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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

A injeção intravenosa de células cancerígenas é frequentemente usada em pesquisas de metástase, mas a carga tumoral metastática pode ser difícil de analisar. Aqui, demonstramos um modelo de injeção de veias traseiras de metástase e incluímos uma nova abordagem para analisar a carga do tumor pulmonar metastático resultante.

Abstract

A metástase, a principal causa de morbidade e mortalidade para a maioria dos pacientes com câncer, pode ser desafiadora para modelar preclinicamente em camundongos. Poucos modelos de metástase espontânea estão disponíveis. Assim, o modelo experimental de metástase envolvendo injeção de veias traseiras de linhas celulares adequadas é um pilar da pesquisa de metástase. Quando as células cancerígenas são injetadas na veia traseira lateral, o pulmão é seu local preferido de colonização. Uma limitação potencial dessa técnica é a quantificação precisa da carga do tumor pulmonar metastático. Enquanto alguns pesquisadores contam macrometastases de um tamanho pré-definido e/ou incluem micrometastases após a secção do tecido, outros determinam a área de lesões metastáticas em relação à área normal do tecido. Ambos os métodos de quantificação podem ser extremamente difíceis quando a carga metastática é alta. Aqui, demonstramos um modelo de injeção intravenosa de metástase pulmonar seguido de um método avançado para quantificar a carga do tumor metastático usando o software de análise de imagem. Esse processo permite a investigação de múltiplos parâmetros de ponto final, incluindo tamanho médio de metástase, número total de metástases e área total de metástase, para fornecer uma análise abrangente. Além disso, este método foi revisado por um conselho veterinário certificado pelo American College of Veterinary Pathologists (SEK) para garantir a precisão.

Introduction

Apesar de ser um processo altamente complexo e ineficiente1, a metástase é um contribuinte significativo para a morbidade e mortalidade de pacientes com câncer2. De fato, a maioria das mortes relacionadas ao câncer é atribuída à disseminação metastática da doença3,4. Para que as células tumorais se metástasizem com sucesso, elas devem se desprender do local primário, invadir através do estroma adjacente, intravasar em circulação sanguínea ou linfáticos, viajar para o leito capilar de um local secundário, extravasar no tecido secundário e proliferar ou crescer para formar lesões metastáticas5. O uso de modelos de camundongos tem sido fundamental para promover a compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis pela semeadura metastática e crescimento6,7. Aqui, focamos na metástase do câncer de mama, para a qual tanto modelos de camundongos geneticamente modificados quanto métodos de transplante são frequentemente utilizados – cada um com seu próprio conjunto de vantagens e limitações.

Modelos de tumor mamário geneticamente modificados fazem uso de promotores específicos da glândula mamária, incluindo MMTV-LTR (vírus tumoramático de camundongos longa repetição terminal) e WAP (Whey Acidic Protein), para impulsionar a expressão de transgenes no epitélio mamário8. Oncogenes incluindo antígeno T médio de polioma (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 e vírus símio 40 (SV40) foram expressos desta forma9,10,11,12,13, e embora esses modelos genéticos sejam úteis para estudar a iniciação e progressão do tumor primário, poucos prontamente metástases para órgãos distantes. Além disso, esses modelos genéticos de camundongos são muitas vezes mais tempo e custo proibitivos do que modelos de metástase espontânea ou experimental. Dada a limitação da maioria dos modelos de tumores mamários geneticamente modificados para estudar a metástase, as técnicas de transplante tornaram-se métodos atraentes para estudar esse processo complexo. Isso inclui ortotópica, veia traseira, intracardiac e injeção intracraniana de linhas celulares adequadas.

Embora várias linhas de células cancerígenas de mama prontamente metástases após a injeção ortotópica na almofada de gordura mamária14,15, a consistência e a reprodutibilidade da carga tumoral metastática podem ser um desafio, e a duração desses estudos pode ser na ordem de vários meses. Para avaliar a metástase pulmonar, em particular, a injeção intravenosa na veia traseira é muitas vezes um método mais reprodutível e eficaz com propagação metastática tipicamente ocorrendo dentro do período de algumas semanas. No entanto, uma vez que o modelo de injeção intravenosa contorna as etapas iniciais da cascata metastática, deve-se tomar cuidado na interpretação dos resultados desses estudos. Nesta demonstração, mostramos a injeção de veias traseiras de células tumorais mamárias, juntamente com um método de análise preciso e abrangente.

Embora a comunidade de pesquisa tenha feito progressos significativos na compreensão do complexo processo de metástase do câncer de mama, estima-se que mais de 150.000 mulheres tenham atualmente câncer de mama metastático16. Das pessoas com câncer de mama estágio IV, >36% das pacientes têm metástase pulmonar17; no entanto, o padrão específico do local e a incidência de metástases podem variar de acordo com o subtipo molecular18,19,20,21. Pacientes com metástases pulmonares associadas ao câncer de mama têm uma sobrevida mediana de apenas 21 meses, destacando a necessidade de identificar tratamentos eficazes e novos biomarcadores para esta doença17. O uso de modelos experimentais de metástase, incluindo a injeção intravenosa de células tumorais, continuará avançando nosso conhecimento sobre este importante desafio clínico. Quando combinadas com a patologia da imagem digital e o método de análise da carga de tumores pulmonares metastáticos descritos neste protocolo, as injeções de veias traseiras são uma ferramenta valiosa para a pesquisa de metástase do câncer de mama.

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Protocol

O uso de animais seguiu as regulamentações do University Laboratory Animal Resources (ULAR) sob o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da OSU – protocolo aprovado 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. Injeção de veias traseiras de células cancerígenas de mama

  1. Preparação de células e seringas para injeção
    1. Placa um número apropriado de células com base no número de camundongos e concentração celular a ser usado.
      NOTA: O número de células injetadas e o tempo para o desenvolvimento de metástases dependerão da linha celular utilizada e precisarão ser otimizadas. Nesta demonstração, 1 x 106 células MDA-MB-231 são injetadas por via intravenosa em camundongos NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) e lesões pulmonares macroscópicas são observadas no máximo 24 dias após a injeção. Para a linha de células tumores mamárias MVT1 murina17, 3 x 106 células são injetadas em camundongos FVB/N imuno-competentes com numerosas metástases pulmonares observadas por 14 dias22,23.
    2. Aspirar mídia e enxaguar placas celulares com 1x PBS. Células de trypsinize em volume mínimo, adicione o volume apropriado de mídia e conte células usando um hematócito ou outro método preferido. O azul trypan (0,4%) ou outros corantes de células vivas/mortas podem ser usados para determinar a contagem de células viáveis.
    3. Células de pelota girando a 180 x g por 5 min.
    4. Resuspenque o número apropriado de células em 1x PBS estéril, de tal forma que um volume de 100 μL seja injetado por mouse. Mantenha a suspensão celular no gelo para manter a viabilidade.
    5. Antes da injeção, ressuspendam completamente as células com uma pipeta de 200 μL ou 1 mL para evitar a aglomeração. Desenhe 100 μL em uma seringa de insulina de 28 G (ver Tabela de Materiais).
    6. Elimine quaisquer bolhas de ar mantendo a seringa vertical, tocando na seringa e ajustando lentamente o êmbolo. A injeção de bolhas de ar na veia pode causar uma embolia de ar/gás que pode ser fatal.
  2. Injeção lateral da veia traseira
    NOTA: Para ensaios experimentais de metástase do câncer de mama, as injeções são realizadas em camundongos fêmeas de > 6 semanas de idade.
    1. Manuseie o mouse pela cauda e deslize animal em um tubo ranhuted/dispositivo de contenção de um tamanho apropriado (consulte a Tabela de Materiais para o dispositivo de contenção usado).
    2. Insira a porção do plugue do dispositivo de contenção e posicione o mouse de lado, de forma que sua veia traseira lateral seja fácil de visualizar. O camundongo tem uma artéria ventral alinhada com a genitália, uma veia dorsal e duas veias caudais laterais.
    3. Limpe a superfície da cauda do rato com um lenço asséptico. Segure a cauda entre o dedo indicador e o polegar com a mão não dominante e aplique uma leve tensão.
    4. Começando pela porção distal da cauda, insira a agulha paralela à veia com o bisel acabar.
    5. Se permitido, recapitula a agulha cuidadosamente e dobre para um ângulo de 20-30°. Uma abordagem individual ou dispositivo de recapeamento de agulhas é altamente recomendado.
      NOTA: Não é necessário aspirar, pois isso pode causar o colapso da veia. No entanto, um pequeno flash de sangue pode ser visto quando colocado pela primeira vez. A agulha avançará suavemente na veia com a colocação adequada.
    6. Distribua lentamente o volume completo na veia. Não deve haver resistência quando o êmbolo é empurrado.
    7. Se houver alguma resistência, remova prontamente a agulha da seringa. Se necessário, reinsira a agulha (idealmente não mais do que 3 tentativas) movendo-se em direção à extremidade proximal da cauda ou veia lateral oposta.
    8. Um pequeno volume de sangue provavelmente será deslocado após a injeção. Aplique pressão suave com gaze estéril e limpe com limpeza asséptica.
    9. Descarte prontamente a seringa no recipiente afiado apropriado.
    10. Devolva o mouse a uma gaiola limpa e ventilada e monitore por sinais de angústia.
    11. Monitore camundongos 2-3x/semanalmente para sinais de formação de metástase (respiração trabalhada, postura curvada, perda de peso) e sofrimento geral. O tempo para o desenvolvimento da metástase dependerá da linha celular e da tensão do rato.
    12. Se usar um dispositivo de imagem animal in vivo vivo, os ratos de imagem imediatamente após a injeção da veia traseira para confirmar a injeção bem sucedida de células e obter dados "zero" do tempo (detalhes específicos sobre imagens de bioluminescência in vivo não estão incluídos aqui, mas são descritos por Yang et al.24).

2. Fixação do tecido pulmonar e análise da carga do tumor pulmonar metastático

  1. Inflação do tecido pulmonar para manter o formato estrutural dos pulmões para histopatologia
    1. Após os procedimentos aprovados de eutanásia (por exemplo, dióxido de carbono a 30 - 70% de deslocamento do volume da câmara/min) são seguidos, proteja a carcaça do rato em uma placa de dissecação com pinos. Pulverizar ou aplicar 70% de etanol para manter a pele do rato fora do caminho durante a dissecação.
      NOTA: Asfixia por dióxido de carbono pode causar hemorragia pulmonar como lesão de fundo esperada, especialmente em taxas de fluxo mais lentas.
    2. Abra o tórax com uma incisão midline, estenda a incisão cranially/caudally através do peritônio, e corte o diafragma agarrando o processo xifoide.
    3. Usando um conjunto separado de tesouras para não entorpecer as lâminas, corte as costelas ao longo de cada lado do esterno e remova cuidadosamente a caixa torácica deixando espaço para os pulmões se expandirem.
    4. Isole a traqueia removendo glândulas salivares submandibulares e musculatura infra-ióide. Colocar pinos em ambos os lados da traqueia pode evitar movimentos indesejados durante a inserção da agulha.
    5. Encha uma seringa de 26 G com 2-3 mL de formalina tamponada neutra de 10% e insira na traqueia.
    6. Injete lentamente formalina e observe que os pulmões se expandam (geralmente requer ~1,5 mL de formalina).
    7. Uma vez que a formalina começa a vazar dos pulmões (evite a inflação), belisque a traqueia com um par de fórceps, remova a agulha da seringa e desprende todo o aparelho respiratório. Coloque pulmões, coração, etc. diretamente em formalina, pois o corte adicional de tecido pode ser feito após a fixação.
    8. Processamento completo, incorporação, secção de tecido e hematoxilina e eosina (H&E) de coloração usando métodos padrão.
  2. Análise da carga do tumor pulmonar metastático
    1. Escaneie seções pulmonares manchadas de H&E em um scanner de slides de alta resolução a 40x de ampliação (Figura 3).
    2. Importar imagens em software de análise de imagens (por exemplo, Análise de Imagem visiopharm) para quantificação de metástases pulmonares.
      NOTA: Recomendamos que novos usuários obtenham treinamento no local ou online para usar o software de análise de imagens. Inúmeros webinars também estão disponíveis através da página comercial.
    3. Selecione o Aplicativo de Metástase pulmonar do Visiopharm 10118 H&E Na biblioteca de aplicativos do software.
      NOTA: O objetivo deste aplicativo é rotular e quantificar a metástase pulmonar em slides manchados de H&E. Como parte do Aplicativo de Metástase Pulmonar 10118, a primeira etapa de processamento de imagem segmenta o tecido pulmonar com o Aplicativo de Detecção de Tecidos. A segunda etapa de processamento de imagem usa o Aplicativo de Detecção de Metástase que identifica as metástases dentro do tecido pulmonar. Metástases são identificadas via forma juntamente com regiões que são muito desacompusadas, muito vermelhas ou muito esparsas para serem identificadas como metástases.
    4. Ajuste os parâmetros que definem a forma e a escassez para melhor se encaixar em imagens representativas. Áreas segmentadas de metástases tumorais e tecido pulmonar normal podem ser exibidas usando diferentes rótulos de cor para cada tipo de tecido.
      NOTA: No caso de o aplicativo não conseguir separar com precisão metástases do tecido pulmonar normal, um aplicativo personalizado usando o programa Visiopharm Decision Forest pode precisar ser escrito como foi feito para os experimentos (ver Figura 2 e Figura 3). Os detalhes para escrever um algoritmo personalizado seguem abaixo. Caso contrário, prossiga para a etapa 2.2.9.
    5. Abra o programa Floresta de Decisão, que funciona treinando várias classes [ou seja, tecido pulmonar (não neoplásico), metástases, glóbulos vermelhos, epitélio e/ou espaço branco] em uma imagem desejada. Na Figura 2, as metástases tumorais são azuis, o tecido normal é verde, e o epitélio bronquiolar é amarelo. Além disso, os glóbulos vermelhos estão em espaços vermelhos e de ar em rosa.
    6. Siga a série solicitada de perguntas sim ou não para treinar adequadamente cada Classe para uma imagem. A precisão do algoritmo determinará o número de perguntas sim/não. Para a análise, o algoritmo/aplicativo personalizado foi escrito com precisão definida para 50 (faixa 0-100).
    7. Ajuste recursos para cada classe aplicando filtros para afiar, desfocar, classificar por forma, etc. para melhorar a precisão do algoritmo/App. Visiopharm visualiza cada Classe através de uma ou várias lentes conhecidas como Recursos. As características mudam a forma como a Classe vê a imagem para trazer certas cores ou intensidades.
      NOTA: Para o algoritmo personalizado, metástases medindo 8500 μm2 ou mais são rotuladas e medidas como metástases. Isso explica a variância de tamanho e metástases muito pequenas para detectar. Pequenas áreas desalinhadas e pequenas áreas metastáticas abaixo de 8500 μm2 foram incluídas na quantificação normal do tecido.
    8. Salve as configurações modificadas do aplicativo ou do algoritmo personalizado e, em seguida, aplique o algoritmo/aplicativo a um conjunto inteiro ou série de tecidos manchados de H&E.
    9. Por fim, exporte todas as variáveis de produção, que incluem as listadas na Tabela 1. A área em mícrons ao quadrado (μm2) pode ser quantificada para cada tipo de tecido e as porcentagens são derivadas da área total do tecido líquido da amostra (ou seja, tecido total menos espaço aéreo).
    10. Ao criar um algoritmo personalizado, revise as marcações teciduais em consulta com um conselho de patologista veterinário certificado pelo American College of Veterinary Pathologists para garantir medidas precisas e diferenciar entre os tipos de tecidos.

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Representative Results

Se usar células não rotuladas para injeção de veias traseiras, pode ser difícil confirmar a colonização pulmonar até (1) o tempo de necropsia se macrometastases podem ser observadas ou (2) após análise histológica se existem metástases microscópicas. Com extensa carga de tumores pulmonares metastáticos, os camundongos terão a respiração trabalhada. Como em qualquer estudo de tumor, os camundongos devem ser cuidadosamente monitorados durante toda a duração do estudo. O uso de células rotuladas é uma maneira fácil de confirmar a injeção bem sucedida da veia traseira; daí o uso de células MDA-MB-231 com marca de luciferase na demonstração. No entanto, a imagem in vivo nem sempre é possível ou necessária dependendo do design experimental e outros fatores. A Figura 1A mostra o sinal de bioluminescência no espaço torácico menos de 2 horas após a injeção da veia traseira das células MDA-MB-231 marcadas pela luciferase como confirmação da injeção precisa. Para este experimento, a contagem de fótons na região torácica aumenta ao longo do tempo e um forte sinal de bioluminescência está presente no dia 24 pós-injeção (Figura 1B e C; note a mudança na barra de escala). No momento da necropsia, muitas lesões pulmonares macroscópicas foram observadas nesses camundongos (Figura 1D).

Após o processamento e a coloração adequados do tecido, as seções pulmonares manchadas de H&E podem ser escaneadas ou imagens. A quantificação da carga do tumor pulmonar metastático pode ser efetivamente alcançada usando um software de análise de imagem e um algoritmo personalizado. Usando o algoritmo personalizado, todo o tecido pulmonar é segmentado por diferentes características teciduais (Figura 2A e B). Ao segmentar o tecido pulmonar desta forma, o software pode quantificar os vários parâmetros listados na Tabela 1. Esta análise tem sido realizada no tecido pulmonar de camundongos injetados com células MDA-MB-231 seguidas de tratamento com uma droga projetada para bloquear a colonização metastática ou um controle de veículo (DMSO). Os dados brutos desta análise estão mostrados na Tabela 2. Além disso, a Figura 3A mostra imagens representativas de H&E de metástases pulmonares MDA-MB-231 de dMSO ou camundongos tratados com drogas. Embora a diferença na carga tumoral metastática entre esses grupos de tratamento possa ter sido facilmente negligenciada, pois o número total de nódulos pulmonares não é diferente, uma análise abrangente de todos os parâmetros indica uma diferença significativa na área de metástase pulmonar líquida percentual (Figura 3B,C). Isso reforça a necessidade de uma abordagem abrangente e completa para analisar a carga do tumor pulmonar metastático, como o método aqui descrito.

Para os dados apresentados na Figura 3, todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o GraphPad Prism 7. Os dados foram considerados normalmente distribuídos ao passar em qualquer um dos seguintes testes de normalidade padrão: omnibus D'Agostino-Pearson, Shapiro-Wilk e Kolmogorov-Smirnov. A comparação entre os grupos de veículos e medicamentos (Figura 3) foi feita pelo teste t-t do aluno de duas caudas não verificado. A significância estatística foi estabelecida em P ≤ 0,05.

Figure 1
Figura 1: Confirmação de bioluminescência in vivo da injeção bem sucedida da veia traseira.
(A) Sinal representativo de bioluminescência em camundongos 1 hora após a injeção de veias traseiras de células MDA-MB-231 marcadas pela luciferase. (B) Sinal representativo de bioluminescência no mesmo conjunto de camundongos (A) 24 dias após a injeção da veia traseira de células MDA-MB-231 marcadas por luciferase. [Observe a mudança na barra de escala entre (A) e (B)]. (C) Quantificação da contagem de fótons ao longo do tempo em camundongos injetados na veia traseira MDA-MB-231. As barras de erro representam macrometastases médias ± SEM. (n = 8 camundongos) (D) Tecido pulmonar não tumoral representativo (direita) e macrometastases MDA-MB-231 nos pulmões (esquerda) no momento da necropsia. Barras de escala = 50 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Segmentação tecidual utilizando software Visiopharm.
(A) Recortes representativos de marcações de tecido não segmentadas e segmentadas usando o algoritmo de software personalizado. (B) Lenda para todas as categorias de tecidos segmentadas por meio de software. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Análise representativa da carga do tumor pulmonar metastático dos tecidos manchados de H&E.
(A) A representação da coloração de tecido pulmonar de camundongos não injetados e de controle (DMSO) e camundongos tratados com drogas após a injeção de veias traseiras de células MDA-MB-231. Metástases tumorais representativas são indicadas com setas. Barras de escala = 500 μm para ampliação 4x e 200 μm para ampliação de 10x. (B) Gráfico de área de metástase pulmonar líquida por cento de controle e camundongos tratados com drogas. As barras de erro representam ± média SD. (*) P = 0,022 pelo t-teste do Aluno. (C) Tabela resumindo a análise da carga do tumor pulmonar metastático (n = 9 DMSO; n = 9 medicamentos tratados). Após a verificação da distribuição normal dos dados, todos os valores P na tabela foram determinados pelo teste t do aluno não verificado, de duas caudas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetro Descrição
Área total do tecido (μm2) Área em mícrons quadrados, incluindo todas as metástases tumorais, pulmão normal e áreas de glóbulos vermelhos.
Contagem de metástases Número total de metástases dentro do tecido pulmonar.
Porcentagem da área de metástase (μm2) Área total de metástase dividida pela área de tecido líquido x 100.
Tecido Total + Área espacial branca (μm2) Área em mícrons quadrados, incluindo todo tecido e espaço branco.
Área de tecido líquido (μm2) Área de tecido em mícrons quadrados (mets e pulmão normal) sem espaço branco e glóbulos vermelhos.
Área total de metástase (μm2) Área total de metástase em mícrons quadrados segmentados pela Floresta de Decisão algorithim.
Área de metástase média (μm2) Área média (média) em mícrons quadrados de metástases dentro de cada imagem.
Área de Metástase Mediana (μm2) Área mediana de metástase em mícrons quadrados. Um número igual de metástases fica abaixo desse valor e um número igual de metástases é maior que o valor médio.

Tabela 1: Parâmetros medidos com software. Lista de parâmetros, juntamente com uma descrição de cada medição que é calculada usando o algoritmo personalizado.

Deslizar Contagem de metástases Porcentagem da área de metástase (μm2) Tecido Total + Área espacial branca (μm2) Espaço Branco Total (μm2) Área de tecido líquido (μm2) Área total de metástase (μm2) Área de Glóbulos Vermelhos (μm2) Área de Metástase Média (μm2) Área de Metástase Mediana (μm2)
171 Deslizamento pulmonar 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 Deslizamento pulmonar 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 Deslizamento pulmonar 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 Deslizamento pulmonar 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 Deslizamento pulmonar 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 Deslizamento pulmonar 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 Deslizamento pulmonar 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 Deslizamento pulmonar 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 Deslizamento pulmonar 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 Deslizamento pulmonar 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 Deslizamento pulmonar 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 Lung Slide 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 Lung Slide 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 Lung Slide 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 Deslizamento pulmonar 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 Deslizamento pulmonar 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 Deslizamento pulmonar 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 Deslizamento pulmonar 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 Deslizamento pulmonar 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 Deslizamento pulmonar 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 Deslizamento pulmonar 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 Deslizamento pulmonar 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 Deslizamento pulmonar 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 Lung Slide 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 Deslizamento pulmonar 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 Deslizamento pulmonar 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 Deslizamento pulmonar 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 Deslizamento pulmonar 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 Deslizamento pulmonar 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 Deslizamento pulmonar 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 Deslizamento pulmonar 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 Deslizamento pulmonar 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 Deslizamento pulmonar 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 Deslizamento pulmonar 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 Deslizamento pulmonar 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 Deslizamento pulmonar 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

Tabela 2: Tabela representativa dos resultados. Tabela de resultados para cada parâmetro do algoritmo a partir de uma coorte de ratos cauda-veia injetada com células MDA-MB-231.

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Discussion

À medida que os pesquisadores continuam a usar a injeção intravenosa de células tumorais como modelo experimental para metástase, faltam práticas padrão para analisar a carga tumoral metastática resultante. Em alguns casos, diferenças significativas na carga tumoral metastática após a manipulação de linhas celulares específicas e/ou uso de compostos químicos podem ser observadas macroscopicamente. No entanto, em outros casos, diferenças sutis na semeadura metastática e no crescimento podem ser negligenciadas ou mal interpretadas sem uma análise patológica completa. Este estudo avança protocolos de injeção de veias traseiras publicados anteriormente, incluindo um método abrangente de análise da carga do tumor pulmonar metastático. É importante ressaltar que este método de análise da patologia digital também pode ser aplicado à quantificação da carga do tumor metastático pulmonar após a injeção ortotópica de células tumorais capazes de metástase espontânea, bem como outros modelos experimentais de metástase (ou seja, intracardiac, etc.) e modelos de xenóxido derivados do paciente (PDX). O uso de imagens digitais e desenvolvimento de algoritmos de software por patologistas veterinários garante a reprodutibilidade, precisão e minuciosidade dessa abordagem para analisar a carga do tumor pulmonar metastático25.

Decisão pensativa de linhas celulares, concentração celular e pontos finais com base em estudos publicados anteriormente ou otimização experimental cuidadosa é absolutamente necessária. Dado que a semeadura metastática e a colonização são altamente dependentes das interações com várias populações de células imunes26,27, o uso de camundongos imuno-competentes é ideal, embora nem sempre viável. Pela mesma razão, a interpretação de estudos experimentais de metástase usando camundongos atímicos ou NSG, que não possuem componentes fundamentais de células imunes, deve ser tomada com cautela. Existem várias linhas de células tumorais mamárias do camundongo, incluindo as células MVT1 utilizadas neste estudo, que foram derivadas da cepa de camundongos FVB/N22,28,29. Outros modelos síngênicos também existem. Em relação à concentração celular, a injeção de um grande número de células pode acelerar e aumentar a carga do tumor pulmonar metastático. No entanto, se os pulmões estão sobrecarregados, pode ser difícil distinguir focos metastáticos individuais e emboli são mais propensos a ocorrer. Além disso, o procedimento de injeção da veia traseira requer ampla prática e treinamento antes de realizar injeções seguras e/ou rotineiramente. Muitas instituições oferecerão treinamento técnico e poderão fornecer ratos para fins de prática. A colocação adequada da agulha e uma injeção suave devem indicar sucesso; no entanto, para fins de treinamento/prática, o corante Evans Blue pode ser usado para ajudar a determinar a injeção bem sucedida (1% em PBS estéril). As extremidades do rato ficarão azuis logo após a injeção, mas o animal deve ser eutanizado depois.

Além disso, a importância das técnicas padrão de necropsia e amostragem de tecidos para controlar e prevenir artefatos deslizantes que possam prejudicar a varredura e análise de slides pelo software de análise de imagem não pode ser suficientemente estressada. A inflação dos pulmões no momento da necropsia é um passo crítico na manutenção da integridade dos tecidos e melhora a coloração subsequente de H&E, bem como a análise final. Para a consistência com resolução e reprodutibilidade, recomenda-se que todos os slides em um conjunto de estudo sejam escaneados com o mesmo objetivo. Neste estudo, todos os slides foram escaneados em 40x para garantir a precisão das configurações do algoritmo e a identificação adequada das metástases tumorais quando aplicadas aos campos analisados. Para cada slide, os mesmos lóbulos pulmonares foram consistentemente escaneados e analisados para cada rato. Também é fortemente recomendado que um patologista revise as marcações teciduais para precisão do algoritmo aplicado e que o mesmo algoritmo seja aplicado a cada slide em um estudo.

O protocolo apresentado pode ser modificado de acordo com o design experimental, as preferências do usuário e as medidas de desfecho desejadas. Uma dessas modificações inclui o uso de uma câmara de indução de anestesia em vez de dispositivo de contenção convencional para um animal consciente. Em termos de saúde animal e bem-estar, nenhuma abordagem é superior à outra e cada uma tem seu próprio conjunto de vantagens, bem como limitações30. Além disso, para ratos pretos ou pardos, uma fonte de luz ou dispositivo de aquecimento pode ser necessário para visualizar as veias da cauda. Lâmpadas infravermelhas ou um banho de água quente podem ser usadas para dilatar as veias. No entanto, a temperatura deve ser cuidadosamente monitorada. Além disso, existem dispositivos de contenção iluminados disponíveis, bem como outras versões comerciais de dispositivos de contenção de roedores. Alguns investigadores preferem seringas Luer-Lok para injeções. Achamos mais difícil eliminar bolhas de ar com seringas Luer-Lok, mas é uma questão de preferência. A viabilidade das células é uma consideração importante para o procedimento de injeção da veia traseira e, portanto, contagem precisa de células, bem como a manutenção de células no gelo antes da injeção são etapas necessárias. Se comparar a semeadura pulmonar e a colonização de linhas celulares manipuladas, é fundamental determinar quaisquer diferenças no tamanho e viabilidade celular antes da injeção, pois estas podem complicar a interpretação dos resultados. Morte celular e/ou dano podem ocorrer ao usar uma agulha de bitola estreita; no entanto, não é recomendável que uma agulha maior que 25 G seja usada, pois pode causar dor e desconforto ao animal.

Como forma de validar que as lesões pulmonares são formadas por células tumorais injetadas, a imunossuagem pode ser feita em seções teciduais. Se usar linhas de células humanas, anticorpos específicos do homem podem ser usados para discernir lesões metastáticas. Alternativamente, se usar linhas de célula marcadas (por exemplo, GFP), podem ser usados anticorpos correspondentes. Além disso, muitas linhas de células cancerígenas de mama são positivas para marcadores epiteliais (ou seja, citokeratins, E-cadherin e EpCAM), mas o conhecimento prévio da expressão é essencial. No entanto, o epitélio pulmonar que reveste as vias aéreas também será positivo para esses marcadores e, portanto, a estrutura também deve ser considerada. Pode haver casos em que o desenvolvimento do tumor pulmonar primário deve ser descartado. Para isso, a coloração imunohistoquímica para o Fator de Transcrição da Tireóide-1 (TTF1) pode ser usada como um marcador de adenocarcinoma pulmonar primário. A coloração TTF1 deve ser avaliada por um patologista certificado.

Aqui, um algoritmo personalizado foi escrito usando um algoritmo de classificação da Floresta de Decisão porque o algoritmo de metástase pulmonar estabelecido não poderia ser ajustado para detecção precisa de metástases que variavam de tamanho. Este algoritmo personalizado permite medições complexas, permite uma segmentação precisa de metástases por tamanho e suporta um corte de tamanho para que pequenas áreas e estruturas normais não sejam mal interpretadas e, portanto, possam ser incluídas no conjunto de dados finais. Prevemos que esse algoritmo será aplicável à maioria dos estudos de metástase pulmonar in vivo, mas os usuários podem precisar ajustar as configurações dentro do software para atender às suas necessidades individuais de estudo. No entanto, este algoritmo serve como uma plataforma para pesquisadores que desejam analisar a carga metastática pulmonar de forma semelhante. Existem muitas opções diferentes para plataformas de análise de imagens pelas quais o acesso ou disponibilidade, custo e treinamento, bem como o nível de experiência podem ditar a melhor plataforma para utilizar36. A gama de opções inclui plataformas gratuitas como o QuPath e plataformas mais caras, mas sofisticadas, como a Visiopharm. Informa-se que se consulta um núcleo de patologia de análise de imagem e patologista ao decidir qual plataforma pode estar disponível e melhor utilizada para um determinado projeto de pesquisa.

Modelos de tumor mamário de camundongos espontâneos (por exemplo, MMTV-PyMT) ou métodos ortotópicos de injeção de almofada de gordura mamária representam o modelo mais fisiologicamente relevante para o estudo da metástase pulmonar. Uma séria desvantagem para o modelo de injeção da veia traseira é que ele não recapitula a cascata metastática completa e, portanto, limita-se ao estudo da extravasação de células tumorais e da colonização de órgãos secundários. No entanto, este modelo experimental de metástase é relevante para a pesquisa do câncer de mama, pois as metástases pulmonares formadas após a injeção de veias traseiras têm perfis genômicos semelhantes às lesões metastáticas que se desenvolvem após a implantação ortotópica das mesmas células31. A fim de estabelecer um modelo de metástase pulmonar, um grande número de células são frequentemente injetadas por via intravenosa, o que pode não representar com precisão o processo de metástase, pois diz respeito à semeadura, reação imunológica e dormência. Além disso, com base na via circulatória, metástases pulmonares são mais comuns com a injeção de veias traseiras32. Com a maioria das linhas de células cancerígenas de mama, relatórios publicados indicam uma incidência relativamente baixa de metástases ósseas, hepáticas ou cerebrais após a injeção de veias da cauda7. Métodos alternativos de metástase experimental, como intracardiac, intratibial, veia portal e injeções intracarotóides são mais apropriados para examinar metástases em outros locais33,34,35,36,37. Novamente, são preferidos modelos de tumores mamários espontâneos ou métodos ortotópicos de injeção de almofadas de gordura que recapitulem todos os passos da cascata metastática. Questões com carga tumoral metastática consistente, duração do estudo e número de animais necessários para tais estudos são uma desvantagem. No entanto, o método de análise patológica digital aqui apresentado pode ser aplicado a metástases pulmonares formadas por qualquer modelo de metástase espontânea ou experimental.

O método de análise também produz certas limitações, como a subjetividade na criação de algoritmos. Embora a imagem de slides inteiras permita a análise digital em toda uma seção de tecido e em todos os lóbulos pulmonares de um único rato, ele é limitado a uma análise bidimensional de um tecido 3D. A estereologia está se tornando uma prática comum que obtém informações 3D para análise de imagens e pode explicar fatores como encolhimento tecidual que ocorre durante o processamento de tecidos38. A estereologia, no entanto, tem suas próprias limitações, como tecido, recursos e restrições de tempo.

Dado o número de pacientes com câncer afetados pela propagação metastática de sua doença, o método de injeção de veias traseiras para estudar metástase continuará a ser uma ferramenta útil em termos de compreensão da biologia complicada da propagação metastática e na determinação da eficácia pré-clínica de novas terapêuticas. Modelos in vivo de camundongos de metástase, particularmente aqueles que usam animais imuno-competentes, estão se tornando ainda mais importantes para a pesquisa sobre câncer, dado o interesse generalizado pela imunoterapia29. Além disso, os modelos experimentais de metástase são críticos em termos de investigação de genes supressores de metástase (ou seja, aqueles que suprimem o potencial metastático das células cancerosas sem afetar o crescimento do tumor primário) e, portanto, continuam a ser uma valiosa ferramenta de pesquisa.

A análise de imagens digitais e slides rapidamente se tornou um pilar na modelagem de mouses diagnósticos e experimentais39. Usar o tipo de abordagem aqui descrita para analisar a carga do tumor metastático pulmonar permitirá análises de alto rendimento de forma mais abrangente e precisa. Além disso, a patologia da imagem digital fornece um caminho para projetos de pesquisa mais colaborativos envolvendo patologistas especializados em áreas como modelos de camundongos de metástase do câncer de mama. À medida que os métodos de imagem de tecido multiplex e as tecnologias de imagem 3D (como mencionado acima) continuam a ser desenvolvidos, a patologia da imagem digital, programas de software sofisticados para análise de imagens e a expertise dos patologistas certamente serão necessárias para o avanço da pesquisa de metástase.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os dados representativos foram financiados por meio do Instituto Nacional de Câncer (K22CA218549 para S.T.S). Além de sua ajuda no desenvolvimento do método de análise abrangente aqui relatado, agradecemos ao Centro Abrangente de Câncer da Universidade estadual de Ohio e ao Recurso Compartilhado de Fenotipagem de Camundongos (Director – Krista La Perle, DVM, PhD) pelos serviços de histologia e imunohistoquímica e pelo Núcleo de Imagem de Patologia para desenvolvimento e análise de algoritmos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

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Pesquisa de Câncer Questão 159 injeção de veias de cauda câncer de mama metástase pulmonar seções manchadas de H&E patologia digital quantitativa análise de imagem

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais
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Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

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