Summary
Este método de fenotipagem gravimétrica de alta produtividade, telemétrica, relações de água de plantas inteiras permite medições diretas e simultâneas em tempo real, bem como a análise de múltiplos traços fisiológicos relacionados ao rendimento envolvidos em interações dinâmicas entre plantas e ambientes.
Abstract
A segurança alimentar para a crescente população global é uma grande preocupação. Os dados fornecidos por ferramentas genômicas excedem em muito o fornecimento de dados fenotípicos, criando uma lacuna de conhecimento. Para enfrentar o desafio de melhorar as culturas para alimentar a crescente população global, essa lacuna deve ser superada.
Os traços fisiológicos são considerados características funcionais fundamentais no contexto de responsividade ou sensibilidade às condições ambientais. Muitas técnicas de fenotipagem de alto rendimento (HTP) recentemente introduzidas são baseadas em sensoriamento remoto ou imagem e são capazes de medir diretamente traços morfológicos, mas medem parâmetros fisiológicos principalmente indiretamente.
Este artigo descreve um método de fenotipagem fisiológica direta que tem várias vantagens para o fenotipamento funcional das interações entre plantas e ambientes. Ele ajuda os usuários a superar os muitos desafios encontrados no uso de sistemas gravimétricos de células de carga e experimentos de maconha. As técnicas sugeridas permitirão que os usuários diferenciem entre o peso do solo, o peso vegetal e o teor de água do solo, fornecendo um método para a medição contínua e simultânea das condições dinâmicas do solo, da planta e da atmosfera, ao lado da medição dos principais traços fisiológicos. Este método permite que os pesquisadores imitem de perto cenários de estresse de campo, levando em consideração os efeitos do ambiente na fisiologia das plantas. Este método também minimiza os efeitos da maconha, que são um dos principais problemas no fenotipagem pré-campo. Ele inclui um sistema de fertigação de alimentação que permite um design experimental verdadeiramente randomizado em uma densidade vegetal semelhante a um campo. Este sistema detecta o limiar limitante de conteúdo de água do solo (φ) e permite a tradução de dados em conhecimento através do uso de uma ferramenta analítica em tempo real e de um recurso estatístico on-line. Este método para a medição rápida e direta das respostas fisiológicas de múltiplas plantas a um ambiente dinâmico tem grande potencial de uso na triagem para traços benéficos associados a respostas ao estresse abiótico, no contexto da melhoramento pré-campo e melhoria das culturas.
Introduction
Garantir a segurança alimentar para uma população global crescente em condições ambientais deterioradas é atualmente uma das principais metas da pesquisa agrícola1,,2,3. A disponibilidade de novas ferramentas moleculares melhorou muito os programas de melhoria de culturas. No entanto, enquanto as ferramentas genômicas fornecem uma enorme quantidade de dados, a compreensão limitada dos traços fenotípicos reais cria uma lacuna significativa de conhecimento. A ponte dessa lacuna é um dos maiores desafios enfrentados pela ciência vegetal moderna4,,5,6. Para enfrentar os desafios que surgem no processo de melhoria das culturas e minimizar a lacuna de conhecimento genótipo-fenótipo, devemos equilibrar a abordagem genotipa com um fenocêntrico7,,8.
Recentemente, várias plataformas de fenotipagem de alto rendimento (HTP) tornaram possível o fenotipo não destrutivo de grandes populações de plantas ao longo do tempo e essas plataformas podem nos ajudar a reduzir a lacuna de conhecimento genótipo-fenótipo6,,8,,9,,10. As técnicas de triagem de HTP permitem a medição de traços em um número maciço de plantas dentro de um período relativamente curto de tempo, graças à robótica e correias transportadoras ou gantries usadas para mover as plantas ou sensores (respectivamente), em oposição a técnicas operadas à mão baseadas na troca de gás ou fotografia. No entanto, as enormes quantidades de dados produzidos pelos sistemas HTP apresentam outros desafios de manipulação de dados eanálises 11,12.
A maioria dessas plataformas HTP envolve a avaliação de traços fenotípicos através de sensores eletrônicos ou aquisição automatizada de imagens13,14. A fenómia de campo avançado envolve a implantação de sensores proximais e tecnologias de imagem no campo, bem como uma escala de medição de alta resolução, precisa e de grande população demedição 15. Os dados de sensores e imagens precisam ser integrados com outros dados multi-omics para criar uma abordagem fenomómica holística de segunda geração16. No entanto, os avanços metodológicos na aquisição, manuseio e processamento de dados estão se tornando cada vez mais importantes, pois os desafios de traduzir informações de sensores em conhecimento foram subestimados grosseiramente durante os primeiros anos da pesquisa de fenômica vegetal13. No entanto, a confiabilidade e a precisão das técnicas de imagem disponíveis atualmente para fenotipagem aprofundada de interações dinâmicas genótipos-ambiente e respostas ao estresse vegetal são questionáveis17,18. Além disso, os resultados de ambientes controlados são muitas vezes muito diferentes dos observados no campo, especialmente quando se trata de fenotipagem de estresse de seca. Isso se deve às diferenças na situação que as plantas experimentam em termos de volume de solo, ambiente do solo e impedância mecânica devido à diminuição da umidade do solo durante o estresse da seca. Portanto, os resultados de ambientes controlados são difíceis de extrapolar para o campo19. Finalmente, o preço de entrada dos sistemas HTP baseados em imagem é muito alto, não apenas devido ao preço dos sensores, mas também devido à robótica, correias transportadoras e gantries, que também exigem padrões mais elevados de infraestrutura de instalações de crescimento e manutenção significativa (muitas peças móveis trabalhando em um ambiente de estufa).
Neste artigo, apresentamos uma plataforma fenotipagem HTP-telemétrica projetada para resolver muitos dos problemas mencionados acima. A tecnologia de telemetria permite a medição e transmissão automática de dados de fontes remotas para uma estação receptora para gravação e análise. Aqui, demonstramos uma plataforma HTP-telemétrica não destrutiva que inclui vários límetros de pesagem (um sistema gravimétrico) e sensores ambientais. Este sistema pode ser usado para a coleta e cálculo imediato (a análise de imagem não é necessária) de uma ampla gama de dados, como ganho de biomassa de plantas inteiras, taxas de transpiração, condutância estematal, fluxos radiculares e eficiência do uso da água (WUE). A análise em tempo real do big data que é diretamente alimentado ao software do controlador no sistema representa um passo importante na tradução de dados para o conhecimento14 que tem grande valor para a tomada de decisões práticas, ampliando substancialmente o conhecimento que pode ser adquirido a partir de experimentos de fenotipagem ambiental controlada, em geral, e estudos de estufa de estresse de seca, em particular.
Outras vantagens da plataforma de telemetria são sua escalabilidade e facilidade de instalação e seus requisitos mínimos de infraestrutura de instalações de crescimento (ou seja, pode ser facilmente instalado na maioria das instalações de crescimento). Além disso, como este sistema baseado em sensores não tem peças móveis, os custos de manutenção são relativamente baixos, incluindo tanto o preço de entrada quanto os custos de manutenção a longo prazo. Por exemplo, o preço de um sistema gravimétrico de 20 unidades, incluindo o sistema de fertigação de feedback para cada planta, estação meteorológica e software, será semelhante ao preço de um sistema portátil de troca de gás de uma marca líder.
O arroz(Oryza sativa L.) foi utilizado como cultura modelo e a seca foi o tratamento examinado. O arroz foi escolhido por ser uma grande cultura de cereais com ampla diversidade genética e é o alimento básico para mais da metade da população mundialde 20 anos. A seca é um importante fator de estresse abiótico ambiental que pode prejudicar o crescimento e o desenvolvimento das plantas, levando à redução da produção agrícola21. Essa combinação de cultura-tratamento foi usada para demonstrar as capacidades da plataforma e a quantidade e a qualidade dos dados que ela pode produzir. Para obter mais informações sobre o histórico teórico para este método, consulte 22.
Protocol
Neste protocolo, referimos-se a 4 potes L carregados em escalas de 20 cm x 20 cm, com cada pote contendo uma planta. O mesmo protocolo é facilmente escalável e pode ser usado com potes muito maiores (até 25 L carregados em escalas de 40 cm x 40 cm, com apenas uma adaptação linear às medidas de protocolo) e várias plantas por pote. Assim, o protocolo pode ser facilmente adaptado para plantas de muitos tipos e tamanhos. Consulte a Figura 1 e a Figura 2 para os componentes do sistema.
1. Prepare os potes para o experimento
- Insira o filtro do solo. Espalhe a malha de nylon (rede) em cima de todo o pote e coloque o suporte da rede em cima da rede. Com uma mão, empurre lentamente o suporte da rede no meio do caminho pelo interior de toda a panela. Certifique-se de que a rede permanece uniformemente espalhada à medida que é empurrada para baixo entre os dois potes.
- Insira o bastão de fibra de vidro (polo) entre os dois potes e empurre-o até o fundo de toda a panela, certificando-se de que ele está no lado externo da rede também e não empurra a rede.
- Antes de empurrar o suporte da rede todo o caminho para baixo, empurre a rede para baixo à mão de dentro da panela e ajuste-a de modo que ela seja espalhada uniformemente e firmemente sobre a parte inferior do pote uma vez que o suporte da rede tenha sido totalmente inserido(Figura 2CI).
- Deslize o anel da junta do fundo da configuração da panela descrita acima, um terço do caminho até o lado da panela. Certifique-se de que as fendas do anel se abram em direção ao fundo da panela(Figura 2CII).
- Repita as etapas 1.1-1.4 para todos os potes experimentais antes de continuar para o próximo passo. Randomize a localização das plantas (Figura 2D; em um projeto de bloco randomizado ou em um design totalmente aleatório) usando o aplicativo Array Randomizer.
NOTA: Para baixar o programa gratuito e para mais informações, consulte o link: https://drive.google.com/open?id=1y4QbTpxRK5Lx430xzu1RFdrlcL8pz_1q). - Rotule os potes de acordo com suas localizações na matriz dentro da estufa. Por exemplo, o rótulo "B10D" corresponde a um pote localizado na Tabela B na Coluna 10 e linha D. Prepare três potes adicionais para cada tabela para medições de teor de água do solo (consulte a Seção 7.1).
2. Cultivar as plantas
- Escolha o meio de cultivo (potting) que melhor se adapte ao experimento. Escolher o meio certo para o experimento é crucial e a escolha correta depende de vários fatores (ver Discussão). Para usuários iniciantes, recomendamos fortemente o uso de um meio poroso, cerâmico e de pequeno porte. Consulte a Tabela 1 e a Tabela 2 para obter mais informações para ajudar a escolher o meio certo para o experimento.
- Germine as sementes em bandejas de cavidade com o meio de vaso desejado. Se possível, faça isso dentro da mesma estufa a ser usada para a parte principal do experimento, a fim de aclimatar as plantas às condições ambientais dentro dessa estufa.
- Se as mudas não foram germinadas em bandejas, transplante-as em bandejas de cavidade contendo o meio de vaso. Plante uma muda em cada cavidade e deixe-a crescer até que suas raízes sejam densas o suficiente para tomar a forma da cavidade (plugue raiz-solo).
- Deixar 5 a 7 cavidades sem mudas para medidas de peso do solo (apenas meio de vaso; Figura 3). Para obter mais informações, consulte a Seção 5.9.
3. Melhore o nível de sinal para ruído
NOTA: As etapas a seguir melhoram a qualidade das medições e reduzem os níveis de ruído.
- Calibrar o límetro.
- Use um nível de espírito para verificar se todos os lysímetros estão nivelados e, em seguida, iniciar o processo de calibração de peso. Use dois pesos padrão (1-10 kg). Realize a calibração enquanto o recipiente verde, incluindo todos os plugues, estiver na célula de carga.
- Coloque o primeiro peso de calibração (mais leve) em cada célula de carga.
- No software operacional, vá para a guia Calibração e escolha o peso para o primeiro ponto. Em seguida, selecione a posição de célula de carga onde o peso foi colocado e clique em Obter ponto1 (Figura Suplementar 1A). Esta etapa pode ser aplicada em várias células de carga simultaneamente.
- Repita para o segundo peso e clique em Obter ponto2.
- Clique em Aplicar calibração.
- Garantindo uma quantidade suficiente de plantas com um tamanho adequado para o experimento
NOTA: Quanto menor a planta, mais fraco será o sinal (por exemplo, o peso da água transpirou em um dia versus o peso da panela). As etapas a seguir ajudarão a melhorar a relação sinal-ruído.- Inicie o experimento quando a planta transpirar aproximadamente 10% da capacidade máxima de água do pote.
NOTA: Por exemplo, se trabalhar com um meio arenoso que contenha aproximadamente 1 L de água na capacidade do vaso (ver Tabela 2),inicie o experimento quando as plantas transpirarem aproximadamente 100 mL por dia. Se trabalhar com um meio à base de turfa que contém cerca de 2 L de água na capacidade do vaso (ver Tabela 2),inicie as medições quando as plantas transpirarem cerca de 200 mL por dia. - Estime a transpiração diária inicial da planta antes de carregá-la no sistema medindo (manualmente) as diferenças de peso matinal versus noturna em algumas mudas.
- Ao trabalhar com pequenas plantas, coloque várias plantas em cada vaso (por exemplo, seis plantas arabidopsis em um pote 3,9 L23, para atingir o nível mínimo recomendado de transpiração)*.
- Inicie o experimento quando a planta transpirar aproximadamente 10% da capacidade máxima de água do pote.
4. Configuração do experimento
NOTA: O processo de criação do experimento é projetado para levar em conta o peso de todas as partes do sistema, ou seja, o peso do meio de vasos (incluindo o peso solo-água na capacidade do pote) e o peso inicial das mudas. Siga os passos abaixo:
- Se possível, trabalhe com componentes estáticos similares que tenham pesos semelhantes. Os componentes de peso estático incluem conjuntos de potes, sondas de solo e outras peças plásticas.
- Para iniciar um novo experimento, abra o software operacional. Abra a guia Experimentos no menu no lado esquerdo da tela. Clique em Criar novas ou duplicar as propriedades do experimento de um experimento anterior clicando com o botão direito do mouse no experimento desejado e escolhendo Duplicata. Renomeie o experimento(Figura Suplementar 1B).
- Certifique-se de que nenhuma unidade está sendo usada em um experimento diferente atualmente em execução no sistema. Verifique se todas as plantas na tabela Plantas combinam com o design experimental. Caso não, altere a tabela de acordo com o desenho (consulte as Seções 5.18, 6 e Figura Suplementar 1C).
- Inicie o experimento clicando no nome do experimento e, em seguida, clicando em Iniciar.
- Faça medições manuais dos potes vazios pré-preparados (pote duplo, rede, vara e anel de junta preta). Se usar peças semelhantes umas às outras, o peso médio de 10 delas será suficiente.
- Misture o meio de vasos completamente com um pouco de água, por pelo menos 1h, de modo que se desfaça em partículas homogêneas e esteja saturado, para garantir uniformidade e homogeneidade. Para usuários iniciantes, recomendamos fortemente o uso de um meio poroso, cerâmico, de pequeno porte (ver Tabela 1 e Tabela 2). Como segunda opção, use areia grosseira.
- Use uma batedeira mecânica (por exemplo, uma batedeira de concreto).
- Quando um meio altamente homogêneo (ou seja, areia industrial) está sendo usado, pule a etapa 4.6.1.
- Encha todos os potes uniformemente para o experimento com o meio de vaso apropriado (por exemplo, areia, solo ou turfa).
- Insira um molde de cavidade (Figura 3B) que seja semelhante em forma e tamanho ao plugue de solo raiz das mudas (da bandeja da cavidade) no meio do vaso. Empurre-o completamente. Bata na parte inferior da panela contra o chão algumas vezes para ter certeza de que o meio de vaso está bem distribuído na panela. Repita para todos os potes.
- Regue bem as panelas e enxágue do lado de fora das panelas. Deixe os potes drenar por 30 minutos antes de continuar para o próximo passo. Certifique-se de que as panelas escorram livremente. Se o meio de vasos drenar muito lentamente (por exemplo, turfa densa), premie-o com um substrato arejado (por exemplo, perlite; consulte também a Tabela 1 e a Tabela 2) para garantir uma drenagem mais rápida.
- Após a drenagem parar completamente, coloque todos os potes cheios no centro da matriz de límetro (nos recipientes verdes que já estão lá) de acordo com o projeto experimental(Figura 2A).
- Verifique se os recipientes verdes estão devidamente encaixados na tampa da célula de carga e não se tocando.
- No software operacional, abra a guia Experimentar e selecione a guia Componentes de medida. Clique em Measure object. Nome da medição"1ª medição"(Figura Suplementar 1D).
- Coloque os pingos de irrigação, sondas e tampas de panela em cada panela. Certifique-se de que as linhas para os gotejadores multi-saída e os cabos da sonda são suportados por seus respectivos suportes (anexados às unidades para cada escala de lysímetro; Figura 1E) antes de colocá-los nos potes. Certifique-se de que todos os pingos, sondas e tampas estejam posicionados com segurança.
- Aguarde até 3 minutos para que uma nova medição seja tomada (os dados são coletados automaticamente a cada 3 minutos) e, em seguida, abra a guia Experimentar. Selecione a guia Experimentar e clique em Experimentar. Meta-marque esta medição parast a "1ª medição" tomada e nomeie-a como "Componentes estáticos"(Figura Suplementar 1E). As meta-tags são usadas quando se quer registrar um valor de peso determinado subtraindo um valor medido de outro.
- Depois de fazer quaisquer ajustes necessários ao sistema, aguarde que um novo ponto de dados seja registrado (a cada 3 minutos) antes de fazer a próxima medição.
- Verifique a coluna Componentes Estáticos para confirmar que os valores registrados na tabela Plantas não incluem outliers. Se algum dos pesos registrados estiver muito baixo ou muito alto, verifique se há alguma interferência na célula de carga (por exemplo, certifique-se de que nada está tocando- o) e, em seguida, faça uma nova medição (depois que o sistema ainda estava por 3 minutos).
- Clique na guia Plantas. Exporte a tabela Plantas como uma planilha, adicione o peso médio do pote (a partir da Etapa 4.5) à medição dos componentes estáticos - "Peso tare". Salve e carregue o arquivo (guia de importação).
- Certifique-se de que todos os pingos estão inseridos com segurança no meio de vasos e no tubo provenientes do controlador. De volta ao software operacional, na guia Experimentar, selecione Cenários de Tratamento. Clique em Criar Novos para fazer um novo "Plano".
- No plano, escolha o primeiro passo (crie um novo passo, se necessário) e abra-o. Escolha "Teste" para Tratamento e "Nunca" para Rescisão. Na opção de etapa, escolha qualquer tratamento listado na guia Tratamentos de Irrigação acima Experimentos (Figura Suplementar 1F; consulte também o Passo 4.21). Pressione a guia Aplicar.
- Extrair a tabela Plantas como uma planilha, adicionar "Plano" à coluna Tratamento e adicionar "1" à coluna Passo. Salve e carregue o arquivo.
- Na guia Tratamentos de Irrigação, escolha o tratamento "Teste" e configure-o para um tempo de irrigação de 4 a 5 minutos [com a quantidade exata de tempo dependendo do teor de água volumostrica (VWC) do solo utilizado] para permitir a drenagem. Defina o tempo 2 minutos à frente e vá para os potes na estufa. Outros tratamentos também podem ser criados. (Veja a explicação detalhada na Etapa 7.4.)
- Verifique visualmente se todos os pingos estão funcionando e se a água está pingando do plugue de drenagem perfurado do recipiente verde.
- No experimento, altere o tratamento de irrigação no Plano "X", Passo 1 (veja o passo 4.19-4.20) para o tratamento de irrigação desejado. Certifique-se de que cada noite de irrigação (com fertigação; veja a Tabela 3 para os componentes de fertigação utilizados) é dividida em vários pulsos curtos (eventos) com pausas substanciais entre eles (pelo menos três eventos todas as noites), para garantir que o solo atinja sua capacidade de campo antes do amanhecer.
- Deixe o programa de irrigação funcionar por 1 ou 2 dias para que o solo atinja sua capacidade de campo e continue até a próxima fase.
5. Iniciar o experimento
NOTA: Os dados coletados nesta fase serão utilizados como valores de referência para o resto do experimento. Por isso, é importante seguir atentamente os próximos passos.
- Repetia as etapas 4.18 até 4.20. Alternativamente, inicie o processo no início da manhã, não muito tempo depois da última etapa de irrigação.
- Verifique visualmente se todos os potes são irrigados e que o excesso de líquido de irrigação está pingando do plugue de drenagem perfurado do banho verde.
- Remova o plugue verde e não perfurado (do orifício mais baixo) do recipiente verde e deixe a água escorrer completamente. Em seguida, coloque o plugue de volta em seu lugar(Figura 1D). Se trabalhar na "drenagem 0" (ou seja, com o orifício inferior aberto/o plugue de drenagem oca conectado no orifício mais baixo), pule esta etapa.
- No software operacional, abra a guia para o experimento e vá para Medidor de Componentes. Clique em Medir objeto e nomeie a medição como "Cast-pre". Retire suavemente todos os moldes dos potes e, em seguida, espere 3 min para que uma nova medição seja registrada(Figura Suplementar 1D).
- Clique em Measure Object, nomeie-o "Cast-post" e meta-marque a medição para "Cast-pre". A opção calculará automaticamente a diferença entre os dois valores medidos e dará ao elenco peso para verificar a sensibilidade ao peso.
- Verifique os valores de peso na tabela Plantas. A diferença entre as medidas "Cast-post" não deve ser superior a 20 ou 30 g.
- Para medir o peso do solo molhado, no software operacional, vá até a guia Componentes de Medida no experimento e selecione a opção Medir o Peso Molhado do Solo. Faça a medição clicando em OK quando solicitado. Verifique as medidas de peso molhado do solo na tabela Plantas do experimento yotheur. O peso aparecerá na coluna "Peso Molhado do Solo"(Figura Suplementar 1D,G).
- Se algumas das medidas parecem flutuar inadequadamente, por favor, faça o seguinte:
- Confirme se cada pote está posicionado corretamente e não está tocando em nenhum pote vizinho.
- Desconecte o primeiro controlador na mesa da eletricidade (o resto dos controladores estão conectados em série uns aos outros e, portanto, desligarão também) por 2 minutos e depois reconectarão-no.
- Meça manualmente o peso médio de algumas cavidades (5-10) com meio de vaso (a partir da Etapa 2.3) sem mudas (plugue do solo). [Certifique-se de que os plugues do solo estão bem irrigados (ou seja, para a capacidade do campo após a drenagem) antes das medições manuais.] Na guia Componentes de Medida, pressione definir o peso do solo a granel e preencha o peso médio(Figura Suplementar 1D).
- Clique em Medir o peso inicial da planta. Esta primeira medição é um ponto de referência antes do plantio(Figura Suplementar 1D).
- Certifique-se de que as mudas nas bandejas da cavidade estão bem irrigadas (ou seja, para a capacidade do campo após a drenagem). Puxe suavemente as mudas com seu plugue de solo raiz das cavidades, certificando-se de não feri-las, e coloque-as cuidadosamente nas cavidades feitas por moldes nos vasos, de acordo com o design do experimento. É preferível transferir as plantas ao amanhecer ou ao anoitecer, a fim de minimizar o estresse às plantas (ou seja, para minimizar o murm)
- Espere por 3 min. Clique em Medir o peso inicial da planta novamente. Esta segunda medição é o peso inicial da planta. Meta-marque a medição para a primeira (o ponto de referência). O software calculará a diferença entre as duas medidas e subtrairá o Peso do Solo A granel de mudas. O resultado é o peso inicial da planta.
- Verifique os valores medidos na tabela Plantas do experimento para ter certeza de que eles se enquadram em uma faixa razoável e lógica (Figura Suplementar 1C).
- Saturar o solo repetindo as etapas 4.18 até 4.20.
- Certifique-se de que todas as panelas estão drenando corretamente. Se não, repita o processo de saturação. Espere 30 min para a drenagem cessar. (Veja também tabela 1 sobre a escolha correta do meio de vaso.)
- Na guia Componentes da Medida, clique em Medir o Peso da Água Reservada (Figura Suplementar 1D).
- Extrair a tabela Plantas como uma planilha, subtrair o peso inicial da planta medida e o peso do solo a granel da medição reservada do peso da água (a coluna "Inventário de Água de Reserva"). Upload do arquivo(Figura Suplementar 1C).
- Confirme que o período durante o qual a transpiração diária será registrada é adequado para os objetivos do experimento. Preencha os valores na guia geral do experimento conforme apropriado para o projeto (Figura Suplementar 1H).
- Preencha a hora zero: O tempo em que o software irá verificar se ele precisa passar para o próximo passo no cenário de tratamento.
- Preencha os valores diários de transpiração: A transpiração diária é calculada como a diferença entre duas janelas de peso durante o dia, para todos os dias. O horário de início da transpiração diária é o momento em que o software começará a medir o peso médio.
- Monitore as plantas por 1 a 2 dias antes de iniciar um novo experimento (duplicar e renomear o experimento).
6. Alterar a tabela de plantas
- Extrair a tabela Plantas como uma planilha e alterar a tabela de acordo com as necessidades. Não altere os IDs, Nomes ou Posições da Planta. Salve e carregue o arquivo.
- Colunas de rotulagem (agrupamento): Apresentar ou analisar (veja a etapa 8) agrupadas com base em rótulos comuns (por exemplo, tratamento, linha), adicionar uma nova coluna e rótulo começando com # (por exemplo, #Treatment). Nesta coluna, faça uma anotação para cada planta (por exemplo, para o rótulo "#Treatment", marque as plantas como seca, controle, etc.; Figura Suplementar 2).
NOTA: O protocolo apresentado acima é o protocolo mais avançado e abrangente para este sistema. No entanto, os usuários iniciantes podem querer começar com o protocolo simplificado (ver EM Suplementar). O protocolo simplificado produz informações sobre menos características e pode levar a níveis de ruído mais altos. Mas, ao mesmo tempo, fornece uma maneira de se familiarizar mais facilmente e se familiarizar com os procedimentos experimentais, hardware e software mais importantes.
7. Execute o experimento
- Calcule o teor de água gravimétrica do solo/o teor de água do solo (valor SWC).
NOTA: O teor de água do solo gravimétrico é diferente do teor volumétrico da água do solo (VWC).- O valor SWC é a razão entre o peso seco do solo e o peso úmido do solo. Para calcular o SWC, utilize os três potes extras cheios de solo (Passo 1.3) sem plantas previamente preparadas e colocadas em uma mesa lateral dentro da estufa por alguns dias e irrigadas regularmente. Pesar o solo molhado em uma bandeja de alumínio no início da manhã, o mais rápido possível após o último evento de irrigação.
- Seque a bandeja de alumínio com o solo em forno (a 105 °C) por 4 a 5 dias. Verifique se o solo está completamente seco, fazendo duas medidas de peso consecutivas com pelo menos 60 minutos de diferença. Se os pesos forem idênticos, o solo é de fato seco e a última medida pode ser registrada como o peso seco do solo.
- No software operacional, vá para Medir Componentes e clique na guia Calcular peso seco do solo. Encha os pesos molhados e secos do solo para cada amostra, clique em Aplicar e Terminar (Figura Suplementar 3).
- Alternativamente, calcule manualmente o SWC usando a equação mostrada abaixo.
- Em média, as duas medidas SWC tomadas manualmente a partir de pelo menos três potes. Selecione a guia Componentes de Medida e clique em Calcular o Peso Seco do Solo o valor φg [g/g], clique em Aplicar e Concluir. Os pesos secos do solo de todos os potes de experimento serão calculados automaticamente pelo software (assumindo que todos os potes do experimento contêm o mesmo meio; Figura Suplementar 1D e Figura Suplementar 3).
- Aplique os tratamentos de irrigação. Os cenários de irrigação podem ser aplicados compondo um plano de tratamento passo a passo.
- Para compor um novo plano de tratamento de irrigação, vá para o Tratamento de Irrigação,clique em Criar Novo, e nomeie o novo tratamento. Abra o tratamento específico na lista de tratamentos de irrigação e clique no padrão "00:00".
NOTA: Na janela principal(Figura Suplementar 4A), "Tempo" indica a hora em que a válvula abrirá (ou seja, o início do tratamento de irrigação). "Válvula" é a válvula a ser aberta (A ou B, dependendo da válvula que está conectada à solução desejada). "Tipo de comando" indica o tipo de dados que serão usados para determinar quando a válvula será fechada:- Por Tempo – Quantos segundos a válvula estará aberta.
- Por Peso – O ganho de peso/água (em gramas) a ser adicionado ao pote via irrigação.
- Por Transpiração – A irrigação pode ser aplicada diferencialmente em cada vaso com base na transpiração de cada planta individual ao longo do dia anterior. O usuário pode decidir qual porcentagem da transpiração do dia anterior será aplicada durante a irrigação. (Sob a condição bem irrigada, sugere-se dar à planta mais de 100%, a fim de lavar o solo e compensar o crescimento da planta.) As plantas tratadas com seca devem receber menos água, com volumes exatos baseados na taxa de estresse de seca desejada.
- Por Sensores – A irrigação pode ser aplicada de acordo com uma leitura de sensor, como a aparente autorização dielétrica (que pode ser usada para determinar o VWC). Selecione o tipo de sensor, o parâmetro desejado e o valor do parâmetro desejado.
- Todas as possibilidades incluem uma opção time out que fechará a torneira mesmo que as condições definidas não tenham sido atingidas. Defina o tempo livre por um período maior do que as condições definidas.
- Após definir os tratamentos de irrigação para o experimento, abra o experimento desejado na lista de experimentos, abra o Cenário de Tratamento,abra o Plano Padrão e selecione o primeiro passo (Figura Suplementar 4B).
- Em Tratamento, escolha um tratamento de irrigação da lista. Em seguida, em Terminação,escolha a condição apropriada para parar a etapa atual e passe para a próxima.
- Após a seleção de um cenário de irrigação, abra a tabela de Plantas do experimento (Figura Suplementar 2) e insira o "Tratamento" e "Passo" para cada planta. "Tratamento" é o nome do cenário do tratamento e "Passo" é o número do evento dentro do cenário do tratamento.
- Para compor um novo plano de tratamento de irrigação, vá para o Tratamento de Irrigação,clique em Criar Novo, e nomeie o novo tratamento. Abra o tratamento específico na lista de tratamentos de irrigação e clique no padrão "00:00".
- Planeje um tratamento de seca.
- Cada planta individual tem uma taxa de transpiração única com base em seu tamanho e localização na estufa. Para permitir um tratamento padrão de seca (ou seja, taxa de secagem semelhante para todos os potes durante o tratamento), planeje um cenário de seca e controle-o através da ferramenta de retroalimentação do sistema(Figura Suplementar 5).
8. Analisar os dados usando o software de análise de dados
- Abra o software de Análise de Dados (por exemplo, SPAC Analytics). Clique no canto superior direito para selecionar o sistema de controle e o nome do experimento ( FiguraSuplementar 6A). Na coluna do lado esquerdo da tela, selecione Experimentos (Figura Suplementar 6B) e digite o nome do experimento na barra Nome na seção Pesquisar. O nome do experimento aparecerá abaixo da seção Pesquisa, na seção Experimentos(Figura Suplementar 6C). Clique no experimento para abrir as seções Informações e Plantas (Figura Suplementar 6D).
- Na seção Informações, edite as datas de início do WUE e wue por um período de pelo menos 3 (preferencialmente mais) dias antes do início do tratamento de seca e, em seguida, clique em Atualizar. O valor WUE e o R2 para cada pote aparecerão na seção Plantas. Escolha excluir qualquer escala com um valor WUE negativo ou um valor R2 inferior a 0,5 clicando no símbolo "olho" na coluna Ativo, que ficará em vermelho. Isso excluirá a escala selecionada (planta) de todos os cálculos adicionais. Os dados podem ser exportados clicando no botão Dados de Exportação na seção Plantas (Figura Suplementar 6D).
- Na coluna do lado esquerdo do scree, clique em Análise. Em seguida, diferentes subseções aparecerão: Graph viewer, Histogram, T-test, ANOVA e Piecewise linear curve.
- Clique no visualizador gráfico. Na seção Filtros, defina as datas para o experimento.
- Clique em Rótulos (consulte o Passo 6) para selecionar a combinação de grupos experimentais (genótipo) e tratamento(s). Automaticamente, todos os potes do grupo selecionado aparecerão na subseção Planta. Nessa subseção, desmarque quaisquer potes (plantas) clicando neles. Até dois parâmetros diferentes de escolha podem ser selecionados ao mesmo tempo como o parâmetro "Y1" e "Parâmetro Y2". Por fim, clique em Mostrar gráfico ( FiguraSuplementar 5).
- Um gráfico de linha dos valores do parâmetro selecionado aparecerá na janela Visualização de gráficos para cada planta. Remova os dados de plantas individuais ou adicione ao gráfico clicando em seus símbolos de legenda à direita do gráfico. No canto superior direito, também há opções para exportar os dados como uma planilha e para ampliar a janela Do Visualizador gráfico para preencher a tela cheia (esta função de download de dados brutos é relevante para todas as outras janelas). Mais opções para modificar o gráfico aparecerão se o cursor for movido para o canto superior direito da tela(Figura Suplementar 5).
- O módulo histograma apresenta a distribuição de um único traço dentro e entre populações por um determinado período de tempo. Para usar este módulo, clique em Histograma.
- Na seção Filtros, defina a data e a hora, o parâmetro, os rótulos e as plantas conforme explicado na etapa 8.4.1. Selecione vários rótulos (grupos) clicando no símbolo +. Por fim, clique em Mostrar gráfico ( FiguraSuplementar 7).
- O histograma aparecerá na seção Histograma, na qual há a opção de alterar as "Lixeiras" e "Data" na parte superior da tela. No canto superior direito, há várias opções como descrito na etapa 8.4.2. Na seção Diagrama de Localização, é possível ver a localização real das plantas na tabela experimental e seus respectivos valores de características(Figura Suplementar 7).
- Clique no teste T. Para comparar estatisticamente os meios de qualquer característica medida de dois grupos, digite as datas, rótulos, plantas e parâmetros na seção "Parâmetros de teste T", conforme explicado na etapa 8.4.1.
- Defina o intervalo de horas para calcular os valores médios dos pontos de dados dentro do período de tempo de juros (a inadimplência é uma apresentação contínua de 24h). Por fim, clique em Mostrar gráfico ( FiguraSuplementar 8).
- Duas janelas aparecerão no lado direito da tela. A principal delas é a seção Visualizador gráfico para todas as plantas selecionadas de ambos os grupos. Abaixo dessa janela está a seção de teste T, na qual aparecerá a comparação dos dois grupos como o teste tdo parâmetro fisiológico selecionado. Os níveis de significância podem ser ajustados alterando o valor de α no canto superior esquerdo da seção de teste T. Um ponto vermelho aparecerá sob valores significativamente diferentes. No canto superior direito, veja várias opções, conforme descrito na etapa 8.4.2 (Figura Suplementar 8).
- Clique em ANOVA. Para comparar estatisticamente os meios de qualquer traço medido em mais de dois grupos, digite as datas, rótulos, plantas e parâmetros na seção "Filtros", conforme explicado na etapa 8.5.1.
- Selecione vários rótulos (grupos) clicando no símbolo + (como na etapa 8.5). Defina o intervalo de horas. Por fim, clique em "MOSTRAR GRÁFICO"(Figura Suplementar 9).
- Na seção ANOVA, use um teste ANOVA (HSD de Tukey) para comparar os parâmetros fisiológicos dos diferentes grupos. As barras representam os erros padrão (±SE). No canto superior direito da tela, há várias opções como descrito na etapa 8.4.2. Clique no gráfico de linha para visualizar uma comparação de gráfico de barras para um determinado dia. Diferentes letras indicam grupos significativamente diferentes um do outro(Figura Suplementar 9A).
- Apresentar a relação entre cinética de transpiração de plantas inteiras ou condutância estomatal e VWC é uma maneira mais precisa de comparar as respostas fisiológicas de diferentes plantas com a seca, em comparação com uma abordagem baseada no tempo. Apresente essa relação usando a função "Curva Linear em termos de peça".
- Clique em Curva linear Piecewise. Digite as datas, rótulos, plantas e parâmetros (tanto o eixo x quanto o eixo y) e, em seguida, defina o intervalo de horas na seção "Filtros", como explicado acima.
NOTA: A data "de" deve ser o mais próxima possível da data de início do tratamento. - Defina o parâmetro x-eixo para ser VWC e o parâmetro do eixo y como parâmetro fisiológico de escolha (por exemplo, taxa de transpiração, condutância estomatal, etc.). Por fim, clique em Mostrar gráfico. Na seção "Filtro", clique em Selecionar todas as recomendações e clique em Mostrar gráfico ( FiguraComplementar 10).
NOTA: Outros parâmetros fisiológicos (por exemplo, transpiração normalizada, taxa de transpiração, peso inicial da planta, condutância estomatal, fluxo radicular, etc.) e parâmetros ambientais (por exemplo, temperatura, umidade relativa, etc.) são facilmente obtidos através do software SPAC (por exemplo, Figura Suplementar 9C). Para obter mais informações sobre o histórico teórico de seus cálculos, consulte Halperin et al. (2017).
- Clique em Curva linear Piecewise. Digite as datas, rótulos, plantas e parâmetros (tanto o eixo x quanto o eixo y) e, em seguida, defina o intervalo de horas na seção "Filtros", como explicado acima.
Representative Results
A duração do experimento foi de 29 dias. O experimento foi realizado em agosto, quando o tempo local é quente e estável e os dias são longos. Dois cenários diferentes de irrigação foram utilizados para demonstrar a capacidade da plataforma de fenotipagem para comparar o comportamento fisiológico de três variedades diferentes de arroz (ou seja, Indica, Karla e Risoto) na presença de estresse da seca. Houve dois tratamentos de estresse por seca: (i) irrigação ideal [até que cada pote atingiu sua capacidade de maconha à noite após a irrigação (controle)] e (ii) uma seca que começou 5 dias após o início do experimento, durou 14 dias, e foi seguida por um período de recuperação de 10 dias (irrigação ideal, dias 19-29). Por uma questão de simplicidade, nem todas as variedades e grupos são mostrados nas figuras aqui apresentadas. Os resultados mostraram que o sistema HTP-telemétrico pode medir eficientemente mudanças nas condições atmosféricas, no solo e na fisiologia das plantas.
Condições ambientais
As condições ambientais [radiação fotosíntese ativa (PAR) e déficit de pressão de vapor (VPD) foram monitoradas durante todo o experimento por uma sonda atmosférica. Os dados coletados indicam que PAR e VPD permaneceram semelhantes ao longo dos diferentes dias e ao longo do dia(Figura 4).
O VWC dos potes tratados com seca foi medido por sondas de solo durante todo o período experimental. Os dados do VWC coletados de um currículo tratado com seca. A planta indica é plotada na Figura 5.
Parâmetros fisiológicos
A transpiração diária aumentou gradualmente em todos os quatro tratamentos (Karla-control, Karla-drought, Risoto-controle e risoto-seca) durante a primeira fase do experimento, durante o qual todas as plantas foram bem irrigadas. Posteriormente, houve redução da transpiração associada ao período de seca (Dia 5 a Dia 18) nos dois tratamentos privados de água. Posteriormente, durante o período de recuperação (a partir do dia 18), a transpiração diária aumentou novamente nos dois grupos privados de água, mas a um nível muito menor do que o observado antes do tratamento da seca (Figura Suplementar 9B).
O peso médio calculado da planta (ou seja, taxa de ganho de peso vegetal) aumentou consistentemente entre os tratamentos Karla-controle e karla-seca durante a primeira fase do experimento, quando todas as plantas receberam irrigação semelhante (Dias 1-5). Quando o tratamento da seca foi aplicado ao cv. Plantas karla (dias 5-18), essas plantas pararam de ganhar peso e não retomaram a ganhar peso até a fase de recuperação. Nesse ponto, houve um aumento de peso que prosseguiu mais lentamente do que o observado para o controle. Em contrapartida, os pesos das Karla-plantas de controle aumentaram continuamente durante o período experimental (Figura 6).
Figura 1: Componentes e configuração do sistema de fenotipagem gravimétrica.
(A) Lysímetro de pesagem. O lysímetro inclui a célula de carga, que converte a carga mecânica de um objeto em uma carga elétrica, e uma plataforma metálica que cobre as partes superior e inferior da célula de carga, para que o peso do objeto possa ser medido corretamente. (B) O liseímetro é coberto com um bloco de poliestireno e uma tampa plástica para isolamento térmico. (C) Escamas. Um reservatório de água (recipiente verde) é colocado na tampa do lysímetro para recolher o líquido que escorre da panela. O recipiente verde é acoplado a uma tampa verde, que tem uma grande abertura redonda através da qual a panela é inserida. Um anel de junta de borracha preta é anexado a um lado da tampa verde e a panela é anexada ao outro lado, para minimizar a perda de água através da evaporação do recipiente. A tampa verde possui dois orifícios de amostragem (pequenos e grandes) acima da extensão de drenagem, que são seladas com tampões de borracha. (D)Plugs. O recipiente possui uma extensão de drenagem com quatro orifícios (com plugues) em diferentes alturas, que podem ser usados para ajustar o nível de água no recipiente após a drenagem através de um determinado furo (o volume de água da reserva). O volume de água desejado dependerá das espécies vegetais, do tipo de meio de vasos utilizado e das necessidades hídricas das plantas (ou seja, volume estimado de transpiração diária). (E) A unidade de controle consiste em uma caixa retangular verde que contém o controlador eletrônico e as válvulas solenoides. Existem buracos através dos quais a solução de fertigação pode entrar e sair dos vasos, bem como soquetes para conectar a célula de carga e diferentes sensores. Diferentes tratamentos, como diferentes níveis de salinidade ou diferentes composições minerais, podem ser aplicados através da solução de fertigação. Um suporte de metal é conectado ao controlador, para segurar os tubos e cabos e evitar que toquem nas panelas e adotrem peso. Os outros componentes necessários são sondasdesolo (por exemplo, umidade, temperatura e sensores CE - 5TE), gotejamentos multi-saída(parafertigação e/ou aplicações de tratamento) e(H)sondas atmosféricas [para medir o déficit de pressão de vapor (VPD) e radiação]. (I)Matriz única totalmente equipada. (J) Matriz totalmente equipada na estufa, setas amarelas apontando as sondas atmosféricas que permitem a normalização da condutância estomatal com base nas condições atmosféricas locais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Peças necessárias para uma única configuração de pote.
(A-C) São necessários os seguintes componentes: um pote de 4 L, um pote de 4 L sem fundo para servir como suporte líquido, um pedaço circular de malha de nylon (tamanho de poros = 60 malha) com um diâmetro duplo do fundo da panela, uma tampa com orifícios designados para pingente de planta e irrigação, um de 60 cm, vara de fibra de vidro branca (poste) e um anel de junta preta. (D) Exemplo de um plano de tabela no qual os potes foram randomizados. Na estufa, cada tabela tinha 1-18 colunas e quatro linhas, aqui usamos 24 posições. No entanto, a estrutura do array pode ser facilmente ajustada a qualquer forma com base no tamanho da própria estufa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Configuração de maconha.
(A) Plantas crescendo em bandejas de cavidade. (As mudas de tomate mostradas aqui são apenas um exemplo; muitas outras espécies de plantas poderiam ser cultivadas da mesma forma). (B) Moldes de moldes para (C) criando cavidades no meio de vaso que (D) se encaixam de perto nos plugues de solo raiz das mudas, para garantir o transplante bem-sucedido de (E) as mudas nos vasos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Condições atmosféricas ao longo do experimento.
O eixo y à direita mostra o déficit diário de pressão de vapor (VPD) e o eixo y à esquerda mostra a radiação fotosintética ativa (PAR) ao longo dos 29 dias consecutivos do experimento. Este gráfico foi produzido pelo software de Análise de Dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Conteúdo volutrico de água (VWC) medido por uma sonda de solo ao longo do experimento.
Os dados representam os valores da VWC para um cv. Planta indica que foi submetida ao tratamento da seca durante todo o período de experimento, incluindo recuperação. Este gráfico foi produzido pelo software de Análise de Dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Pesos de plantas inteiras (significa ± SE) durante todo o período experimental para cv. Karla sob condições bem irrigadas (controle) e seca.
Os grupos foram comparados utilizando-se a ANOVA (HSD de Tukey; p < 0,05). Cada média ± SE representa pelo menos quatro plantas. O gráfico e a análise estatística foram produzidos pelo software de Análise de Dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Janelas de software operacionais para a configuração de um experimento. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 2: tabela 'Plantas' como planilha; Software operacional. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 3: Janela de software para o cálculo do peso seco do solo; Software operacional. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 4: Janela de software para a criação de um tratamento de irrigação; Software operacional. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 5: Janela do visualizador do gráfico de análise de dados. Em nosso experimento, utilizamos três cultivares de arroz (ou seja, Indica, Karla e Risoto) e dois cenários diferentes de irrigação, bem irrigados (controle) e seca. Os dados brutos revelaram variação no peso das plantas ao longo do experimento. Cada linha representa uma planta/vaso. Durante o dia, as plantas ocorreram, de modo que o sistema perdeu peso, como pode ser visto nas encostas das curvas diárias. Os vasos eram irrigados todas as noites para a capacidade máxima, tão representados como os picos nas curvas. O evento de irrigação foi seguido pela drenagem do excesso de água após a saturação do meio de vasos. Inicialmente, todas as plantas foram bem irrigadas (controle). A partir de 7 de agosto de 2018, metade das plantas foram submetidas a tratamento de seca. Ao mesmo tempo, o resto das plantas continuou recebendo irrigação ideal. A recuperação diferencial foi alcançada restaurando a irrigação às plantas tratadas com seca, a partir de 20 de agosto de 2018 (permitindo que cada planta experimentasse um grau de estresse semelhante) e continuando até o final do experimento. Clique aqui para baixar este número.
A ferramenta de irrigação de feedback do sistema permite que o usuário projete programas de irrigação para cada pote individual com base no tempo, peso do pote, dados de um sensor de solo (por exemplo, VWC) ou transpiração de plantas ao longo do dia anterior. Cada planta pode ser irrigada individualmente de forma personalizada com base em seu próprio desempenho. Essa irrigação diferencial minimiza as diferenças entre o conteúdo hídrico do solo das plantas, de modo que todas as plantas sejam expostas a um tratamento controlado de seca, independentemente de suas demandas de água individuais.
Figura suplementar 6: Janela de Análise de Dados para a análise dos dados. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 7: Data Analysis histogram window. Esta figura mostra uma representação gráfica da distribuição dos valores de transpiração diária nas três cultivares de arroz diferentes (ou seja, Indica, Karla e Risoto) em condições bem irrigadas (controle). O diagrama inferior representa uma visualização do mapa de calor das plantas de transpiração diária com base na localização física dos vasos sobre a mesa. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 8: Janela de teste T de análise de dados. As linhas representam as diferenças na transpiração diária (traço fisiológico fundamental e importante) entre duas cultivares de arroz (ou seja, Karla e Risoto) em condições bem irrigadas (controle). A janela mostra a transpiração diária das plantas individuais (canto superior direito) e uma comparação dos meios ± SE de cada grupo realizado utilizando o teste tdo Aluno (inferior direito). A análise estatística foi realizada automaticamente pelo software. Os pontos vermelhos representam diferenças significativas entre os tratamentos de acordo com os t-testesdo Aluno; p < 0,05. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 9: Análise de dados Janela ANOVA. (A) Representação gráfica das diferenças na transpiração diária entre duas variedades de arroz (ou seja, Karla e Risoto) em condições bem irrigadas (controle) e seca durante todo o período experimental. O tratamento da seca foi iniciado 5 dias após o início do experimento. Clicar em qualquer dia apresentará a comparação (B) Grupos usando ANOVA (HSD de Tukey; p < 0,05), aqui em 12 ago. Cada média ± SE representa pelo menos quatro plantas. Os mesmos grupos também poderiam ser apresentados como uma (C) Taxa contínua de transpiração de plantas (Significa ± SE) durante todo o período experimental. Os gráficos e a análise estatística foram produzidos pelo software de Análise de Dados. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 10: Análise de dados em termos de curva linear. Esta janela mostra as curvas lineares em pedaços de três cultivares de arroz (ou seja, Indica, Karla e Risoto) em condições de seca. O software pode realizar uma análise de ajuste linear em pedaços da relação entre qualquer parâmetro fisiológico (aqui, transpiração diária) e o teor de água volumétrica calculada (VWC) das plantas submetidas ao tratamento da seca. Clique aqui para baixar este número.
Materiais Complementares. Clique aqui para baixar esses materiais.
| Média | Descrição | |
| Areia grosseira | Areia de sílica 20-30 (telas de malha superior e inferior através das quais a areia foi passada: 0,841 e 0,595 mm, respectivamente) | |
| Areia fina | Areia de sílica 75-90 (telas de malha superior e inferior através das quais a areia foi passada: 0,291 e 0,163 mm, respectivamente) | |
| Solo à base de turfa | Klasmann 686 | |
| Solo loamy (solo natural) | Solo de loam de areia retirado da camada superior de um terreno na fazenda experimental da Faculdade de Agricultura, Alimentação e Meio Ambiente, Rehovot, Israel | |
| Vermiculite | Vermiculite 3G | |
| Perlite | Perlite 212 (Faixa de tamanho: 0,5-2,5 mm) | |
| Adubo | Solo de Bental 11 Potting | |
| Poroso, cerâmica, meio de pequeno porte | Perfil Cerâmica porosa 20-50 (telas de malha superior e inferior através das quais a cerâmica moída foi passada: 0,841 e 0,297 mm, respectivamente) | |
| Poroso, cerâmica, meio de tamanho misto | Perfil Cerâmica porosa 50% 20-50 malha e 50% 20-6 malha, 0,841 - 3,36 mm | |
Tabela 1: Mídia de envasamento.
| Tipo de mídia do solo / Parâmetros | Areia grosseira | Areia fina | Solo loamy | Perlite | Vermiculite | Cerâmica porosa de tamanho misto | Cerâmica porosa de pequeno porte | Solo à base de turfa | Adubo |
| Água total (TW, ml) | 860 ± 7.2 (F) | 883.1 ± 24 (F) | 1076.3 ± 35.9 (E) | 1119,9 ± 8,5 (E) | 1286 ± 22.4 (D) | 1503,6 ± 15,4 (C) | 1713 ± 25,9 (B) | 1744,3 ± 8,2 (B) | 2089,6 ± 61,6 (A) |
| Conteúdo de água volumosa (VWC, ml3/ml3) | 0.26 (F) | 0.27 (F) | 0.33 (E) | 0.35 (E) | 0.4 (D) | 0,46 (C) | 0,53 (B) | 0,54 (B) | 0,65 (A) |
| Densidade a granel (BD, g/cm3) | 1.7 (A) | 1,6 (B) | 1.5(C) | 0.1 (H) | 0.2 (F) | 0.8 (D) | 0.7 (E) | 0.2 (G) | 0.1 (G) |
| Estabilidade do peso do solo (SWS, g/d) | ±2,3 ± 0,3 (B) | ±4,3 ± 0,3 (B) | ±2,9 ± 0,9 (B) | ±14,9 ± 0,7 (A) | ±7,6 ± 2,8 (B) | ±1,3 ± 0,1 (B) | ±1,9 ± 0,4 (B) | ±6,7 ± 0,8 (B) | ±4,3 ± 1,2 (B) |
| Estabilidade do peso do solo com água reservada no banho (g/dia; consulte a Seção 6.14) | 3 ± 0,4 (B) | 3.3 ± 0.4 (B) | 3.2 ± 1.2 (B) | 6.3 ± 0.5 (A) | 2,7 ± 0,8 (B) | 1.6 ± 0,3 (B) | 1.9 ± 0,3 (B) | 10.6 ± 3 (A) | 1,5 ± 0,3 (B) |
| Teor de umidade gravimétrica da capacidade do pote (SWC; consulte a Seção 8.2) | 0.18 (G) | 0.23 (G) | 0.23 (G) | 3.79 (C) | 3.0 (D) | 0,74 (F) | 0.99 (E) | 4.25 (B) | 6.13 (A) |
| Capacidade de drenagem relativa | Excelente | Média | Médio-baixo | Excelente | Excelente | Excelente | Excelente | Baixo | Média |
| Tempo relativo para atingir a capacidade do pote | Rápido | Rápido | Rápido | Lento | Lento | Rápido | Rápido | Lento | Lento |
| Capacidade relativa de troca de cation (CEC) | Baixo | Baixo | Baixo | Baixo | Alta | Alta | Alta | Alta | Alta |
| Compatibilidade com: | |||||||||
| Lavagem de raízes (no final do experimento) | ++ | ++ | + | ++ | + | ++ | ++ | - | - |
| Tratamento nutriente/bioestimulante | ++ | ++ | - | ++ | + | + | + | - | - |
| Tratamentos de salinidade | ++ | ++ | + | ++ | + | ++ | ++ | + | - |
| Medição precisa das taxas de crescimento | ++ | ++ | + | -,+ | + | ++ | +++ | + | + |
| Recuperação da estrutura física do solo após a seca | +++ | +++ | ++ | + | - | +++ | +++ | -,+ | - |
| * Água total (TW, ml) = peso molhado do solo (na capacidade do pote) – peso seco do solo. Teor de água volumosa (VWC) = TW/volume do solo. | |||||||||
| Densidade a granel (BD) = peso seco do solo/volume do solo. Estabilidade do peso do solo (SWS) = Variação média do peso úmido do solo ao longo de 4 dias consecutivos (médio na capacidade do pote sem planta após a última irrigação). | |||||||||
| Teor de umidade gravimétrica da capacidade do pote (SWC); para o cálculo, consulte a Seção 7.2. | |||||||||
Tabela 2: Características gerais de 9 diferentes meios de envasamento e sua compatibilidade com a plataforma gravimétrica. As medidas foram tomadas utilizando potes 4-L preenchidos com 3,2 L de capacidade média no campo (capacidade do pote). Os dados são mostrados como meios ± SE. Diferentes letras nas colunas indicam diferenças significativas entre os meios de comunicação, de acordo com o teste HSD de Tukey(P < 0,05; 3 ≤ n ≤ 5).
| Componentes de fertigação | Concentração final (ppm) | Concentração final (mM) |
| NaNO3 | 195.8 | 2.3 |
| H3PO4 | 209 | 0.000969 |
| KNO3 | 271.4 | 2.685 |
| MgSO4 | 75 | 0.623 |
| ZnSO4 | 0.748 | 0.0025 |
| Cuso4 | 0.496 | 0.00198 |
| MoO3 | 0.131 | 0.00081 |
| MnSO4 | 3.441 | 0.0154 |
| Bórax | 0.3 | 0.00078 |
| C10H12N2NaFeo8 (Fe) | 8.66 | 0.0204 |
| O pH da solução de irrigação final do gotejamento (após diluição com água da torneira) variou entre 6,5 e 7. | ||
Tabela 3: Componentes de fertigação.
Discussion
A lacuna de conhecimento genótipo-fenótipo reflete a complexidade das interações genótipo x ambiente (revisada por18,24). Pode ser possível preencher essa lacuna através do uso de plataformas de diagnóstico telemétrico de alta resolução, HTP-telemétricas e de triagem fenotípica que podem ser usadas para estudar o desempenho fisiológico de plantas inteiras e cinéticas de relação água8,,9. A complexidade das interações genótipos x ambientes torna a fenotipagem um desafio, particularmente à luz da rapidez com que as plantas respondem rapidamente aos seus ambientes em mudança. Embora vários sistemas de fenotipagem estejam atualmente disponíveis, a maioria desses sistemas são baseados em sensoriamento remoto e técnicas avançadas de imagem. Embora esses sistemas forneçam medições simultâneas, até certo ponto, suas medidas estão limitadas a traços fisiológicos morfológicos e indiretos25. Traços fisiológicos são muito importantes no contexto de responsividade ou sensibilidade às condições ambientais26. Portanto, medições diretas tomadas de forma contínua e simultânea a uma resolução muito alta (por exemplo, intervalos de 3 minutos) podem fornecer uma descrição muito precisa do comportamento fisiológico de uma planta. Apesar dessas vantagens substanciais do sistema gravimétrico, o fato de que este sistema tem algumas desvantagens potenciais também deve ser levado em conta. As principais desvantagens resultam da necessidade de trabalhar com potes e em condições de estufa, que podem apresentar grandes desafios para a regulação do tratamento (particularmente a regulação dos tratamentos de seca) e a repetibilidade experimental.
Para resolver essas questões, deve-se padronizar as tensões aplicadas, criar uma estrutura experimental verdadeiramente aleatória, minimizar os efeitos do vaso e comparar múltiplos comportamentos dinâmicos das plantas em condições ambientais em mudanças em um curto período de tempo. A abordagem de fenotipagem funcional HTP-telemétrica descrita neste artigo aborda essas questões conforme observado abaixo.
A fim de correlacionar a resposta dinâmica da planta com seu ambiente dinâmico e capturar um quadro completo e grande de interações complexas entre plantas e meio ambiente, tanto as condições ambientais (Figura 4) quanto as respostasvegetais (Figura Suplementar 9B)devem ser medidas continuamente. Este método permite a medição de mudanças físicas no meio de vaso e atmosfera de forma contínua e simultânea, ao lado de traços vegetais (solo-planta-atmosfera contínua, SPAC).
Para melhor prever como as plantas se comportarão no campo, é importante realizar o processo de fenotipagem em condições tão semelhantes quanto possível às encontradas no campo18. Realizamos os experimentos em uma estufa em condições semi-controladas para imitar as condições de campo tanto quanto possível. Uma das condições mais importantes é o meio de cultivo ou potting. Selecionar o meio de vaso mais adequado para o experimento do sistema gravimétrico é crucial. É aconselhável escolher um meio de solo que escorra rapidamente, permite a rápida realização da capacidade do pote e tem uma capacidade de pote altamente estável, pois essas características permitem medições mais precisas pelo sistema gravimétrico. Além disso, os diferentes tratamentos a serem aplicados no experimento também devem ser considerados. Por exemplo, tratamentos envolvendo sais, fertilizantes ou produtos químicos exigem o uso de um meio de vaso inerte, de preferência um com baixa capacidade de troca de cation. Os tratamentos de seca aplicados a espécies vegetais de baixa transpiração funcionariam melhor com meios de água com níveis relativamente baixos de VWC. Em contraste, tratamentos de seca lenta aplicados a plantas de alto transpiração funcionariam melhor com meios de envasamento com níveis relativamente altos de VWC. Se as raízes forem necessárias para análise pós-experimento (por exemplo, morfologia radicular, peso seco, etc.), o uso de um meio com teor de matéria orgânica relativamente baixo (ou seja, areia, cerâmica porosa ou perlite) facilitará a lavagem das raízes sem danificá-las. Para experimentos que continuarão por períodos mais longos, é aconselhável evitar mídias ricas em matéria orgânica, pois essa matéria orgânica pode se decompor com o tempo. Consulte a Tabela 1 e a Tabela 2 para obter informações mais detalhadas sobre este tópico.
Fenotipagem de campo e fenotipagem de estufa (pré-campo) têm seus próprios objetivos e exigem diferentes configurações experimentais. O fenotipo pré-campo auxilia na seleção de genótipos candidatos promissores que têm uma alta probabilidade de se sair bem no campo, para ajudar a tornar os testes de campo mais focados e econômicos. No entanto, o fenotipagem pré-campo envolve uma série de limitações (por exemplo, efeitos de maconha) que podem fazer com que as plantas tenham um desempenho diferente do que fariam em condições de campo18,27. Tamanho pequeno de maconha, perda de água por evaporação e aquecimento das escamas de límetro são exemplos de fatores em experimentos de estufa que podem levar a efeitos de maconha18. O método descrito aqui foi projetado para minimizar esses efeitos potenciais da seguinte forma:
a O tamanho do pote é escolhido com base no genótipo a ser examinado. O sistema é capaz de suportar vários tamanhos de maconha (até 25 L) e tratamentos de irrigação, o que permite o exame de qualquer tipo de planta agrícola.
b As panelas e as escamas de límetro são isoladas para evitar que o calor seja transferido e qualquer aquecimento dos potes.
c Este sistema envolve um sistema de irrigação e drenagem cuidadosamente projetado.
(d) Existe um controlador separado para cada pote, para permitir a verdadeira randomização com tratamentos auto-irrigados e auto-monitorados.
e O software leva em conta o VPD local das plantas no cálculo da condução do dossel estomatal. Consulte as várias estações VPD localizadas na Figura 1J.
Este sistema envolve medições fisiológicas diretas em densidades vegetais semelhantes a campos, o que elimina a necessidade de grandes espaços entre as plantas ou a movimentação das plantas para fenotipagem baseada em imagem. Este sistema inclui a análise de dados em tempo real, bem como a capacidade de detectar com precisão o ponto de estresse fisiológico (φ) de cada planta. Isso permite que o pesquisador monitore as plantas e deva decisões sobre como o experimento deve ser conduzido e como quaisquer amostras devem ser coletadas ao longo do experimento. A calibração de peso fácil e simples do sistema facilita a calibração eficiente. Sistemas de alto rendimento geram grandes quantidades de dados, que apresentam desafios adicionais de manipulação de dados e analíticas11,12. A análise em tempo real do big data que é diretamente alimentado ao software do controlador é um passo importante na tradução de dados para o conhecimento14 que tem grande valor para a tomada de decisões práticas.
Este método de fenotipagem fisiológica HTP-telemétrica pode ser útil para a realização de experimentos de estufa em condições próximas ao campo. O sistema é capaz de medir e calcular diretamente as respostas fisiológicas relacionadas à água das plantas ao seu ambiente dinâmico, ao mesmo tempo em que supera eficientemente a maioria dos problemas associados ao efeito de vaso. As habilidades deste sistema são extremamente importantes na fase de fenotipagem pré-campo, pois oferecem a possibilidade de prever penalidades de rendimento durante os estágios iniciais do crescimento da planta.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo programa de pesquisa conjunta ISF-NSFC (subvenção nº 2436/18) e também foi parcialmente apoiado pelo Ministério da Agricultura e Desenvolvimento Rural de Israel (Centros de Conhecimento Eugene Kandel) como parte do Centro de Conhecimento raiz da matéria – O Centro de Conhecimento da Zona Raiz para Alavancar a Agricultura Moderna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atmospheric Probes | SpectrumTech/Meter group | 3686WD | Watchdog 2475 |
| 40027 | VP4 | ||
| Array Randomizer | None | The software "Array Randomizer" can be used for creating an experimental design of a randomized block design, or fully random design. It was developed to have better control over the random distribution of the experimental samples (plants) in order to normalize the atmospheric microvariation inside the greenhouse. | |
| Free download and more information, please click on the following link: https://drive.google.com/open?id=1y4QbTpxRK5Lx430xzu1RFdrlcL8pz_1q | |||
| Cavity trays | Danish size with curved rim for nursery | 30162 | 4X4X7 Cell, 84 cell per tray https://desch.nl/en/products/seed_propagation_trays/danish-size-with-curved-rim-for-nursery~p92 |
| Coarse sand | Negev Industrial Minerals Ltd., Israel | ||
| Compost | Tuff Marom Golan, Israel | ||
| Data Analysis software | Plant-Ditech Ltd., Israel | SPAC Analytics | |
| Drippers | Netafim | 21500-001520 | PCJ 8L/h |
| Fine sand | Negev Industrial Minerals Ltd., Israel | ||
| Loamy soil (natural soil) | |||
| Nylon mesh | Not relevant (generic products) | ||
| Operating software | Plant-Ditech Ltd., Israel | Plantarray Feedback Control (PFC) | |
| Peat-based soil | Klasmann-Deilmann GmbH, Germany | ||
| Perlite | Agrekal , Israel | ||
| Plantarray 3.0 system | Plant-Ditech Ltd., Israel | SCA400s | Weighing lysimeters |
| PLA300S | Planter unit container | ||
| CON100 | Control unit | ||
| part of the planter set | Fiberglass stick | ||
| part of the planter set | Gasket ring | ||
| Operating software | |||
| SPAC Analytics software | |||
| Porous, ceramic, mixed-sized medium | Greens Grade, PROFILE Products LLC., USA | ||
| Porous, ceramic, small-sized medium | Greens Grade, PROFILE Products LLC., USA | ||
| Pots | Not relevant (generic products) | ||
| Soil | Bental 11 by Tuff Marom Golan | ||
| Soil Probes | Meter group | 40567 | 5TE |
| 40636 | 5TM | ||
| 40478 | GS3 | ||
| Vermiculite | Agrekal , Israel |
References
- Ray, D. K., Mueller, N. D., West, P. C., Foley, J. A. Yield Trends Are Insufficient to Double Global Crop Production by 2050. PLoS One. 8, 66428 (2013).
- Food and Agriculture Organization of the United Nations. The future of food and agriculture: Trends and challenges. , Rome. (2017).
- Dhankher, O. P., Foyer, C. H. Climate resilient crops for improving global food security and safety. Plant, Cell & Environment. 41, 877-884 (2018).
- Chen, D., et al. Dissecting the phenotypic components of crop plant growthand drought responses based on high-throughput image analysis w open. Plant Cell. 26, 4636-4655 (2014).
- Ubbens, J. R., Stavness, I. Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks. Frontiers in Plant Science. , (2017).
- Danzi, D., et al. Can High Throughput Phenotyping Help Food Security in the Mediterranean Area. Frontiers in Plant Science. , (2019).
- Miflin, B. Crop improvement in the 21st century. Journal of Experimental Botany. 51, 1-8 (2000).
- Dalal, A., et al. Dynamic Physiological Phenotyping of Drought-Stressed Pepper Plants Treated With "Productivity-Enhancing" and "Survivability-Enhancing" Biostimulants. Frontiers in Plant Science. , (2019).
- Moshelion, M., Altman, A. Current challenges and future perspectives of plant and agricultural biotechnology. Trends in Biotechnology. 33, 337-342 (2015).
- Singh, A., Ganapathysubramanian, B., Singh, A. K., Sarkar, S. Machine Learning for High-Throughput Stress Phenotyping in Plants. Trends in Plant Science. 21, 110-124 (2016).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: The next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855-866 (2010).
- Fiorani, F., Schurr, U. Future Scenarios for Plant Phenotyping. Annual Review of Plant Biology. 64, 267-291 (2013).
- Tardieu, F., Cabrera-Bosquet, L., Pridmore, T., Bennett, M. Plant Phenomics, From Sensors to Knowledge. Current Biology. 27, 770-783 (2017).
- Negin, B., Moshelion, M. The advantages of functional phenotyping in pre-field screening for drought-tolerant crops. Functional Plant Biology. , (2017).
- Gebremedhin, A., Badenhorst, P. E., Wang, J., Spangenberg, G. C., Smith, K. F. Prospects for measurement of dry matter yield in forage breeding programs using sensor technologies. Agronomy. 9, 65 (2019).
- Roitsch, T., et al. New sensors and data-driven approaches-A path to next generation phenomics. Plant Science. 282, 2-10 (2019).
- Li, L., Zhang, Q., Huang, D. A review of imaging techniques for plant phenotyping. Sensors (Switzerland). 14, 20078-20111 (2014).
- Gosa, S. C., Lupo, Y., Moshelion, M. Quantitative and comparative analysis of whole-plant performance for functional physiological traits phenotyping: New tools to support pre-breeding and plant stress physiology studies. Plant Science. 282, 49-59 (2019).
- Araus, J. L., Cairns, J. E. Field high-throughput phenotyping: the new crop breeding frontier. Trends in Plant Science. 19, 52-61 (2014).
- Ito, V. C., Lacerda, L. G. Black rice (Oryza sativa L.): A review of its historical aspects, chemical composition, nutritional and functional properties, and applications and processing technologies. Food Chemistry. 301, 125304 (2019).
- Anjum, S. A., et al. physiological and biochemical responses of plants to drought stress. African Journal of Agricultural Research. , (2011).
- Halperin, O., Gebremedhin, A., Wallach, R., Moshelion, M. High-throughput physiological phenotyping and screening system for the characterization of plant-environment interactions. The Plant Journal. 89, 839-850 (2017).
- Yaaran, A., Negin, B., Moshelion, M. Role of guard-cell ABA in determining steady-state stomatal aperture and prompt vapor-pressure-deficit response. Plant Science. 281, 31-40 (2019).
- Dalal, A., Attia, Z., Moshelion, M. To produce or to survive: how plastic is your crop stress physiology. Frontiers in Plant Science. 8, 2067 (2017).
- Araus, J. L., Kefauver, S. C., Zaman-Allah, M., Olsen, M. S., Cairns, J. E. Translating High-Throughput Phenotyping into Genetic Gain. Trends in Plant Science. 23, 451-466 (2018).
- Ghanem, M. E., Marrou, H., Sinclair, T. R. Physiological phenotyping of plants for crop improvement. Trends in Plant Science. 20, 139-144 (2015).
- Sinclair, T. R., et al. Pot binding as a variable confounding plant phenotype: theoretical derivation and experimental observations. Planta. 245, 729-735 (2017).
