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Cancer Research

ट्यूमर कोशिकाओं के पार्श्व पूंछ-शिरा इंजेक्शन के बाद फेफड़ों के मेटास्टेसिस का पैथोलॉजिकल विश्लेषण

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

कैंसर कोशिकाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन का उपयोग अक्सर मेटास्टेसिस अनुसंधान में किया जाता है, लेकिन मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ का विश्लेषण करना मुश्किल हो सकता है। इसमें, हम मेटास्टेसिस के एक पूंछ-शिरा इंजेक्शन मॉडल का प्रदर्शन करते हैं और परिणामी मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ का विश्लेषण करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण शामिल करते हैं।

Abstract

मेटास्टेसिस, अधिकांश कैंसर रोगियों के लिए रुग्णता और मृत्यु दर का प्राथमिक कारण, चूहों में प्रीक्लिनिकल रूप से मॉडल करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। कुछ सहज मेटास्टेसिस मॉडल उपलब्ध हैं। इस प्रकार, उपयुक्त सेल लाइनों के पूंछ-शिरा इंजेक्शन को शामिल करने वाला प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल मेटास्टेसिस अनुसंधान का मुख्य आधार है। जब कैंसर कोशिकाओं को पार्श्व पूंछ-नस में इंजेक्ट किया जाता है, तो फेफड़े उपनिवेशीकरण की उनकी पसंदीदा साइट होती है। इस तकनीक की एक संभावित सीमा मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ का सटीक परिमाणीकरण है। जबकि कुछ जांचकर्ता एक पूर्व-परिभाषित आकार के मैक्रोमेटास्टेसिस की गिनती करते हैं और / या ऊतक के विभाजन के बाद माइक्रोमेटास्टेसिस शामिल करते हैं, अन्य सामान्य ऊतक क्षेत्र के सापेक्ष मेटास्टैटिक घावों के क्षेत्र को निर्धारित करते हैं। मेटास्टैटिक बोझ अधिक होने पर इन दोनों परिमाणीकरण विधियों को बहुत मुश्किल हो सकता है। यहां, हम छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मेटास्टैटिक ट्यूमर के बोझ को मापने के लिए एक उन्नत विधि के बाद फेफड़ों के मेटास्टेसिस के एक अंतःशिरा इंजेक्शन मॉडल का प्रदर्शन करते हैं। यह प्रक्रिया एक व्यापक विश्लेषण प्रदान करने के लिए औसत मेटास्टेसिस आकार, मेटास्टेसिस की कुल संख्या और कुल मेटास्टेसिस क्षेत्र सहित कई अंत-बिंदु मापदंडों की जांच की अनुमति देती है। इसके अलावा, सटीकता सुनिश्चित करने के लिए अमेरिकन कॉलेज ऑफ वेटरनरी पैथोलॉजिस्ट (एसईके) द्वारा प्रमाणित एक पशु चिकित्सा रोगविज्ञानी बोर्ड द्वारा इस विधि की समीक्षा की गई है।

Introduction

एक अत्यधिक जटिल और अक्षम प्रक्रिया 1 होने के बावजूद, मेटास्टेसिस कैंसर रोगियों की रुग्णता और मृत्यु दर के लिए एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है2। वास्तव में, अधिकांश कैंसर से संबंधित मौतों को रोग 3,4 के मेटास्टैटिक प्रसार के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। ट्यूमर कोशिकाओं को सफलतापूर्वक मेटास्टेसाइज़ करने के लिए, उन्हें प्राथमिक साइट से अलग होना चाहिए, आसन्न स्ट्रोमा के माध्यम से आक्रमण करना चाहिए, रक्त परिसंचरण या लसीका में इंट्रावेसेट करना चाहिए, एक माध्यमिक साइट के केशिका बिस्तर की यात्रा करना चाहिए, माध्यमिक ऊतक में extravasate करना चाहिए, और मेटास्टैटिक घावों को बनाने के लिए फैलना या बढ़ना चाहिए5। माउस मॉडल का उपयोग मेटास्टैटिक सीडिंग और विकास के लिए जिम्मेदार आणविक तंत्र की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रहा है6,7। इसमें, हम स्तन कैंसर मेटास्टेसिस पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जिसके लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के साथ-साथ प्रत्यारोपण के तरीकों दोनों का अक्सर उपयोग किया जाता है - प्रत्येक के फायदे और सीमाओं के अपने स्वयं के सेट के साथ।

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर स्तन ट्यूमर मॉडल स्तन ग्रंथि विशिष्ट प्रवर्तकों का उपयोग करते हैं, जिसमें एमएमटीवी-एलटीआर (माउस स्तन ट्यूमर वायरस लंबे टर्मिनल दोहराने) और डब्ल्यूएपी (मट्ठा अम्लीय प्रोटीन) शामिल हैं, स्तन उपकला 8 में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए। पॉलीओमा मिडिल टी एंटीजन (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, WNT-1, और सिमियन वायरस 40 (SV40) सहित ऑन्कोजीन को इस तरह से व्यक्त किया गया है9,10,11,12,13, और जबकि ये आनुवंशिक मॉडल प्राथमिक ट्यूमर दीक्षा और प्रगति का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं, कुछ आसानी से दूर के अंगों में मेटास्टेसाइज़ करते हैं। इसके अलावा, ये आनुवंशिक माउस मॉडल अक्सर सहज या प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल की तुलना में अधिक समय और लागत निषेधात्मक होते हैं। मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए सबसे आनुवंशिक रूप से इंजीनियर स्तन ट्यूमर मॉडल की सीमा को देखते हुए, प्रत्यारोपण तकनीक इस जटिल प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए आकर्षक तरीके बन गए हैं। इसमें ऑर्थोटोपिक, पूंछ-शिरा, इंट्राकार्डियक और उपयुक्त सेल लाइनों के इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन शामिल हैं।

यद्यपि कई स्तन कैंसर सेल लाइनें स्तन वसा पैड 14,15 में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के बाद आसानी से मेटास्टेसाइज़ करती हैं, मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ की स्थिरता और पुनरुत्पादन एक चुनौती हो सकती है, और इस तरह के अध्ययनों की अवधि कई महीनों के आदेश पर हो सकती है। फेफड़ों के मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने के लिए, विशेष रूप से, पूंछ-नस में अंतःशिरा इंजेक्शन अक्सर मेटास्टैटिक प्रसार के साथ एक अधिक पुनरुत्पादक और समय-प्रभावी तरीका होता है जो आमतौर पर कुछ हफ्तों की अवधि के भीतर होता है। हालांकि, चूंकि अंतःशिरा इंजेक्शन मॉडल मेटास्टैटिक कैस्केड के प्रारंभिक चरणों को दरकिनार करता है, इसलिए इन अध्ययनों के परिणामों की व्याख्या करने में सावधानी बरतनी चाहिए। इस प्रदर्शन में, हम विश्लेषण की एक सटीक और व्यापक विधि के साथ स्तन ट्यूमर कोशिकाओं की पूंछ-शिरा इंजेक्शन दिखाते हैं।

भले ही अनुसंधान समुदाय ने स्तन कैंसर मेटास्टेसिस की जटिल प्रक्रिया को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति की है, यह अनुमान लगाया गया है कि वर्तमान में 150,000 से अधिक महिलाओं को मेटास्टैटिक स्तन कैंसर है। चरण IV स्तन कैंसर वाले लोगों में से, >36% रोगियों में फेफड़े के मेटास्टेसिस 17 हैं; हालांकि, साइट-विशिष्ट पैटर्न और मेटास्टेसिस की घटनाएं आणविक उपप्रकार 18,19,20,21 के आधार पर भिन्न हो सकती हैं। स्तन कैंसर से जुड़े फेफड़ों के मेटास्टेसिस वाले रोगियों में केवल 21 महीनों का औसत अस्तित्व होता है, जो इस बीमारी के लिए प्रभावी उपचार और उपन्यास बायोमार्कर की पहचान करने की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। ट्यूमर कोशिकाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन सहित प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल का उपयोग, इस महत्वपूर्ण नैदानिक चुनौती के हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाना जारी रखेगा। जब डिजिटल इमेजिंग पैथोलॉजी और इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ विश्लेषण की विधि के साथ संयुक्त किया जाता है, तो पूंछ-शिरा इंजेक्शन स्तन कैंसर मेटास्टेसिस अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं।

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Protocol

पशु उपयोग ने OSU संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के तहत विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु संसाधन (ULAR) नियमों का पालन किया - अनुमोदित प्रोटोकॉल 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore)।

1. स्तन कैंसर कोशिकाओं की पूंछ-शिरा इंजेक्शन

  1. इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं और सिरिंज की तैयारी
    1. प्लेट चूहों की संख्या और उपयोग किए जाने वाले सेल एकाग्रता के आधार पर कोशिकाओं की एक उपयुक्त संख्या।
      नोट:: इंजेक्ट किए गए कक्षों की संख्या और मेटास्टेसिस के विकास के लिए समय उपयोग की गई सेल लाइन पर निर्भर करेगा और इसे अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। इस प्रदर्शन में, 1 x 106 MDA-MB-231 कोशिकाओं को अंतःशिरा रूप से NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) चूहों में इंजेक्ट किया जाता है, और मैक्रोस्कोपिक फेफड़ों के घावों को इंजेक्शन के बाद 24 दिनों के बाद नहीं देखा जाता है। MVT1 मुरीन स्तन ट्यूमर सेल लाइन 17 के लिए, 3 x 106 कोशिकाओं को 14 दिनों 22,23 द्वारा देखे गए कई फेफड़ों के मेटास्टेसिस के साथ प्रतिरक्षा-सक्षम FVB / N चूहों में इंजेक्ट किया जाता है।
    2. Aspirate मीडिया और 1x PBS के साथ सेल प्लेटों कुल्ला. न्यूनतम मात्रा में कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें, मीडिया की उचित मात्रा जोड़ें, और हेमटोसाइटोमीटर या किसी अन्य पसंदीदा विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें। Trypan नीले (0.4%) या अन्य जीवित / मृत सेल रंजक व्यवहार्य सेल गिनती निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. 5 मिनट के लिए 180 x g पर कताई द्वारा गोली कोशिकाओं.
    4. बाँझ 1x PBS में कोशिकाओं की उचित संख्या को फिर से निलंबित करें जैसे कि प्रति माउस 100 μL की मात्रा इंजेक्ट की जाती है। व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
    5. इंजेक्शन से पहले, क्लैंपिंग से बचने के लिए 200 μL या 1 mL पिपेट के साथ कोशिकाओं को अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें। एक 28 जी इंसुलिन सिरिंज में 100 μL ड्रा ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. सिरिंज ऊर्ध्वाधर रखने, सिरिंज पर दोहन, और धीरे-धीरे प्लंजर को समायोजित करके किसी भी हवा के बुलबुले को समाप्त करें। नस में हवा के बुलबुले के इंजेक्शन से एक हवा / गैस एम्बोलिज्म होने की संभावना होती है जो घातक हो सकती है।
  2. पार्श्व पूंछ-शिरा इंजेक्शन
    नोट: प्रयोगात्मक स्तन कैंसर मेटास्टेसिस assays के लिए, इंजेक्शन > 6 सप्ताह पुराने मादा चूहों पर प्रदर्शन कर रहे हैं।
    1. पूंछ द्वारा माउस को संभालें और एक उपयुक्त आकार के एक स्लॉटेड ट्यूब / संयम डिवाइस में जानवर को स्लाइड करें (उपयोग किए गए संयम डिवाइस के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    2. संयम डिवाइस के प्लग भाग को डालें और माउस को अपनी तरफ इस तरह से रखें कि इसकी पार्श्व पूंछ नस को देखना आसान हो। माउस में जननांग, एक पृष्ठीय शिरा और दो पार्श्व पुच्छल नसों के अनुरूप एक वेंट्रल धमनी होती है।
    3. माउस की पूंछ की सतह को एक एसेप्टिक पोंछे के साथ साफ करें। तर्जनी और अंगूठे के बीच की पूंछ को गैर-प्रमुख हाथ से समझें और थोड़ा तनाव लागू करें।
    4. पूंछ के दूरस्थ भाग से शुरू करते हुए, बेवल अंत के साथ नस के समानांतर सुई डालें।
    5. यदि अनुमति दी जाती है, तो सुई को ध्यान से दोहराएं और 20-30 ° कोण पर झुकें। एक एकल हाथ दृष्टिकोण या सुई recapping डिवाइस अत्यधिक अनुशंसित है.
      नोट: एस्पिरेट करना आवश्यक नहीं है क्योंकि इससे नस ढह सकती है। हालांकि, पहली बार रखे जाने पर रक्त का एक छोटा सा फ्लैश देखा जा सकता है। सुई उचित स्थान के साथ नस में आसानी से आगे बढ़ेगी।
    6. धीरे-धीरे नस में पूरी मात्रा को वितरित करें। प्लंजर को धक्का दिए जाने पर प्रतिरोध नहीं होना चाहिए।
    7. यदि कोई प्रतिरोध महसूस किया जाता है, तो तुरंत सिरिंज सुई को हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो सुई को फिर से डालें (आदर्श रूप से 3 से अधिक प्रयास नहीं) पूंछ के समीपस्थ छोर की ओर बढ़ते हुए या पार्श्व शिरा का विरोध करते हुए।
    8. इंजेक्शन के बाद रक्त की एक छोटी मात्रा को विस्थापित होने की संभावना होगी। बाँझ धुंध के साथ कोमल दबाव लागू करें और एसेप्टिक पोंछे के साथ पोंछें।
    9. उचित शार्प कंटेनर में सिरिंज का तुरंत निपटान करें।
    10. माउस को एक साफ, हवादार पिंजरे में वापस लाएं और संकट के संकेतों के लिए मॉनिटर करें।
    11. मेटास्टेसिस गठन (श्रमित श्वास, कूबड़ मुद्रा, वजन घटाने) और सामान्य संकट के संकेतों के लिए चूहों को 2-3x / साप्ताहिक मॉनिटर करें। मेटास्टेसिस के विकास का समय सेल लाइन और माउस तनाव पर निर्भर करेगा।
    12. यदि विवो लाइव पशु इमेजिंग डिवाइस का उपयोग कर रहे हैं, तो कोशिकाओं के सफल इंजेक्शन की पुष्टि करने और समय "शून्य" डेटा प्राप्त करने के लिए पूंछ-शिरा इंजेक्शन के तुरंत बाद छवि चूहों की छवि (विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में विशिष्ट विवरण यहां शामिल नहीं हैं, लेकिन यांग एट अल.24 द्वारा वर्णित हैं)।

2. फेफड़ों के ऊतक निर्धारण और मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ का विश्लेषण

  1. हिस्टोपैथोलॉजी के लिए फेफड़ों के संरचनात्मक प्रारूप को बनाए रखने के लिए फेफड़ों के ऊतक मुद्रास्फीति
    1. अनुमोदित इच्छामृत्यु प्रक्रियाओं के बाद (उदाहरण के लिए कक्ष की मात्रा / मिनट के 30 - 70% विस्थापन पर कार्बन डाइऑक्साइड) का पालन किया जाता है, माउस शव को पिन के साथ एक विच्छेदन बोर्ड पर सुरक्षित करें। विच्छेदन के दौरान माउस के फर को रास्ते से बाहर रखने के लिए या तो स्प्रे करें या 70% इथेनॉल लागू करें।
      नोट: कार्बन डाइऑक्साइड श्वासावरोध एक अपेक्षित पृष्ठभूमि घाव के रूप में फुफ्फुसीय hemorhage का कारण बन सकता है, विशेष रूप से धीमी प्रवाह दरों पर।
    2. एक मिडलाइन चीरा के साथ वक्ष को खोलें, पेरिटोनियम के माध्यम से चीरा कपाल / पुच्छल रूप से विस्तारित करें, और जाइफोइड प्रक्रिया को पकड़कर डायाफ्राम को काट दें।
    3. ब्लेड को सुस्त नहीं करने के लिए कैंची के एक अलग सेट का उपयोग करके, उरोस्थि के प्रत्येक पक्ष के साथ पसलियों को काटें और फेफड़ों के विस्तार के लिए जगह छोड़ने के लिए रिब पिंजरे को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    4. श्वासनली को अलग-अलग करके सबमैंडिबुलर लार ग्रंथियों और इन्फ्राहायॉइड मस्कुलचर को हटाकर। श्वासनली के दोनों ओर पिन रखने से सुई सम्मिलन के दौरान अवांछित आंदोलन को रोका जा सकता है।
    5. 10% तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन के 2-3 मिलीलीटर के साथ एक 26 जी सिरिंज भरें और श्वासनली में डालें।
    6. धीरे-धीरे फॉर्मेलिन इंजेक्ट करें और फेफड़ों के विस्तार के लिए देखें (आमतौर पर फॉर्मेलिन के ~ 1.5 एमएल की आवश्यकता होती है)।
    7. एक बार जब फॉर्मेलिन फेफड़ों से बाहर निकलना शुरू हो जाता है (मुद्रास्फीति से बचें), संदंश की एक जोड़ी के साथ श्वासनली को बंद कर दें, सिरिंज सुई को हटा दें और पूरे श्वसन तंत्र को अलग करें। फेफड़ों, हृदय, आदि को सीधे फॉर्मेलिन में रखें क्योंकि ऊतक की अतिरिक्त ट्रिमिंग को निर्धारण के बाद किया जा सकता है।
    8. पूर्ण प्रसंस्करण, एम्बेडिंग, ऊतक के विभाजन, और hematoxylin और eosin (एच एंड ई) मानक तरीकों का उपयोग कर धुंधला.
  2. मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ का विश्लेषण
    1. एक उच्च रिज़ॉल्यूशन पर एच एंड ई-दाग वाले फेफड़ों के वर्गों को स्कैन करें, 40x आवर्धन पर स्लाइड स्कैनर (चित्रा 3)।
    2. फेफड़ों के मेटास्टेसिस के परिमाणीकरण के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (जैसे, Visiopharm छवि विश्लेषण) में छवियों को आयात करें।
      नोट:: हम अनुशंसा करते हैं कि नए उपयोगकर्ता छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के लिए या तो ऑनसाइट या ऑनलाइन प्रशिक्षण प्राप्त करें। कई वेबिनार भी वाणिज्यिक वेबपेज के माध्यम से उपलब्ध हैं।
    3. सॉफ़्टवेयर की ऐप लाइब्रेरी से Visiopharm 10118 H &E Lung Metastasis ऐप का चयन करें।
      नोट: इस एप्लिकेशन का उद्देश्य लेबल और एच एंड ई-दाग स्लाइड पर फेफड़ों के मेटास्टेसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए है। 10118 एच एंड ई फेफड़े के मेटास्टेसिस ऐप के हिस्से के रूप में, पहला छवि प्रसंस्करण चरण ऊतक का पता लगाने वाले ऐप के साथ फेफड़ों के ऊतकों को खंडित करता है। दूसरा छवि प्रसंस्करण चरण मेटास्टेसिस डिटेक्ट ऐप का उपयोग करता है जो फेफड़ों के ऊतकों के अंदर मेटास्टेसिस की पहचान करता है। मेटास्टेसिस को उन क्षेत्रों के साथ आकार के माध्यम से पहचाना जाता है जो या तो बहुत गलत आकार के होते हैं, बहुत लाल होते हैं या मेटास्टेसिस के रूप में पहचाने जाने के लिए बहुत विरल होते हैं।
    4. सबसे अच्छा फिट प्रतिनिधि छवियों के लिए आकार और विरलता को परिभाषित पैरामीटर समायोजित करें। ट्यूमर मेटास्टेसिस और सामान्य फेफड़ों के ऊतकों के खंडित क्षेत्रों को प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए विभिन्न रंग लेबल का उपयोग करके प्रदर्शित किया जा सकता है।
      नोट: इस घटना में कि एप्लिकेशन सटीक रूप से सामान्य फेफड़ों के ऊतकों से मेटास्टेसिस को अलग नहीं कर सकता है, Visiopharm निर्णय फ़ॉरेस्ट प्रोग्राम का उपयोग करने वाले एक कस्टम ऐप को प्रयोगों के लिए किए गए अनुसार लिखा जाना चाहिए ( चित्रा 2 और चित्रा 3 देखें)। एक कस्टम एल्गोरिथ्म लिखने के लिए विवरण नीचे का पालन करें. अन्यथा, चरण 2.2.9 पर आगे बढ़ें।
    5. निर्णय वन कार्यक्रम खोलें, जो एक वांछित छवि पर कई कक्षाओं [यानी, फेफड़ों के ऊतकों (गैर-नियोप्लास्टिक), मेटास्टेसिस, लाल रक्त कोशिकाओं, उपकला, और / या सफेद स्थान] को प्रशिक्षित करके काम करता है। चित्रा 2 में, ट्यूमर मेटास्टेसिस नीले रंग के होते हैं, सामान्य ऊतक हरे रंग के होते हैं, और ब्रोन्किओलर उपकला पीले रंग की होती है। इसके अलावा, लाल रक्त कोशिकाएं लाल रंग में होती हैं और हवा के स्थान गुलाबी रंग में होती हैं।
    6. एक छवि के लिए प्रत्येक कक्षा को उचित रूप से प्रशिक्षित करने के लिए हाँ या नहीं प्रश्नों की प्रेरित श्रृंखला का पालन करें। एल्गोरिथ्म की सटीकता हाँ / नहीं प्रश्नों की संख्या निर्धारित करेगी। विश्लेषण के लिए, कस्टम एल्गोरिथ्म / ऐप को 50 (रेंज 0-100) पर सेट सटीकता के साथ लिखा गया था।
    7. प्रत्येक वर्ग के लिए सुविधाओं को तेज करने, धुंधला करने, आकार द्वारा सॉर्ट करने, आदि के लिए फ़िल्टर लागू करके एल्गोरिदम / ऐप की सटीकता को बढ़ाने के लिए समायोजित करें। Visiopharm प्रत्येक वर्ग को एक या एकाधिक लेंस के माध्यम से देखता है जिसे सुविधाओं के रूप में जाना जाता है। विशेषताएं बदलती हैं कि कक्षा कुछ रंगों या तीव्रताओं को बाहर लाने के लिए छवि को कैसे देखती है।
      नोट:: कस्टम एल्गोरिथ्म के लिए, 8500 μm2 और उसके बाद के संस्करण को मापने वाले मेटास्टेसिस को लेबल किया जाता है और मेटास्टेसिस के रूप में मापा जाता है। यह आकार विचरण और मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए बहुत छोटा है। छोटे गलत आकार के क्षेत्रों और 8500 μm2 के तहत छोटे मेटास्टैटिक क्षेत्रों को सामान्य ऊतक परिमाणीकरण में शामिल किया गया था।
    8. संशोधित सेटिंग्स को ऐप या कस्टम एल्गोरिथ्म से सहेजें और फिर, एल्गोरिथ्म / ऐप को एच एंड ई-दाग ऊतकों के पूरे सेट या श्रृंखला पर लागू करें।
    9. अंत में, सभी आउटपुट चर निर्यात करें, जिसमें तालिका 1 में सूचीबद्ध वे शामिल हैं। माइक्रोन वर्ग (μm2) में क्षेत्र को प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए परिमाणित किया जा सकता है और प्रतिशत नमूना कुल शुद्ध ऊतक क्षेत्र (यानी, कुल ऊतक माइनस एयर स्पेस) से प्राप्त होते हैं।
    10. एक कस्टम एल्गोरिथ्म बनाते समय, सटीक माप सुनिश्चित करने और ऊतक प्रकारों के बीच अंतर करने के लिए अमेरिकन कॉलेज ऑफ वेटरनरी पैथोलॉजिस्ट द्वारा प्रमाणित पशु चिकित्सा रोगविज्ञानी बोर्ड के परामर्श से ऊतक मार्कअप की समीक्षा करें।

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Representative Results

यदि पूंछ-शिरा इंजेक्शन के लिए बिना लेबल वाली कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, तो फेफड़े के उपनिवेशीकरण की पुष्टि करना मुश्किल हो सकता है जब तक कि (1) नेक्रोप्सी का समय यदि मैक्रोमेटास्टेस को देखा जा सकता है या (2) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के बाद यदि माइक्रोस्कोपिक मेटास्टेसिस मौजूद हैं। व्यापक मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ के साथ, चूहों को सांस लेने में श्रम किया जाएगा। किसी भी ट्यूमर अध्ययन के साथ, अध्ययन की अवधि के दौरान चूहों को सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए। लेबल कोशिकाओं का उपयोग सफल पूंछ-शिरा इंजेक्शन की पुष्टि करने का एक आसान तरीका है; इसलिए प्रदर्शन में लूसिफेरस-टैग किए गए एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं का उपयोग। हालांकि, विवो इमेजिंग में प्रयोगात्मक डिजाइन और अन्य कारकों के आधार पर हमेशा संभव या आवश्यक नहीं होता है। चित्रा 1A सटीक इंजेक्शन की पुष्टि के रूप में लूसिफेरस-टैग किए गए एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं की पूंछ-शिरा इंजेक्शन के बाद 2 घंटे से भी कम समय में वक्षीय अंतरिक्ष में बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल दिखाता है। इस प्रयोग के लिए, वक्षीय क्षेत्र में फोटॉन की गिनती समय के साथ बढ़ती है और एक मजबूत बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल दिन 24 पोस्ट-इंजेक्शन (चित्रा 1 बी और सी; स्केल बार में परिवर्तन पर ध्यान दें) पर मौजूद होता है। necropsy के समय, इन चूहों में कई मैक्रोस्कोपिक फेफड़ों के घावों को देखा गया था (चित्रा 1 डी)।

उचित ऊतक प्रसंस्करण और धुंधला होने के बाद, एच एंड ई-दाग वाले फेफड़ों के वर्गों को स्कैन या इमेज किया जा सकता है। मेटास्टैटिक फेफड़े के ट्यूमर बोझ परिमाणीकरण प्रभावी ढंग से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर और एक कस्टम एल्गोरिथ्म का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। अनुकूलित एल्गोरिथ्म का उपयोग करके, पूरे फेफड़े के ऊतकों को विभिन्न ऊतक विशेषताओं (चित्रा 2 ए और बी) द्वारा विभाजित किया जाता है। इस तरह से फेफड़ों के ऊतकों को विभाजित करके, सॉफ़्टवेयर तालिका 1 में सूचीबद्ध विभिन्न मापदंडों को माप सकता है। यह विश्लेषण एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों से फेफड़ों के ऊतकों पर किया गया है, जिसके बाद मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण या वाहन नियंत्रण (डीएमएसओ) को अवरुद्ध करने के लिए डिज़ाइन की गई दवा के साथ उपचार किया गया है। इस विश्लेषण से कच्चे डेटा को तालिका 2 में दिखाया गया है। इसके अलावा, चित्रा 3ए या तो डीएमएसओ या दवा-उपचारित चूहों से एमडीए-एमबी -231 फेफड़ों के मेटास्टेसिस की प्रतिनिधि एच एंड ई छवियों को दिखाता है। हालांकि इन उपचार समूहों के बीच मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ में अंतर को आसानी से अनदेखा किया जा सकता है क्योंकि फेफड़ों के नोड्यूल की कुल संख्या अलग नहीं है, सभी मापदंडों का एक व्यापक विश्लेषण प्रतिशत शुद्ध फेफड़ों के मेटास्टेसिस क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है (चित्रा 3 बी, सी)। यह मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक और संपूर्ण दृष्टिकोण की आवश्यकता को रेखांकित करता है जैसे कि यहां वर्णित विधि।

चित्रा 3 में प्रस्तुत आंकड़ों के लिए, सभी सांख्यिकीय विश्लेषण GraphPad प्रिज्म 7 का उपयोग करके आयोजित किए गए थे। डेटा को सामान्य रूप से निम्नलिखित मानक सामान्यता परीक्षणों में से किसी को भी पारित करने पर वितरित माना जाता था: डी'एगोस्टिनो-पियर्सन ओम्निबस, शापिरो-विल्क, और कोलमोगोरोव-स्मिरनोव। वाहन और दवा-उपचारित समूहों (चित्रा 3) के बीच तुलना दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट द्वारा की गई थी। सांख्यिकीय महत्व पी ≤ 0.05 पर स्थापित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: विवो bioluminescence में सफल पूंछ-शिरा इंजेक्शन की पुष्टि.
(ए) लूसिफेरस-टैग किए गए एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं की पूंछ-शिरा इंजेक्शन के 1 घंटे बाद चूहों में प्रतिनिधि बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल। (बी) (ए) के रूप में चूहों के एक ही सेट में प्रतिनिधि बायोल्यूमिनेसेंस संकेत लूसिफेरस-टैग किए गए एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं की पूंछ-नस इंजेक्शन के 24 दिन बाद। [(ए) और (बी) के बीच स्केल बार में परिवर्तन पर ध्यान दें]। (ग) एमडीए-एमबी-231 टेल-वेन इंजेक्टेड चूहों में समय के साथ फोटॉन की गणना का परिमाणीकरण। त्रुटि सलाखों का प्रतिनिधित्व करते हैं मतलब ± SEM. (n = 8 चूहों) (D) प्रतिनिधि गैर-ट्यूमर असर फेफड़ों के ऊतकों (दाएं) और MDA-MB-231 मैक्रोमेटास्टेस फेफड़ों में (बाएं) necropsy के समय. स्केल बार = 50 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: Visiopharm सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ऊतक विभाजन.
(ए) अनुकूलित सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म का उपयोग करके अविभाजित और खंडित ऊतक मार्क-अप के प्रतिनिधि स्निप्स। (बी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विभाजित सभी ऊतक श्रेणियों के लिए किंवदंती। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एच एंड ई-दाग ऊतकों के प्रतिनिधि मेटास्टैटिक फेफड़े के ट्यूमर बोझ विश्लेषण।
(ए) एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के पूंछ-शिरा इंजेक्शन के बाद बिना इंजेक्ट किए गए चूहों और नियंत्रण (डीएमएसओ) और दवा-उपचारित चूहों से फेफड़ों के ऊतकों का प्रतिनिधि एच एंड ई धुंधला होना। प्रतिनिधि ट्यूमर मेटास्टेसिस तीर के साथ इंगित कर रहे हैं। स्केल सलाखों = 4x आवर्धन के लिए 500 μm और 10x आवर्धन के लिए 200 μm. (बी) नियंत्रण और दवा-उपचारित चूहों के प्रतिशत शुद्ध फेफड़ों के मेटास्टेसिस क्षेत्र का ग्राफ। त्रुटि पट्टियाँ SD ± माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं. (*) P = 0.022 छात्र के t-test द्वारा। (सी) मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर बोझ विश्लेषण को सारांशित करने वाली तालिका (एन = 9 डीएमएसओ; एन = 9 दवा-उपचारित)। डेटा के सामान्य वितरण की जांच के बाद, तालिका में सभी पी-मानों को अनपेयर्ड, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राचल वर्णन
कुल ऊतक क्षेत्र (μm2) सभी ट्यूमर मेटास्टेसिस, सामान्य फेफड़े और लाल रक्त कोशिकाओं के क्षेत्रों सहित वर्ग माइक्रोन में क्षेत्र।
मेटास्टेसिस गिनती फेफड़ों के ऊतकों के भीतर मेटास्टेसिस की कुल संख्या।
मेटास्टेसिस क्षेत्र प्रतिशत (μm2) कुल मेटास्टेसिस क्षेत्र को शुद्ध ऊतक क्षेत्र x 100 द्वारा विभाजित किया गया है।
कुल ऊतक + सफेद अंतरिक्ष क्षेत्र (μm2) सभी ऊतक और सफेद अंतरिक्ष के समावेशी वर्ग माइक्रोन में क्षेत्र।
शुद्ध ऊतक क्षेत्र (μm2) सफेद स्थान और लाल रक्त कोशिकाओं के बिना वर्ग माइक्रोन (मेट्स और सामान्य फेफड़े) में ऊतक क्षेत्र।
कुल मेटास्टेसिस क्षेत्र (μm2) निर्णय वन algorithim द्वारा खंडित के रूप में वर्गीकृत के रूप में वर्गाकार माइक्रोन में कुल मेटास्टेसिस क्षेत्र.
माध्य मेटास्टेसिस क्षेत्र (μm2) प्रत्येक छवि के भीतर मेटास्टेसिस के वर्ग माइक्रोन में माध्य (औसत) क्षेत्र।
माध्यिका मेटास्टेसिस क्षेत्र (μm2) वर्ग माइक्रोन में माध्यिका मेटास्टेसिस क्षेत्र। मेटास्टेसिस की एक समान संख्या इस मान से नीचे आती है और समान संख्या में मेटास्टेसिस माध्यिका मान से अधिक होते हैं।

तालिका 1: पैरामीटर सॉफ्टवेयर के साथ मापा. कस्टम एल्गोरिथ्म का उपयोग करके परिकलित प्रत्येक माप के विवरण के साथ पैरामीटर्स की सूची.

फिसलना मेटास्टेसिस गिनती मेटास्टेसिस क्षेत्र प्रतिशत (μm2) कुल ऊतक + सफेद अंतरिक्ष क्षेत्र (μm2) कुल सफेद अंतरिक्ष (μm2) शुद्ध ऊतक क्षेत्र (μm2) कुल मेटास्टेसिस क्षेत्र (μm2) लाल रक्त कोशिकाओं क्षेत्र (μm2) माध्य मेटास्टेसिस क्षेत्र (μm2) माध्यिका मेटास्टेसिस क्षेत्र (μm2)
171 फेफड़े स्लाइड 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 फेफड़े स्लाइड 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 फेफड़े स्लाइड 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 फेफड़े स्लाइड 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 फेफड़े स्लाइड 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 फेफड़े स्लाइड 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 फेफड़ों स्लाइड 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 फेफड़े स्लाइड 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 फेफड़े स्लाइड 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 फेफड़े स्लाइड 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 फेफड़े स्लाइड 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 फेफड़े स्लाइड 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 फेफड़े स्लाइड 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 फेफड़े स्लाइड 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 फेफड़े स्लाइड 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 फेफड़े स्लाइड 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 फेफड़े स्लाइड 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 फेफड़े स्लाइड 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 फेफड़े स्लाइड 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 फेफड़े स्लाइड 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 फेफड़े स्लाइड 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 फेफड़े स्लाइड 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 फेफड़े स्लाइड 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 फेफड़े स्लाइड 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 फेफड़े स्लाइड 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 फेफड़े स्लाइड 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 फेफड़े स्लाइड 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 फेफड़े स्लाइड 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 फेफड़े स्लाइड 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 फेफड़े स्लाइड 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 फेफड़े स्लाइड 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 फेफड़े स्लाइड 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 फेफड़े स्लाइड 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 फेफड़े स्लाइड 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 फेफड़े स्लाइड 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 फेफड़े स्लाइड 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

तालिका 2: परिणामों की प्रतिनिधि तालिका। एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों की पूंछ-नस के एक समूह से एल्गोरिथ्म के प्रत्येक पैरामीटर के लिए परिणामों की तालिका।

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Discussion

जैसा कि शोधकर्ता मेटास्टेसिस के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन का उपयोग करना जारी रखते हैं, परिणामी मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ का विश्लेषण करने के लिए मानक प्रथाओं की कमी है। कुछ मामलों में, विशेष सेल लाइनों के हेरफेर और / या रासायनिक यौगिकों के उपयोग पर मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ में महत्वपूर्ण अंतर मैक्रोस्कोपिक रूप से देखा जा सकता है। हालांकि, अन्य उदाहरणों में, मेटास्टैटिक सीडिंग और विकास में सूक्ष्म अंतर को पूरी तरह से पैथोलॉजिकल विश्लेषण के बिना अनदेखा या गलत व्याख्या की जा सकती है। यह अध्ययन मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ विश्लेषण की एक व्यापक विधि को शामिल करके पहले प्रकाशित पूंछ-शिरा इंजेक्शन प्रोटोकॉल को आगे बढ़ाता है। महत्वपूर्ण रूप से, डिजिटल पैथोलॉजी विश्लेषण की इस विधि को ट्यूमर कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के बाद फेफड़ों के मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ के परिमाणीकरण पर भी लागू किया जा सकता है जो सहज मेटास्टेसिस के साथ-साथ अन्य प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल (यानी इंट्राकार्डियक, आदि) और रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) मॉडल में सक्षम हैं। पशु चिकित्सा रोगविज्ञानियों द्वारा डिजिटल इमेजिंग और सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म विकास का उपयोग मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर बोझ 25 का विश्लेषण करने के लिए इस दृष्टिकोण की पुनरुत्पादन, सटीकता और संपूर्णता सुनिश्चित करता है।

सेल लाइनों, सेल एकाग्रता, और समापन बिंदुओं का विचारशील निर्णय या तो पहले प्रकाशित अध्ययनों या सावधान प्रयोगात्मक अनुकूलन के आधार पर बिल्कुल आवश्यक है। यह देखते हुए कि मेटास्टैटिक सीडिंग और उपनिवेशीकरण विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका आबादी 26,27 के साथ बातचीत पर अत्यधिक निर्भर हैं, प्रतिरक्षा-सक्षम चूहों का उपयोग आदर्श है, हालांकि हमेशा संभव नहीं होता है। इसी कारण से, एथाइमिक या एनएसजी चूहों का उपयोग करके प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस अध्ययनों की व्याख्या, जिसमें प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका घटकों की कमी है, को सावधानी के साथ लिया जाना चाहिए। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली एमवीटी 1 कोशिकाओं सहित कई माउस स्तन ट्यूमर सेल लाइनें हैं, जिन्हें एफवीबी / एन माउस स्ट्रेन 22,28,29 से प्राप्त किया गया है। अन्य syngeneic मॉडल के रूप में अच्छी तरह से मौजूद है. सेल एकाग्रता के संबंध में, बड़ी संख्या में कोशिकाओं का इंजेक्शन मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ को बहुत तेज और बढ़ा सकता है। हालांकि, यदि फेफड़े अभिभूत हैं, तो व्यक्तिगत मेटास्टैटिक फोकी को अलग करना मुश्किल हो सकता है और एम्बोली होने की अधिक संभावना है। इसके अलावा, पूंछ-शिरा इंजेक्शन प्रक्रिया को सुरक्षित रूप से और / या नियमित रूप से इंजेक्शन करने से पहले पर्याप्त अभ्यास और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। कई संस्थान तकनीकी प्रशिक्षण प्रदान करेंगे और अभ्यास उद्देश्यों के लिए चूहों को प्रदान कर सकते हैं। सुई का उचित प्लेसमेंट और एक चिकनी इंजेक्शन सफलता का संकेत देना चाहिए; हालांकि, प्रशिक्षण / अभ्यास उद्देश्यों के लिए, इवांस ब्लू डाई का उपयोग सफल इंजेक्शन (बाँझ पीबीएस में 1%) निर्धारित करने में मदद करने के लिए किया जा सकता है। माउस के चरम इंजेक्शन के तुरंत बाद नीले हो जाएंगे, लेकिन बाद में जानवर को euthanized किया जाना चाहिए।

इसके अतिरिक्त, स्लाइड कलाकृतियों को नियंत्रित करने और रोकने के लिए मानक necropsy और ऊतक नमूना तकनीकों के महत्व है कि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा स्लाइड स्कैनिंग और विश्लेषण को बाधित कर सकते हैं पर्याप्त जोर नहीं दिया जा सकता है। necropsy के समय फेफड़ों की मुद्रास्फीति ऊतक अखंडता को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण कदम है और बाद में एच एंड ई धुंधला के साथ-साथ अंतिम विश्लेषण में सुधार करता है। रिज़ॉल्यूशन और पुनरुत्पादन के साथ स्थिरता के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि एक अध्ययन सेट में सभी स्लाइड्स को एक ही उद्देश्य के साथ स्कैन किया जाता है। इस अध्ययन में, एल्गोरिथ्म सेटिंग्स की सटीकता और विश्लेषण किए गए क्षेत्रों पर लागू होने पर ट्यूमर मेटास्टेसिस की उचित पहचान सुनिश्चित करने के लिए सभी स्लाइड्स को 40x पर स्कैन किया गया था। प्रत्येक स्लाइड के लिए, एक ही फेफड़े के लोब को लगातार स्कैन किया गया था और प्रत्येक माउस के लिए विश्लेषण किया गया था। यह भी दृढ़ता से सिफारिश की जाती है कि एक रोगविज्ञानी लागू एल्गोरिथ्म की सटीकता के लिए ऊतक मार्कअप की समीक्षा करता है और यह कि एक ही एल्गोरिथ्म एक अध्ययन में हर स्लाइड पर लागू होता है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल को प्रयोगात्मक डिजाइन, उपयोगकर्ता वरीयताओं और वांछित परिणाम माप के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। इस तरह के एक संशोधन में एक सचेत जानवर के लिए पारंपरिक अवरोधक उपकरण के बजाय एक संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष का उपयोग शामिल है। पशु स्वास्थ्य और कल्याण के संदर्भ में, न तो दृष्टिकोण दूसरे से बेहतर है और प्रत्येक के पास फायदे के साथ-साथ सीमाओं का अपना सेट है। इसके अलावा, काले या भूरे रंग के चूहों के लिए, पूंछ नसों की कल्पना करने के लिए एक प्रकाश स्रोत या हीटिंग डिवाइस की आवश्यकता हो सकती है। नसों को फैलाने के लिए इन्फ्रारेड लैंप या गर्म पानी के स्नान का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, तापमान की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए। इसके अलावा, वहाँ प्रबुद्ध संयम उपकरणों के रूप में अच्छी तरह से कृंतक संयम उपकरणों के अन्य वाणिज्यिक संस्करणों के रूप में अच्छी तरह से उपलब्ध हैं. कुछ जांचकर्ता इंजेक्शन के लिए लुएर-लोक सिरिंज पसंद करते हैं। हमें ल्यूर-लोक सिरिंज के साथ हवा के बुलबुले को खत्म करना अधिक कठिन लगता है, लेकिन यह वरीयता का मामला है। कोशिकाओं की व्यवहार्यता पूंछ-शिरा इंजेक्शन प्रक्रिया के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है, और इसलिए, सटीक सेल गिनती के साथ-साथ इंजेक्शन से पहले बर्फ पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए आवश्यक कदम हैं। यदि फेफड़ों के सीडिंग और हेरफेर की गई सेल लाइनों के उपनिवेशीकरण की तुलना की जाती है, तो इंजेक्शन से पहले सेल आकार और व्यवहार्यता में किसी भी अंतर को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है क्योंकि ये परिणामों की व्याख्या को जटिल बना सकते हैं। एक संकीर्ण गेज सुई का उपयोग करते समय सेल की मृत्यु और / या क्षति हो सकती है; हालांकि, यह अनुशंसा नहीं की जाती है कि 25 जी से बड़ी सुई का उपयोग किया जाए क्योंकि यह जानवर को दर्द और असुविधा का कारण बन सकता है।

यह सत्यापित करने के तरीके के रूप में कि फेफड़ों के घावों को इंजेक्ट किए गए ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा बनाया जाता है, ऊतक वर्गों पर इम्युनोस्टेनिंग किया जा सकता है। यदि मानव सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है, तो मेटास्टैटिक घावों को समझने के लिए मानव-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि टैग की गई सेल लाइनों (जैसे, जीएफपी) का उपयोग कर रहे हैं, तो संबंधित एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, कई स्तन कैंसर सेल लाइनें उपकला मार्करों (यानी, साइटोकेराटिन, ई-कैडरिन और ईपीसीएएम) के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन अभिव्यक्ति का पूर्व ज्ञान आवश्यक है। हालांकि, वायुमार्ग को अस्तर करने वाला फेफड़ों का उपकला भी इन मार्करों के लिए सकारात्मक होगा और इस प्रकार, संरचना पर भी विचार किया जाना चाहिए। ऐसे मामले हो सकते हैं जिनमें प्राथमिक फेफड़ों के ट्यूमर के विकास से इनकार किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, थायराइड ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर -1 (टीटीएफ 1) के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग का उपयोग प्राथमिक फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा के मार्कर के रूप में किया जा सकता है। TTF1 धुंधला एक प्रमाणित रोगविज्ञानी द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

इसमें, एक कस्टम एल्गोरिथ्म को एक निर्णय वन वर्गीकरण एल्गोरिथ्म का उपयोग करके लिखा गया था क्योंकि स्थापित फेफड़े के मेटास्टेसिस एल्गोरिथ्म को आकार में भिन्न मेटास्टेसिस का सटीक पता लगाने के लिए ठीक नहीं किया जा सकता था। यह अनुकूलित एल्गोरिथ्म जटिल माप को सक्षम बनाता है, आकार के अनुसार मेटास्टेसिस के सटीक विभाजन की अनुमति देता है, और आकार कटऑफ का समर्थन करता है ताकि छोटे मिसशेप वाले क्षेत्रों और सामान्य संरचनाओं की गलत व्याख्या न की जा सके और इसलिए अंतिम डेटा सेट में शामिल किया जा सके। हम उम्मीद करते हैं कि यह एल्गोरिथ्म विवो फेफड़ों के मेटास्टेसिस अध्ययन में अधिकांश पर लागू होगा, लेकिन उपयोगकर्ताओं को अपनी व्यक्तिगत अध्ययन आवश्यकताओं को फिट करने के लिए सॉफ़्टवेयर के भीतर सेटिंग्स को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, यह एल्गोरिथ्म जांचकर्ताओं के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है जो इसी तरह से फेफड़ों के मेटास्टैटिक बोझ का विश्लेषण करना चाहते हैं। छवि विश्लेषण प्लेटफार्मों के लिए कई अलग-अलग विकल्प हैं जिससे पहुंच या उपलब्धता, लागत और प्रशिक्षण, साथ ही साथ अनुभव स्तर का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा मंच निर्धारित हो सकता है36। विकल्पों की श्रेणी में मुफ्त प्लेटफ़ॉर्म जैसे कि QuPath और अधिक महंगे, लेकिन परिष्कृत प्लेटफ़ॉर्म शामिल हैं, जैसे Visiopharm। यह सलाह दी जाती है कि कोई छवि विश्लेषण पैथोलॉजी कोर और पैथोलॉजिस्ट के साथ परामर्श करता है जब यह तय करता है कि कौन सा मंच उपलब्ध हो सकता है और किसी विशेष शोध परियोजना के लिए सबसे अच्छा उपयोग किया जा सकता है।

सहज माउस स्तन ट्यूमर मॉडल (जैसे, MMTV-PyMT) या ऑर्थोटोपिक स्तन वसा पैड इंजेक्शन विधियां फेफड़ों के मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए सबसे शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल का प्रतिनिधित्व करती हैं। पूंछ-शिरा इंजेक्शन मॉडल के लिए एक गंभीर दोष यह है कि यह पूर्ण मेटास्टैटिक कैस्केड को दोहराता नहीं है और इसलिए ट्यूमर सेल एक्सट्रावेशन और माध्यमिक अंग उपनिवेशीकरण के अध्ययन तक सीमित है। हालांकि, यह प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए प्रासंगिक है क्योंकि पूंछ-शिरा इंजेक्शन के बाद गठित फेफड़ों के मेटास्टेसिस में मेटास्टैटिक घावों के समान जीनोमिक प्रोफाइल होते हैं जो एक ही कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक आरोपण के बाद विकसित होते हैं31। फेफड़ों के मेटास्टेसिस मॉडल को स्थापित करने के लिए, बड़ी संख्या में कोशिकाओं को अक्सर अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया जाता है जो मेटास्टेसिस की प्रक्रिया का सटीक प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है क्योंकि यह सीडिंग, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और नींद से संबंधित है। इसके अलावा, परिसंचरण मार्ग के आधार पर, फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस पूंछ-शिरा इंजेक्शन 32 के साथ सबसे आम हैं। अधिकांश स्तन कैंसर सेल लाइनों के साथ, प्रकाशित रिपोर्टें पूंछ-नस इंजेक्शन के बाद हड्डी, यकृत, या मस्तिष्क मेटास्टेसिस की अपेक्षाकृत कम घटनाओं का संकेत देती हैं। वैकल्पिक प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस विधियां जैसे कि इंट्राकार्डियक, इंट्राटिबियल, पोर्टल शिरा और इंट्राकैरोटिड इंजेक्शन अन्य साइटों 33,34,35,36,37 के लिए मेटास्टेसिस की जांच करने के लिए अधिक उपयुक्त हैं। फिर से, सहज स्तन ट्यूमर मॉडल या ऑर्थोटोपिक वसा पैड इंजेक्शन विधियां जो मेटास्टैटिक कैस्केड के सभी चरणों को दोहराती हैं, उन्हें प्राथमिकता दी जाती है। लगातार मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ, अध्ययन की अवधि, और इस तरह के अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या के साथ मुद्दे एक नकारात्मक पक्ष हैं। हालांकि, यहां प्रस्तुत डिजिटल पैथोलॉजी विश्लेषण की विधि को किसी भी सहज या प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल के माध्यम से गठित फेफड़ों के मेटास्टेसिस पर लागू किया जा सकता है।

विश्लेषण की विधि भी एल्गोरिथ्म निर्माण में व्यक्तिपरकता जैसी कुछ सीमाओं को उत्पन्न करती है। भले ही पूरी स्लाइड इमेजिंग एक पूरे ऊतक अनुभाग पर और एक माउस के सभी फेफड़ों के लोब पर डिजिटल विश्लेषण की अनुमति देती है, यह 3 डी ऊतक के दो आयामी विश्लेषण तक सीमित है। स्टीरियोलॉजी एक सामान्य अभ्यास बन रहा है जो छवि विश्लेषण के लिए 3 डी जानकारी प्राप्त करता है और ऊतक प्रसंस्करण के दौरान होने वाले ऊतक संकोचन जैसे कारकों के लिए जिम्मेदार हो सकता है38। हालांकि, स्टीरियोलॉजी की अपनी सीमाएं हैं जैसे ऊतक, संसाधन और समय की कमी।

उनकी बीमारी के मेटास्टैटिक प्रसार से प्रभावित कैंसर रोगियों की संख्या को देखते हुए, मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए पूंछ-शिरा इंजेक्शन विधि मेटास्टैटिक प्रसार के जटिल जीव विज्ञान को समझने और उपन्यास चिकित्सीय की पूर्व-नैदानिक प्रभावकारिता को निर्धारित करने के मामले में एक उपयोगी उपकरण बनी रहेगी। मेटास्टेसिस के विवो माउस मॉडल में, विशेष रूप से प्रतिरक्षा-सक्षम जानवरों का उपयोग करने वाले, इम्यूनोथेरेपी 29 में व्यापक रुचि को देखते हुए कैंसर अनुसंधान के लिए और भी महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं। इसके अलावा, प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल मेटास्टेसिस सप्रेसर जीन की जांच के मामले में महत्वपूर्ण हैं (यानी, जो प्राथमिक ट्यूमर के विकास को प्रभावित किए बिना कैंसर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक क्षमता को दबाते हैं), और इसलिए, एक मूल्यवान शोध उपकरण बने हुए हैं।

डिजिटल इमेजिंग और स्लाइड विश्लेषण तेजी से नैदानिक और प्रयोगात्मक माउस मॉडलिंग 39 में एक मुख्य आधार बन गए हैं। फेफड़ों के मेटास्टैटिक ट्यूमर के बोझ का विश्लेषण करने के लिए यहां वर्णित दृष्टिकोण के प्रकार का उपयोग करना अधिक व्यापक और सटीक तरीके से उच्च थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देगा। इसके अलावा, डिजिटल इमेजिंग पैथोलॉजी अधिक सहयोगी अनुसंधान परियोजनाओं के लिए एक एवेन्यू प्रदान करती है जिसमें पैथोलॉजिस्ट शामिल होते हैं जो स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के माउस मॉडल जैसे क्षेत्रों में विशेषज्ञ होते हैं। जैसा कि मल्टीप्लेक्स ऊतक इमेजिंग विधियों और 3 डी इमेजिंग प्रौद्योगिकियों (जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है) को विकसित किया जाना जारी है, डिजिटल इमेजिंग पैथोलॉजी, छवि विश्लेषण के लिए परिष्कृत सॉफ्टवेयर प्रोग्राम, और मेटास्टेसिस अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए पैथोलॉजिस्ट की विशेषज्ञता निश्चित रूप से आवश्यक होगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

प्रतिनिधि डेटा को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (K22CA218549 से S.T.S. के लिए) के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था। यहां रिपोर्ट की गई व्यापक विश्लेषण विधि को विकसित करने में उनकी सहायता के अलावा, हम ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर तुलनात्मक पैथोलॉजी और माउस फेनोटाइपिंग साझा संसाधन (निदेशक - Krista La Perle, DVM, PhD) को हिस्टोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सेवाओं के लिए धन्यवाद देते हैं और एल्गोरिथ्म विकास और विश्लेषण के लिए पैथोलॉजी इमेजिंग कोर।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 159 पूंछ-नस इंजेक्शन स्तन कैंसर फेफड़ों के मेटास्टेसिस एच एंड ई-दाग वर्गों मात्रात्मक डिजिटल पैथोलॉजी छवि विश्लेषण

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ट्यूमर कोशिकाओं के पार्श्व पूंछ-शिरा इंजेक्शन के बाद फेफड़ों के मेटास्टेसिस का पैथोलॉजिकल विश्लेषण
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Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

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