Summary
प्रोटोकॉल का लक्ष्य मस्तिष्क में गैर-इनवेसिव न्यूरोनल घावों के उत्पादन के लिए एक विधि प्रदान करना है। यह विधि मस्तिष्क परेन्चिमा को परिसंचारी न्यूरोटॉक्सिन देने के लिए, क्षणिक और फोकल तरीके से रक्त मस्तिष्क बाधा को खोलने के लिए चुंबकीय अनुनाद-निर्देशित केंद्रित अल्ट्रासाउंड (MRgFUS) का उपयोग करती है।
Abstract
कुछ प्रकार के चिकित्सकीय असभ्य न्यूरोलॉजिकल रोगों के इलाज के लिए शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप काफी प्रभावी हो सकता है। यह दृष्टिकोण विशेष रूप से विकारों के लिए उपयोगी है जिसमें पहचाने जाने योग्य न्यूरोनल सर्किटरी मिर्गी और आंदोलन विकारों जैसे महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वर्तमान में उपलब्ध सर्जिकल तौर-तरीकों, जबकि प्रभावी, आम तौर पर एक आक्रामक शल्य प्रक्रिया शामिल होती है, जिसके परिणामस्वरूप गैर-लक्षित ऊतकों को सर्जिकल चोट हो सकती है। नतीजतन, एक तकनीक शामिल करने के लिए सर्जिकल दृष्टिकोण की सीमा का विस्तार करना मूल्य का होगा जो गैर-आक्रामक और न्यूरोटॉक्सिक दोनों है।
यहां, मस्तिष्क में फोकल, न्यूरोनल घावों को गैर-आक्रामक तरीके से उत्पादन के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। यह दृष्टिकोण कम तीव्रता वाले अल्ट्रासाउंड का उपयोग करता है, जिसमें नसों में माइक्रोबबल्स के साथ क्षणिक रूप से और फोकल रूप से ब्लड ब्रेन बैरियर (बीबीबी) को खोलते हैं। क्षणिक बीबीबी खोलने की अवधि को एक लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र में व्यवस्थित रूप से प्रशासित न्यूरोटॉक्सिन देने के लिए शोषण किया जाता है। न्यूरोटॉक्सिन क्विनोलिक एसिड (क्यूए) आम तौर पर बीबीबी-अभेद्य होता है, और जब इंट्रापेरिटोनली या नसों के द्वारा प्रशासित किया जाता है तो इसे अच्छी तरह से सहन किया जाता है। हालांकि, जब क्यूए मस्तिष्क के ऊतकों तक सीधी पहुंच प्राप्त करता है, तो यह न्यूरॉन्स के लिए विषाक्त होता है। विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए चूहों और चूहों में इस विधि का उपयोग किया गया है। MRgFUS के तुरंत बाद, BBB के सफल उद्घाटन के विपरीत बढ़ाया T1 भारित इमेजिंग का उपयोग कर पुष्टि की है । प्रक्रिया के बाद, टी 2 इमेजिंग मस्तिष्क के लक्षित क्षेत्र तक सीमित चोट दिखाता है और लक्षित क्षेत्र में न्यूरॉन्स के नुकसान को हिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करते हुए पोस्टमार्टम की पुष्टि की जा सकती है। विशेष रूप से, जानवरों के बजाय QA के खारा के साथ इंजेक्शन BBB के उद्घाटन का प्रदर्शन करते हैं, लेकिन डॉट चोट या न्यूरोनल नुकसान प्रदर्शन नहीं है । इस विधि, सटीक इंट्रासर्जेब्रल नॉन-इनवेसिव गाइडेड सर्जरी (पिंग) कहा जाता है तंत्रिका सर्किटरी में गड़बड़ी से जुड़े तंत्रिका संबंधी विकारों के इलाज के लिए एक गैर-आक्रामक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है।
Introduction
इस विधि का उद्देश्य मस्तिष्क के एक लक्षित क्षेत्र में गैर-इनवेसिव न्यूरोनल घावों के उत्पादन के लिए एक साधन प्रदान करना है। इस तरह के दृष्टिकोण को विकसित करने का औचित्य न्यूरोलॉजिकल विकारों में योगदान देने वाले न्यूरोनल सर्किटरी को डिस्कनेक्ट करना है। उदाहरण के लिए, सर्जरी कुछ चिकित्सकीय असभ्य न्यूरोलॉजिकल विकारों, जैसे दवा प्रतिरोधी मिर्गी(DRE) 1के इलाज में काफी प्रभावी हो सकती है । हालांकि, उपलब्ध सर्जिकल तौर-तरीकों में से प्रत्येक के पास मस्तिष्क को अवांछनीय संपाश्र्वक क्षति के उत्पादन के मामले में सीमाएं हैं। पारंपरिक रेसेक्टिव सर्जरी रक्तस्राव, संक्रमण, रक्त के थक्के, स्ट्रोक, दौरे, मस्तिष्क की सूजन, और तंत्रिका क्षति2के जोखिम के साथ अत्यधिक आक्रामक हो सकती है। कम से कम इनवेसिव या नॉन-इनवेसिव होने वाली रेसेक्टिव सर्जरी के विकल्पों में लेजर इंटरस्टिशियल थर्मल थेरेपी और रेडियोसर्जरी शामिल हैं, जो ड्रे में बरामदगी को दबाने में भी कारगर साबित हुए हैं। हाल ही में, उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (HIFU) द्वारा उत्पादित थर्मल घावों ने दौरे को कम करने में वादा दिखाया है। हिफू गैर-आक्रामक है; हालांकि, इसकी उपचार खिड़की वर्तमान में खोपड़ी के आसपास स्थित गैर-लक्षित ऊतकों को थर्मल चोट के जोखिम के कारण मस्तिष्क के अधिक केंद्रीय क्षेत्रों तक सीमित है। ऐसी सीमाओं के बावजूद, सर्जरी के लाभ अक्सर संभावित जोखिमों से पल्ला झाड़ लेते हैं। उदाहरण के लिए, हालांकि DRE के लिए सर्जरी जमानत मस्तिष्क क्षति का उत्पादन कर सकते हैं, बरामदगी को दबाने और जीवन की गुणवत्ता में सुधार करने में इसके लाभकारी प्रभाव आम तौर पर शल्य चिकित्सा जोखिम पर प्रबल ।
यहां वर्णित विधि, सटीक इंट्रासेरेब्रल नॉन-इनवेसिव गाइडेड सर्जरी (पिंग) को न्यूरल सर्किटरी को डिस्कनेक्ट करने के उद्देश्य से विकसित किया गया था, जबकि संपाश्र्वक मस्तिष्क क्षति को सीमित किया गया था। यह विधि न्यूरोटॉक्सिन देने के लिए बीबीबी को खोलने के लिए माइक्रोबबल्स के नसों में इंजेक्शन के साथ संयुक्त रूप से कम तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग करती है। यह दृष्टिकोण मस्तिष्क,,3,4,5,6,7में थर्मल घावों का उत्पादन नहीं करता है, और बीबीबी खोलने की अवधि का फायदा उठाया जा सकता है ताकि मस्तिष्क परेन्चिमा तक बीबीबी-अभेद्य यौगिकों को वितरित किया जा सके।,, बीबीबी का उद्घाटन क्षणिक है, और चुंबकीय अनुनय इमेजिंग मार्गदर्शन का उपयोग करके लक्षित तरीके से उत्पादित किया जा सकता है। हमारे अध्ययनों में, बीबीबी खोलने की अवधि का उपयोग चूहों और चूहों8,,9में मस्तिष्क परेन्चिमा के लक्षित क्षेत्र में परिसंचारी न्यूरोटॉक्सिन देने के लिए किया गया है। क्विनोलिक एसिड एक न्यूरोटॉक्सिन है जिसे नसों में10, इंट्राआर्टेरिटी10या इंट्रारिटेली 8 , 9,11प्रशासित होने पर अच्छीतरहसे सहन कियाजाता,है। क्यूए विषाक्तता की कमी इसकी खराब बीबीबी पारगम्यता के कारण है, जिसे नगण्य10बताया गया है । इसके विपरीत, मस्तिष्क परेन्चिमा में क्यूए का सीधा इंजेक्शन न्यूरोनल घावों का उत्पादन करता है जो पड़ोसी अक्षोंको 12,,13से बचाता है। इस प्रकार, जब क्यूए को बीबीबी खोलने के लक्षित क्षेत्र में मस्तिष्क परेन्चिमा तक पहुंच प्राप्त होती है, तो न्यूरोनल डेथ8, 9,का उत्पादनहोताहै। वर्तमान विधि इस प्रकार एक सटीक लक्षित और गैर-आक्रामक तरीके से फोकल न्यूरोनल हानि पैदा करती है।
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Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को यूनिवर्सिटी ऑफ वर्जीनिया एनिमल केयर एंड यूज कमेटी ने मंजूरी दे दी है ।
1. रिएजेंट्स की तैयारी
- सर्जरी के दिन, इंजेक्शन क्विनोलिनिक एसिड (क्यूए) के 6.0 एमएल तैयार करें। 1.0 एन नाओएच के 4.0 मिलीग्राम क्यूए में 450 मिलीग्राम क्यूए को भंग करें। 10x पीबीएस, पीएच से 7.4 के 0.6 एमएल जोड़ें, और 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से डीएच2ओ फ़िल्टर के साथ 6.0 मिलियन की अंतिम मात्रा में लाएं। समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह के लिए स्थिर है।
- डेफ्लोरोबुटेन गैस से जांच करके सामान्य खारा में माइक्रोबबल्स का एक जलीय फैलाव तैयार करें और डीएसपीसी/खूंटी स्टेरेट मोनोलेयर शेल12के साथ स्थिर करें ।
- सामान्य गुरुत्वाकर्षण पर प्लवनशीलता द्वारा आकार माइक्रोबबल्स। मल्टीसाइजर III काउंटर का उपयोग करके इलेक्ट्रोजोन संवेदन द्वारा माइक्रोबबल एकाग्रता और आकार निर्धारित करें। माइक्रोबबल एकाग्रता और आकार वितरण क्रमशः 6 x 108/एमएल और ~ 2 माइक्रोन (मतलब कण व्यास) होना चाहिए। सबसे बड़े बुलबुले प्लवनशीलता अपवर्जन/पृथक्करण द्वारा हटा दिए जाते हैं ।
- वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोबबल्स खरीदें।
2. जानवरों की तैयारी
- प्रसव के बाद 3 दिनों के लिए जानवर (चूहा या माउस) को अनुकूलित करें। यहां वर्णित प्रयोगों में स्प्राग-डावले चूहों (5-6 सप्ताह की उम्र) या टेलेंसेफेलिक आंतरिक संरचनात्मक हेट्रोटोपिया (टिश) चूहों (स्थानीय कॉलोनी) का उपयोग किया गया।
- 12 घंटे की रोशनी के नीचे जानवरों को घर दें: 12 घंटे का अंधेरा चक्र।
- जानवरों के वजन को रिकॉर्ड करें। यह जानकारी प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण है ।
- पूर्व-परिचालन आधारभूत छवियों को स्थापित करने के लिए FUS प्रक्रिया से पहले दिन T2-भारित एमआर छवियां प्राप्त करें। टी 2 इमेजिंग के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: पुनरावृत्ति समय/इको टाइम [TR/TE] = 3,000/138 मिलीसेकंड, 3 औसत, देखने के क्षेत्र = 29 x 45मिमी 2,मैट्रिक्स आकार = 125 x 192, स्लाइस मोटाई = 0.23 मिमी।
- आइसोफ्लुन (4% इंडक्शन, 2% रखरखाव) के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें। एक अंगुली चुटकी का उपयोग कर संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई की पुष्टि करें। आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
- जानवर की खोपड़ी को शेव करें, और शेष बालों को डिपिलेटरी क्रीम से हटा दें।
- माइक्रोबबल्स, कंट्रास्ट एजेंट और क्यूए के अर्क के लिए पूंछ नस कैथेटर का उपयोग करें। कैथेटर में 30 जी x 1/2 इंच सुई के साथ लगे पीई10 ट्यूबिंग की लंबाई होती है । लाइन में हेपरिनाइज्ड नमकीन के साथ 1 एमएल सिरिंज छोड़ दें, जब लाइन का उपयोग इन्फ्यूजन के लिए किया जाता है तो हटा दिया जाए और फिर से संलग्न किया जाए।
3. एमआरआई और पिंग प्रक्रियाएं
- 600 मीटर/एम/एम(चित्रा 1 और चित्रा 2)की ढाल शक्ति के साथ 7 टी एमआर यूनिट पर एमआरआई करें। FUS प्रणाली में शामिल एक सतह कुंडली का उपयोग कर एमआरआई अधिग्रहण करते हैं।
नोट: प्रयोगों के लिए उपयोग की जाने वाली FUS प्रणाली में तीन भाग शामिल हैं: (i) सोनीशन सिस्टम एक एमआर-संगत पूर्व-केंद्रित है, 8-तत्व वलयाकार सरणी, 1.5 मेगाहर्ट्ज ट्रांसड्यूसर (गोलाकार त्रिज्या = 20 मिमी ± 2 मिमी, सक्रिय व्यास = 25 मिमी (एफ-नंबर = 0.8), 80% इलेक्ट्रिक-ध्वनिक दक्षता के साथ, जो चरणबद्ध सरणी जनरेटर और आरएफ पावर एम्पलीफायर से जुड़ा हुआ है; (ii) पूर्वकाल-पीछे की दिशा और औसत-पक्षीय दिशा में ट्रांसड्यूसर को स्थानांतरित करने के लिए एक एमआर-संगत मोटराइज्ड पोजिशनिंग चरण; (iii) फोकल गहराई(चित्रा 2)को समायोजित करने के लिए चरण मॉड्यूलेशन के माध्यम से इलेक्ट्रॉनिक ध्यान केंद्रित करने सहित सोनीशन की डिलीवरी को नियंत्रित करने के लिए एक थर्मोगाइड वर्कस्टेशन। - एमआर-संगत FUS सिस्टम की कुंडली स्लेज असेंबली(चित्रा 1)पर एनेस्थेटाइज्ड जानवर को प्रवण स्थिति में रखें। स्लेज के पालने में शामिल छेदक बार और कान सलाखों का उपयोग करके जानवर को स्थिर करें।
- पानी से गीला खोपड़ी पर ध्वनिक जेल लागू करें; यह सुनिश्चित करना कि कोई बुलबुले मौजूद नहीं हैं, जानवर की खोपड़ी के ऊपर ट्रांसड्यूसर असेंबली के पानी परिसंचरण भाग की झिल्ली बाधा रखें, और खोपड़ी की प्लेट के सापेक्ष समानांतर प्लैनर ओरिएंटेशन में जहां तक संभव हो ट्रांसड्यूसर असेंबली को कम करें। ट्रांसड्यूसर के डायाफ्राम को सीधे खोपड़ी की प्लेट पर जानवर की मुंडा खोपड़ी के खिलाफ मजबूती से रखें।
- श्वसन की निगरानी के लिए, सर्जिकल टेप के साथ शरीर के लिए एक वायवीय सेंसर संलग्न करें। बाएं निचले रिब पिंजरे पर वायवीय सेंसर की स्थिति।
- 7T एमआरआई इकाई(चित्रा 1)में कुंडली, स्लेज, और जानवर के साथ FUS हाथ विधानसभा ले जाएँ ।
- जानवर के सिर के सापेक्ष ट्रांसड्यूसर असेंबली की सामान्य शारीरिक स्थिति निर्धारित करने के लिए एक T2-स्काउट अनुक्रम चलाएं, और आवश्यक(चित्रा 2)के रूप में यांत्रिक समायोजन करें। टी 2 इमेजिंग के लिए पैरामीटर हैं: पुनरावृत्ति समय/इको टाइम [टीआर/टीई] = 3,000/138 मिलीसेकंड, 3 औसत, फील्ड ऑफ व्यू = 29 x 45मिमी 2,मैट्रिक्स आकार = 125 x 192, स्लाइस मोटाई = 0.23 मिमी। थर्मोमेट्री आमतौर पर इस प्रोटोकॉल में उपयोग नहीं किया जाता है।
- ट्रांसड्यूसर स्थिति को परिष्कृत करने के लिए टी 2 छवियां प्राप्त करें। ठीक, ट्रांसड्यूसर स्थान को परिभाषित करें और सॉफ्टवेयर के लक्ष्यीकरण फ़ंक्शन का उपयोग करके सोनीसेक्शन के फोकल पॉइंट (एस) को निर्दिष्ट करें। टी 2 इमेजिंग के लिए पैरामीटर हैं: पुनरावृत्ति समय/इको टाइम [टीआर/टीई] = 3,000/138 मिलीसेकंड, 3 औसत, फील्ड ऑफ व्यू = 29 x 45मिमी 2,मैट्रिक्स आकार = 125 x 192, स्लाइस मोटाई = 0.23 मिमी।
- बस सोनीशन से पहले, पूंछ नस के माध्यम से14 माइक्रोबबल्स के ३०० μL/kg सुई ।
- सोनीशेंश (30 एमएस वेव पैकेट, 3% ड्यूटी साइकिल, 1 हर्ट्ज फट पुनरावृत्ति आवृत्ति, 240 s अवधि/sonication) का उत्पादन करने के लिए 1.5 मेगाहर्ट्ज ट्रांसड्यूसर का उपयोग करें।
- सोनीशन के तुरंत बाद, पूंछ नस के माध्यम से गाडोडायमाइड कंट्रास्ट एजेंट इंजेक्ट करें, और फिर बीबीबी के उद्घाटन और लक्ष्यीकरण की सटीकता की पुष्टि करने के लिए T1-भारित प्लस कंट्रास्ट स्कैन करें। टी 1-भारित इमेजिंग के लिए पैरामीटर: टीआर/टीई = 900/12 मिलीसेकंड, 2 औसत, देखने का क्षेत्र = 24 x 30मिमी 2,मैट्रिक्स आकार = 208 x 256, स्लाइस मोटाई = 0.7 मिमी। आमतौर पर, एक भी T1 स्कैन किया जाता है।
- एमआरआई से फ्यूज आर्म और स्लेज निकालें, और जानवर को 2% आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण को बनाए रखते हुए 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक हीटिंग पैड पर रखें।
- सोनीशन के बाद 30 मिनट शुरू, २२५ मिलीग्राम/किलो (q.s से १.० ml नमकीन) की अंतिम खुराक प्राप्त करने के लिए १६.८ μL/min की दर से 1 घंटे के लिए पूंछ नस के माध्यम से क्यूए (७५ मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान) को बढ़ावा देने के लिए एक सिरिंज पंप का उपयोग करें ।
- जब जलसेक पूरा हो जाता है, तो जानवरों को बंद करें, जानवरों को सतर्क होने तक हीटिंग पैड पर रखें। एक पिंजरे में जानवर प्लेस और प्रक्रिया के बाद कई घंटे के लिए, हर 15 मिनट अपनी गतिविधि के लिए नियमित जांच करते हैं ।
- जानवर को विवरियम में लौटाएं और संकट या अनियमित गतिविधि के लिए पहले दिन हर 6 घंटे की जांच करें।
- एक दिन के बाद sonication, सोनीशन के क्षेत्र में किसी भी नुकसान का आकलन करने के लिए T2 भारित एमआर इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं । टी 2 इमेजिंग के लिए पैरामीटर: पुनरावृत्ति समय/इको टाइम [TR/TE] = 3,000/138 मिलीसेकंड, 3 औसत, देखने का क्षेत्र = 29 x 45मिमी 2,मैट्रिक्स आकार = 125 x 192, स्लाइस मोटाई = 0.23 मिमी। संभावित ऊतक क्षति/एडिमा की पहचान करने के लिए अतिसंथत्व के क्षेत्रों के लिए छवियों का मूल्यांकन किया जाता है ।
4. न्यूरोनल हानि का पोस्टमार्टम विश्लेषण
- फ्लोरो-जेड हिस्टोकेमिस्ट्री के साथ न्यूरोनल हानि का आकलन करने के लिए 4-5 दिनों की पोस्ट-सोनीशन, जीवित रहने की अवधि की अनुमति दें।
- आइसोफ्लाणे के साथ जानवर को गहराई से एनेस्थेटाइज करें, और 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.4) के साथ इंट्राकार्डियल परफ्यूजन के माध्यम से इच्छामृत्यु दें और इसके बाद फॉस्फेट बफर में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड करें।
- खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें और 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड में 2 दिनों के लिए पोस्ट-फिक्स करें।
- क्रायोप्रोटेक्शन के लिए मस्तिष्क को 30% सुक्रोज में विसर्जित करें, और क्रायोस्टेट के साथ 20-30 माइक्रोन की मोटाई पर वर्गों में कटौती करें।
- जिलेटिनीकृत स्लाइड्स पर माउंट क्रायोस्टेट सेक्शन और रात भर हवा-सूखी।
- आसुत पानी में स्लाइड रीहाइड्रेट, और फिर आरोही वर्गीकृत इथेनॉल में निर्जलित। निर्जलीकरण के बाद, उतरते ग्रेडेड इथेनॉल में स्लाइड रिहाइड्रेट करें।
- एक कक्षीय शेखर पर 15 मिनट के लिए 0.06% पोटेशियम परमंगनेट के समाधान के लिए स्लाइड स्थानांतरित करें।
- आसुत पानी में 1 मिनट के लिए स्लाइड कुल्ला और 0.1% एसिटिक एसिड में फ्लोरो-जेड बी के 0.001% समाधान के लिए स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के तहत इनक्यूबेट । आसुत पानी में 1 मिनट के लिए स्लाइड तीन बार कुल्ला।
- स्लाइड्स को एक स्लाइड गर्म पर सुखाएं, 3 मिनट के लिए जाइलीन में संतुलन, और DPX बढ़ते मीडिया का उपयोग करके कवरलिप करें।
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Representative Results
यह खंड एक नियोकॉर्टिकल डिस्प्लेसिया में स्थित न्यूरॉन्स पर पिंग के प्रभाव का वर्णन करता है। ऊतक डिस्प्लेसियास दवा प्रतिरोधी मिर्गी के रोगियों के दिमाग में एक आम विशेषता है, और जब्ती-जेनिक डिस्प्लेसियास को हटाने से दौरे का उत्कृष्ट नियंत्रण प्रदान किया जा सकता है15। डिस्प्लास्टिक मस्तिष्क ऊतक पर पिंग के प्रभाव को परिभाषित करना इसलिए एक महत्वपूर्ण प्राथमिकता है। आनुवंशिक कॉर्टिकल डिस्प्लेसिया, टिश चूहे का एक चूहा मॉडल, इस मुद्दे का अध्ययन करने के लिए चुना गया था क्योंकि ताश मस्तिष्क सामान्य रूप से स्थित नियोकॉर्टेक्स(चित्रा 3)16के नीचे स्थित डिस्प्लास्टिक ऊतक (उपकॉर्टिकल बैंड हेट्रोटोपिया) प्रदर्शित करता है। डिस्प्लासिया और ओवरलाइंग नियोकॉर्टेक्स दोनों में न्यूरॉन्स होते हैं जो कार्यात्मक होते हैं और विशिष्ट नियोकॉर्टिकल कनेक्टिविटी17,18प्रदर्शित करते हैं ।
tish चूहा मस्तिष्क के हेट्रोटोपिया को लक्षित पिंग डिस्प्लास्टिक न्यूरॉन्स(चित्र 3)के फोकल न्यूरोनल हानि के उत्पादन में प्रभावी था । टी 2-भारित छवियों को एक दिन के बाद लिया-अतिउंतेंसिटी के पिंग प्रदर्शन क्षेत्रों, sonication के लक्षित क्षेत्रों में ऊतक क्षति के अनुरूप । 5 दिन के बाद पिंग सर्वाइवल पीरियड के बाद फ्लोरो-जेड का उपयोग करके पोस्टमार्टम धुंधला टी-हाइपरइंटेंसिटी के क्षेत्रों में न्यूरॉन्स को विकृत करने का प्रदर्शन किया, लक्षित डिस्प्लास्टिक नियोकॉर्टिकल ऊतक में न्यूरोनल हानि का उत्पादन करने के लिए पिंग की क्षमता की पुष्टि की ।
चित्रा 1: चुंबकीय अनुनाद (एमआर) संगत स्लेज और 7T एमआर चुंबक। एमआर चुंबक में जानवर को रखने और सोनीशन देने के लिए उपयोग किए जाने वाले स्लेज की प्रमुख विशेषताओं को चित्रित किया गया है(ए)। स्लेज असेंबली को 7T एमआर चुंबक(बी)में डाला गया दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: चुंबकीय अनुनाद (एमआर) इमेजिंग और एमआर-गाइडेड फोकस्ड अल्ट्रासाउंड (FUS) के लिए नियंत्रण कक्ष। कंट्रोल रूम में दो प्राथमिक स्टेशन शामिल हैं। जिस स्टेशन पर अन्वेषक बैठा है, वह FUS(ए)को निशाना बनाने के लिए योजना क्षेत्र है । दूसरा स्टेशन एमआरआई सिस्टम(बी)के लिए कंट्रोल एरिया है । एमआरआई स्टेशन के पीछे तांबे प्रबलित खिड़की कमरे में 7T चुंबक आवास में लग रहा है । फ़्यूस स्टेशन पर मॉनिटर सोनीसेशन(सी)के मार्गदर्शन और मापदंडों को नियंत्रित करने वाले सॉफ्टवेयर को प्रदर्शित करता है। इस उदाहरण से पता चलता है कि टी-2 भारित एमआर इमेज(डी)पर आरोपित स्ट्राटम को निशाना बनाते हुए एक सोनीशन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: पिंग तिश चूहे मस्तिष्क के डिस्प्लास्टिक नियोकॉर्टेक्स में न्यूरोनल हानि पैदा करता है। टी 2 भारित एमआर इमेजेज(ए, बी)पिंग के एक दिन बाद प्राप्त किए गए थे । नियोकॉर्टेक्स [एन], हेट्रोटोपिया [एच], और पार्श्व वेंट्रिकल्स [एलवी] को अभिविन्यास(ए)के उद्देश्य से लेबल किया जाता है। ऊतक क्षति का संकेत देने वाले अतिसंताचार [सफेद और पीले तीर] के क्षेत्रों को मस्तिष्क के दोनों किनारों (बी) पर विषमता के लक्षित क्षेत्रों में देखा जासकता है। फ्लोरो-जेड(सी-एफ)के साथ पोस्टमार्टम धुंधला । मस्तिष्क के बाईं ओर(सी, ई,सफेद तीर) और दाएं(डी, एफ,पीले तीर) दोनों पर अतिप्रचार के क्षेत्रों के अनुरूप क्षेत्रों में विकृत न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करने वाली उज्ज्वल हरी कोशिकाएं देखी जाती हैं। स्केल बार: सी, डी = 1 मिमी; ई,एफ = 0.5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
पिंग विधि को गैर-आक्रामक, लक्षित न्यूरोनल घावों का उत्पादन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह विधि केंद्रित अल्ट्रासाउंड 3 , 4 ,5,,,6,,7के क्षेत्र में अनुसंधान की एक मजबूत औरबढ़तीनींव से प्राप्त होती है ।7 बीबीबी के क्षणिक उद्घाटन के माध्यम से मस्तिष्क पैरान्चिमा के विशिष्ट क्षेत्रों तक फोकल एक्सेस प्रदान करने की क्षमता ने विभिन्न प्रकार के एजेंटों को वितरित करने के लिए एक अवसर बनाया है जो आम तौर पर मस्तिष्क तक पहुंच प्राप्त नहीं करेंगे। यह अवसर काफी हद तक चिकित्सीय एजेंटों के केंद्रीय वितरण के लिए उन्नत किया जा रहा है जो खराब बीबीबी पारंभय के अधिकारी हैं। पिंग विधि न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन में योगदान देने वाले सर्किट को नष्ट करने के अंतिम लक्ष्य के साथ न्यूरोटॉक्सिन वितरित करके एक अलग तरीके से एक ही अवसर का लाभ उठाती है। 2,15तरह के कुछ न्यूरोलॉजिकल विकारों के प्रभाव2को कम करने के लिए शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के लिए एक प्रभावी लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है । पिंग विधि के लिए दीर्घकालिक लक्ष्य तंत्रिका रोग में योगदान करने वाले सर्किटरी को डिस्कनेक्ट करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध दृष्टिकोणों को बढ़ाना है।
पिंग विधि का उपयोग करके एक व्यापक अध्ययन के डिजाइन में कई नियंत्रण समूहों को शामिल किया जाएगा। इन समूहों में शामिल होंगे: (क) एक अनुपचारित समूह [कोई FUS/कोई QA]; (ख) FUS [FUS/No QA] के प्रत्यक्ष प्रभावों को नियंत्रित करने वाला एक समूह; (ग) एक समूह जो फ्यूस [नो फ्यूस/क्यूए] की अनुपस्थिति में प्रणालीगत न्यूरोटॉक्सिन के प्रत्यक्ष प्रभावों का आकलन करता है । इन समूहों में परिणामों की तुलना प्राथमिक पिंग समूह [FUS/QA] से की जाएगी ।
पिंग विधि छोटे जानवरों की हैंडलिंग के लिए बुनियादी कौशल की आवश्यकता है। इनमें संज्ञाहरण का प्रेरण और रखरखाव, पूंछ की नस रेखा का स्थान, एमआरआई इकाई की स्थापना में कई एजेंटों का नसों में प्रशासन, एक दवा का नसों में जलसेक, और ऑपरेटिव और पश्चात अवधि के दौरान पशु देखभाल शामिल हैं। इसके लिए इंट्राकार्डियल परफ्यूजन, टिश्यू सेक्शनिंग, हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग और माइक्रोस्कोपिक एनालिसिस करने की क्षमता की भी जरूरत होती है । एक पशु देखभाल और उपयोग समिति, या समकक्ष एजेंसी से संस्थागत प्रशिक्षण और अनुमोदन, प्रोटोकॉल में कई चरणों के लिए आवश्यक है ।
पिंग प्रक्रिया के प्रारंभिक प्रोटोकॉल में8,9में क्यूए के दोहराव वाले इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग किया गया । यह दृष्टिकोण अभी भी व्यवहार्य और प्रभावी है । हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल ने क्यूए प्रशासन के मार्ग और दर को संशोधित किया। विशेष रूप से, क्यूए को जलसेक की 1 घंटे के बाद की अवधि के दौरान नसों के द्वारा प्रशासित किया गया था। फिर, या तो प्रशासन प्रोटोकॉल प्रभावी है । वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली 4-5 दिन की जीवित रहने की अवधि को डिजेनरेटिंग न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए फ्लोरो-जेड विधि के उपयोग को अनुकूलित करने के लिए अपनाया गया था। यदि अब जीवित रहने की अवधि की आवश्यकता है, तो वैकल्पिक ऊतक धुंधला तरीकों का संकेत दिया जाएगा । ऐसा ही एक दृष्टिकोण एक न्यूरॉन-विशिष्ट एंटीबॉडी (जैसे, एंटी-न्यून) का उपयोग करना होगा, ताकि इम्यूनोहिस्टोकेमिक रूप से प्रदर्शित किया जा सके जहां जीवित न्यूरॉन्स एक लंबे बाद-सोनीशन जीवित रहने की अवधि के बाद बने रहे। वर्तमान संरचनात्मक विश्लेषणों के अलावा विभिन्न प्रकार के परिणाम भी उपयोगी होंगे । उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और व्यवहार परिणामों के पोस्ट-पिंग आकलन पिंग विधि के प्रभाव के लक्षण वर्णन को काफी आगे बढ़ाएंगे।
FUS प्रक्रियाओं की एक संभावित जटिलता यह है कि खोपड़ी के आसपास तापमान को ऊंचा किया जा सकता है, खासकर जब खोपड़ी के पास स्थित कॉर्टिकल क्षेत्रों को लक्षित किया जाता है। यह जटिलता वर्तमान में उच्च तीव्रता वाले FUS (HIFU) का उपयोग करके थर्मल घाव के लिए उत्तरदायी साइटों (उपचार लिफाफा) की सीमा को प्रतिबंधित करती है। पिंग के संदर्भ में, खोपड़ी के पास थर्मल बढ़ता है भी तकनीक की एक सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। हालांकि, पिंग के साथ उपयोग किए जाने वाले सोनीसेशन की कम तीव्रता थर्मल चोट के जोखिम को कम करती है, और एचआईएफयू की तुलना में उपचार लिफाफे का विस्तार करना चाहिए।
पिंग विधि में कई विशेषताएं हैं जो बुनियादी ढांचे-गहन और प्रशिक्षण-प्रधान दोनों हैं। एमआरआई संगत FUS उपकरण और एक एमआरआई पशु अनुसंधान के लिए सुसज्जित सुविधा की आवश्यकता है । यह आवश्यक अनुसंधान बुनियादी ढांचे को प्रदान करने के लिए काफी फ्रंट-एंड निवेश का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, यह ध्यान रखना उत्साहजनक है कि FUS प्रौद्योगिकी से लैस साइटों की संख्या अनुसंधान और नैदानिक प्रयासों दोनों के लिए तेजी से विस्तार हो रहा है । इस प्रकार, जैसे-जैसे इस तरह के कार्य करने के लिए उपलब्ध स्थलों की संख्या बढ़ती है, ऑन-साइट और/या सहयोगात्मक जांच के अवसर बढ़ेंगे । प्रशिक्षण के संदर्भ में, FUS अध्ययन शुरू करने की मांग करने वाले किसी भी अन्वेषक को FUS प्रयोग में अनुभवी एक अनुसंधान समूह द्वारा प्रशिक्षण से लाभ होगा। उदाहरण के लिए, MRgFUS सॉफ्टवेयर को लक्षित करना, जबकि अपेक्षाकृत सीधा, एक अनुभवी अन्वेषक द्वारा सलाह दिए जाने पर अधिक आसानी से प्राप्त किया जाता है।
अशांत न्यूरोनल सर्किटरी को हटाने के लिए कई, वैकल्पिक शल्य चिकित्सा के तौर-तरीके मौजूद हैं। इनमें रेसेक्टिव सर्जरी, स्टीरियोटैक्टिक लेजर एब्लेशन, रेडियोसर्जरी, उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड, और रेडियोफ्रीक्वेंसी उपचार शामिल हैं। इन दृष्टिकोणों में से प्रत्येक प्रभावी है और कुछ चिकित्सकीय असभ्य विकारों के लिए काफी चिकित्सकीय मूल्य का हो सकता है । हालांकि, इन शल्य चिकित्सा तौर-तरीकों में एक या अधिक विशिष्ट सीमाएं होती हैं: (क) आक्रामक प्रक्रिया, (ख) लक्षित ऊतक पर पैननेक्रोटिक प्रभाव, (ग) आसन्न, गैर-लक्षित ऊतक (जैसे, पारित होने के अक्षों) को नुकसान, और (घ) प्रभावी परिणाम प्राप्त करने में देरी । पिंग विधि के महत्वपूर्ण फायदे यह हैं कि यह: (क) गैर-आक्रामक है, (ख) पैननेक्रोटिक नहीं है, (ग) आसन्न गैर-लक्षित ऊतक पर प्रभाव को सीमित करता है, और (घ) को तेजी से परिणाम प्रदान करना चाहिए।
पिंग विधि के लिए भविष्य के कई संभावित निर्देश हैं, जिनमें प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अनुप्रयोग दोनों शामिल हैं। पशु प्रयोग के संबंध में, विधि न्यूरोलॉजिकल रोग के पूर्व नैदानिक मॉडल में फोकल न्यूरोनल घावों के उत्पादन के लिए एक साधन प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, हमने हाल ही में लिम्बिक मिर्गी19के कृंतक मॉडल में पिंग के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया है। पिंग के साथ उपचार ने लिम्बिक मिर्गी के पिलोकार्पाइन मॉडल में पुरानी, सहज दौरे की आवृत्ति को कम कर दिया। इस अध्ययन में न्यूरोलॉजिकल विकार के इलाज में पिंग की उपयोगिता के लिए अवधारणा का पहला, प्रीक्लिनिकल प्रूफ प्रदान किया गया।
क्विनोलिक एसिड को दो प्राथमिक कारणों से पिंग प्रक्रिया के लिए चुना गया था। सबसे पहले, मौजूदा साहित्य11 इंगित करता है कि न्यूरोनल सेल शरीर के घावों का उत्पादन किया जा सकता है, जबकि अन्य गैर लक्ष्य ऊतक, जैसे पारित होने के अक्षतंप बख्शते । दूसरा, हालांकि क्यूए एक न्यूरोटॉक्सिक है जब सीधे मस्तिष्क को दिया जाता है, तो बीबीबी के माध्यम से इसकी सीमित पारगम्यता के कारण व्यवस्थित रूप से प्रशासित होने पर इसे अच्छी तरह से सहन किया जाता है। अन्य विषाक्त पदार्थ जो मोनोसोडियम ग्लूटामेट (एमएसजी) जैसे परिधीय रूप में अच्छी तरह से सहन किए जाते हैं, को क्यूए के लिए विकल्प के रूप में माना जा सकता है। एमएसजी का एक प्रमुख लाभ यह होगा कि मनुष्यों द्वारा इस यौगिक के उपयोग के बारे में एक पर्याप्त साहित्य मौजूद है। भविष्य के अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य के लिए संभावित सेल प्रकार विशिष्टता के मामले में क्यूए या अंय प्रणालीबद्ध प्रशासित न्यूरोटॉक्सिन द्वारा उत्पादित चोट की विशिष्टता को परिभाषित किया जाएगा । इस सामान्य दृष्टिकोण के लिए एक और संभावित प्रीक्लिनिकल एप्लिकेशन एक परिधीय रूप से सहन किए गए यौगिक को प्रशासित करना होगा जो मस्तिष्क पैरेंचिमा में अन्य कोशिका प्रकारों के लिए विषाक्त है, जैसे कि ग्लियल कोशिकाएं। उदाहरण के लिए, ओलिगोडेन्ड्रोग्लिया को प्रभावित करने वाले विष का परिधीय इंजेक्शन सफेद पदार्थ के क्षेत्र में फोकल डिमाइलेशन की अनुमति दे सकता है। यह एक लक्षित मार्ग के हिस्से के लक्षित demyelination की अनुमति होगी । इसके अलावा, दृष्टिकोण एक ही साइट के धारावाहिक demyelination के आकलन की अनुमति हो सकती है, जो relapsing-प्रेषण कई काठिन्य की एक बानगी है ।
मनुष्यों में पिंग के संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों के संबंध में, न्यूरोलॉजिकल विकार जिसमें परेशान तंत्रिका सर्किटरी एक लक्ष्य हैं, पिंग के साथ उपचार के लिए उत्तरदायी हो सकते हैं। हमारे प्रारंभिक पूर्व नैदानिक निष्कर्षों के आधार पर19,दवा प्रतिरोधी मिर्गी (ड्रे) एक विकार का एक आशाजनक उदाहरण है जो पिंग से लाभान्वित हो सकता है। ड्रे का सर्जिकल उपचार अत्यधिक फायदेमंद हो सकता है, लेकिन सबसे कम उपयोग किए गए उपचारों में से एक है जो वास्तव में एक प्रमुख न्यूरोलॉजिकल विकार के लिए प्रभावी है। इस सेटिंग में पिंग का एक लाभ यह है कि कई साइटों पर धारावाहिक सोनीशन का उपयोग करके लक्ष्य क्षेत्र की मात्रा को अनुरूप और बढ़ाया जा सकता है। यह मस्तिष्क परेंचिमा में अनियमित आकार और अनियमित आकार के लक्ष्यों को अधिक सटीक रूप से लक्षित करने की अनुमति देगा। पिंग के लिए अनुवाद प्रक्रिया में आवश्यक रूप से गैर-मानव वानरों में क्यूए के प्रणालीगत प्रशासन की सुरक्षा के लिए परीक्षण शामिल होगा, और अंततः मनुष्यों में। किनुरेनिन मेटाबोलाइट्स को आमतौर पर गुर्दे के माध्यम से रक्त से साफ किया जाता है और पेशाब के माध्यम से समाप्त कर दिया जाता है20,,21। हालांकि, इस मॉडल में इंजेक्शन क्यूए के भाग्य का आकलन नहीं किया गया है । फिर भी, इस संदर्भ में यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रणालीबद्ध रूप से प्रशासित क्यूए के उच्च स्तर को कृंतक में अच्छी तरह से सहन किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, पिंग का उपयोग देखभाल उपचार के मानक को बाधित नहीं करेगा। किसी दिए गए रोगी में अप्रभावी साबित करने के लिए एकल या कई पिंग उपचार थे, फिर अन्य प्रक्रियाएं, जैसे कि पुन: प्राप्त या एब्लेटिव सर्जरी, व्यवहार्य विकल्प रहेंगे। यह पहचानना भी जरूरी है कि जिस नैदानिक वातावरण में पिंग निकलेगी , वह 22 ,23,24 , 25,26,,,26के अनुवाद और कार्यान्वयनकेलिए आदर्श रूप से तैयार है ।25 संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग तौर-तरीके तेजी से अधिक परिष्कृत होते जा रहे हैं, जो सटीक हस्तक्षेपों के लिए उपयुक्त लक्ष्य (ओं) की पहचान के लिए बेहतर अनुमति देंगे । इसके अलावा, पिंग के लिए एक नए चिकित्सा उपकरण के डिजाइन, निर्माण या अनुमोदन की कोई आवश्यकता नहीं है। एमआर-निर्देशित, उच्च तीव्रता वाले फ्यूज पहले से ही न्यूरोलॉजिकल अनुप्रयोगों सहित कई संकेतों के लिए एक स्थापित और अनुमोदित मोडलि मोडल है। और, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, हाल के वर्षों में उन स्थलों का प्रसार देखा गया है जिन पर FUS पहले से ही नैदानिक उपयोग में है । साथ में, ये फायदे कई अनुप्रयोगों के लिए पिंग के लिए विकास का एक आशाजनक पाठ्यक्रम सुझाते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक एमआरआई के क्षेत्र में अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए रेने जैक रॉय को पहचानते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R01 NS102194 से केएसएल और R01 CA217953-01 से मेगावाट), चेस्टर फंड (केएसएल), और केंद्रित अल्ट्रासाउंड फाउंडेशन (केएसएल और जेडब्ल्यू) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
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