏡ステージに移し、シリン注射器をシリンジポンプに取り付けます。0.25 mL/minの流量に適した速度でモータを始動します。次に、37 °Cに設定されたインラインソリューションヒーターを接続してオンにします。
- 目的ヒーターを接続し、37°Cに設定し、目的に油を適用し、ステージマウントに灌流チャンバーを挿入します。
- チャンバーヒーターパッドにオイルを塗布し、灌流室に取り付けます。チャンバーヒーターを接続してオンにします。37 °Cに設定します。
注:温度の変化は、溶液の外気のために灌流チャンバに泡を形成する可能性があります。気泡が形成された場合は、泡がチャンバーをクリアするまで溶液の流量を5〜10倍に簡単に増やします。 - 灌流チャンバをステージアダプターにロックし、目的のオイルをチャンバーの下側のカバースリップに接触させる。
注:ここで使用するASIステージアダプタを備えたBioptechsチャンバーは、逆顕微鏡構成用に設計されています。
5. 蛍光活性化と画像取得
- 明視野照明を使用して、カバースリップ表面に最も近い神経の底面の軸索の層に焦点を当てる(図2B)。ミエリー化軸索(通常、成体マウスの直径1〜6μm)は、コントラスト強化なしに明視野透過光照明下で可視であるミエリン鞘の存在によって識別することができる。シュミット・ランターマン裂け目とランヴィエのノードも容易に明らかである。非髄色の軸索はより細く(通常は<1 μmの直径)、一般的にバンドル(Remakバンドル)に存在し、一般的に互いに解決するにはあまりにも密接にアポスされています。
- 顕微鏡で利用可能な場合は、タイムラプスイメージングの過程で焦点を維持するためにオートフォーカスシステムをアクティブにします。
- 明視野参照画像を取得します。画像に対する神経の向き(脊椎近位および遠位端)を記録します。
- 488 nmレーザーを用いた共焦点像とpaGFPに適した発光フィルタ(例えば525/50nm)を取得し、漂白前自家蛍光を記録します。レーザーパワーを低く抑え、光の消光を最小限に抑え、かすかな信号を検出するために露出時間を調整します。例として、代表的なデータは、5%のレーザーパワーと4s露光で取得した。今後のすべての実験で使用するために取得設定を記録します。
注:光の活性化後、理想的なイメージング設定では、20枚の画像の間に、信号対雑音比>8と元の信号の25%未満の光の点滅が生成されます。軸索は、当初7のように広視野発蛍光顕微鏡で画像化することもできますが、共焦点性の欠如により画質が劣ります。 - レーザーパワーを通常の5倍程度の撮影電力に設定し、3~4分の露光時間で画像を取得します。必須ではありませんが、このステップは、バックグラウンドシグナルを低減し、光活性化蛍光の信号対雑音を最大化するために、自己蛍光および望ましくない蛍光の他のソースを漂白することをお勧めします。
- この漂白ステップの後に、起動前の自己蛍光を記録するためにステップ5.4で使用される設定で画像を取得します。
- 明視野のイメージで、目的のアクティベーションウィンドウサイズと等しい長さの軸索に平行な線を描きます。このウィンドウの長さは、実験の目標とパラメータによって異なりますが、パルスエスケープパラダイムの場合は通常の長さは5μm、パルス拡散パラダイムの場合は40μmです。
- この線をガイドとして使用して、軸索に対して垂直な視野をまたぐ長方形の領域(ROI)を描きます。領域は、光活性化されるすべての軸索を包含する必要があります。
- 405 nm照明で光活性化に最適な設定を決定します。
注: 最初の実験的なアクティベーションの前に、このステップとサブステップのみを実行してください。実験の過程で、同じ写真の活性化設定を使用する必要があります。- 405nmレーザーラインを使用して目的領域を繰り返し活性化し、低レーザーパワー(例えば、5%)、およびピクセルドウェル時間(例えば、40μs)、および1パルスを、各活性化後に活性化されたGFP蛍光の画像を取得する。蛍光が増えなくなるまで繰り返し、各画像の対象領域で蛍光を定量化します。
- 平均蛍光強度とパルス数をプロットします。蛍光が増加しなくなった後のパルス数を、活性化のための最適なパルス数として選択します。
- 405 nm光によるパターン励起により、ステップ5.8で描かれた領域のpaGFP蛍光を活性化します。イメージがアクティベーションの直前に取得され、アクティベーションの直後に取得されていることを確認します。
注:理想的なpaGFP活性化はROI内に含まれる鋭い境界を有する蛍光の明確に定義された領域を生成する。 - アクティベーションが完了したら、1分間のタイマーを開始します。1分の終わりに、タイムラプスシリーズの取得を開始します。
注:1分の遅延は、paGFP11の光活性化後に観察される蛍光の増加を可能にするために必要です。パルス拡散法では、30秒のタイムラプス間隔を持つ5〜10分の取得期間で、中央および側面の窓の初期傾斜角を測定して速度と方向性を測定するのに十分です。パルスエスケープ法の場合、5分または10分のタイムラプス間隔で30〜150分の取得期間を使用すると、フィラメントの長期休止行動の分析が可能 - 取得したすべての画像と、蛍光活性化に使用されるROIを保存します。
- 神経の新しい領域に移動し、手順 5.1 から 5.11 を繰り返します。新しい領域が同じ軸索に沿っている場合、他の活性化領域から移動した蛍光神経フィラメントの検出を避けるために、以前活性化された領域から少なくとも500 μmである必要があります。最終タイムラプスの取得は、3時間のウィンドウの終了前に終了する必要があります。
注:準備が3時間以上有効である可能性がありますが、確認していません。熟練した解剖および準備により、この3時間のウィンドウ内で5〜8個の10分間のタイムラプス画像セットが取得される可能性があります。 - 最終的なタイムラプス画像系列が取得された後、生理食物の流れを停止し、溶液とチャンバーヒーターを切断し、顕微鏡ステージから灌流装置を取り外します。
6. フラットフィールドとダークフィールド画像の取得
- 250mgのフルオレセインパウダーを0.5mLの二重蒸留水に加えて、フルオレセインの溶液を作ります。目に見える粒子がなくなるまで混ぜ、卓上遠心分離機で30秒間溶液を回転させて、溶解していない材料を沈下させます。この溶液は光の露出から保護される場合4 °Cで数ヶ月間保存することができる。
- 8 μLのフルオレセイン溶液をスライドに加え、#1.5カバースリップを塗布します。余分な液体をブロットし、マニキュアで密封し、乾燥させます。
注:この高濃度では、フルオレセイン色素の強い吸収は溶液内の照明ビームを消し、急速な拡散交換12による光漂白に対して均一かつ耐性のあるカバースリップの表面で蛍光の薄い面を生成する。 - 蛍光スライドのカバースリップ側を反転した顕微鏡ステージに下に置き、カバースリップの表面の蛍光の薄い面に焦点を合わせます。スライドの周囲を移動して、気泡(暗い斑点)や大きなフルオレスセイン粒子(明るいスポット)を含まない視野を見つけます。
- 中央の画像が元のフォーカスプレーンになるように、0.2 μm間隔で6 μmに及ぶZスタックを取得します。蛍光は非常に明るくなるので、短時間の暴露時間(例えば、40ミリ秒)を使用してください。このzスタックの取得は、カバースリップが完全に水平になることはめったになく、蛍光の面が非常に狭いため、視野全体で最大蛍光を捕捉するために必要です。この操作を繰り返して、合計 25 の視野で、フィールド間の任意の方向にステージを少なくとも 20 μm 移動します。
- カメラのシャッターを含むすべてのライトパスシャッターを閉じ、レーザーパワーと露出時間をゼロに設定します。これらの設定で100枚の画像のスタックを取得します。これらの画像は、ダークフィールド画像を生成するために平均化され、カメラチップの暗電流とバイアスオフセットを補正するために使用されます。
注: ストリーミング取得は、これらの画像をキャプチャする理想的な方法です。
7. 漂白剤補正のための神経を解答的に阻害した画像化
- ステップ1のように生理食前の溶液を作り、酸素化する。しかし、D-グルコースに対して2-デオキシD-グルコースを置換し、0.5 mMヨードアセテートナトリウムを添加して解糖13を阻害する。これを「阻害生理活性」と呼んでいます。
- 抑制生理生理活性を使用して、ステップ5.11に設定された10〜30分のタイムラプス画像を使用して、ステップ2〜5を繰り返します。神経フィラメント輸送の完全な阻害を確実にするために、イメージングの前に阻害生理液を塗布した後40〜50分を許可する。
注:解糖阻害は最終的に軸索を殺すので、阻害後の狭い時間枠があり、通常は約30分です。代謝抑制のレベルの指標は、axonalミトコンドリアのフラビン自己蛍光であり、paGFP蛍光14を画像化するために使用する長時間露光のためにタイムラプスシリーズで検出することができる。典型的には、ミトコンドリア自己蛍光は、阻害生理的な生理学による治療中に増加する。ミトコンドリアが切り上げまたは断片化し始めた場合は、イメージングを中止します。
8. ImageJを用いた画像処理と解析
- フラットフィールドとダークフィールド補正
- ダークフィールドイメージスタックを開き、[画像] メニューの [画像] をクリックして画像の平均を 取得します。スタック |Z プロジェクト を選択し、ドロップダウン メニューで [平均強度 ] を選択して 、ダークフィールド イメージを生成します。
- フルオレセイン フラットフィールド イメージ スタックを開き、[ イメージ |スタック |Z プロジェクト を選択し、ドロップダウン メニューで [最大強度 ] を選択します。
- [イメージ | スタック |スタックするイメージ。 [イメージ|スタック |Z プロジェクト を選択し、ドロップダウン メニューから 平均強度 を選択して フラットフィールド イメージを生成します。
- [プロセス ] をクリックしてフラットフィールド イメージからダークフィールド イメージを引きます 。イメージ計算機で、演算として [減算 ] を選択します。 32 ビット (浮動小数点) 結果 オプションがチェックされていることを確認します。結果は 、修正されたフラットフィールドイメージになります。
- 最初に [分析] をクリックして、修正したフラットフィールド イメージのピクセルの平均強度 を測定する |[測定値] を設定 し、[ 平均グレー 値] ボックスをオンにして、'm' キーを押します。
- [プロセス ] をクリックして、修正したフラットフィールド イメージを平均強度で割ります 。数学 |ステップ 7.1.5 で得られた平均グレー値を分割して入力します。逆 ゲイン イメージが生成されます。
- タイムラプスイメージスタックと共に、起動前およびアクティベーション後の画像を開きます。[イメージ] をクリックして画像を 1 つのスタックに結合 する |スタック |ツール |を連結し、ドロップダウンメニューから時系列で画像を選択します。 [4D 画像として開く ] オプションが選択されていないかどうかを確認します。結果のスタックは 、完全なイメージ セットです。
- フルイメージセットでステップ 8.1.4 を繰り返し、結果を逆ゲイン画像で除算するには、[プロセス |画像計算機を選択し、操作として除算を選択します。これにより、各画像が照明分野および検出器上の不均一性に対して補正されたフルイメージセットが生成されます。
- 画像スタックの配置
- ステージまたはサンプルドリフトによるタイムラプスシリーズのイメージプレーンのずれを修正するには、[プラグイン] をクリックして 固定領域 プラグイン (補足ファイル 1)による配置 をインストールします。PlugInをインストールし、プラグインファイルを含むフォルダに移動し、プラグインを選択します。プラグインをインストールした後、ImageJ を再起動します。
注:このプラグインは、「最小二乗」の原則15に基づいて画像を整列させます。 - いくつかの軸索にまたがり、各軸索内の活性化蛍光の近位および遠位境界を越えて伸びない 補正されたフルイメージセット にROIを描画します。領域のジオメトリは重要ではありませんが、構造の形状やサイズが変化すると位置合わせが改善される領域は除外されます。
- [プラグイン] をクリックしてアライメント プラグインを実行する |固定領域による整列:プラグインはフレーム間の変位にデフォルトの 2 ピクセルの最大値を設定しますが、サンプルの有意なドリフトがある場合は、初期ポップアップウィンドウで調整できます。イメージ スタックのサイズによっては、配置に数分かかる場合があります。
- 整列されたスタックを視覚的に検査して、整列の品質を評価します。自動アライメントはフレーム間の蛍光の大きな変動に対してうまく機能しない可能性があるため、一部のフレームは手動で調整する必要があります。これは、[ イメージ |変換 |翻訳.次のポップアップで[ いいえ ]をクリックし、スタック全体を変換するかどうかを尋ねられます。ピクセルのピクセル値のリサンプリングによって小数のピクセルシフトまたは補間がデータを変更するため、変換に整数ピクセル値のみを使用し、ドロップダウン補間メニューが Noneに設定されていることを確認します。
- これを整列フルイメージセットとして保存します。
- ステージまたはサンプルドリフトによるタイムラプスシリーズのイメージプレーンのずれを修正するには、[プラグイン] をクリックして 固定領域 プラグイン (補足ファイル 1)による配置 をインストールします。PlugInをインストールし、プラグインファイルを含むフォルダに移動し、プラグインを選択します。プラグインをインストールした後、ImageJ を再起動します。
- 蛍光強度の測定
- アクティブ領域の 1 つのエッジに沿って、軸索に垂直、2 番目のアームを垂直に沿って最初の腕で 設定した、位置合わせフル イメージ の最初のフレームに対して[角度]ツールを使用して ROI を描画します。'm' キーを押して、視野の軸索の方向を示す角度を測定します。
- [分析] をクリックして、画像のスケールをミクロン単位で測定するように設定します。スケールを設定し、適切な値を入力します。
- [分析] をクリックして ROI マネージャを開きます 。ツール |ROI マネージャー.パルスエスケープパラダイムの場合は、ステップ 8.3.7 に進みます。パルス拡散の場合は、ステップ 8.3.4 に進みます。
- 任意の寸法の四角い ROI を描画し、[編集] をクリックします。選択 |を指定します。[スケール単位]オプションがオンになっていることを確認し、ROI を 15 μm の幅と高さがイメージの高さ以上に設定します。
- ステップ 8.3.1 で測定した角度で ROI を回転するには、[ 編集] をクリックします。選択 |回転 して軸索に垂直にし、アクティブ領域の近位エッジに沿って片側の ROI を配置します。この ROI を、近位ガイド ROI と呼ぶ場合は、't' キーを押してマネージャーに追加します。
- アクティブ領域の遠位エッジに合わせて ROI をドラッグし、't' キーを押して ROI マネージャに再度追加します。これは遠位ガイド ROI と呼ぶ。近位および遠位ガイドROIは後で、隣接する測定ROIを描くために使用されます。
- 上記のステップ5.11で取得したタイムラプス画像シーケンスを使用して、定量する軸索を選択します。この画像シーケンスは、軸索の弱い自己蛍光を捕捉し、活性化領域の外側の形態を明らかにするので、この目的に役立ちます。
注: 次の基準を満たさない軸索は、解析から除外されます。- 軸索は、すべての測定ウィンドウの全長に沿って焦点を合わせる必要があります。
- 軸索は、活性化領域の近位および遠位端に対して垂直の5°以内になければなりません。
- 軸索は、活性化領域の近位および遠位端の5μm以内に内径を有してはならない。
- イメージングの過程で目に見えて形状を変化させる軸索を除外します。
- これは、アクソンが死んだときに起こる活性化蛍光の拡散分散を示すものであるため、活性化後の画像(図2C、下部)に離散活性化領域がないことによって証明されるように異常に見える軸索を除外する。
- 軸索内の自己蛍光構造に対して、ステップ5.5からの長時間露光漂白画像を観察します。この蛍光はミトコンドリア16内のフラビンによるものである。これらのミトコンドリアが丸みを帯びたまたは断片化しているように見える場合(図2D、下)、拡張された直線的な構造(図2D、上)とは対照的に、分析から軸索を除外します。
- 上記で作成した近位ガイドと遠位ガイドROIを使用して、分析中の軸索ごとに3つの測定ROIを描きます:40μm活性化領域内の軸索を包含する中央窓と、活性化領域の境界で軸索の直径によって制約される側面窓15μm ROIと高さによって制約される幅を持つ2つの側面窓。3 つの地域をすべて ROI マネージャに追加します。分解的に阻害された軸索の場合、活性化領域の中央に幅5μm以下で、軸索の外側に伸びない単一領域を描きます。パルスエスケープパラダイムの場合、活性化領域の幅はわずか5μmなので、ウィンドウ全体を使用する必要があります。
- ステップ 8.3.7 および 8.3.8 の基準を満たすすべての軸索について、ステップ 8.3.9 を繰り返します。
- [分析] メニューの [分析] をクリックして、アクティブな測定をピクセルの平均強度に設定します 。[測定値] を設定 し、[ グレーの平均値 ] オプションを選択します。他の測定オプションがチェックされていないことを確認します。
- [ROI マネージャ]ウィンドウで[Ctrl]+[a]を押して、すべてのROIを選択します。[ROI マネージャ]ウィンドウで、[ 詳細] をクリックします。 蛍光強度を測定するマルチメジャー。結果ウィンドウからスプレッドシートにデータをコピーして、さらに分析します。
- [分析] をクリックしてアクティブな計測値を領域領域に設定する |[計測値] を設定 し、[ 面積 ] オプションを選択します。他の測定オプションがチェックされていないことを確認します。
- ステップ 8.3.12 を繰り返します。エリアは時間によって変化しないため、エリアの結果の 1 行だけをコピーする必要があります。
9. フォトブリーチ補正
- 糖分解的に阻害された軸索のデータスプレッドシートでは、所定のROIのフレーム3(最初のタイムラプスフレーム)から始まる各フレームの平均蛍光からフレーム1(プレ活性化フレーム)の平均蛍光を差し引きます。結果は 、背景を減算した平均です。
- このデータを、横軸としてフレーム番号を使用して散布図としてプロットします。指数近似曲線を、各 ROI のデータに適合します (ほとんどのスプレッドシート プログラムはこの関数を持ちます) Ae-bxの形式の数式を使用します。この式は、Ft=F0*e-tɣのフォト0ブリーチ関数-tɣと同等でありt、F0はタイムラプスの第1フレームにおける蛍光であり、ɣは指数的な漂白速度、tは時間、eは自然対数基底値である。
- 解答性抑制神経のすべての軸索のすべてのROIについて、ステップ9.1.1~9.1.2を繰り返します。光の切開率の最も正確な推定値を得る場合は、少なくとも5つの別々の神経から合計で少なくとも15軸索を使用してください。すべての阻害軸索からの指数漂白率(ɣ)の平均を使用して、フォトブリーチングの実験データを修正します。フォトブリーチは画像取得の設定とレーザーパワーに依存するため、時間の経過とともに変化する可能性があるため、実験または研究ごとに新しい漂白キャリブレーションを実行する必要があります。
- 正常な生理食糸で画像化された軸索のすべての領域(すなわち、解糖的に阻害されない)について、ステップ9.1.1を繰り返します。
- t の時間と、ステップ 9.1.3 で見つかった平均ɣを使用して、各データポイントを e-tɣで除算します。これらは フォトブリーチ補正手段です。
- 各データポイントに対象領域の面積を掛けると、その地域の 蛍光の合計 が毎回見つかります。
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Representative Results
図3は、パルスエスケープおよびパルス拡散実験の代表的な画像を示しています。パルスエスケープ法を用いて得られたデータと、それらのデータ5、6、7、8、176,7の5分析方法を用いて得られたいくつかの研究,8を17発表しました。以下に、これまで報告されていないニューロフィラメント輸送の方向性と速度に関する情報をパルス拡散データがどのように得ることができるかを示す。
軸索中のニューロフィラメント輸送は断続的かつ双方向である。この輸送は、順方向および逆行方向の任意の時点で移動するフィラメントの画分と 
、それぞれ、順方向および逆行方向におけるそれらの速度によって表すことができる 
。軸索の単位長さ当たりのニューロフィラメントポリマーの総量を取ると 
、所定の領域を通る前行方向および逆行方向のフラックスは、
そして
,
それぞれ、総流束 
は
,
ユニット 
μm-1を 
持ち、単位 
があり、 単位 
があります。軸索に沿った所定の位置のフラックスは、その位置を過ぎて一定の時間で移動するニューロフィラメントポリマーの量であるため、平均速度に関連 
する 
。したがって、私たちは書くことができます
.
パルス拡散実験では、蛍光性ニューロフィラメントが活性化領域から出発する速度からフラックスを求めることができ、これは中央窓と呼ばれる。この中央の窓からの蛍光ニューロフィラメントポリマーの損失の総損失/秒 
は、前向きおよび逆行方向に残る蛍光ニューロフィラメントポリマーによる損失の合計、すなわち。
中央の窓の蛍光性ニューロフィラメントポリマーの初期内容に正規化され、すなわち 
中央 
窓の長さであるところ、この損失率は次のようになります。
ここで 
中央窓の蛍光減少の傾きは、最初は8によって与えられた期間に対して線形である 
8。40 μm の中央ウィンドウの場合、これはわずか数十秒に相当します。しかし、この大きな窓の場合、指数崩壊相への移行は緩やかであり、傾斜は数分間以上の間、効果的に線形である。
早い段階で、これらのフィラメントは側面の窓を通過し、反対側にそれらを終了するのに十分な時間を持っていないので、側面の窓は中央の窓を出るすべての神経フィラメントをキャプチャします。この場合、中央窓を1秒間に順次逆順に残す蛍光性ニューロフィラメントポリマーの量、すなわちフラックス 
および 
、および、神経フィラメント含有量の増加 
および 
横向きの窓内での量が与えられる。中央の窓の蛍光ニューロフィラメントポリマーの初期内容に正規化され、隣接する窓の増加率は
場所 
と 
は、それぞれ、近位および遠位の側面の窓における蛍光の増加の斜面である。
したがって、我々は、隣接する窓、すなわち斜面の観点から平均速度を表現することができます。
(Eq. 1)
これらの斜面の比率の観点から、先行性および逆行性の神経フィラメントの数の比率、すなわち。
(Eq. 2)
ここで 
、 
ニューロフィラメントが順方向から逆行に逆戻りし、逆方向に8.及びの値は 
、培養ニューロンにおける個々の神経フィラメントの運動を測定することによって決定することができる、前に報告された17.重要なことに、Eq.1の速度の発現は、蛍光性ニューロフィラメントが隣接する窓に入るが、残らない間に活性化後の短時間にのみ適用される。この短い時間枠の持続時間は、側面の窓の長さとニューロフィラメント運動の運動に依存します。横の窓が長いほど、原則として、時間枠は長くなります。理論的には、この基準が満たされていることを確認することによってテストすることができます。
(Eq. 3)
隣接する窓の斜面の差によって与えられるEq. 1の速度の式とは対照的に、Eq. 2の方向性の式は、隣接する窓の斜面の比率によって与えられるため、窓の横方向に強い。
図3 は、C57Bl/6JバックグラウンドのhThy1 paGFP-NFMラインから8週齢の雄マウスの脛骨神経中のミカエル化軸索に対するパルスエスケープおよびパルス拡散実験の代表的な結果を示し、それぞれ5μmと40μmのウィンドウサイズを使用した。少なくとも2週齢のマウスは、オスとメスの両方で、これらの実験的パラダイムに使用されてきた。適切な年齢と性別は、研究でテストされているものに応じて研究者によって決定されるべきです.時間が経つにつれて、活性化領域の縁が前向きおよび逆行方向の両方で神経フィラメントの出発のためにぼかし、中央の窓からの蛍光の損失をもたらすことが見られる。
パルスエスケープ法(図3A、C、E)については、活性化領域における蛍光減衰運動薬が、長期および短期間の休止行動88,1818に関する情報を得ることができる。これらの実験では、活性化された領域は短くすることができます(通常は5 μmを使用します。図3Aの黄色いボックスを参照)。パルス拡散法(図3B、D、F)では、蛍光性ニューロフィラメントのより大きなプールを提供するために、より長い活性化領域(ここでは40 μm、図3Bの黄色いボックスを参照)を使用します。これは、隣接する領域の蛍光増加が直線的に保たれる時間を長くする(上記参照)。この蛍光のリニアドメインは、これらの窓の長さを大きくすることによっても増加することができますが、これは視野の大きさによって制限されます。図 3Dに示すデータには、赤と緑で示された 15 μm のウィンドウを使用しました。
図3E,3Fは、図3C,3Dに示す測定窓に対する全蛍光強度(すなわち、ピクセル強度の合計)の定量を示す。パルスエスケープ法の場合、減衰は二方的であり、オントラックニューロフィラメントの出発を表す初期指数崩壊を有する。これは、オフトラックフィラメント8の動員と出発を表す2番目の遅い指数崩壊に約10〜20分で移行します。パルス拡散法との比較のために、図3Eでは12分の時間経過しか示していないが、通常、長期間の休止動態55、6、186,18を捕捉するには、解析の時間経過時間を長くする必要がある(通常は30~120分)。パルス拡散戦略では、移動の速度と方向の計算は、隣接するウィンドウの斜面にのみ依存します。ここで使用するウィンドウ長の場合、線形フェーズは約 5 分間延長されます。この時間ウィンドウの直線性の期間は、傾斜角の測定に使用する時間を段階的に短縮し、勾配が増加しなくなった点を決定することによって評価する必要があります。この時間は、カメラの視野が許せばウィンドウの長さを増やすことで延長することができますが、特定の実験ですべての軸索に対してウィンドウの長さを一定に保つ必要があります。例として、図 3Fのパルス拡散データの傾きを測定するために、データの最初の 5 分を使用しました。これにより、近位、中央、遠位の窓に対して、それぞれ72のA.U/分、-594 A.U./min、および111 A.U./minの斜面が得られます(A.U. = 任意の単位)。これらの値を正規化するために、中央ウィンドウの初期蛍光で除算され、0.108 %F0/min、-0.962 %F0/min、0.173 %F0/min のレートが得られます。EMCCDカメラの視野(82 μm x 82 μm)による技術的な制限です。sCMOSチップを搭載したカメラは、はるかに大きな視野を持つことができ、より大きな側面の窓サイズの使用を可能にする可能性があります。しかし、中央斜面と横方向の斜面の間のこの不一致は、少なくとも部分的には、側面のある窓の正の斜面を過小評価し、中央窓の負の斜面を過大評価する効果がある光漂白の程度を過小評価する可能性を排除することはできません。
上の側面の窓(%F0/min)とEq. 2のレートから、 
および 
17の値を使用して、比率 
= 2.12を計算します。これは、フィラメントの68%が前向きに移動し、32%が逆行していたことを示しています。上記の同じレートとEq.1を使用して、平均正味母集団速度 
= 40*(0.00173-0.00108)=0.026 μm/min、または0.037 mm/dayを計算します。同年代のマウスにおける放射性同位体パルス標識研究は、坐骨神経の最も近い部分において約0.6mm/日のニューロフィラメント集団速度を報告しており、2センチメートル19,2020の距離にわたって0.12mm/日に減速19した。私たちのパルス拡散データは、これらの措置に約2〜3センチメートル遠位の脛骨神経に収集されました。上記の理由から、0.037 mm/日の推定値は、真の速度の過小評価であると考えています。しかし、放射性同位体パルス標識によって脛骨神経に観察される空間減速を外挿することは、特に非常に異なる空間的および時間的スケールで非常に異なる方法論を使用して決定されたことを考慮すると、不合理ではないと推定される。
集団間の有意な違いを検出するパルス拡散法の能力を実証するために、正常および阻害剤の両方の系統を透過した神経から測定された近位および遠位の窓の斜面を比較した。我々は、以前に報告したように、神経フィラメントの動きをブロックする解糖の阻害5,6,,7.実験用のサンプルサイズの選択については後述しますが、阻害時の神経1個につき1つの取得フィールドの制限により、正常生理食前に1つの神経と抑制生理食食糸の2つの神経を使用しました。図4Aは、解糖的に阻害された神経からのタイムラプスの例を示し、活性化領域外の輸送の明らかな減少を示す。実際、阻害生理生理を治療した神経と正常生理的生理的な神経に対して、遠位および近位の斜面(図4B、p= 0.00000639および0.0121、それぞれ、ANOVAに続くTukeyの対比比較)を見つける。また、これら2つの条件間の母集団速度の有意な低下を見つける(図4C、p= 0.0232、不均一な分散を伴うt検定、p = 0.0190との等分散のF検定)。
図1:灌流室。(A)灌流室ハウジングと外ガスケットの組み立てを示す図で、生理食糸状のシリンジと廃フラスコにチューブを接続した。(B)チャンバ自体の組み立てを示す図。内側のガスケットは#1.5カバースリップの上に平らに置かれる。神経は内部ガスケットの長方形の開口部によって作成される井戸のカバースリップに置かれる。マイクロ水道管スライドは、#1.5カバースリップとマイクロ水道管スライドの間に神経を挟むために神経の上に配置されます。最後に、サンドイッチは、(A)に示すアセンブリの外側のガスケットの上に取り付ける前に反転し、ロックリング(図示せず)で固定されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:脛骨神経製剤。(A)マウスの足の中の脛骨神経の位置を示す画像は、臀部表面膜症、上腕二頭筋、半腱症、ポプラテン、チシャリス・カウダリスおよびフレクサー・デジトーラム・ロンゴラス筋が除去された。脛骨神経は、膝に生じる坐骨神経の3つの主要な枝の1つと見なすことができます。(B)組み立てられたチャンバ内の断面の神経の模式図、カバースリップの下の油浸性目標を示す。最高の光学品質は、カバースリップの表面に割り当て軸索の層を活性化し、イメージングすることによって得られます。光散乱により、画像の品質が深く神経に低下します。(C) 健康軸索(上)の例、および活性化直後の不健康な軸索(下)の例。黄色の破線は、アクティブな領域を示します。活性化された蛍光は健康な軸索に鋭い境界を有するが、不健康な軸索では活性化された蛍光が活性化領域から急速に拡散し、数秒以内に軸索を満たす。スケールバー= 10 μm(D) 健康軸索(上)と不健康な軸索(下)におけるミトコンドリアの外観の例。ミトコンドリアはフラビン自己蛍光16のために目に見える。それらは健康な軸索の線形(固体矢印)に現れる。不健康な軸索では、ミトコンドリアは最初に穿刺(開いた矢印)になり、その後時間の経過とともに薄くなり、軸索の健康の指標を提供する。健康な軸索の破線の開いた矢印は、線形から穿刺に移行するミトコンドリアを指しています。スケールバー= 10 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:パルスエスケープとパルス拡散実験8週齢マウスの脛骨神経中のミエリン軸索の活性化前、活性化後およびタイムラプス画像の例(A)におけるパルスエスケープ実験及び(B)パルス拡散実験。事前アクティベーションイメージは、以下のアクティベーション後の画像を含むトップパネルです。 タイム・スタンプには、アクティブ化後の経過時間が表示されます。黄色のボックスは、アクティブ化された領域を表します。これらの活性化は、40 μsピクセルのドウェル時間と5%のレーザーパワーを持つ5つのスキャンを使用して実行されました。スケールバー= 10 μm(C)パルスエスケープ実験における3軸索の測定ロワ(黄色)(D) パルス拡散実験における3軸索の近位(赤)、中央(黄)および遠位(緑色)測定ROI。各軸索の測定ROIは、赤(近位)、黄色の実線(中央窓)、緑(遠位窓)で示されています。(E)平均蛍光対時間のプロットは、C.破線における3軸索の平均は、データに適合する指数関数であり、Ft=Ae-τttの形式の、-τt前述の7。F)中央の蛍光のプロット、遠位および近位ROI対時間、Dの3軸索を含む平均14軸索。傾斜角は、データの最初の 5 分に合う近似曲線から計算されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ニューロフィラメント輸送に対する代謝阻害剤の効果(A) 5.6%(w/v)2-デオキシグルコースおよび0.5 mMヨードアセテートナトリウムで前処理された神経のタイムラプス画像の例を挙げ、解糖を阻害し、細胞ATPを枯渇させる。活性化領域の遠位境界および近位境界は、鋭いままであり、ニューロフィラメント輸送の阻害を示す。スケールバー=10μm(B)遠位(D)および近位(P)横方向窓(それぞれ前向きおよび逆行)の斜面の定量化は、中央窓の初期蛍光の割合(%F0/分)として表され、標準的な生理学を使用する1つの神経(14軸索)から、および2つの神経(8軸索)から、凝縮性を含む2つの神経(8軸索)からB(C)神経フィラメントの集団速度は、隣接する窓の斜面から算出し、阻害剤治療後の速度の有意な減少を示す。- p < 0.005;** - p < 0.01;* - p < 0.05.このデータは、阻害剤の存在下におけるニューロフィラメント輸送の有意な障害を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
後処理時に、主にフラットフィールド補正、画像アライメント、漂白剤補正の間に誤差が導入される可能性が大きいため、パルスエスケープおよびパルス拡散実験の分析には注意が必要です。フラットフィールド補正は、照明の不均一性を補正するために必要であり、その結果、中心から周辺までの視野全体の強度が低下します。不均一性の程度は波長依存であり、したがって、常に実験データの取得に使用される波長で行われるべきである。フラットフィールド画像の不均一性が、補正する画像の不均一性を真に表すことを確認することが重要です。パルス拡散実験は、強度の減衰が最も大きい画像の周囲に向かって測定ROIが広がるため、不適切なフラットフィールド補正によるエラーに対して特に脆弱です。
最適な paGFP 活性化設定は、活性化方法とレーザー パラメーターによって異なり、最初のイメージング セッションの前に経験的に決定する必要があります。あまり活性化しない場合、活性化蛍光のシグナル対ノイズ比が低くなりますが、あまり多すぎると、非活性化および活性化paGFPの両方がバイオレット光によって励起されるため、活性化蛍光の漂白が生じてしまいます。画像の対象領域を選択的に照らすには、代表的な結果に示すように、鮮明な境界を持つ蛍光の明確に定義された領域を生成するAndor FRAPPAレーザーガルボスキャナを使用します。また、照明源7として水銀アーク灯を備えたデジタルマイクロミラーデバイスであるAndor Mosaicデジタルダイアフラムを使用して成功を収めています。他のオプションは市販されています。paGFPを扱う際の課題は、光活性化ステップの1分以内に起こる蛍光強度の遅延増加である。この増加は、紫色光による照明が活性化されたpaGFP分子の割合を「暗い状態」に入り、そこから数十秒の時間経過でリラックスすることができるため起こる。我々の経験では、増加は通常、広視野励起で5%未満であるが、レーザー励起で20%を超えることができ、活性化された蛍光の有意な過小評価につながる可能性がある。これを説明するには、光活性化の1分後にpaGFP蛍光の2番目の「事後活性化」画像を取得し、その後のタイムラプスの基準点としてこの画像を使用します。しかし、これは初期の蛍光と崩壊動態を早期に決定する際に別の潜在的な潜在的なエラー源を導入することを認識することが重要です。
画像スタックの配置には、さらに注意が必要です。ミスアライメントの主な原因は、タイムラプス画像取得中の標本のドリフトまたは他の動きです。これは、適切な厚さの内部ガスケットを使用し、イメージングの前に準備が「落ち着く」ことを可能にすることによって最小限に抑えることができます。しかし、このような遅延は、準備が生存可能性の限られたウィンドウを有するので、画像取得に利用可能な時間を短縮する。また、これらの手順では画像のピクセルの強度を再サンプリングするため、イメージのワープやサブピクセルシフトを導入するアライメントアルゴリズムを避けることも重要です。パルス拡散実験は、活性化蛍光領域の境界が比較的鋭く、この領域の蛍光が隣接する非活性化領域よりも有意に高いため、不適切な位置合わせに起因するエラーに対して特に脆弱である。スタック内のイメージ プレーンのわずかなずれでも、遠位および近位の測定ウィンドウの蛍光値に大きなジャンプが生じる可能性があります。したがって、解析を進める前に、イメージセットを適切に配置し、慎重に検査することが不可欠です。
時間の経過に伴う蛍光強度の変化が蛍光タンパク質の量の変化を正確に反映するように、光漂白の補正が必要です。このような補正は、中央および横側面の窓における絶対蛍光強度を推定する際の重大なエラー源となり得る。光漂白運動は照明の強度と蛍光色素の環境に依存するので、実際の光漂白率はセッション間および軸索から軸索によって異なる場合があります。したがって、複数の軸索を測定し、結果のデータを平均する必要があり、それ自体がエラーを引き起こします。上述のアプローチは、神経を解糖抑制剤で治療し、その後、対象領域で蛍光を活性化し、時間の経過とともに蛍光強度の損失を追跡することである。この解糖阻害剤はATPを枯渇させ、したがって、蛍光の喪失が完全に活性化領域からの神経フィラメントの動きではなく光漂白によるものとなるように、ニューロフィラメント輸送を阻害する。この方法で決定された平均漂白運動は、実験データを修正するために使用されます。各イメージングセッションで個別の漂白キャリブレーションを実行することは現実的ではないため、1つのキャリブレーションを数週間にわたって広がる複数のセッションに適用する必要があります。このアプローチの欠点は、レーザーパワー/照明強度の日々の変動を考慮していないため、監視する必要があります。「固有漂白補正」と呼ばれる別のアプローチは、輸送測定に使用されるのと同じタイムラプスムービーで活性化領域の中心にある蛍光を定量することによって光漂白を推定することです。この測定領域が活性化領域の長さより中央に位置し、かつ短時間で、測定領域から移動する蛍光神経フィラメントは、それに移動する蛍光神経フィラメントに置き換えられます。しかしながら、時間とともに、非蛍光性ニューロフィラメントが軸索の非蛍光領域を横切りから測定領域に移動する確率が高くなると、漂白による蛍光の消失の過大評価を招く。この方法の利点は、同じフィールド内の漂白特性を補正することですが、時間枠の期間は経験的に決定する必要があり、輸送速度と活性化領域の長さに依存するという欠点があります。このすべては、我々の方法を用いたニューロフィラメント輸送の方向性の推定は、隣接する窓の斜面の比率によって与えられるため(窓の大きさを横向きするため)漂白誤差に強く、その計算では分子と分母の両方に適用される乗数であるため、注意が必要です。
蛍光システムに固有のノイズと、上記の画像後処理工程中に追加の誤差が発生する可能性があるため、十分な統計電力を得るためには、大きなサンプルサイズを使用することが重要です。実験前に母平均、偏差、効果サイズを正確に特定することはできませんが、中程度の効果サイズとアルファが0.05であると仮定して、Cohenメソッド21を使用することをお勧めします。これは、両方の母集団のdプールされた標準偏差で割った平均の差であるコーエンのd、0.5で、グループごとに少なくとも105サンプルを獲得することを示唆する。このしきい値に達すると、実際の人口測定に照らして統計電力を再評価するために、ポストホックパワー分析を実行できます。最適な実験条件下では、1回の活性化につき1〜7個の分析可能な軸索(全軸索の9~20個のうち)から、活性化ごとに10分間のタイムラプスを獲得すると仮定して神経当たり5〜8個の活性化を得ることができるはずです。
ミトコンドリアまたは小胞を標的とする蛍光融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、末梢神経ex vivo22,23,24,25における膜小器官の軸索輸送を研究するためにも使用されてきた。22,23,24,25さらに、スキアボ研究室は、蛍光タグ付き破傷風毒素断片を使用して生体内の軸索中の逆行移動膜小器官の軸索輸送を画像化するアプローチを開発した。しかし、これらの軸索では蛍光顕微鏡法で膜状の小器官を分解できるため、タイムラプスやカイモグラフ解析を用いてそれらの動きの速度や頻度を直接解析することができる。ここで説明するパルスエスケープ法とパルス拡散法は、単一の神経フィラメントを解決できないこれらの軸索におけるニューロフィラメント輸送の運動を分析するという具体的な目的で開発された。これには、分または数十分の期間にわたる母集団レベルの分析が必要です。この目的のためにトランスジェニックマウスを使用しますが、ウイルス導入や子宮エレクトロポレーションなどの方法を用いて光活性化可能なタンパク質を発現させることも可能である必要があります。焦点はニューロフィラメント輸送であったが、パルスエスケープ法およびパルス拡散法は、軸索輸送の遅い成分において軸索に沿って輸送される他の細胞骨格および細胞質タンパク質の動きを研究するためにも適応され得る。その大きさとミエリン鞘は、私たちが彼らの隣人からそれらを解決することを可能にするので、私たちは、ミエリン軸索に私たちの分析を閉じ込めます。非髄積軸は、その小さな口径とRemakバンドルにクラスターする傾向があるために解決することはできません。我々は、脛神経ex vivoの使用について述べているが、方法は十分に長い(>5 mm)および枝分かれしていない他の末梢神経にも適用可能であるべきである。原則として、これらの方法を生体内でのニューロフィラメント輸送を画像化するように適応させることも可能である(例えば、鎮静マウスで神経を外科的に暴露し、顕微鏡ステージにマウスを置くことによって)。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らはポーラ・モンスマに対する共焦点顕微鏡と脛骨神経解剖の指導と支援、内田敦子博士、クロエ・デュガー博士、サナ・チャハンデ博士にマウスの畜産の支援を感謝したいと考えています。この研究の一部は、国立科学財団がIOS1656784をA.Bに助成金を提供することによって支援されました。 IOS1656765からP.J.、国立衛生補助金R01 NS038526、P30 NS104177、S10 OD010383からA.B.N.P.B.へのIOS1656765は、オハイオ州立大学学長の博士研究員プログラムのフェローシップによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
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