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Cancer Research

肿瘤细胞外侧尾静脉注射后肺转移的病理分析

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

静脉注射癌细胞常用于转移研究，但转移性肿瘤负担可能难以分析。在本文中，我们展示了转移的尾静脉注射模型，并包括一种分析所得转移性肺肿瘤负担的新方法。

Abstract

转移是大多数癌症患者发病和死亡的主要原因，在小鼠中进行临床前建模可能具有挑战性。很少有自发性转移模型可用。因此，涉及尾静脉注射合适细胞系的实验转移模型是转移研究的主要内容。当癌细胞被注射到外侧尾静脉时，肺是它们首选的定植部位。该技术的一个潜在局限性是转移性肺肿瘤负担的准确定量。虽然一些研究人员对预定义大小的大转移酶进行计数和/或包括组织切片后的微转移酶，但其他研究人员则确定相对于正常组织区域的转移性病变区域。当转移负担很高时，这两种定量方法都可能非常困难。在本文中，我们展示了肺转移的静脉注射模型，然后使用图像分析软件量化转移性肿瘤负荷的先进方法。该过程允许研究多个终点参数，包括平均转移大小，转移总数和总转移面积，以提供全面的分析。此外，这种方法已经过美国兽医病理学家学会（SEK）认证的兽医病理学家委员会的审查，以确保准确性。

Introduction

尽管转移是一个高度复杂且低效的过程1，但转移是癌症患者发病率和死亡率的重要因素2。事实上，大多数癌症相关死亡归因于疾病的转移性传播3，4。为了使肿瘤细胞成功转移，它们必须从原发部位脱离，通过相邻的基质侵入，侵入血液循环或淋巴管，行进到次级部位的毛细血管床，外渗到次级组织，并增殖或生长形成转移性病变5。小鼠模型的使用对于进一步了解负责转移性播种和生长的分子机制至关重要6，7。在本文中，我们专注于乳腺癌转移，为此经常使用转基因小鼠模型和移植方法 - 每种方法都有自己的一套优点和局限性。

基因工程乳腺肿瘤模型利用乳腺特异性启动子，包括 MMTV-LTR （小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复）和 WAP （乳清酸性蛋白），以驱动乳腺上皮中转基因的表达8。包括中位T抗原（PyMT）、 ErbB2/Neu、 c-Myc、 Wnt-1和猿猴病毒40（SV40）在内的癌基因已经以这种方式表达9，10，11，12，13，虽然这些遗传模型有助于研究原发性肿瘤的发生和进展，但很少有易转移至远处器官的遗传基因。此外，这些遗传小鼠模型通常比自发或实验转移模型花费更多的时间和成本。鉴于大多数基因工程乳腺肿瘤模型在研究转移方面的局限性，移植技术已成为研究这一复杂过程的有吸引力的方法。这包括原位、尾静脉、心内和颅内注射合适的细胞系。

虽然几种乳腺癌细胞系在将原位注射到乳腺脂肪垫14，15后容易转移，但转移性肿瘤负荷的一致性和可重复性可能是一个挑战，并且此类研究的持续时间可能长达数月。特别是对于评估肺转移，静脉注射到尾静脉通常是一种更具可重复性和时间有效的方法，转移性扩散通常发生在几周内。然而，由于静脉注射模型绕过了转移性级联反应的初始步骤，因此在解释这些研究的结果时必须小心。在这个演示中，我们展示了乳房肿瘤细胞的尾静脉注射以及准确而全面的分析方法。

尽管研究界在了解乳腺癌转移的复杂过程方面取得了重大进展，但据估计，目前有超过150，000名女性患有转移性乳腺癌16。在IV期乳腺癌患者中，>36%的患者有肺转移17;然而，位点特异性模式和转移发生率可能因分子亚型而异18，19，20，21。乳腺癌相关肺转移患者的中位生存期仅为 21 个月，这凸显了确定该疾病的有效治疗方法和新型生物标志物的必要性17。实验转移模型的使用，包括静脉注射肿瘤细胞，将继续推进我们对这一重要临床挑战的了解。当与本方案中描述的数字成像病理学和转移性肺肿瘤负荷分析方法相结合时，尾静脉注射是乳腺癌转移研究的宝贵工具。

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Protocol

动物使用遵循俄勒冈州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议2007A0120-R4（PI：Gina Sizemore博士）下的大学实验动物资源（ULAR）法规。

1. 乳腺癌细胞尾静脉注射

  1. 制备注射用细胞和注射器
    1. 根据要使用的小鼠数量和细胞浓度，接种适当数量的细胞。
      注意：注射的细胞数量和转移发生的时间将取决于所使用的细胞系，需要优化。在该演示中，将1 x 106 MDA-MB-231细胞静脉注射到 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ（NSG）小鼠中，并且在注射后24天内观察到宏观肺病变。对于MVT1小鼠乳腺肿瘤细胞系17，将3 x 10 6个细胞注射到免疫感受态FVB / N小鼠中，这些小鼠在14天内观察到许多肺转移22，23。
    2. 吸出培养基并用1x PBS冲洗细胞板。胰蛋白酶消化以最小体积对细胞进行胰蛋白酶消化，加入适当体积的培养基，并使用血细胞计数器或其他优选方法对细胞进行计数。台盼蓝（0.4%）或其他活/死细胞染料可用于确定活细胞计数。
    3. 通过以180× g 旋转5分钟来沉淀细胞。
    4. 在无菌的1x PBS中重悬适当数量的细胞，使得每只小鼠注射100μL的体积。将细胞悬浮液保持在冰上以保持活力。
    5. 在注射前，用200μL或1mL移液器彻底重悬细胞以避免结块。在28G胰岛素注射器中吸取100μL（ 见材料表）。
    6. 通过保持注射器垂直，点击注射器并缓慢调整柱塞来消除任何气泡。将气泡注入静脉可能会导致致命的空气/气体栓塞。
  2. 尾静脉外侧静脉注射
    注意：对于实验性乳腺癌转移测定，在>6周龄的雌性小鼠上进行注射。
    1. 用尾巴操作鼠标，将动物滑入适当尺寸的开槽管/约束装置中（请参阅所用约束装置 的材料表 ）。
    2. 插入约束装置的塞子部分，并将鼠标放置在其侧面，以便其横向尾静脉易于查看。小鼠有一条与生殖器对齐的腹侧动脉，一条背静脉和两条外侧尾静脉。
    3. 用无菌擦拭物清洁小鼠尾巴的表面。用非惯用手抓住食指和拇指之间的尾巴，并施加轻微的张力。
    4. 从尾巴的远端部分开始，将针头平行于静脉，斜面向上。
    5. 如果允许， 请仔细 地将针头重新包裹起来，并弯曲成20-30°的角度。强烈建议使用单手方法或针头重盖装置。
      注意：没有必要抽吸，因为这可能会导致静脉塌陷。然而，首次放置时可能会看到少量血迹。针头将平稳地进入静脉，并正确放置。
    6. 慢慢地将整个体积分配到静脉中。当柱塞被推动时，不应该有阻力。
    7. 如果感觉到任何阻力，请立即取出注射器针头。如果需要，重新插入针头（理想情况下不超过3次尝试），向尾部近端或对侧静脉移动。
    8. 注射后可能会有少量血液移位。用无菌纱布轻轻按压，然后用无菌擦拭。
    9. 及时将注射器丢弃在适当的尖锐容器中。
    10. 将鼠标放回干净、通风的笼子中，并监测是否有遇险迹象。
    11. 监测小鼠2-3次/周转移的迹象（呼吸困难，驼背姿势，体重减轻）和一般痛苦。转移的发展时间将取决于细胞系和小鼠品系。
    12. 如果使用体内活体动物成像装置，则在尾静脉注射后立即对小鼠进行成像，以确认细胞注射成功并获得时间"零"数据（本文未包括体内生物发光成像的具体细节，但由Yang等人描述24）。

2. 肺组织固定及转移性肺肿瘤负荷分析

  1. 肺组织充气以保持肺的结构形式，用于组织病理学
    1. 遵循批准的安乐死程序（例如，室容积的30-70%位移/分钟的二氧化碳）后，将小鼠尸体固定在带有销钉的解剖板上。喷洒或施用70%乙醇，以防止在解剖过程中阻挡小鼠的皮毛。
      注意：二氧化碳窒息可引起肺出血，作为预期的背景病变，特别是在流速较慢时。
    2. 用中线切口打开胸部，将切口从颅骨/尾部延伸穿过腹膜，并通过抓住椎骨过程切除隔膜。
    3. 使用一套单独的剪刀，以免刀片变钝，沿着胸骨两侧切开肋骨，并小心地取出肋骨笼，为肺部扩张留出空间。
    4. 通过切除下颌下唾液腺和舌骨下肌肉组织来隔离气管。在气管的两侧放置销钉可以防止在针插入过程中不必要的移动。
    5. 在 26 G 注射器中加入 2-3 mL 10% 中性缓冲福尔马林，然后插入气管。
    6. 缓慢注射福尔马林，观察肺部扩张（通常需要约1.5毫升福尔马林）。
    7. 一旦福尔马林开始从肺部泄漏（避免过度充气），用一对镊子捏住气管，取出注射器针头并取下整个呼吸装置。将肺、心脏等直接放入福尔马林中，因为固定后可以对组织进行额外的修剪。
    8. 使用标准方法完成组织加工，包埋，切片以及苏木精和曙红（H&E）染色。
  2. 转移性肺肿瘤负荷分析
    1. 在高分辨率载玻片扫描仪上以40倍放大倍率扫描H&E染色的肺部切片（图3）。
    2. 将图像导入图像分析软件（例如，Visiopharm 图像分析）以定量肺转移。
      注意：我们建议新用户获得现场或在线培训以使用图像分析软件。许多网络研讨会也可以通过商业网页获得。
    3. 从软件的应用程序库中选择Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis App。
      注意：此应用程序的目的是标记和量化H&E染色载玻片上的肺转移。作为10118 H&E肺转移应用程序的一部分，第一个图像处理步骤使用组织检测应用程序分割肺组织。第二个图像处理步骤使用转移检测应用程序来识别肺组织内的转移。转移通过形状以及形状太畸形，太红或太稀疏的区域来识别，无法识别为转移。
    4. 调整定义形状和稀疏度的参数，以最适合代表性图像。肿瘤转移和正常肺组织的分割区域可以使用每种组织类型的不同颜色标签显示。
      注意：如果应用程序无法准确地将转移从正常肺组织中分离出来，则可能需要编写使用Visiopharm决策森林程序的自定义应用程序，就像实验一样（参见 图2 和 图3）。下面详细介绍了编写自定义算法。否则，请继续执行步骤 2.2.9。
    5. 打开决策森林程序，该程序通过在所需图像上训练多个 类 [即肺组织（非肿瘤）、转移、红细胞、上皮和/或空白]来工作。在 图2中，肿瘤转移是蓝色的，正常组织是绿色的，支气管上皮是黄色的。此外，红细胞是红色的，空气空间是粉红色的。
    6. 按照提示的一系列是或否问题进行相应的训练，以便为映像适当地训练每个 类 。算法的准确性将决定是/否问题的数量。对于分析，编写自定义算法/应用时，精度设置为 50（范围 0-100）。
    7. 通过应用滤镜来调整每个类的功能，以锐化，模糊，按形状排序等，以提高算法/应用程序的准确性。功能会更改类查看图像的方式，以显示某些颜色或强度。
      注意：对于自定义算法，测量为8500μm2及以上的转移被标记为转移并测量。这解释了尺寸差异和转移太小而无法检测到的原因。将8500 μm2以下的小畸形区域和小转移区域纳入正常组织定量。
    8. 保存来自应用程序或自定义算法的修改设置，然后将算法/应用程序应用于整套或一系列H&E染色组织。
    9. 最后，导出所有输出变量，其中包括 表 1 中列出的变量。可以针对每种组织类型量化以微米平方（μm2）为单位的面积，并且百分比来自标本总净组织面积（即总组织减去空气空间）。
    10. 创建自定义算法时，请咨询由美国兽医病理学家学会认证的兽医病理学家委员会，以检查组织标记，以确保准确的测量并区分组织类型。

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Representative Results

如果使用未标记的细胞进行尾静脉注射，则可能难以确认肺定植，直到（1）如果可以观察到大转移酶，则尸检时间或（2）如果存在微观转移，则在组织学分析之后。随着广泛的转移性肺肿瘤负担，小鼠将有劳动呼吸。与任何肿瘤研究一样，在整个研究期间应仔细监测小鼠。使用标记细胞是确认尾静脉注射成功的简单方法;因此，在演示中使用了荧光素酶标记的MDA-MB-231细胞。然而，根据实验设计和其他因素，体内成像并不总是可能或必要的。 图1A 显示了尾静脉注射荧光素酶标记的MDA-MB-231细胞后不到2小时的胸腔生物发光信号，以确认准确注射。对于该实验，胸部区域的光子计数随着时间的推移而增加，并且在注射后的第24天存在强烈的生物发光信号（图1B和C;注意比例尺的变化）。在尸检时，在这些小鼠中观察到许多宏观的肺部病变（图1D）。

经过适当的组织处理和染色后，可以扫描或成像H&E染色的肺切片。使用图像分析软件和自定义算法可以有效地实现转移性肺肿瘤负荷定量。使用定制算法，整个肺组织按不同的组织特征进行分割（图2A和B）。通过以这种方式分割肺组织，软件可以量化 表1中列出的各种参数。该分析已在注射MDA-MB-231细胞的小鼠的肺组织上进行，然后用旨在阻断转移定植或载体对照（DMSO）的药物治疗。该分析的原始数据如 表2所示。此外， 图3A 显示了DMSO或药物治疗小鼠的MDA-MB-231肺转移的代表性H&E图像。虽然这些治疗组之间转移性肿瘤负担的差异可能很容易被忽视，因为肺结节的总数没有区别，但对所有参数的全面分析表明，净肺转移面积百分比存在显着差异（图3B，C）。这强调了需要一种全面而彻底的方法来分析转移性肺肿瘤负担，例如本文所述的方法。

对于 图3中提供的数据，所有统计分析均使用GraphPad Prism 7进行。在通过以下任何标准正态性检验时，数据被认为是正态分布的：D'Agostino-Pearson omnibus，Shapiro-Wilk和Kolmogorov-Smirnov。车辆组和药物治疗组之间的比较（图3）是通过不成对的双尾学生t检验完成的。P ≤ 0.05建立统计学意义。

Figure 1
图1：尾静脉注射成功的体内生物发光确认。
（A）尾静脉注射荧光素酶标记的MDA-MB-231细胞后1小时小鼠的代表性生物发光信号。（B）在尾静脉注射荧光素酶标记的MDA-MB-231细胞后24天，同一组小鼠中的代表性生物发光信号。[注意（A）和（B）之间比例尺的变化]。（C）定量MDA-MB-231尾静脉注射小鼠中随时间变化的光子计数。误差线表示SEM±平均值（n = 8只小鼠）（D）在尸检时具有代表性的非肿瘤携带肺组织（右）和肺部MDA-MB-231大转移酶（左）。比例尺 = 50 mm。 请单击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2：使用Visiopharm软件进行组织分割。
（A） 使用定制软件算法的未分割和分段组织标记的代表性片段。（B）使用软件分割的所有组织类别的图例。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3：H&E染色组织的代表性转移性肺肿瘤负荷分析。
（A）尾静脉注射MDA-MB-231细胞后，未注射小鼠和对照组（DMSO）和药物治疗小鼠的肺组织的代表性H&E染色。代表性肿瘤转移用箭头表示。比例尺 = 500 μm（4 倍放大倍率）和 200 μm（10 倍放大倍率）。（B）控制和药物治疗小鼠的净肺转移区域百分比图。误差线表示学生 t 检验的平均值 ± SD。（*） P = 0.022。（三）转移性肺肿瘤负荷分析表（n=9 DMSO;n=9药治疗）。在检查数据的正态分布后，表中的所有 P 值均由不成对的双尾学生 t 检验确定。 请点击此处查看此图的放大版本。

参数 描述
总组织面积 （μm2） 面积以平方微米为单位，包括所有肿瘤转移，正常肺和红细胞区域。
转移计数 肺组织内转移的总数。
转移面积百分比 （μm2） 总转移面积除以净组织面积 x 100。
总组织 + 空白面积 （μm2） 面积以平方微米为单位，包括所有组织和空白区域。
净组织面积 （μm2） 组织面积以方形微米为单位（mets和正常肺），没有空白和红细胞。
总转移面积 （μm2） 总转移面积以平方微米为单位，由决策林算法分割。
平均转移面积 （μm2） 每个图像中转移的平均（平均）面积（以平方微米为单位）。
中位转移面积 （μm2） 中位转移面积以平方微米为单位。等数量的转移低于此值，等数量的转移大于中位数。

表1：使用软件测量的参数。 参数列表以及使用自定义算法计算的每个测量值的说明。

滑 转移计数 转移面积百分比 （μm2） 总组织 + 空白面积 （μm2） 总空白 （μm2） 净组织面积 （μm2） 总转移面积 （μm2） 红细胞面积 （μm2） 平均转移面积 （μm2） 中位转移面积 （μm2）
171 肺幻影片 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 肺幻影带 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 肺幻影片 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 肺幻影片 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 肺幻影片 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 肺滑梯 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 肺幻影片 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 肺幻影片 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 肺幻影片 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 肺幻影片 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 肺滑梯 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 肺滑梯 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 肺滑梯 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 肺幻影片 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 肺滑梯 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 肺滑梯 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 肺滑梯 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 肺幻影片 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 肺滑梯 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 肺滑梯 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 肺滑梯 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 肺滑梯 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 肺滑梯 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 肺滑梯 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 肺滑梯 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 肺滑梯 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 肺滑梯 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 肺滑梯 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 肺滑梯 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 肺滑梯 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 肺滑梯 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 肺滑梯 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 肺滑梯 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 肺滑梯 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 肺滑梯 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 肺滑梯 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

表2：具有代表性的结果表。 来自注射MDA-MB-231细胞的小鼠尾静脉队列的算法的每个参数的结果表。

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Discussion

随着研究人员继续使用静脉注射肿瘤细胞作为转移的实验模型，缺乏分析由此产生的转移性肿瘤负担的标准实践。在某些情况下，可以在宏观上观察到操作特定细胞系和/或使用化合物时转移性肿瘤负担的显着差异。然而，在其他情况下，如果没有彻底的病理分析，转移性播种和生长的细微差异可能会被忽视或误解。本研究通过包括转移性肺肿瘤负荷分析的综合方法，推进了先前发表的尾静脉注射方案。重要的是，这种数字病理学分析方法还可以应用于原位注射能够自发转移的肿瘤细胞以及其他实验转移模型（即心内等）和患者来源的异种移植（PDX）模型后肺转移性肿瘤负荷的定量。兽医病理学家使用数字成像和软件算法开发，确保了这种方法分析转移性肺肿瘤负担的可重复性，准确性和彻底性25。

根据先前发表的研究或仔细的实验优化，对细胞系，细胞浓度和终点进行深思熟虑的决策是绝对必要的。鉴于转移性接种和定植高度依赖于与各种免疫细胞群的相互作用26，27，使用免疫能力小鼠是理想的，尽管并不总是可行的。出于同样的原因，使用缺乏关键免疫细胞成分的无胸腺小鼠或NSG小鼠的实验转移研究的解释应该谨慎对待。有几种小鼠乳腺肿瘤细胞系，包括本研究中使用的MVT1细胞，它们来自FVB / N小鼠品系22，28，29。其他同源模型也存在。在细胞浓度方面，注射大量细胞可大大加速和增强转移性肺肿瘤负担。然而，如果肺部不堪重负，可能难以区分个体转移灶和栓子更容易发生。此外，尾静脉注射程序在安全和/或常规进行注射之前需要大量的练习和培训。许多机构将提供技术培训，并可能为练习目的提供鼠标。针头的正确放置和平稳的注射应表明成功;然而，出于培训/实践目的，Evans Blue染料可用于帮助确定注射成功（无菌PBS中为1%）。注射后不久，小鼠的四肢会变蓝，但动物之后应该被安乐死。

此外，标准尸检和组织采样技术对于控制和防止可能损害图像分析软件的玻片扫描和分析的玻片伪影的重要性再怎么强调也不过分。尸检时肺部充气是保持组织完整性的关键步骤，可改善随后的 H&E 染色以及最终分析。为了与分辨率和再现性保持一致，建议使用相同的目标扫描研究集中的所有载玻片。在这项研究中，所有载玻片都以40倍扫描，以确保算法设置的准确性和应用于分析区域时正确识别肿瘤转移。对于每张载玻片，对每只小鼠的肺叶进行一致的扫描和分析。还强烈建议病理学家审查组织标记，以确保所应用算法的准确性，并将相同的算法应用于研究中的每个载玻片。

所提出的方案可以根据实验设计、用户偏好和期望的结果测量进行修改。其中一项修改包括对有意识的动物使用麻醉诱导室而不是传统的约束装置。在动物健康和保健方面，这两种方法都不优于另一种方法，每种方法都有自己的一套优点和局限性30。此外，对于黑色或棕色小鼠，可能需要光源或加热装置才能可视化尾静脉。红外灯或温水浴可用于扩张静脉。但是，应仔细监测温度。此外，还有照明约束装置以及其他商业版本的啮齿动物约束装置。一些调查人员更喜欢使用Luer-Lok注射器进行注射。我们发现使用Luer-Lok注射器消除气泡更加困难，但这是一个偏好问题。细胞的活力是尾静脉注射程序的重要考虑因素，因此，准确的细胞计数以及在注射前将细胞保持在冰上是必要的步骤。如果比较肺接种和受操纵细胞系的定植，在注射前确定细胞大小和活力的任何差异至关重要，因为这些差异可能会使结果的解释复杂化。使用窄针时可能发生细胞死亡和/或损伤;但是，不建议使用大于25 G的针头，因为它可能会给动物带来疼痛和不适。

作为验证肺部病变是由注射的肿瘤细胞形成的一种方法，可以在组织切片上进行免疫染色。如果使用人细胞系，人特异性抗体可用于识别转移性病变。或者，如果使用标记的细胞系（例如，GFP），则可以使用相应的抗体。此外，许多乳腺癌细胞系对上皮标志物（即细胞角蛋白、E-钙粘蛋白和 EpCAM）呈阳性，但先前的表达知识至关重要。然而，气道内衬的肺上皮对这些标志物也是阳性的，因此，还必须考虑结构。在某些情况下，必须排除原发性肺肿瘤的发展。为此，甲状腺转录因子-1（TTF1）的免疫组织化学染色可用作原发性肺腺癌的标志物。TTF1 染色应由经过认证的病理学家进行评估。

本文使用决策森林分类算法编写了自定义算法，因为无法对已建立的肺转移算法进行微调，以准确检测大小不一的转移。这种定制算法可实现复杂的测量，允许按大小准确分割转移灶，并支持尺寸截止，以便小的畸形区域和正常结构不会被误解，因此可以包含在最终数据集中。我们预计该算法将适用于大多数体内肺转移研究，但用户可能需要调整软件中的设置以适应其个人研究需求。然而，该算法为希望以类似方式分析肺转移负荷的研究人员提供了一个平台。图像分析平台有许多不同的选项，访问或可用性，成本和培训以及经验水平可能决定了要利用的最佳平台36。选项范围包括免费平台（如QuPath）和更昂贵但更复杂的平台（如Visiopharm）。建议在决定哪个平台可能可用并且最适合用于特定研究项目时，咨询图像分析病理学核心和病理学家。

自发性小鼠乳腺肿瘤模型（例如 ，MMTV-PyMT）或原位乳腺脂肪垫注射方法代表了研究肺转移的最生理相关模型。尾静脉注射模型的一个严重缺点是它不能概括完整的转移级联反应，因此仅限于研究肿瘤细胞外渗和次级器官定植。然而，这种实验转移模型与乳腺癌研究相关，因为尾静脉注射后形成的肺转移具有类似于同一细胞原位植入后产生的转移性病变的基因组特征31。为了建立肺转移模型，大量细胞经常被静脉注射，这可能不能准确代表转移过程，因为它与播种，免疫反应和休眠有关。此外，根据循环通路，肺转移最常见于尾静脉注射32。对于大多数乳腺癌细胞系，已发表的报告表明尾静脉注射后骨、肝或脑转移的发生率相对较低7。其他实验转移方法，如心内、胫内、门静脉和颈内注射更适合检查转移到其他部位的转移33，34，35，36，37。同样，首选自发性乳腺肿瘤模型或原位脂肪垫注射方法，以概括转移性级联反应的所有步骤。一致的转移性肿瘤负担，研究持续时间以及此类研究所需的动物数量是不利的一面。然而，本文介绍的数字病理学分析方法可以应用于通过任何自发或实验转移模型形成的肺转移。

分析方法还产生了某些限制，例如算法创建的主观性。尽管整个载玻片成像允许对单个小鼠的整个组织切片和所有肺叶进行数字分析，但它仅限于3D组织的二维分析。立体病学正在成为一种常见的做法，它获取用于图像分析的3D信息，并且可以解释组织处理过程中发生的组织收缩等因素38。然而，立体学有其自身的局限性，如组织、资源和时间限制。

鉴于受其疾病转移性扩散影响的癌症患者数量众多，研究转移的尾静脉注射方法将继续成为理解转移扩散的复杂生物学和确定新疗法临床前疗效的有用工具。鉴于对免疫疗法的广泛兴趣，体内转移小鼠模型，特别是那些使用免疫能力动物的小鼠模型，对于癌症研究变得越来越重要29。此外，实验转移模型对于研究转移抑制基因（即那些抑制癌细胞转移潜力而不影响原发性肿瘤生长的基因）至关重要，因此，仍然是一种有价值的研究工具。

数字成像和载玻片分析已迅速成为诊断和实验小鼠建模的中流砥柱39。使用本文描述的方法类型来分析肺转移性肿瘤负担将允许以更全面和准确的方式进行高通量分析。此外，数字成像病理学为涉及专门研究乳腺癌转移小鼠模型等领域的病理学家的更多合作研究项目提供了途径。随着多重组织成像方法和3D成像技术（如上所述）的不断发展，数字成像病理学，用于图像分析的复杂软件程序以及病理学家的专业知识对于推进转移研究肯定是必要的。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

代表性数据由美国国家癌症研究所（K22CA218549至S.T.S）资助。除了协助开发本文报道的综合分析方法外，我们还感谢俄亥俄州立大学综合癌症中心比较病理学和小鼠表型共享资源（主任 - Krista La Perle，DVM，PhD）的组织学和免疫组织化学服务以及病理学成像核心的算法开发和分析。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

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Tags

癌症研究，第159期，尾静脉注射，乳腺癌，肺转移，H&E染色切片，定量数字病理学，图像分析

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

肿瘤细胞外侧尾静脉注射后肺转移的病理分析
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Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

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