Summary
Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.
Abstract
Os polímeros de proteína neurofilamental movem-se ao longo dos axônios no componente lento do transporte axonal a velocidades médias de ~0,35-3,5 mm/dia. Até recentemente, o estudo desse movimento in situ só era possível utilizando rotulagem de pulso radioisotópica, que permite a análise do transporte axonal em nervos inteiros com resolução temporal de dias e resolução espacial de milímetros. Para estudar o transporte de neurofilamento in situ com maior resolução temporal e espacial, desenvolvemos um camundongo transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa proteína de neurofilamento M marcada com GFP fotoativatável em neurônios. Aqui descrevemos os métodos de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso e difusão de pulso para analisar o transporte de neurofilamento em axônios mieliados únicos de nervos tibiais desses camundongos ex vivo. Segmentos nervosos isolados são mantidos no estágio do microscópio por perfusão com soro fisiológico oxigenado e imageados por microscopia de fluorescência confocal de disco giratório. A luz violeta é usada para ativar a fluorescência em uma janela axonal curta. A fluorescência nas regiões ativadas e flanqueadas é analisada ao longo do tempo, permitindo o estudo do transporte de neurofilamento com resolução temporal e espacial na ordem de minutos e mícrons, respectivamente. A modelagem matemática pode ser usada para extrair parâmetros cinéticos do transporte de neurofilamento, incluindo a velocidade, viés direcional e comportamento de pausa dos dados resultantes. Os métodos de fuga de pulso e difusão de pulso também podem ser adaptados para visualizar o transporte de neurofilamento em outros nervos. Com o desenvolvimento de camundongos transgênicos adicionais, esses métodos também poderiam ser usados para imagem e análise do transporte axonal de outras proteínas citoesqueletal e citosóica em axônios.
Introduction
O transporte axonal de neurofilamentos foi demonstrado pela primeira vez na década de 1970 pela rotulagem de pulso radioisotópica1. Essa abordagem tem gerado uma riqueza de informações sobre o transporte de neurofilamento in vivo,mas tem resolução espacial e temporal relativamente baixa, tipicamente na ordem dos milímetros e dias, no máximo2. Além disso, a rotulagem de pulso radioisotópica é uma abordagem indireta que requer a injeção e o sacrifício de vários animais para gerar um curso único. Com a descoberta de proteínas fluorescentes e os avanços na microscopia de fluorescência na década de 1990, tornou-se posteriormente possível a imagem do transporte de neurofilamento diretamente em neurônios cultos em uma escala de tempo de segundos ou minutos e com resolução espacial sub-micrômetro, proporcionando uma visão muito maior do mecanismo do movimento3. Esses estudos revelaram que os polímeros de neurofilamento em axônios se movem de forma rápida e intermitente em direções anterogradas e retrógradas ao longo de trilhas de microtúbulos, impulsionados por proteínas motoras microtúbulas. No entanto, neurofilamentos são estruturas limitadas à difração com apenas 10 nm de diâmetro que são tipicamente espaçadas além de seus vizinhos por apenas dezenas de nanômetros; portanto, os polímeros só podem ser rastreados em neurônios cultivados que contenham neurofilamentos pouco distribuídos para que os polímeros em movimento possam ser resolvidos a partir de seus vizinhos4. Assim, não é possível rastrear neurofilamentos únicos em axônios que contenham polímeros neurofilados abundantes, como axônios mieliados.
Para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios ricos em neurofilamentos usando microscopia de fluorescência, utilizamos um método de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso que desenvolvemos para estudar o comportamento de pausa a longo prazo de neurofilamentos em células nervosas cultivadas4,,5. Neurofilamentos marcados com uma proteína de fusão de neurofilamento fluorescente fotoativat são ativados em um pequeno segmento de axônio, e então a taxa de saída desses filamentos da região ativada é quantificada pela medição da decadência da fluorescência ao longo do tempo. A vantagem dessa abordagem é que é uma análise em nível populacional do transporte de neurofilamento que pode ser aplicada em uma escala de tempo de minutos ou horas sem a necessidade de rastrear o movimento de polímeros de neurofilamento individual. Por exemplo, usamos este método para analisar a cinética do transporte de neurofilamento nas culturas mielique6.
Recentemente, descrevemos o desenvolvimento de um rato transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa baixos níveis de uma proteína de neurofilamento com marca paGFP M (paGFP-NFM) em neurônios sob o controle do promotor Thy1 específico do neurônio humano7. Este camundongo permite a análise do transporte de neurofilamento in situ usando microscopia de fluorescência. Neste artigo, descrevemos as abordagens experimentais para a análise do transporte de neurofilamento em axônios mieliados de nervos tibiais desses camundongos usando duas abordagens. A primeira dessas abordagens é o método de fuga de pulso descrito acima. Este método pode gerar informações sobre o comportamento de pausa dos neurofilamentos, mas é cego para a direção em que os filamentos partem da região ativada e, portanto, não permite a medição da direcionalidade líquida e da velocidade de transporte8. A segunda dessas abordagens é um novo método de propagação de pulso no qual analisamos não apenas a perda de fluorescência da região ativada, mas também o aumento transitório da fluorescência em duas janelas de flanqueamento através das quais os filamentos fluorescentes se movem à medida que saem da região ativada em direções anterogradas e retrógradas. Em ambas as abordagens, parâmetros de transporte de neurofilamento, como a velocidade média, direcionalidade líquida e comportamento de pausa podem ser obtidos utilizando-se análise matemática e modelagem das mudanças na fluorescência nas janelas de medição. A Figura 3 ilustra essas duas abordagens.
Este protocolo demonstra dissecação e preparação do nervo, ativação e imagem da fluorescência paGFP e quantificação do transporte de neurofilamento a partir das imagens adquiridas utilizando o pacote de distribuição FIJI da ImageJ9. Usamos o nervo tibial porque é longo (vários cm) e não ramifica; no entanto, em princípio, qualquer nervo que expresse paGFP-NFM é apropriado para uso com esta técnica se ela pode ser dissecada e desapeto sem danificar os axônios.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio.
1. Preparação da solução salina nervosa
- Faça 100 mL de soro fisiológico de Breuer10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glicose, 23,8 mM NaHCO3 em água duplamente destilada.
- Bolha 95% de oxigênio/5% dióxido de carbono (carbogen) através da solução salina por pelo menos 30 minutos antes do uso. As sobras de soro fisiológico podem ser reutilizadas dentro de uma semana; no entanto, deve ser reoxiscinado antes de cada uso.
- Despeje soro fisiológico oxigenado em uma seringa de 60 mL e certifique-se de que há ar mínimo restante na seringa.
2. Montagem inicial da câmara de perfusão nervosa
- Conecte a seringa e a tubulação, conforme mostrado na Figura 1A,colocando o tubo de saída em um frasco de resíduos.
- Coloque a junta externa na carcaça da câmara de perfusão, garantindo que a entrada de fluxo e os postes de saída estejam alinhados com os orifícios da junta.
- Coloque a junta interna (silicone, 100 μm de espessura) em uma mancha circular de #1,5 (diâmetro de 40 mm), alisando cuidadosamente todas as rugas na junta para garantir uma vedação apertada. Para facilitar a montagem posterior, coloque o talo de cobertura e a junta em uma toalha de papel ou limpe a tarefa com a junta voltada para cima.
3. Dissecção e preparação do nervo tibial do rato
- Sacrifique o animal por inalação de dióxido de carbono ou outro método institucionalmente aprovado. Inicie um temporizador quando o animal cessar o movimento/respiração, pois os experimentos só devem ser realizados dentro de 3 horas após o sacrifício7.
- Pulverize a pele com 70% de etanol e retire o máximo possível das pernas e costas do animal usando uma navalha elétrica.
- Usando um par de tesouras de dissecção grande, faça uma incisão dorsal na pele perto do meio da coluna vertebral e continue o corte ao redor do aspecto ventral do animal. A partir deste corte, reflita lentamente a pele das pernas puxando-a suavemente para longe do músculo e cortando a fáscia.
- Coloque o animal em uma posição supina em uma bandeja de dissecação e fixe todas as quatro patas. Opcionalmente fixe a cauda para reduzir ainda mais o movimento.
- Usando uma tesoura de microdisseção, faça uma incisão nos músculos da coxa no meio do caminho entre a cauda e o joelho para expor o nervo ciático. Certifique-se de que o nervo, que é visível através do músculo, não seja cortado.
- Estenda a incisão dorsal e ventrally para remover o músculo. Da mesma forma, remova os músculos da panturrilha, mantendo os cortes rasos e curtos para evitar danificar o nervo.
- Remova os músculos até que o nervo tibial esteja totalmente exposto do ponto em que se ramifica do nervo ciático (no joelho) até o calcanhar(Figura 2A).
NOTA: Em todas as etapas, incluindo e após a dissecação do nervo tibial, evite exposição desnecessária à luz ambiente para minimizar a possível ativação incidental do paGFP no nervo. - Segure o nervo tibial na extremidade vertebral-proximal com um par de fórceps e corte o nervo usando um par de tesouras de microdisseção. Tomando cuidado para não colocar tensão no nervo, levantá-lo para longe do músculo, cortando quaisquer acessórios.
- Corte a extremidade distal da coluna vertebral do nervo tibial e transfira para uma pequena placa de Petri de soro fisiológico de temperatura ambiente. A partir deste ponto no procedimento, certifique-se sempre de acompanhar as extremidades proximal e distal do nervo.
NOTA: Uma maneira de fazer isso é marcar a extremidade distal do nervo com um corte angular de tal forma que o afunilador seja visível. - A partir da extremidade proximal do nervo, segure suavemente as extremidades do axônio exposto com um par de fórceps muito finos.
- Com um segundo par de fórceps, segure a bainha nervosa proximally, e puxe lentamente para a extremidade distal do nervo. A baásma nervosa deslizará ao longo dos axônios com resistência mínima. Certifique-se de que nenhuma tensão indevida seja aplicada ao nervo durante este processo.
4. Montagem final da câmara de perfusão do nervo
- Agarrando a extremidade proximal do nervo, remova-a do soro fisiológico e lentamente deite-a sobre a tampa da câmara de perfusão dentro da abertura retangular da junta interna, mantendo uma tensão suave no nervo enquanto você a coloca para baixo para que ela fique reta.
- Coloque o deslizamento do microacoduto sobre o nervo com o lado ranhurado voltado para o nervo, e a direção do fluxo paralelo ao nervo. Vire o deslizamento de tampas e o conjunto de micropacdutos, e coloque-o dentro da carcaça da câmara de perfusão com o slide de microacoduto emposto à junta externa. O nervo e a junta interna circundante serão agora sanduíches entre o deslizamento de tampa e o slide microaqueduto, que são separados pela junta, com o deslizamento de tampa voltado para cima(Figura 1B).
- Fixar a câmara de perfusão colocando-a na caixa metálica e girando o anel de bloqueio. Certifique-se de que a carcaça de plástico está totalmente sob todos os clipes metálicos e aperte bem para evitar vazamento salino. O apertar demais pode quebrar o slide ou o deslizamento de cobertura do microacoduto. Vire a câmara para que a tampa esteja virada para baixo.
- Deprimir lentamente o êmbolo da seringa salina para encher a câmara de perfusão. Mantenha a entrada e a tubulação de saída, o frasco de saída e a seringa elevados acima da própria câmara o tempo todo durante a configuração e a imagem. Isso evita o sifonamento, que pode introduzir bolhas ou causar instabilidade de foco devido à pressão negativa na câmara.
- Transfira o conjunto de perfusão para um estágio de microscópio invertido e monte a seringa salina para a bomba de seringa. Ligue o motor a uma velocidade adequada para uma vazão de 0,25 mL/min. Em seguida, conecte-se e ligue o aquecedor de solução em linha definido para 37 °C.
- Conecte o aquecedor objetivo e defina para 37 °C, aplique óleo ao objetivo e insira a câmara de perfusão na montagem do palco.
- Aplique óleo na almofada de aquecedor de câmara e conecte-se à câmara de perfusão. Conecte e ligue o aquecedor da câmara; definido para 37 °C.
NOTA: Mudanças na temperatura podem fazer com que bolhas se formem na câmara de perfusão devido à desgaseamento da solução. Se as bolhas se formarem, aumente brevemente a taxa de fluxo da solução em 5-10x até que as bolhas limpem a câmara. - Tranque a câmara de perfusão no adaptador de palco e leve o óleo objetivo para contato com a tampa na parte inferior da câmara.
NOTA: A câmara Bioptechs com adaptador de estágio ASI usado aqui foi projetada para uma configuração de microscópio invertido.
5. Ativação da fluorescência e aquisição de imagens
- Usando iluminação de campo brilhante, concentre-se na camada de axônios na superfície inferior do nervo mais próximo da superfície de deslizamento de tampas(Figura 2B). Axônios mielinados (tipicamente de 1 a 6 μm de diâmetro em camundongos adultos) podem ser identificados pela presença de uma baia de mielina, que é visível sob iluminação de luz transmitida de campo brilhante sem aprimoramento de contraste. Fissuras e nódulos de Ranvier schmidt-lanterman também são facilmente aparentes. Os axônios nãoomiados são mais finos (tipicamente <1 μm de diâmetro) e geralmente estão presentes em pacotes (pacotes Remak), onde geralmente são muito próximos para serem resolvidos um do outro.
- Se estiver disponível no microscópio, ative o sistema de foco automático para manter o foco ao longo da imagem timelapse.
- Adquira uma imagem de referência brightfield. Regisso da orientação do nervo (extremidades proximais e distais da coluna vertebral) em relação às imagens.
- Adquira uma imagem confocal usando um laser de 488 nm e um filtro de emissão apropriado para paGFP (por exemplo, 525/50 nm) para registrar a autofluorescência pré-alvejante. Mantenha a potência do laser baixa para minimizar o fotobleaching, com o tempo de exposição ajustado de acordo para detectar o sinal fraco. Como exemplo, os dados representativos foram adquiridos com 5% de potência laser e exposições de 4 s. Registo as configurações de aquisição para uso em todos os experimentos futuros.
NOTA: Após a fotoativação, as configurações ideais de imagem produzirão uma relação sinal-ruído > 8 e fotobleaching de menos de 25% do sinal original ao longo de 20 imagens. Os axônios também podem ser imagens por microscopia de epifluorescência widefield como fizemos originalmente7,mas a qualidade da imagem será inferior devido à falta de confocalidade. - Defina a potência laser para aproximadamente 5x potência normal de imagem e adquira uma imagem com um tempo de exposição de 3-4 minutos. Embora não seja essencial, este passo é recomendado para branquear a autofluorescência e outras fontes de fluorescência indesejada, a fim de reduzir o sinal de fundo e, assim, maximizar o sinal-ruído da fluorescência fotoativada.
- Adquira uma imagem com as configurações usadas na etapa 5.4 para registrar a autofluorescência de pré-ativação após esta etapa de branqueamento.
- Na imagem brightfield, desenhe uma linha paralela aos axônios com um comprimento igual ao tamanho da janela de ativação desejada. O comprimento desta janela variará dependendo do objetivo experimental e parâmetros, mas os comprimentos típicos são de 5 μm para o paradigma de fuga de pulso e 40 μm para o paradigma de difusão de pulso.
- Usando esta linha como guia, desenhe uma região retangular de interesse (ROI) através do campo de visão perpendicular aos axônios. A região deve abranger todos os axônios a serem fotoativados.
- Determine as configurações ideais para fotoativação com iluminação de 405 nm.
NOTA: Somente realize esta etapa e sub-passos antes da primeira ativação experimental. Ao longo de um experimento, devem ser utilizadas as mesmas configurações de fotoativação.- Ative uma região de interesse repetidamente usando a linha laser de 405 nm, baixa potência laser (por exemplo, 5%) e tempo de moradia de pixels (por exemplo, 40 μs), e um pulso, adquirindo uma imagem da fluorescência GFP ativada após cada ativação. Repita até que a fluorescência não aumente mais e, em seguida, quantifique a fluorescência em uma região de interesse para cada imagem.
- Plote as intensidades médias de fluorescência versus número de pulso. Selecione o número de pulsos após o qual a fluorescência não aumenta mais como o número ideal de pulsos para ativação.
- Ative a fluorescência paGFP da região desenhada na etapa 5.8 por excitação padronizada com luz de 405 nm. Certifique-se de que uma imagem seja adquirida pouco antes e apenas após a ativação.
NOTA: A ativação ideal do paGFP produzirá uma região claramente definida de fluorescência com limites afiados contidos no ROI. - Inicie um temporizador de 1 minuto à medida que a ativação terminar. No final de 1 minuto, comece a aquisição de uma série timelapse.
NOTA: O atraso de 1 minuto é necessário para permitir o aumento da fluorescência observada após a fotoativação do paGFP11. Para o método de difusão de pulso, um período de aquisição de 5-10 minutos com intervalos de timelapse de 30 segundos é suficiente para a medição das encostas iniciais nas janelas centrais e de flanqueamento para medir a velocidade e a direcionalidade. Para o método de fuga de pulso, um período de aquisição de 30-150 minutos com intervalos de timelapse de 5 ou 10 minutos permite a análise do comportamento de pausa a longo prazo dos filamentos - Salve todas as imagens adquiridas, bem como o ROI utilizado para ativação de fluorescência.
- Mova-se para uma nova região do nervo e repita as etapas 5.1-5.11. Se a nova região estiver ao longo do mesmo axônio, deve ser pelo menos 500 μm da região anteriormente ativada para evitar a detecção de neurofilamentos fluorescentes que saíram da outra região ativada. A aquisição do timelapse final deve terminar antes do fim da janela de 3 horas.
NOTA: É possível que a preparação possa ser viável por mais de 3 horas, mas não confirmamos isso. Com dissecção e preparação proficientes, entre cinco e oito conjuntos de imagens timelapse de 10 minutos podem ser adquiridos dentro desta janela de 3 horas. - Após a aquisição da série final de imagens timelapse, pare o fluxo de soro fisiológico, desconecte a solução e os aquecedores de câmara e remova o aparelho de perfusão do estágio do microscópio.
6. Aquisição de imagem flatfield e darkfield
- Faça uma solução de fluoresceína adicionando 250 mg de pó de fluoresceína a 0,5 mL de água dupla destilada. Misture até que não haja partículas visíveis e gire a solução por 30 segundos em uma centrífuga de mesa para sedimentar qualquer material não resolvido. Esta solução pode ser armazenada por vários meses a 4 °C se protegida da exposição à luz.
- Adicione 8 μL de solução de fluoresceína a um slide e aplique uma folha de cobertura de #1,5. Borrar o excesso de líquido, selar com esmalte e deixar secar.
NOTA: Nesta alta concentração, a forte absorção do corante fluoresceína extingue o feixe iluminador dentro da solução, produzindo um fino plano de fluorescência na superfície do deslizamento de tampas que é uniforme e resistente ao fotobleaching devido à rápida troca difusiva12. - Coloque a cobertura do slide fluoresceína para baixo no estágio do microscópio invertido e ajuste o foco no fino plano de fluorescência na superfície do deslizamento. Mova-se ao redor do slide para encontrar um campo de visão que não contenha bolhas de ar (manchas escuras) ou grandes partículas de fluoresceína (pontos brilhantes).
- Adquira uma pilha z de 6 μm a intervalos de 0,2 μm, de modo que a imagem do meio seja o plano de foco original. Use um curto tempo de exposição (por exemplo, 40 ms) porque a fluorescência será muito brilhante. Esta aquisição de pilha z é necessária para capturar a fluorescência máxima através do campo de visão, pois o deslizamento de cobertura raramente é perfeitamente horizontal e o plano de fluorescência fluoresceína é muito estreito. Repita isso para um total de 25 campos de visão, movendo o palco em pelo menos 20 μm em qualquer direção entre os campos.
- Feche todas as persianas do caminho da luz, incluindo o obturador da câmera, e ajuste a potência do laser e o tempo de exposição a zero. Adquira uma pilha de 100 imagens com essas configurações. Essas imagens serão mediadas para gerar a imagem darkfield, que será usada para corrigir a corrente escura e o viés compensado no chip da câmera.
NOTA: A aquisição por streaming é uma maneira ideal de capturar essas imagens.
7. Imagem glicolicoticamente inibiu nervos para correção de alvejante
- Fazer e oxigenar uma solução salina como na etapa 1; no entanto substitua 2-desoxi-D-glicose para D-glicose e adicione 0,5 mM de iodoacetato de sódio para inibir a glicolise13. Nós nos referimos a isso como "soro fisiológico inibidor".
- Repita as etapas 2-5 usando o soro fisiológico inibidor, com uma imagem timelapse de 10-30 minutos definida na etapa 5.11. Permita 40-50 minutos após a aplicação de soro fisiológico inibidor antes da imagem para garantir a inibição completa do transporte neurofilamento.
NOTA: A inibição glicolítica acabará por matar os axônios, de modo que há uma janela estreita de tempo após a inibição para adquirir dados, tipicamente cerca de 30 minutos. Um indicador do nível de inibição metabólica é a autofluorescência flavina das mitocôndrias axonanas, que podem ser detectadas na série timelapse devido às longas exposições que usamos para a imagem da fluorescência paGFP14. Normalmente, a autofluorescência mitocondrial aumentará durante o tratamento com soro fisiológico inibidor. Se as mitocôndrias começarem a arredondar ou fragmentar, então cessem a imagem.
8. Processamento e análise de imagem usando ImageJ
- Correção flatfield e darkfield
- Abra a pilha de imagens de darkfield e média das imagens clicando em Imagem | Pilhas | Projeto Z e seleção de intensidade média no menu suspenso para gerar a imagem de darkfield.
- Abra as pilhas de imagens de campo plano fluorescein e crie uma projeção de intensidade máxima de cada um (25 no total) clicando em Imagem | Pilhas | Projeto Z e seleção de Intensidade Máxima no menu suspenso.
- Combine as 25 imagens máximas de projeção resultantes em uma pilha clicando em Imagem | Pilhas | Imagens para Stack. Crie uma projeção de intensidade média desta pilha clicando em Imagem | Pilhas | Projeto Z e seleção de intensidade média do menu suspenso para gerar a imagem flatfield.
- Subtraia a imagem do campo escuro da imagem flatfield clicando em Process | Calculadora de imagens,selecionando Subtrato como operação. Certifique-se de que a opção de resultado de 32 bits (flutuação) seja verificada. O resultado é a imagem de flatfield corrigida.
- Meça a intensidade média do pixel da imagem plana corrigida clicando primeiro em Analisar | Defina medidas e verifique a caixa de valor cinza Média e, em seguida, pressione a tecla 'm'.
- Divida a imagem plana corrigida por sua intensidade média clicando em Process | Matemática | Divida e digite o valor cinza médio obtido na etapa 7.1.5. Isso produzirá a imagem de ganho inverso.
- Abra as imagens de pré-ativação e pós-ativação, juntamente com a pilha de imagens timelapse. Combine as imagens em uma única pilha clicando em Imagem | Pilhas | Ferramentas | Concatenare selecionar as imagens em ordem cronológica nos menus suspensos. Certifique-se de que a opção abrir como imagem 4D não esteja selecionada. A pilha resultante é o conjunto de imagens completo.
- Repita o passo 8.1.4 no conjunto completo de imagense, em seguida, divida o resultado pela imagem de ganho inverso clicando em Processo | Calculadora de imagem e seleção de Dividir como operação. Isso produzirá o conjunto de imagens completa corrigida,no qual cada imagem foi corrigida para a não uniformidade no campo de iluminação e no detector.
- Alinhamento da pilha de imagens
- Para corrigir o desalinhamento dos planos de imagem na série timelapse devido à deriva de estágio ou amostra, instale o Alinhamento por plugin de região fixa (Arquivo Suplementar 1) clicando em Plugins | Instale o PlugIn,navegando até a pasta que contém o arquivo plugin e selecionando o plugin. Reinicie o ImageJ após a instalação do plugin.
NOTA: Este plugin alinha imagens com base no princípio "menos quadrados congestionando"princípio 15. - Desenhe um ROI no conjunto de imagem completo corrigido que abrange vários axônios e não se estende além dos limites proximais e distais da fluorescência ativada dentro de cada um dos axônios. A geometria da região não é importante, porém excluindo áreas em que as estruturas mudam de forma ou tamanho melhorará o alinhamento.
- Execute o plugin de alinhamento clicando em Plugins | Alinhamento por região fixa. O plugin coloca um máximo padrão de 2 pixels no deslocamento entre os quadros, no entanto, isso pode ser ajustado na janela pop-up inicial se houver uma deriva significativa da amostra. O alinhamento pode levar vários minutos, dependendo do tamanho da pilha de imagens.
- Inspecione visualmente a pilha alinhada para avaliar a qualidade do alinhamento. Alguns quadros podem então precisar ser alinhados manualmente, pois o alinhamento automatizado pode não funcionar bem para grandes flutuações na fluorescência entre os quadros. Isso pode ser feito ao visualizar um quadro que deve ser deslocado clicando em Imagem | Transformar | Traduzir. Clique em Não no pop-up a seguir perguntando se toda a pilha deve ser traduzida. Use apenas valores de pixels inteiros na tradução e certifique-se de que o menu de interpolação suspenso seja definido como Nenhum,pois mudanças fracionadas de pixels ou interpolação alterarão os dados devido à resamplagem das intensidades dos pixels.
- Guarde isso como o conjunto de imagens completas alinhados.
- Para corrigir o desalinhamento dos planos de imagem na série timelapse devido à deriva de estágio ou amostra, instale o Alinhamento por plugin de região fixa (Arquivo Suplementar 1) clicando em Plugins | Instale o PlugIn,navegando até a pasta que contém o arquivo plugin e selecionando o plugin. Reinicie o ImageJ após a instalação do plugin.
- Medição das intensidades de fluorescência
- Desenhe um ROI usando a ferramenta Ângulo no primeiro quadro do conjunto de imagem completo alinhado com o primeiro braço ao longo de uma borda da região ativada, perpendicular aos axônios e o segundo braço vertical. Pressione a tecla 'm' para medir o ângulo, que descreve a orientação dos axônios no campo de visão.
- Defina a escala das imagens para que as dimensões sejam medidas em mícrons clicando em Analisar | Defina escala e digite os valores apropriados.
- Abra o gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI. Para o paradigma de fuga de pulso, pule para o passo 8.3.7. Para o pulso espalhado, continue a passo 8.3.4.
- Desenhe um ROI quadrado de qualquer dimensão e clique em Editar | Seleção | Especifique. Certifique-se de que a opção unidades dimensionadas seja verificada e, em seguida, ajuste o ROI para uma largura de 15μm e uma altura igual ou superior à altura da imagem.
- Gire o ROI pelo ângulo medido na etapa 8.3.1 clicando em Editar | Seleção | Gire para torná-lo perpendicular aos axônios, e coloque o ROI com um lado ao longo da borda proximal da região ativada. Adicione este ROI, que vamos chamar de ROI guia proximal, ao gerente pressionando a tecla 't'.
- Arraste o ROI para se alinhar com a borda distal da região ativada e adicione novamente ao gerenciador de ROI pressionando a tecla 't'. Vamos nos referir a isso como o guia distal ROI. Os ROIs do guia proximal e distal serão usados posteriormente para desenhar os ROIs de medição de flanqueamento.
- Selecione axons para quantificação, usando a sequência de imagem timelapse adquirida na etapa 5.11 acima. Esta sequência de imagem é útil para este fim porque captura a fraca autofluorescência dos axônios, revelando sua morfologia fora da região ativada.
NOTA: Os Axônios que não atendam aos seguintes critérios são excluídos da análise:- Os axônios devem estar em foco ao longo de toda a extensão de todas as janelas de medição.
- Os axônios devem estar dentro de 5° do perpendicular às extremidades proximais e distais da região de ativação.
- Os axônios não devem ter invaginações dentro de 5μm das extremidades proximais e distais da região de ativação.
- Exclua axônios que mudam de forma visivelmente durante o curso da imagem.
- Exclua axônios que pareçam insalubres como evidenciado pela ausência de uma região ativada discreta na imagem pós-ativação(Figura 2C, inferior), pois isso é indicativo de dispersão difusiva da fluorescência ativada, que acontece quando o axônio morre.
- Observe a imagem de branqueamento de longa exposição da etapa 5.5 para estruturas autofluorescentes dentro dos axônios. Esta fluorescência é devido a flavinas dentro das mitocôndrias16. Exclua os axônios da análise se essas mitocôndrias aparecerem arredondadas ou fragmentadas(Figura 2D, inferior), em oposição a estruturas lineares estendidas(Figura 2D, topo), pois isso é uma indicação de declínio metabólico.
- Utilizando os ROIs de guia proximal e distal criados acima, desenhe três ROIs de medição por axônio sendo analisados: uma janela central que abrange o axônio dentro da região ativada de 40 μm, e duas janelas de flanqueamento com largura restrita pela janela de flanqueamento 15 μm ROIs e altura restrita pelo diâmetro do axônio na borda da região de ativação. Adicione as três regiões ao gerente do ROI. Para axônios glicolíticos inibidos, desenhe uma única região que não tenha mais de 5 μm de largura no meio da região ativada e que não se estenda fora do axônio. Para o paradigma de fuga de pulso, a região ativada tem apenas 5 μm de largura, por isso toda a janela deve ser usada.
- Repita a etapa 8.3.9 para todos os axônios que atendam aos critérios das etapas 8.3.7 e 8.3.8.
- Definir medições ativas para intensidade média de pixels clicando em Analisar | Defina medidas e selecione a opção De valor cinza Médio. Certifique-se de que nenhuma outra opção de medição seja verificada.
- Selecione todos os ROIs na janela ROI Manager selecionando a janela e pressionando 'Ctrl' + 'a'. Na janela ROI Manager, clique em Mais | Multi Medida para medir as intensidades de fluorescência. Copie os dados da janela de resultados para uma planilha para análise posterior.
- Definir medições ativas para a área da região clicando em Analisar | Defina medidas e selecione a opção Área. Certifique-se de que nenhuma outra opção de medição seja verificada.
- Repita o passo 8.3.12. Só é necessário copiar uma linha dos resultados para a área, pois a área não varia de acordo com o tempo.
9. Correção de fotobleach
- Na planilha de dados para axônios glicolíticos inibidos, subtraia a fluorescência média do quadro 1 (o quadro de pré-ativação) da fluorescência média de cada quadro a partir do quadro 3 (o primeiro período timelapse) para um determinado ROI. Os resultados são os meios subtraídos em segundo plano.
- Plote os dados como uma tabela de dispersão com os números de quadros como a abscissa. Encaixe uma linha de tendência exponencial aos dados de cada ROI (a maioria dos programas de planilha tem essa função) com uma equação na forma de Ae-bx. Esta equação é equivalente à função fotobleaching Ft = F0 * e-tɣ onde F0 é a fluorescência no primeiro quadro do timelapse, ɣ é a taxa de branqueamento exponencial, t é o tempo, e e é a base natural do logaritmo.
- Repita as etapas 9.1.1-9.1.2 para todos os ROIs de todos os axônios dos nervos glicolíticos inibidos. Para a estimativa mais precisa da taxa de fotobleaching, use pelo menos 15 axônios no total de pelo menos 5 nervos separados. Use a média das taxas de branqueamento exponencial (ɣ) de todos os axônios inibidos para corrigir os dados experimentais para fotobleaching. Uma nova calibração de branqueamento deve ser realizada para cada experimento ou estudo, pois o fotobleaching depende das configurações de aquisição de imagem e da potência do laser, que pode mudar com o tempo.
- Repita o passo 9.1.1 para todas as regiões de axônios com soro fisiológico normal (ou seja, não glicolítico inibido).
- Divida cada ponto de dados por e-tɣ, utilizando o tempo para t e a média ɣ encontrada na etapa 9.1.3. Estes são os meios corrigidos por fotobleach.
- Multiplique cada ponto de dados pela área para que essa região de interesse encontre a fluorescência total naquela região a cada momento.
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Representative Results
A Figura 3 mostra imagens representativas de experimentos de fuga de pulso e propagação de pulso. Publicamos diversos estudos que descrevem dados obtidos utilizando o método pulse-escape e nossos métodos para a análise desses dados5,,6,7,,8,,17. Abaixo, mostramos como os dados de difusão de pulso podem produzir informações sobre a direcionalidade e velocidade do transporte de neurofilamento, que não reportamos anteriormente.
O transporte de neurofilamento no axônio é intermitente e bidirecional. Este transporte pode ser descrito pela fração de filamentos movendo-se a qualquer momento nas direções anterograda e retrógrada, 
e 
respectivamente, e suas velocidades nas direções anterogradas e retrógradas, denotadas por 
e 
. Se tomarmos a quantidade total de polímero de neurofilamento por unidade de comprimento de axônio para 
ser, então os fluxos nas direções anterogradas e retrógradas através de uma determinada região são dadas por
E
,
respectivamente, e o fluxo total 
é dado por
,
onde 
tem unidades μm-1, 
tem unidades e tem 
unidades. Uma vez que o fluxo em um determinado local ao longo do axônio é a quantidade de polímero de neurofilamento que passa por esse local em uma unidade de tempo, está relacionado com a velocidade média 
através 
de . Assim, podemos escrever
.
Em um experimento de propagação de pulso, o fluxo pode ser determinado a partir da taxa de partida dos neurofilamentos fluorescentes da região ativada, que chamamos de janela central. A perda total de polímero de neurofilamento fluorescente desta janela central por segundo 
é a soma das perdas devido aos polímeros de neurofilamento fluorescente saindo em direções anterogradas e retrógradas, ou seja.
Normalizada ao teor inicial de polímero de neurofilamento fluorescente na janela central, 
ou seja, onde 
está o comprimento da janela central, essa taxa de perda se torna então
onde 
está a inclinação da diminuição da fluorescência na janela central, que é inicialmente linear por um período de tempo dado por 
8. Para uma janela central de 40 μm, isso equivale a apenas dezenas de segundos. No entanto, para janelas tão grandes, a transição para a fase de decadência exponencial é gradual e a inclinação é efetivamente linear por vários minutos ou mais8.
Nos primeiros tempos, as janelas de flanqueamento capturam todos os neurofilamentos que saem da janela central porque esses filamentos não têm tempo suficiente para passar pelas janelas de flanqueamento e sair do outro lado. Neste caso, as quantidades de polímero de neurofilamento fluorescente que deixam a janela central anterogradely e retrógradamente por segundo, ou seja, os fluxos 
e, são dadas pelo aumento do conteúdo de neurofilamento 
e nas janelas de 
flanqueamento. Normalizadas ao teor inicial de polímero de neurofilamento fluorescente na janela central, as taxas de aumento nas janelas de flanqueamento tornam-se
onde 
e são as 
encostas do aumento da fluorescência nas janelas de flanqueamento proximal e distal, respectivamente.
Assim, podemos expressar a velocidade média em termos das encostas nas janelas de flanqueamento, ou seja.
(Eq. 1)
e a razão do número de neurofilamentos móveis anterogrados e retrógrados em termos da razão dessas encostas, ou seja.
(Eq. 2)
onde 
e 
denotar as taxas em que os neurofilamentos se invertem de anterogradely para retrógradamente em movimento e vice-versa8. Os valores 
e 
podem ser determinados medindo o movimento de neurofilamentos individuais em neurônios cultivados, conforme relatado anteriormente17. É importante ressaltar que a expressão para a velocidade em Eq. 1 só se aplica em poucos momentos após a ativação durante a qual neurofilamentos fluorescentes entram na janela de flanqueamento, mas não saem. A duração desta janela de tempo curto dependerá do comprimento das janelas de flanqueamento e da cinética do movimento de neurofilamento. Quanto mais longas as janelas de flanqueamento, em princípio, maior a janela de tempo. Teoricamente, pode-se testar que esse critério é atendido confirmando que
(Eq. 3)
Em contraste com a expressão para a velocidade em Eq. 1, que é dada pela diferença entre as encostas nas janelas de flanqueamento, a expressão para a direcionalidade em Eq. 2 é robusta ao tamanho da janela de flanqueamento porque é dada pela razão das encostas nas janelas de flanqueamento.
A Figura 3 mostra resultados representativos de experimentos de fuga de pulso e difusão de pulso em axônios mieliados no nervo tibial de um rato macho de 8 semanas de idade da nossa linha hThy1 paGFP-NFM em um fundo C57Bl/6J, usando tamanhos de janelas de 5 e 40 μm, respectivamente. Camundongos de pelo menos 2 semanas de idade, tanto masculinos quanto femininos, têm sido usados para esses paradigmas experimentais. A idade e o sexo adequados devem ser determinados pelo pesquisador dependendo do que está sendo testado no estudo. Com o tempo, pode-se ver que as bordas das regiões ativadas desfocam devido à partida de neurofilamentos em direções anterogradas e retrógradas, resultando na perda da fluorescência da janela central.
Para o método de fuga de pulso(Figura 3A, C, E), a cinética de decaimento da fluorescência na região ativada pode fornecer informações sobre o comportamento de pausa a longo prazo e de curto prazo8,,18. Para esses experimentos, a região ativada pode ser curta (normalmente usamos 5 μm; ver caixa amarela na Figura 3A). Para o método de difusão de pulso(Figura 3B, D, F), usamos uma região ativada mais longa (40 μm aqui; ver caixa amarela na Figura 3B) a fim de fornecer uma piscina maior de neurofilamentos fluorescentes. Isso alonga o tempo sobre o qual o aumento da fluorescência nas regiões de flanqueamento permanece linear (veja acima). O domínio linear deste aumento de fluorescência nas janelas de flanqueamento também pode ser aumentado aumentando o comprimento dessas janelas, no entanto isso é limitado pelo tamanho do campo de visão. Utilizamos janelas de flanqueamento de 15 μm, mostradas em vermelho e verde, para os dados mostrados na Figura 3D.
A Figura 3E,3F mostra a quantificação das intensidades totais de fluorescência (ou seja, a soma das intensidades dos pixels) para as janelas de medição mostradas na Figura 3C,3D, respectivamente. Para o método de fuga de pulso, a decadência é bifásica, com uma decadência exponencial inicial que representa a partida de neurofilamentos na pista. Isso transita em torno de 10-20 minutos para uma segunda decadência exponencial mais lenta que representa a mobilização e partida de filamentos off-track8. Para comparação com o método de difusão de pulso, mostramos apenas um curso de tempo de 12 minutos na Figura 3E,mas geralmente o curso de tempo da análise precisa ser mais longo (tipicamente 30-120 minutos) para capturar a cinética de pausa a longo prazo5,,6,,18. Para a estratégia de propagação de pulso, os cálculos da velocidade e direcionalidade do movimento dependem apenas das encostas nas janelas de flanqueamento. Para os comprimentos da janela utilizados aqui, a fase linear se estende por cerca de 5 minutos. A duração desta janela de tempo de linearidade deve ser avaliada encurtando gradualmente o tempo utilizado para medir a inclinação, e determinando o ponto em que a inclinação não aumenta mais. Esta duração pode ser aumentada aumentando os comprimentos da janela se o campo de visão da câmera permitir, embora os comprimentos da janela devem ser mantidos constantes para todos os axônios em um determinado experimento. Como exemplo, usamos os primeiros 5 minutos de dados para medir as encostas dos dados de difusão de pulso na Figura 3F. Isso resulta em encostas de 72 A.U./min, -594 A.U./min, e 111 A.U./min para as janelas proximais, centrais e distais, respectivamente (A.U. = unidades arbitrárias). Para normalizar esses valores, são divididos pela fluorescência inicial da janela central, resultando em taxas de 0,108 %F0/min, -0,962 %F0/min e 0,173 %F0/min. Aplicando Eq. 3 constatamos que o critério de conservação não é atendido, indicando que não estamos capturando toda a fluorescência nas janelas de flanqueamento. Esta é uma limitação técnica devido ao campo de visão da nossa câmera EMCCD (82 μm x 82 μm). Câmeras com chips sCMOS, que podem ter campos de visão muito maiores, poderiam permitir o uso de tamanhos de janelas de flanco maiores. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que essa discrepância entre as encostas centrais e de flanqueamento também possa ser devida, pelo menos em parte, à subestimação da extensão do fotobleaching (ver Discussão), o que teria o efeito de subestimar as encostas positivas nas janelas de flanqueamento e superestimar a inclinação negativa na janela central.
Das taxas nas janelas de flanqueamento (%F0/min) e Eq. 2 acima, e usando valores de 
e 
17,calculamos a razão 
= 2,12. Isso indica que 68% dos filamentos estavam se movendo anterograde e 32% retrógrados. Utilizando as mesmas taxas e Eq. 1 acima, calculamos a velocidade média da população líquida 
= 40*(0,00173-0,00108) = 0,026 μm/min, ou 0,037 mm/dia. Estudos radioisotópicos de rotulagem de pulso em camundongos de idade semelhante relataram uma velocidade populacional de neurofilamento de aproximadamente 0,6 mm/dia nas porções mais proximais do nervo ciático, diminuindo para 0,12 mm/dia a uma distância de dois centímetros19,20. Nossos dados de propagação de pulso foram coletados no nervo tibial, aproximadamente mais 2-3 centímetros distal a essas medidas. Pelas razões mencionadas acima, acreditamos que a estimativa de 0,037 mm/dia é uma subestimação da verdadeira velocidade. No entanto, extrapolando a desaceleração espacial observada pela rotulagem de pulso radioisotópica no nervo tibial esta estimativa não é irracional, especialmente quando consideramos que foi determinada usando uma metodologia muito diferente em uma escala espacial e temporal muito diferente.
Para demonstrar a capacidade do método de propagação de pulso para detectar diferenças significativas entre as populações, comparamos as encostas de flanqueamento proximal e distal medidas a partir de nervos perfumados com soro fisiológico normais e inibidores. A inibição da glicólise bloqueia o movimento dos neurofilamentos, como já noticiamos anteriormente5,,6,7. Discutiremos mais tarde a seleção de tamanhos amostrais para experimentos, porém aqui usamos um nervo em soro fisiológico normal e dois em soro fisiológico inibidor, devido à limitação de um campo de aquisição por nervo durante a inibição. A Figura 4A mostra um exemplo de timelapse de um nervo glicógliticamente inibido, demonstrando uma aparente redução no transporte para fora da região ativada. De fato, encontramos inclinações distal e proximais significativamente menores (Figura 4B, p = 0,00000639 e 0,0121, respectivamente, a comparação paira de Tukey após ANOVA) em nervos tratados com soro fisiológico inibidor versus aqueles perfumados com soro fisiológico normal. Também encontramos uma diminuição significativa da velocidade populacional entre essas duas condições (Figura 4C, p = 0,0232, teste t com variâncias desiguais, após teste F para igual variância com p = 0,0190).
Figura 1: A câmara de perfusão. (A) Diagrama mostrando a montagem da carcaça da câmara de perfusão e da junta externa, com tubos conectados à seringa salina e frasco de resíduos. (B) Diagrama mostrando a montagem da própria câmara. A junta interna é colocada plana em cima da #1,5. O nervo é colocado na tampa no poço criado pela abertura retangular da junta interna. O slide microacoduto é colocado sobre o nervo para sanduichar o nervo entre o deslizamento de cobertura #1,5 e o slide microacoduto. Finalmente, o sanduíche é virado antes de montar em cima da junta externa do conjunto mostrado em (A) e fixado com um anel de bloqueio (não mostrado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A preparação do nervo tibial. (A) Imagem mostrando a localização do nervo tibial dentro da perna de um camundongo, na qual os músculos glúteos superficial, bíceps femoris, semitendinoso, popliteus, tibialis caudalis e flexor digitorum longus foram removidos. O nervo tibial pode ser visto como um dos três principais ramos do nervo ciático que surge no joelho. (B) Esquema do nervo em seção transversal na câmara montada, mostrando o objetivo de imersão de óleo sob a mancha de cobertura. A melhor qualidade óptica é obtida ativando e imagens da camada de axônios appostos à superfície do deslizamento de tampa; a qualidade da imagem diminui mais profundamente no nervo devido à dispersão de luz. (C) Exemplos de um axônio saudável (superior) e de um axônio insalubre (inferior) imediatamente após a ativação. A linha amarela tracejada marca a região ativada. A fluorescência ativada tem limites acentuados no axônio saudável, enquanto no axônio insalubre a fluorescência ativada se difusa rapidamente para fora da região ativada, preenchendo o axônio em segundos. Barra de escala = 10 μm. (D) Exemplos da aparência mitocondrial em um axônio saudável (superior) e um axônio insalubre (inferior). As mitocôndrias são visíveis devido à autofluorescência flavin16. Eles aparecem lineares (pontas de flecha sólida) em axônios saudáveis. Em axônios insalubres, as mitocôndrias primeiro se tornam pontuadas (pontas de flecha abertas) e, posteriormente, mais fracas ao longo do tempo, fornecendo um indicador de saúde do axônio. A ponta de flecha aberta tracejada no axônio saudável aponta para uma mitocôndria em transição de linear para pontual. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Experimentos de fuga de pulso e propagação de pulso. Exemplo de imagens de pré-ativação, pós-ativação e timelapse de axônios mieliados no nervo tibial de um rato de 8 semanas de idade em (A) um experimento de fuga de pulso e(B) um experimento de propagação de pulso. A imagem de pré-ativação é o painel superior, com as imagens pós-ativação abaixo. Os carimbos de hora mostram o tempo decorrido após a ativação. As caixas amarelas representam a região ativada. Essas ativações foram realizadas utilizando-se 5 varreduras com um tempo de moradia de 40 μs pixel e 5% de potência laser. Barras de escala = 10 μm. (C) Os ROIs de medição (amarelo) para três axônios em um experimento de fuga de pulso. (D) Os ROIs de medição proximal (vermelho), central (amarelo) e distal (verde) para três axônios em um experimento de propagação de pulso. Os ROIs de medição para cada axônio são mostrados em vermelho sólido (proximal), amarelo sólido (janela central) e verde sólido (janela distal). (E) Parcela da fluorescência média versus tempo, média dos 3 axônios em C. Linha tracejada é uma função exponencial adequada aos dados, da forma Ft = Ae-τt,como descrito anteriormente7. F) Parcelas da fluorescência nos ROIs centrais, distal e proximal versus tempo, média de 14 axônios incluindo os três axônios em D. A inclinação é calculada a partir de linhas de tendência adequadas aos primeiros 5 minutos de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O efeito dos inibidores metabólicos no transporte de neurofilamento. (A) Exemplo de imagens timelapse de um nervo pré-tratado com 5,6% (w/v) 2-desoxy-glicose e 0,5 mM de iodoacetato de sódio para inibir a glicolise e esgotar o ATP celular. Note-se que os limites distal e proximal das regiões ativadas permanecem afiados, indicativo de uma inibição do transporte neurofilamento. Barra de escala = 10 μm. (B) Quantificação das encostas nas janelas de flanqueamento distal (D) e proximal (P) (anterograda e retrógrada, respectivamente), expressas como percentual de fluorescência inicial na janela central (%F0/min), de um nervo (14 axônios) utilizando soro fisiológico padrão e de dois nervos (8 axônios) pré-tratados com soro fisiológico contendo os inibidores glicósticos. (C) Velocidades populacionais de neurofilamento calculadas a partir de encostas nas janelas de flanqueamento, mostrando uma diminuição significativa na velocidade após o tratamento inibidor. - p < 0,005; ** - p < 0,01; * - p < 0,05. Os dados mostram prejuízo significativo do transporte neurofilamento na presença dos inibidores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Deve-se tomar cuidado na análise de experimentos de fuga de pulso e difusão de pulso, pois há um potencial significativo para a introdução de erros durante o pós-processamento, principalmente durante a correção de campo plano, alinhamento de imagem e correção de alvejante. A correção em campo plano é necessária para corrigir a não uniformidade na iluminação, o que resulta em uma queda de intensidade em todo o campo de visão do centro para a periferia. A extensão da não uniformidade é dependente do comprimento de onda e, portanto, deve ser sempre realizada no comprimento de onda que deve ser usado para a aquisição dos dados experimentais. É importante garantir que a não uniformidade na imagem de campo plano seja verdadeiramente representativa da não uniformidade nas imagens a serem corrigidas. Experimentos de propagação de pulso são particularmente vulneráveis a erros de correção inadequada de campo plano porque os ROIs de medição se estendem para a periferia da imagem onde a queda de intensidade é maior.
As configurações ideais de ativação paGFP variam de acordo com o método de ativação e parâmetros laser, e devem ser determinadas empiricamente antes da primeira sessão de imagem. Pouca ativação resultará em uma baixa relação sinal-ruído para a fluorescência ativada, enquanto muito resultará em branqueamento da fluorescência ativada porque tanto o paGFP não ativado quanto ativado podem ser animados pela luz violeta. Para iluminar seletivamente uma região de interesse pela imagem, utilizamos um scanner de galvo laser Andor FRAPPA, que gera uma região claramente definida de fluorescência com limites afiados, como mostrado nos Resultados Representativos. Também tivemos sucesso usando um Diafragma Digital Andor Mosaic, que é um dispositivo micromedor digital, com uma lâmpada de arco de mercúrio como fonte de iluminação7. Outras opções estão disponíveis comercialmente. Um desafio ao trabalhar com paGFP é o aumento retardado da intensidade de fluorescência que acontece dentro de 1 minuto após a etapa de fotoativação. Esse aumento ocorre porque a iluminação com luz violeta faz com que uma proporção das moléculas paGFP ativadas entrem em um "estado escuro" do qual podem relaxar de volta em um curso de tempo de dezenas de segundos11. Em nossa experiência, o aumento geralmente é inferior a 5% com excitação widefield, mas pode exceder 20% com excitação a laser, o que pode levar a uma subestimação significativa da fluorescência ativada. Contamos com isso adquirindo uma segunda imagem de "pós-ativação" da fluorescência paGFP 1 minuto após a fotoativação e, em seguida, usando esta imagem como ponto de referência para o timelapse subsequente. No entanto, é importante reconhecer que isso introduz outra fonte potencial de erro na determinação da fluorescência inicial e da cinética de decaimento em tempos iniciais.
Deve-se prestar atenção adicional ao alinhamento das pilhas de imagens. A principal fonte de desalinhamento é a deriva ou outro movimento do espécime durante a aquisição de imagens timelapse. Isso pode ser minimizado usando juntas internas da espessura apropriada e permitindo que a preparação "se instale" antes da imagem. No entanto, qualquer atraso reduzirá o tempo disponível para aquisição de imagens, uma vez que a preparação tem uma janela limitada de viabilidade. Também é importante evitar algoritmos de alinhamento que distorcem a imagem ou introduzem mudanças de sub-pixel, pois esses procedimentos aumentariam a intensidade dos pixels na imagem. Experimentos de propagação de pulso são particularmente vulneráveis a erros decorrentes de alinhamento inadequado porque as fronteiras da região de fluorescência ativada são relativamente nítidas, e a fluorescência nesta região é significativamente maior do que as regiões não ativadas de flanqueamento. Mesmo um leve desalinhamento dos planos de imagem na pilha pode resultar em grandes saltos nos valores de fluorescência nas janelas de medição distal e proximal. Assim, é imprescindível que os conjuntos de imagens sejam alinhados adequadamente e inspecionados cuidadosamente antes de prosseguir com a análise.
A correção para fotobleaching é necessária para garantir que mudanças na intensidade da fluorescência ao longo do tempo reflitam com precisão as mudanças na quantidade da proteína fluorescente. Tais correções podem ser uma fonte significativa de erro na estimativa das intensidades absolutas de fluorescência nas janelas centrais e de flanqueamento. Como a cinética fotobleaching depende da intensidade da iluminação e do ambiente do fluoróforo, as taxas reais de fotobleaching podem variar entre as sessões e do axônio ao axônio. Assim, é necessário medir vários axônios e mediar os dados resultantes, o que por si só introduz algum erro. A abordagem descrita acima é tratar o nervo com inibidores glicolíticos e, em seguida, ativar a fluorescência em uma região de interesse e acompanhar a perda de intensidade de fluorescência ao longo do tempo. Os inibidores glicolíticos esgotam o ATP e inibem o transporte de neurofilamento para que a perda de fluorescência seja inteiramente devido ao fotobleaching e não ao movimento de neurofilamentos para fora da região ativada. A cinética de branqueamento médio determinada dessa forma é usada para corrigir os dados experimentais. Uma vez que não é prático realizar uma calibração de branqueamento separada em cada sessão de imagem, uma única calibração deve ser aplicada a várias sessões espalhadas ao longo de muitas semanas. Uma desvantagem dessa abordagem é que ela não contabiliza variações na intensidade de potência/iluminação a laser do dia a dia, que, portanto, devem ser monitoradas. Uma abordagem alternativa, que chamamos de "correção de branqueamento intrínseco", é estimar o fotobleaching quantificando a fluorescência no centro da região ativada nos mesmos filmes timelapse que são usados para as medições de transporte. Se esta região de medição estiver localizada centralmente e muito menor do que o comprimento da região ativada, e então em pouco tempo quaisquer neurofilamentos fluorescentes que se movem para fora da região de medição serão substituídos por neurofilamentos fluorescentes que se movem para ela. No entanto, com o tempo, a probabilidade de neurofilamentos não fluorescentes se movendo para a região de medição a partir de regiões não fluorescentes do axônio aumenta, levando a uma superestimação da perda de fluorescência devido ao branqueamento. Uma vantagem dessa abordagem é que ela corrige para as características de branqueamento dentro desse mesmo campo, mas uma desvantagem é que a duração da janela de tempo deve ser determinada empiricamente e dependerá da taxa do transporte, bem como do comprimento da região ativada. Tudo isso dito, deve-se notar que a estimativa da direcionalidade do transporte de neurofilamento usando nosso método é robusta para erros de branqueamento (como é para flanquear o tamanho da janela) porque é dada pela razão das encostas nas janelas de flanqueamento e qualquer correção de branqueamento é um multiplicador aplicado tanto ao numerador quanto ao denominador nesse cálculo.
Devido ao ruído inerente a um sistema fluorescente e ao potencial de erro adicional adicionado durante as etapas pós-processamento da imagem descritas acima, é importante usar grandes tamanhos de amostra para poder estatístico suficiente. Embora não seja possível determinar com precisão os meios populacionais, desvios e tamanhos de efeito antes da experimentação, recomendamos usar o método Cohen21 assumindo um tamanho de efeito médio e um alfa de 0,05. Isso resulta em um Dde Cohen, que é a diferença de meios divididos pelo desvio padrão agrupado de ambas as populações, de 0,5, o que sugere a aquisição de pelo menos 105 amostras por grupo. Uma vez atingido esse limiar, pode-se realizar uma análise de poder pós-hoc para reavaliar o poder estatístico à luz das medidas populacionais reais. Em condições experimentais ideais, deve ser possível obter a partir de 1-7 axônios analisáveis (de 9-20 axônios totais) por ativação, e 5-8 ativações por nervo assumindo a aquisição de um timelapse de 10 minutos por ativação.
Camundongos transgênicos que expressam proteínas de fusão fluorescente direcionadas a mitocôndrias ou vesículas também têm sido usados para estudar o transporte axonal de organelas membranous em nervos periféricos ex vivo22,23,24,25. Além disso, o laboratório de Schiavo desenvolveu abordagens para a imagem do transporte axonal de organelas membranous móveis retrógradamente em axônios in vivo usando fragmentos de toxina tétano fluorescentemente marcados, que podem ser injetados no músculo e são tomados por terminais nervosos motoras26. No entanto, uma vez que organelas membranous podem ser resolvidas nestes axônios por microscopia de fluorescência, é possível analisar a velocidade e a frequência de seu movimento diretamente usando análise de timelapse ou kymograph. Os métodos de fuga de pulso e difusão de pulso descritos aqui foram desenvolvidos com o objetivo específico de analisar a cinética do transporte de neurofilamento nestes axônios, nos quais neurofilamentos únicos não podem ser resolvidos. Isso requer uma análise de nível populacional durante um período de minutos ou dezenas de minutos. Usamos um rato transgênico para este fim, mas também deve ser possível expressar a proteína fotoativat usando métodos como transdução viral ou na eletroporação do útero. Embora o foco tenha sido o transporte de neurofilamento, os métodos de fuga de pulso e difusão de pulso também podem ser adaptados para estudar o movimento de outras proteínas citoesqueletal e citosolíticas que são transportadas ao longo dos axônios nos componentes lentos do transporte axonal. Limitamos nossas análises a axônios micolinados porque seu tamanho e baialina nos permitem resolvê-los de seus vizinhos. Axônios não entregues não podem ser resolvidos devido ao seu pequeno calibre e tendência a agrupar-se em pacotes Remak. Descrevemos o uso de nervos tibiais ex vivo, mas os métodos também devem ser aplicáveis a outros nervos periféricos que são suficientemente longos (>5 mm) e não desbranchados. Em princípio, também deve ser possível adaptar esses métodos ao transporte de neurofilamento de imagem in vivo (por exemplo, expondo cirurgicamente um nervo em um rato sedado e, em seguida, colocando o rato em um estágio de microscópio).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer paula Monsma por instrução e assistência com microscopia confocal e dissecção do nervo tibial e Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger e Sana Chahande pela assistência com a criação de ratos. Este trabalho foi apoiado em parte pela Colaborativa National Science Foundation Grants IOS1656784 to A.B. e IOS1656765 a P.J., e Institutos Nacionais de Subsídios à Saúde R01 NS038526, P30 NS104177 e S10 OD010383 a A.B. N.P.B. foi apoiado por uma bolsa do Programa de Pós-Doutorado do Presidente da Universidade estadual de Ohio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
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