Summary
Este método de fenotipado gravimétrico de relaciones de agua de alto rendimiento, telemétrico y de planta entera permite mediciones directas y simultáneas en tiempo real, así como el análisis de múltiples rasgos fisiológicos relacionados con el rendimiento involucrados en interacciones dinámicas entre plantas y entornos.
Abstract
La seguridad alimentaria para la creciente población mundial es una de las principales preocupaciones. Los datos proporcionados por las herramientas genómicas superan con creces el suministro de datos fenotípicos, creando una brecha de conocimiento. Para hacer frente al desafío de mejorar los cultivos para alimentar a la creciente población mundial, esta brecha debe ser superada.
Los rasgos fisiológicos se consideran rasgos funcionales clave en el contexto de la capacidad de respuesta o la sensibilidad a las condiciones ambientales. Muchas técnicas de fenotipado de alto rendimiento (HTP) introducidas recientemente se basan en la teledetección o la imagen y son capaces de medir directamente los rasgos morfológicos, pero miden los parámetros fisiológicos principalmente indirectamente.
Este artículo describe un método para el fenotipado fisiológico directo que tiene varias ventajas para el fenotipado funcional de interacciones entre plantas y ambiente. Ayuda a los usuarios a superar los muchos desafíos encontrados en el uso de sistemas gravimétricos de células de carga y experimentos de macetas. Las técnicas sugeridas permitirán a los usuarios distinguir entre el peso del suelo, el peso de la planta y el contenido de agua del suelo, proporcionando un método para la medición continua y simultánea de las condiciones dinámicas del suelo, la planta y la atmósfera, junto con la medición de los rasgos fisiológicos clave. Este método permite a los investigadores imitar de cerca los escenarios de estrés de campo teniendo en cuenta los efectos del medio ambiente en la fisiología de las plantas. Este método también minimiza los efectos de la maceta, que son uno de los principales problemas en el fenotipado previo al campo. Incluye un sistema de fertirrigación de retroalimentación que permite un diseño experimental verdaderamente aleatorio a una densidad de planta similar al campo. Este sistema detecta el umbral limitante suelo-agua-contenido (o) y permite la traducción de los datos al conocimiento a través del uso de una herramienta analítica en tiempo real y un recurso estadístico en línea. Este método para la medición rápida y directa de las respuestas fisiológicas de múltiples plantas a un entorno dinámico tiene un gran potencial para su uso en el cribado de rasgos beneficiosos asociados con las respuestas al estrés abiótico, en el contexto de la cría previa al campo y la mejora de los cultivos.
Introduction
Garantizar la seguridad alimentaria de una población mundial en crecimiento en condiciones ambientales deteriorada es actualmente uno de los principales objetivos de la investigación agrícola1,2,3. La disponibilidad de nuevas herramientas moleculares ha mejorado considerablemente los programas de mejora de cultivos. Sin embargo, mientras que las herramientas genómicas proporcionan una enorme cantidad de datos, la comprensión limitada de los rasgos fenotípicos reales crea una brecha de conocimiento significativa. Bridging this gap is one of the greatest challenges facing modern plant science4,5,6. Para hacer frente a los desafíos que surgen en el proceso de mejora de los cultivos y minimizar la brecha de conocimiento genotipo-fenotipo, debemos equilibrar el enfoque genotípico con uno fenocéntrico7,,8.
Recientemente, varias plataformas de fenotipado de alto rendimiento (HTP) han hecho posible el fenotipado no destructivo de grandes poblaciones de plantas a lo largo del tiempo y estas plataformas pueden ayudarnos a reducir la brecha de conocimiento genotipo-fenotipo6,,8,,9,,10. Las técnicas de cribado de HTP permiten la medición de rasgos en un gran número de plantas en un período relativamente corto de tiempo, gracias a la robótica y las cintas transportadoras o gantries utilizados para mover las plantas o sensores (respectivamente), a diferencia de las técnicas operadas a mano basadas en el intercambio de gas o la fotografía. Sin embargo, las enormes cantidades de datos producidos por los sistemas HTP presentan desafíos analíticos y de tratamiento de datos adicionales11,12.
La mayoría de estas plataformas HTP implican la evaluación de rasgos fenotípicos a través de sensores electrónicos o adquisición automatizada de imágenes13,,14. Los fenómicos de campo avanzados implican el despliegue de sensores proximales y tecnologías de imagen en el campo, así como una escala de medición de alta resolución, precisa y de gran población15. Los datos del sensor y de la imagen deben integrarse con otros datos multiómicos para crear un enfoque fenómico holístico de segunda generación16. Sin embargo, los avances metodológicos en la adquisición, el manejo y el procesamiento de datos son cada vez más importantes, ya que los desafíos de traducir la información de los sensores en conocimiento se han subestimado gravemente durante los primeros años de la investigación fenómica vegetal13. Sin embargo, la fiabilidad y precisión de las técnicas de imagen disponibles actualmente para el fenotipado en profundidad de interacciones dinámicas genotipo-medio ambiente y respuestas de tensión vegetal son cuestionables17,,18. Por otra parte, los resultados de entornos controlados son a menudo muy diferentes de los observados en el campo, especialmente cuando se trata de fenotipado de estrés por sequía. Esto se debe a diferencias en la situación que experimentan las plantas en términos de volumen del suelo, ambiente del suelo e impedancia mecánica debido a la disminución de la humedad del suelo durante el estrés por sequía. Por lo tanto, los resultados de entornos controlados son difíciles de extrapolar al campo19. Por último, el precio de entrada de los sistemas HTP basados en imágenes es muy alto, no sólo debido al precio de los sensores, sino también debido a la robótica, cintas transportadoras y gantries, que también requieren estándares más altos de infraestructura de instalaciones de crecimiento y mantenimiento significativo (muchas piezas móviles que trabajan en un entorno de invernadero).
En este artículo, presentamos una plataforma de fenotipado HTP-telemétrico diseñada para resolver muchos de los problemas mencionados anteriormente. La tecnología de telemetría permite la medición y transmisión automática de datos desde fuentes remotas a una estación receptora para su grabación y análisis. Aquí, demostramos una plataforma no destructiva HTP-telemétrica que incluye múltiples lysímetros de pesaje (un sistema gravimétrico) y sensores ambientales. Este sistema se puede utilizar para la recopilación y el cálculo inmediato (no se necesita análisis de imagen) de una amplia gama de datos, como la ganancia de biomasa de plantas enteras, las tasas de transpiración, la conductancia estomatal, los fundentes radiculares y la eficiencia del uso del agua (WUE). El análisis en tiempo real del big data que se alimenta directamente al software desde el controlador en el sistema representa un paso importante en la traducción de datos al conocimiento14 que tiene un gran valor para la toma de decisiones prácticas, ampliando sustancialmente los conocimientos que se pueden adquirir de los experimentos de fenotipado de entorno controlado, en general, y estudios de invernadero de estrés por sequía, en particular.
Otras ventajas de la plataforma de telemetría son su escalabilidad y facilidad de instalación y sus requisitos mínimos de infraestructura de instalaciones de crecimiento (es decir, se puede instalar fácilmente en la mayoría de las instalaciones de crecimiento). Además, como este sistema basado en sensores no tiene piezas móviles, los costos de mantenimiento son relativamente bajos, incluyendo tanto el precio de entrada como los costos de mantenimiento a largo plazo. Por ejemplo, el precio de un sistema gravimétrico de 20 unidades, incluido el sistema de fertirrigación de retroalimentación para cada planta, estación meteorológica y software, será similar al precio de un sistema portátil de intercambio de gas de una marca líder.
El arroz (Oryza sativa L.) fue utilizado como un cultivo modelo y la sequía fue el tratamiento examinado. El arroz fue elegido ya que es un importante cultivo de cereales con amplia diversidad genética y es el alimento básico para más de la mitad de la población mundial20. La sequía es un importante factor de estrés abiótico ambiental que puede afectar el crecimiento y desarrollo de las plantas, lo que lleva a una reducción de los rendimientos de los cultivos21. Esta combinación de cultivo y tratamiento se utilizó para demostrar las capacidades de la plataforma y la cantidad y calidad de los datos que puede producir. Para obtener más información sobre los antecedentes teóricos de este método, consulte 22.
Protocol
En este protocolo, nos referimos a macetas de 4 L cargadas en escamas de 20 cm x 20 cm, con cada maceta que contiene una planta. El mismo protocolo es fácilmente escalable y se puede utilizar con macetas mucho más grandes (hasta 25 L cargadas en escalas de 40 cm x 40 cm, con sólo una adaptación lineal a las medidas de protocolo) y varias plantas por maceta. Por lo tanto, el protocolo se puede adaptar fácilmente para plantas de muchos tipos y tamaños. Consulte la Figura 1 y la Figura 2 para conocer los componentes del sistema.
1. Preparar las ollas para el experimento
- Inserte el filtro de suelo. Extienda la malla de nylon (neto) encima de toda la olla y coloque el soporte de red en la parte superior de la red. Con una mano, empuje lentamente el soporte de la red a mitad del interior de toda la olla. Asegúrese de que la red permanezca uniformemente esparcida a medida que se empuja hacia abajo entre las dos ollas.
- Inserte el palillo de fibra de vidrio (polo) entre las dos ollas y empújelo hasta la parte inferior de toda la olla, asegurándose de que esté en el lado exterior de la red también y no empuje la red.
- Antes de empujar el soporte de la red hasta el fondo, empuje la red hacia abajo a mano desde el interior de la olla y ajústela de modo que se extienda uniforme y firmemente sobre la parte inferior de la olla una vez que el soporte de la red se ha insertado completamente (Figura 2CI).
- Deslice el anillo de la junta desde la parte inferior de la configuración de la olla descrita anteriormente, un tercio del camino hacia arriba en el lado de la olla. Asegúrese de que las ranuras del anillo se abran hacia la parte inferior de la olla(Figura 2CII).
- Repita los pasos 1.1-1.4 para todas las macetas experimentales antes de continuar con el siguiente paso. Aleatorizar la ubicación de las plantas(Figura 2D; en un diseño de bloque aleatorio o un diseño totalmente aleatorio) utilizando la aplicación Randomizer de matriz.
NOTA: Para descargar el programa gratuito y para obtener más información, consulte el enlace: https://drive.google.com/open?id=1y4QbTpxRK5Lx430xzu1RFdrlcL8pz_1q). - Etiquete las ollas de acuerdo con sus ubicaciones en la matriz dentro del invernadero. Por ejemplo, la etiqueta "B10D" corresponde a un maceta ubicada en la Tabla B en la Columna 10 y la Fila D. Preparar tres macetas adicionales para cada tabla para las mediciones del contenido de agua del suelo (consulte la Sección 7.1).
2. Cultivar las plantas
- Elija el medio de cultivo (potting) que mejor se adapte al experimento. Elegir el medio adecuado para el experimento es crucial y la elección correcta depende de varios factores (consulte Discusión). Para los usuarios por primera vez, recomendamos encarecidamente el uso de un medio poroso, cerámico y de tamaño pequeño. Consulte los Cuadros 1 y 2 para obtener más información que le ayude a elegir el medio adecuado para el experimento.
- Germinar las semillas en bandejas de cavidad con el medio de maceta deseado. Si es posible, haga esto dentro del mismo invernadero que se utilizará para la parte principal del experimento, con el fin de aclimatar las plantas a las condiciones ambientales dentro de ese invernadero.
- Si las plántulas no fueron germinadas en bandejas, trasplantarlas en bandejas de cavidades que contengan el medio de maceta. Planta una plántula en cada cavidad y deja que crezca hasta que sus raíces sean lo suficientemente densas como para tomar la forma de la cavidad (enchufe de raíz-suelo).
- Dejar 5–7 cavidades sin plántulas para mediciones del peso del suelo (sólo medio de maceta; Figura 3). Para obtener más información, consulte la Sección 5.9.
3. Mejorar el nivel de señal a ruido
NOTA: Los siguientes pasos mejoran la calidad de las mediciones y reducen los niveles de ruido.
- Calibre el nanómetro.
- Utilice un nivel de espíritu para comprobar que todos los lysímetros están nivelados y luego iniciar el proceso de calibración de peso. Utilice dos pesos estándar (1-10 kg). Realice la calibración mientras el contenedor verde, incluidos todos los enchufes, está en la celda de carga.
- Coloque el primer peso de calibración (más ligero) en cada celda de carga.
- En el software operativo, vaya a la pestaña Calibración y elija el peso para el primer punto. A continuación, seleccione la posición de la celda de carga donde se colocó el peso y haga clic en Obtener punto1 (Figura complementaria 1A). Este paso se puede aplicar en varias células de carga simultáneamente.
- Repita el proceso para el segundo peso y haga clic en Obtener punto2.
- Haga clic en Aplicar calibración.
- Asegurar una cantidad suficiente de plantas con un tamaño adecuado para el experimento
NOTA: Cuanto más pequeña sea la planta, más débil será su señal (por ejemplo, el peso del agua que se produce en un día en comparación con el peso de la olla). Los siguientes pasos ayudarán a mejorar la relación señal-ruido.- Comience el experimento cuando la planta transpira aproximadamente el 10% de la capacidad máxima de agua de la maceta.
NOTA: Por ejemplo, si se trabaja con un medio arenoso que contiene aproximadamente 1 L de agua a gran capacidad (ver Tabla 2), inicie el experimento cuando las plantas transpiran aprox. 100 ml por día. Si trabaja con un medio a base de turba que contiene aproximadamente 2 L de agua a la capacidad de la olla (ver Tabla 2), inicie las mediciones cuando las plantas transpiran alrededor de 200 ml por día. - Estimar la transpiración diaria inicial de la planta antes de cargarla en el sistema midiendo (manualmente) las diferencias de peso por la mañana frente a las nocturnas en unas pocas plántulas.
- Cuando trabaje con plantas pequeñas, coloque varias plantas en cada maceta (por ejemplo, seis plantas de Arabidopsis en una maceta de 3,9 L23,para alcanzar el nivel mínimo recomendado de transpiración)*.
- Comience el experimento cuando la planta transpira aproximadamente el 10% de la capacidad máxima de agua de la maceta.
4. Configuración del experimento
NOTA: El proceso de configuración del experimento está diseñado para tener en cuenta el peso de todas las partes del sistema, a saber, el peso del medio de maceta (incluido el peso del agua del suelo a la capacidad de la olla) y el peso inicial de las plántulas. Siga los pasos que se indican a continuación:
- Si es posible, trabaje con componentes estáticos similares que tengan pesos similares. Los componentes de peso estático incluyen juegos de macetas, sondas de suelo y otras piezas de plástico.
- Para iniciar un nuevo experimento, abra el software operativo. Abra la pestaña Experimentos en el menú de la parte izquierda de la pantalla. Haga clic en Crear nuevo o duplique las propiedades del experimento de un experimento anterior haciendo clic con el botón derecho en el experimento deseado y seleccionando Duplicar. Cambie el nombre del experimento(Figura complementaria 1B).
- Asegúrese de que no se está utilizando ninguna unidad en un experimento diferente que se está ejecutando actualmente en el sistema. Compruebe que todas las plantas de la tabla Plantas coinciden con el diseño experimental. Si no es así, cambie la tabla de acuerdo con el diseño (consulte las Secciones 5.18, 6 y la Figura Complementaria 1C).
- Inicie el experimento haciendo clic en el nombre del experimento y, a continuación, haga clic en Iniciar.
- Tome medidas manuales de las ollas vacías pre-preparadas (olla doble, red, palo y anillo de junta negra). Si se utilizan piezas similares entre sí, el peso medio de 10 de ellas será suficiente.
- Mezclar el medio de maceta a fondo con un poco de agua, durante al menos 1 h, de modo que se descompone en partículas homogéneas y se satura, para garantizar la uniformidad y la homogeneidad. Para los usuarios por primera vez, recomendamos encarecidamente el uso de un medio poroso, cerámico y de tamaño pequeño (ver Tabla 1 y Tabla 2). Como segunda opción, utilice arena gruesa.
- Utilice una mezcladora mecánica (por ejemplo, una hormigonera).
- Cuando se utilice un medio altamente homogéneo (es decir, arena industrial), omita el paso 4.6.1.
- Llene todas las ollas uniformemente para el experimento con el medio de maceta apropiado (por ejemplo, arena, tierra o turba).
- Inserte un molde de cavidad(Figura 3B) que sea similar en forma y tamaño al tapón de raíz-suelo de las plántulas (de la bandeja de cavidad) en el centro del medio de maceta. Empújalo por completo. Toque la parte inferior de la olla contra el suelo varias veces para asegurarse de que el medio de maceta está bien distribuido en la olla. Repita para todas las ollas.
- Regar bien las ollas y enjuagar el exterior de las ollas. Deje que las ollas drene durante 30 minutos antes de continuar con el siguiente paso. Asegúrese de que las ollas drenan libremente. Si el medio de maceta drena demasiado lentamente (por ejemplo, turba densa), premezclarlo con un sustrato ventilado (por ejemplo, perlita; consulte también la Tabla 1 y la Tabla 2)para asegurar un drenaje más rápido.
- Después de que el drenaje se haya detenido por completo, coloque todas las macetas rellenas en el centro de la matriz de nanómetros (en los contenedores verdes que ya están allí) de acuerdo con el diseño experimental (Figura 2A).
- Compruebe que los recipientes verdes estén correctamente instalados en la cubierta de la célula de carga y que no se toquen entre sí.
- En el software operativo, abra la pestaña Experimento y seleccione la pestaña Medir componentes. Haga clic en Objeto de medida. Nombre la medida "1st measurement"(Figura complementaria 1D).
- Coloque los goteros de irrigación, las sondas y las cubiertas de la olla en cada olla. Asegúrese de que las líneas para los goteros de salida múltiple y los cables de la sonda están soportados por sus respectivos soportes (unidos a las unidades para cada escala de llímetro; Figura 1E) antes de colocarlos en las ollas. Asegúrese de que todos los goteros, sondas y cubiertas estén bien posicionados.
- Espere hasta 3 minutos para que se realice una nueva medición (los datos se recopilan automáticamente cada 3 minutos) y, a continuación, abra la pestaña Experimento. Seleccione la pestaña Experimento y haga clic en Experimento. Meta-etiquetar esta medida a la "1medida st" tomada y asígnele el nombre "Componentes estáticos"(Figura complementaria 1E). Las metaetiquetas se utilizan cuando se desea registrar un valor de peso que se determina restando un valor medido de otro.
- Después de realizar los ajustes necesarios en el sistema, espere a que se registre un nuevo punto de datos (cada 3 min) antes de tomar la siguiente medición.
- Compruebe la columna Componentes estáticos para confirmar que los valores registrados en la tabla Plantas no incluyen valores atípicos. Si alguno de los pesos registrados es demasiado bajo o demasiado alto, compruebe si hay alguna interferencia con la célula de carga (por ejemplo, asegúrese de que nada la está tocando) y luego tome una nueva medición (después de que el sistema estuviera todavía durante 3 minutos).
- Haga clic en la pestaña Plantas. Exporte la tabla Plantas como una hoja de cálculo, agregue el peso promedio del bote (desde el paso 4.5) a la medición de los componentes estáticos - "Peso de la hoja". Guarde y cargue el archivo (pestaña Importar).
- Asegúrese de que todos los goteros estén bien insertados en el medio de maceta y en la tubería procedente del controlador. De vuelta en el software operativo, en la pestaña Experimento, seleccione Escenarios de tratamientos. Haga clic en Crear nuevo para crear un nuevo "Plan".
- En el plan, elija el primer paso (cree un nuevo paso si es necesario) y ábralo. Elija "Prueba" para el tratamiento y "Nunca" para la terminación. En la opción de paso, elija cualquier tratamiento que aparezca en la pestaña Tratamientos de riego sobre Experimentos (Figura complementaria 1F; consulte también el paso 4.21). Pulse la pestaña Aplicar.
- Extraiga la tabla Plantas como una hoja de cálculo, agregue "Plan" a la columna Tratamiento y agregue "1" a la columna Paso. Guarde y cargue el archivo.
- En la pestaña Tratamientos de riego, elija el tratamiento "Prueba" y establézcalo en un tiempo de riego de 4-5 min [con la cantidad exacta de tiempo dependiendo del contenido volumétrico de agua (VWC) del suelo utilizado] para habilitar el drenaje. Ajuste el tiempo 2 minutos por delante e ir a las ollas en el invernadero. También se pueden crear otros tratamientos. (Véase la explicación detallada en el paso 7.4.)
- Compruebe visualmente que todos los goteros están funcionando y que el agua está goteando del tapón de drenaje perforado del recipiente verde.
- En el experimento, cambie el tratamiento de riego en el Plan "X", Paso 1 (consulte el paso 4.19-4.20) al tratamiento de riego deseado. Asegúrese de que cada riego nocturno (con fertirrigación; ver Tabla 3 para los componentes de fertirrigación utilizados) se divide en varios pulsos cortos (eventos) con pausas sustanciales entre ellos (al menos tres eventos cada noche), para asegurar que el suelo alcance su capacidad de campo antes del amanecer.
- Deje que el programa de riego se ejecute durante 1 o 2 días para que el suelo alcance su capacidad de campo y continúe hasta la siguiente fase.
5. Inicio del experimento
NOTA: Los datos recopilados en esta etapa se utilizarán como valores de referencia para el resto del experimento. Por lo tanto, es importante seguir los siguientes pasos cuidadosamente.
- Repita los pasos 4.18 a 4.20. Alternativamente, inicie el proceso en la madrugada, no mucho después del último paso de riego.
- Compruebe visualmente que todas las ollas están regadas y que el exceso de líquido de riego está goteando fuera del tapón de drenaje perforado del baño verde.
- Retire el tapón verde y sin perforado (del orificio más bajo) del recipiente verde y deje que el agua se drene por completo. A continuación, vuelva a colocar el enchufe en su lugar(Figura 1D). Si trabaja en "drenaje 0" (es decir, con el orificio inferior abierto/el tapón de drenaje hueco conectado en el orificio más bajo), omita este paso.
- En el software operativo, abra la pestaña del experimento y vaya a Medir componentes. Haga clic en Medir objeto y asigne a la medida el nombre "Cast-pre". Retire suavemente todos los moldes de las ollas y luego espere 3 minutos para que se registre una nueva medición(Figura suplementaria 1D).
- Haga clic en Medir objeto, asígnele el nombre "Cast-post" y metaetiquete la medida a "Cast-pre". La opción calculará automáticamente la diferencia entre los dos valores medidos y dará el peso fundido para verificar la sensibilidad al peso.
- Compruebe los valores de peso en la tabla Plantas. La diferencia entre las mediciones "Cast-post" no debe ser superior a 20 o 30 g.
- Para medir el peso del suelo húmedo, en el software operativo, vaya a la pestaña Medir componentes del experimento y seleccione la opción Medir el peso húmedo del suelo. Tome la medida haciendo clic en Aceptar cuando se le pregunte. Compruebe las mediciones de Peso Húmedo del Suelo en la tabla Plantas del experimento yoteur. El peso aparecerá en la columna "Peso húmedo del suelo"(Figura suplementaria 1D,G).
- Si algunas de las medidas parecen fluctuar inapropiadamente, haga lo siguiente:
- Confirme que cada maceta está colocada correctamente y no está tocando ninguna olla(s) vecina(s).
- Desconecte el primer controlador de la mesa de la electricidad (el resto de los controladores están conectados en serie entre sí y, por lo tanto, también se apagará) durante 2 minutos y luego vuelva a conectarlo.
- Mida manualmente el peso medio de unas pocas cavidades (5-10) con medio de maceta (desde el paso 2.3) sin plántulas (enchufe del suelo). [Asegúrese de que los tapones del suelo estén bien regados (es decir, a la capacidad de campo después del drenaje) antes de las mediciones manuales.] En la ficha Medir componentes, pulse Establecer peso de suelo a granel de siembra y rellene el peso medio ( Figuracomplementaria 1D).
- Haga clic en Medir peso inicial de centro. Esta primera medición es un punto de referencia antes de la plantación(Figura complementaria 1D).
- Asegúrese de que las plántulas de las bandejas de cavidad estén bien regadas (es decir, a la capacidad de campo después del drenaje). Tire suavemente de las plántulas con su tapón de raíz-suelo de las cavidades, asegurándose de no herirlas, y colóquelas cuidadosamente en las cavidades hechas por moldes en las ollas, de acuerdo con el diseño del experimento. Es preferible transferir las plantas al amanecer o al atardecer, con el fin de minimizar el estrés a las plantas (es decir, para minimizar el marchitamiento).
- Espere 3 min. Vuelva a hacer clic en Medir el peso inicial de la planta. Esta segunda medida es el peso inicial de la planta. Meta-etiquetar la medida a la primera (el punto de referencia). El software calculará la diferencia entre las dos mediciones y restará el peso de suelo a granel de plántulas. El resultado es el peso inicial de la planta.
- Compruebe los valores medidos en la tabla Plantas del experimento para asegurarse de que están dentro de un intervalo razonable y lógico (Figura complementaria 1C).
- Saturar el suelo repitiendo los pasos 4.18 a 4.20.
- Asegúrese de que todas las ollas se están drenando correctamente. Si no es así, repita el proceso de saturación. Espere 30 minutos hasta que el drenaje cesa. (Véase también el Cuadro 1 sobre la elección correcta del medio de maceta.)
- En la ficha Medir componentes, haga clic en Medir peso de agua reservado ( Figura complementaria1D).
- Extraiga la tabla Plantas como una hoja de cálculo, reste el peso inicial de la planta medido y el peso de suelo a granel de la medición de peso de agua reservada (la columna "Inventario de agua de reserva"). Cargue el archivo(figura complementaria 1C).
- Confirme que el período de tiempo durante el cual se registrará la transpiración diaria es adecuado para los objetivos del experimento. Rellene los valores de la ficha general del experimento según corresponda para el proyecto(Figura complementaria 1H).
- Rellenar la hora cero: La hora a la que el software comprobará si necesita pasar al siguiente paso en el escenario de tratamiento.
- Rellene los valores diarios de transpiración: La transpiración diaria se calcula como la diferencia entre dos ventanas de peso durante el día, para todos los días. La hora diaria de inicio de la transpiración es la hora a la que el software comenzará a medir el peso promedio.
- Supervise las plantas durante 1-2 días antes de iniciar un nuevo experimento (duplicar y cambiar el nombre del experimento).
6. Cambiar la tabla de plantas
- Extraiga la tabla Plantas como una hoja de cálculo y cambie la tabla según las necesidades. No cambie los documentos de planta, nombres o posiciones. Guarde y cargue el archivo.
- Etiquetar (agrupar) columnas: Para presentar o analizar (consulte el paso 8) plantas agrupadas basadas en etiquetas comunes (por ejemplo, tratamiento, línea), agregue una nueva columna y etiqueta a partir de la opción .por ejemplo, #Treatment). En esta columna, haga una notación para cada planta (por ejemplo, para la etiqueta "#Treatment", marque las plantas como sequía, control, etc.; Figura complementaria 2).
NOTA: El protocolo presentado anteriormente es el protocolo más avanzado y completo para este sistema. Sin embargo, es posible que los usuarios por primera vez deseen comenzar con el protocolo simplificado (consulte MS suplementario). El protocolo simplificado proporciona información sobre menos rasgos y puede conducir a niveles de ruido más altos. Pero, al mismo tiempo, proporciona una manera de familiarizarse más fácilmente y familiarizarse con los procedimientos experimentales más importantes, hardware y software.
7. Ejecute el experimento
- Calcular el contenido de agua gravimétrica del suelo/contenido de agua del suelo (valor SWC).
NOTA: El contenido de agua del suelo gravimétrico es diferente del contenido volumétrico de agua del suelo (VWC).- El valor SWC es la relación entre el peso seco del suelo y el peso húmedo del suelo. Para calcular SWC, utilice las tres macetas extra llenas de tierra (Paso 1.3) sin plantas que previamente fueron preparadas y colocadas en una mesa auxiliar dentro del invernadero durante unos días y regadas regularmente. Pesar el suelo húmedo en una bandeja de aluminio en la madrugada, tan pronto como sea posible después del último evento de riego.
- Secar la bandeja de aluminio con el suelo en un horno (a 105 oC) durante 4-5 días. Verifique que el suelo esté completamente seco tomando dos mediciones de peso consecutivas con al menos 60 minutos de diferencia. Si los pesos son idénticos, el suelo es realmente seco y la última medida se puede registrar como el peso del suelo seco.
- En el software operativo, vaya a Medir componentes y haga clic en la pestaña Calcular peso seco del suelo. Rellene los pesos húmedos y secos del suelo para cada muestra, haga clic en Aplicar y finalizar (Figura complementaria 3).
- Alternativamente, calcule manualmente SWC usando la ecuación que se muestra a continuación.
- Promedio de las dos mediciones SWC tomadas manualmente de al menos tres macetas. Seleccione la pestaña Medir componentes y haga clic en Calcular peso seco del suelo el valor de g [g/g], haga clic en Aplicar y finalizar. Los pesos secos del suelo de todas las macetas del experimento serán calculados automáticamente por el software (suponiendo que todas las macetas del experimento contengan el mismo medio; Figura complementaria 1D y Figura complementaria 3).
- Aplicar los tratamientos de riego. Los escenarios de riego se pueden aplicar componiendo un plan de tratamiento paso a paso.
- Para componer un nuevo plan de tratamiento de riego, vaya a Tratamiento de riego,haga clic en Crear nuevoy asigne un nombre al nuevo tratamiento. Abra el tratamiento específico en la lista de tratamientos de riego y haga clic en el valor predeterminado "00:00".
NOTA: En la ventana principal (Figura complementaria 4A), "Tiempo" indica el tiempo en que se abrirá la válvula (es decir, el inicio del tratamiento de riego). "Válvula" es la válvula a abrir (A o B, dependiendo de la válvula que esté conectada a la solución deseada). "Tipo de comando" indica el tipo de datos que se utilizarán para determinar cuándo se cerrará la válvula:- Por tiempo – Cuántos segundos la válvula estará abierta.
- Por peso – El aumento de peso / agua (en gramos) que se añadirá a la olla a través del riego.
- Por Transpiración – El riego se puede aplicar diferencialmente a cada maceta en función de la transpiración de cada planta individual durante el día anterior. El usuario puede decidir qué porcentaje de la transpiración del día anterior se aplicará durante el riego. (Bajo la condición bien irrigada, se sugiere dar a la planta más del 100%, con el fin de lavar el suelo y compensar el crecimiento de la planta.) Las plantas tratadas con sequía deben recibir menos agua, con volúmenes exactos basados en la tasa de estrés por sequía deseada.
- Por sensores – El riego se puede aplicar de acuerdo con una lectura del sensor, como la permitividad dieléctrica aparente (que se puede utilizar para determinar el VWC). Seleccione el tipo de sensor, el parámetro deseado y el valor de parámetro deseado.
- Todas las posibilidades incluyen una opción de tiempo de espera que cerrará el grifo incluso si no se alcanzaron las condiciones establecidas. Establezca el tiempo de espera para un período más largo que las condiciones establecidas.
- Después de definir los tratamientos de riego para el experimento, abra el experimento deseado en la lista de experimentos, abra Escenario de tratamiento,abra el plan predeterminado y seleccione el primer paso (Figura complementaria 4B).
- En Tratamiento, elija un tratamiento de riego de la lista. A continuación, en Terminación, elija la condición adecuada para detener el paso actual y pasar al siguiente.
- Después de seleccionar un escenario de riego, abra la tabla Plantas del experimento(Figura complementaria 2) e introduzca el "Tratamiento" y "Paso" para cada planta. "Tratamiento" es el nombre del escenario de tratamiento y "Paso" es el número de evento dentro del escenario de tratamiento.
- Para componer un nuevo plan de tratamiento de riego, vaya a Tratamiento de riego,haga clic en Crear nuevoy asigne un nombre al nuevo tratamiento. Abra el tratamiento específico en la lista de tratamientos de riego y haga clic en el valor predeterminado "00:00".
- Planifique un tratamiento contra la sequía.
- Cada planta individual tiene una tasa de transpiración única basada en su tamaño y ubicación en el invernadero. Para permitir un tratamiento estándar contra la sequía (es decir, una tasa de secado similar para todas las macetas durante el tratamiento), planifique un escenario de sequía y controle a través de la herramienta de retroalimentación-irrigación del sistema(Figura complementaria 5).
8. Analizar los datos utilizando el software de análisis de datos
- Abra el software de análisis de datos (por ejemplo, SPAC Analytics). Haga clic en la esquina superior derecha para seleccionar sistema de control y el nombre del experimento(Figura complementaria 6A). En la columna del lado izquierdo de la pantalla, seleccione Experimentos (Figura complementaria 6B) y escriba el nombre del experimento en la barra Nombre en la sección Buscar. El nombre del experimento aparecerá debajo de la sección Buscar, en la sección Experimentos(Figura complementaria 6C). Haga clic en el experimento para abrir las secciones Información y Plantas(Figura complementaria 6D).
- En la sección Información, edite las fechas de inicio y de finalización de WUE durante un período de al menos 3 (preferiblemente más) días antes del inicio del tratamiento contra la sequía y, a continuación, haga clic en Actualizar. El valor WUE y R2 para cada maceta aparecerá en la sección Plantas. Elija excluir cualquier escala con un valor WUE negativo o un valor de R2 inferior a 0,5 haciendo clic en el símbolo "ojo" debajo de la columna Activa, que luego se volverá roja. Esto excluirá la escala seleccionada (planta) de todos los cálculos posteriores. Los datos se pueden exportar haciendo clic en el botón Exportar datos en la sección Plantas(Figura complementaria 6D).
- En la columna del lado izquierdo de la escoba, haga clic en Análisis. A continuación, aparecerán diferentes subsecciones: Visor de gráficos, Histograma, Prueba en T, ANOVA y Curva lineal a piecewise.
- Haga clic en Visor de gráficos. En la sección Filtros, establezca las fechas del experimento.
- Haga clic en Etiquetas (consulte el Paso 6) para seleccionar la combinación de grupos experimentales (genotipo) y tratamientos. Automáticamente, todos los macetas del grupo seleccionado aparecerán en la subsección Planta. En esa subsección, anule la selección de las macetas (plantas) haciendo clic en ellas. Se pueden seleccionar hasta dos parámetros diferentes de elección a la vez como el "parámetro Y1" y el "parámetro Y2". Finalmente, haga clic en Mostrar gráfico (Figura complementaria 5).
- Aparecerá un gráfico de líneas de los valores del parámetro seleccionado en la ventana Visor de gráficos para cada planta. Elimine datos de plantas individuales o agréguelos al gráfico haciendo clic en sus símbolos de leyenda a la derecha del gráfico. En la esquina superior derecha, también hay opciones para exportar los datos como una hoja de cálculo y para ampliar la ventana del Visor de gráficos para llenar la pantalla completa (esta función de descarga de datos sin procesar es relevante para todas las demás ventanas). Aparecerán más opciones para modificar el gráfico si el cursor se mueve a la esquina superior derecha de la pantalla(Figura complementaria 5).
- El módulo histograma presenta la distribución de un rasgo único dentro y entre poblaciones durante un período de tiempo determinado. Para utilizar este módulo, haga clic en Histograma.
- En la sección Filtros, establezca la fecha y hora, el parámetro, las etiquetas y los vegetales como se explica en el paso 8.4.1. Seleccione varias etiquetas (grupos) haciendo clic en el símbolo +. Finalmente, haga clic en Mostrar gráfico (Figura complementaria 7).
- El histograma aparecerá en la sección Histograma, en la que existe la opción de cambiar las "Bins" y "Fecha" en la parte superior de la pantalla. En la esquina superior derecha, hay varias opciones como se describe en el paso 8.4.2. En la sección Diagrama de ubicación, se puede ver la ubicación real de las plantas en la tabla experimental y sus respectivos valores de rasgo(Figura complementaria 7).
- Haga clic en T-test. Para comparar estadísticamente los medios de cualquier rasgo medido de dos grupos, introduzca las fechas, etiquetas, plantas y parámetros en la sección "Parámetros de prueba T", como se explica en el paso 8.4.1.
- Establezca el intervalo de horas para calcular los valores medios de los puntos de datos dentro del período de tiempo de interés (el valor predeterminado es una presentación continua de 24 horas). Finalmente, haga clic en Mostrar gráfico (Figura complementaria 8).
- Aparecerán dos ventanas en el lado derecho de la pantalla. La parte superior es la sección Visor de gráficos para todas las plantas seleccionadas de ambos grupos. Debajo de esa ventana se encuentra la sección T-test, en la que aparecerá la comparación de los dos grupos como la prueba tdel parámetro fisiológico seleccionado. Los niveles de significancia se pueden ajustar cambiando el valor de α en la esquina superior izquierda de la sección de prueba en T. Un punto rojo aparecerá bajo valores que son significativamente diferentes. En la esquina superior derecha, vea varias opciones, como se describe en el paso 8.4.2(Figura complementaria 8).
- Haga clic en ANOVA. Para comparar estadísticamente los medios de cualquier rasgo medido en más de dos grupos, introduzca las fechas, etiquetas, plantas y parámetros en la sección "Filtros", como se explica en el paso 8.5.1.
- Seleccione varias etiquetas (grupos) haciendo clic en el símbolo + (como en el paso 8.5). Establezca el rango de horas. Por último, haga clic en "SHOW GRAPH"(Figura complementaria 9).
- En la sección ANOVA, utilice una prueba ANOVA (HSD de Tukey) para comparar los parámetros fisiológicos de los diferentes grupos. Las barras representan los errores estándar (±SE). En la esquina superior derecha de la pantalla, hay varias opciones como se describe en el paso 8.4.2. Haga clic en el gráfico de líneas para ver una comparación de barras-gráfico para un día determinado. Diferentes letras indican grupos que son significativamente diferentes entre sí(Figura complementaria 9A).
- Presentar la relación entre la cinética de transpiración de plantas enteras o la conductancia estomatal y la VWC es una manera más precisa de comparar las respuestas fisiológicas de diferentes plantas con la sequía, en comparación con un enfoque basado en el tiempo. Presente esta relación utilizando la función "Curva lineal de pieza".
- Haga clic en Curva lineal a piecewise. Introduzca las fechas, etiquetas, plantas y parámetros (tanto el eje X como el eje Y) y, a continuación, establezca el intervalo de horas en la sección "Filtros", como se explicó anteriormente.
NOTA: La fecha "desde" debe estar lo más cerca posible de la fecha de inicio del tratamiento. - Establezca el parámetro del eje X como VWC y el parámetro del eje Y como parámetro fisiológico de elección (por ejemplo, tasa de transpiración, conductancia estomatal, etc.). Finalmente, haga clic en Mostrar gráfico. En la sección "Filtro", haga clic en Seleccionar todas las recomendaciones y luego haga clic en Mostrar gráfico (Figura complementaria 10).
NOTA: Otros parámetros fisiológicos (por ejemplo, transpiración normalizada, tasa de transpiración, peso inicial de la planta, conductancia estomatal, flujo radicular, etc.) y parámetros ambientales (por ejemplo, temperatura, humedad relativa, etc.) se obtienen fácilmente a través del software SPAC (por ejemplo, La Figura Complementaria 9C). Para obtener más información sobre los antecedentes teóricos de sus cálculos, véase Halperin et al. (2017).
- Haga clic en Curva lineal a piecewise. Introduzca las fechas, etiquetas, plantas y parámetros (tanto el eje X como el eje Y) y, a continuación, establezca el intervalo de horas en la sección "Filtros", como se explicó anteriormente.
Representative Results
La duración del experimento fue de 29 días. El experimento se llevó a cabo en agosto, cuando el clima local es cálido y estable y los días son largos. Se utilizaron dos escenarios de riego diferentes para demostrar la capacidad de la plataforma de fenotipado para comparar el comportamiento fisiológico de tres variedades diferentes de arroz (es decir, Indica, Karla y Risotto) en presencia de estrés por sequía. Hubo dos tratamientos de estrés por sequía: (i) riego óptimo [hasta que cada maceta alcanzó su capacidad de maceta por la noche después del riego (control)] y ii) una sequía que comenzó 5 días después del inicio del experimento, duró 14 días y fue seguida por un período de recuperación de 10 días (riego óptimo, Días 19–29). En aras de la simplicidad, no todas las variedades y grupos se muestran en las figuras presentadas aquí. Los resultados mostraron que el sistema de HTP-telemétrico puede medir eficientemente los cambios en las condiciones atmosféricas, el suelo y la fisiología de las plantas.
Condiciones ambientales
Las condiciones ambientales [radiación fotosintéticamente activa (PAR) y déficit de presión de vapor (VPD)] fueron monitoreadas durante todo el experimento por una sonda atmosférica. Los datos recogidos indican que PAR y VPD permanecieron similares durante los diferentes días y en el transcurso del día (Figura 4).
El VWC de las macetas tratadas por sequía se midió mediante sondas de suelo durante todo el período experimental. Los datos de VWC recogidos de un cv tratado por sequía. La planta Indica se traza en la Figura 5.
Parámetros fisiológicos
La transpiración diaria aumentó gradualmente en los cuatro tratamientos (Control de Karla, Karla-sequía, Control de Risotto y Risotto-sequía) durante la primera etapa del experimento, durante el cual todas las plantas fueron bien regadas. Más tarde, hubo una reducción en la transpiración que se asoció con el período de sequía (Día 5 al Día 18) en los dos tratamientos privados de agua. Posteriormente, durante el período de recuperación (desde el día 18 en adelante), la transpiración diaria volvió a aumentar en los dos grupos privados de agua, pero a un nivel mucho menor que el observado antes del tratamiento de la sequía(Figura complementaria 9B).
El peso medio calculado de la planta (es decir, la tasa de aumento de peso de la planta) aumentó consistentemente tanto entre la Karla-control y los tratamientos Karla-sequía durante la primera etapa del experimento, cuando todas las plantas recibieron riego similar (Días 1–5). Cuando el tratamiento de sequía se aplicó a la cv. Las plantas de Karla (Días 5–18), esas plantas dejaron de aumentar de peso y no reanudaron el aumento de peso hasta la etapa de recuperación. En ese momento, hubo un aumento de peso que procedió más lentamente de lo que se observó para el control. Por el contrario, los pesos de la Karla-plantas de control aumentaron continuamente durante todo el período experimental (Figura 6).
Figura 1: Componentes y configuración del sistema de fenotipado gravimétrico.
(A) Anpesímetro de pesaje. El nanómetro incluye la célula de carga, que convierte la carga mecánica de un objeto en una carga eléctrica, y una plataforma metálica que cubre las partes superior e inferior de la célula de carga, de modo que el peso del objeto se puede medir correctamente. (B) El nanómetro está cubierto con un bloque de poliestireno y una cubierta de plástico para el aislamiento térmico. (C) Escalar piezas. Se coloca un depósito de agua (contenedor verde) en la cubierta del nanómetro para recoger el líquido que drena de la olla. El recipiente verde está acoplado a una cubierta verde, que tiene una gran abertura redonda a través de la cual se inserta la olla. Un anillo de junta de goma negro se une a un lado de la cubierta verde y la olla está unida al otro lado, para minimizar la pérdida de agua a través de la evaporación del recipiente. La cubierta verde tiene dos orificios de muestreo (pequeños y grandes) por encima de la extensión de drenaje, que están sellados con tapones de goma. (D) Enchufes. El contenedor tiene una extensión de drenaje con cuatro orificios (con tapones) a diferentes alturas, que se puede utilizar para ajustar el nivel de agua en el contenedor después del drenaje a través de un agujero en particular se detiene (el volumen de agua de reserva). El volumen de agua deseado dependerá de las especies de plantas, el tipo de medio de maceta que se utiliza y las necesidades de agua de las plantas (es decir, el volumen de transpiración diario estimado). (E) La unidad de control consta de una caja rectangular verde que contiene el controlador electrónico y las válvulas solenoides. Hay agujeros a través de los cuales la solución de fertirrigación puede entrar y salir de las ollas, así como tomas para conectar la célula de carga y diferentes sensores. Diferentes tratamientos, tales como diferentes niveles de salinidad o diferentes composiciones minerales, se pueden aplicar a través de la solución de fertirrigación. Un soporte de metal está conectado al controlador, para sostener las tuberías y cables y evitar que toquen las ollas y agreguenpeso. Los demás componentes requeridos son (F) sondas de suelo (por ejemplo, sensores de humedad, temperatura y EC - 5TE), goteos multi-salida opcionales (G) (para aplicaciones de fertirrigación y/o tratamiento) y(H)sondas atmosféricas [para medir el déficit de presión de vapor (VPD) y la radiación]. (I) Matriz individual totalmente equipada. (J) Matriz totalmente equipada en el invernadero, flechas amarillas que apuntan a las sondas atmosféricas que permite la normalización de la conductancia estomatal basada en las condiciones atmosféricas locales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Piezas necesarias para una sola configuración de maceta.
(A–C) Se necesitan los siguientes componentes: una olla de 4 L, una olla de 4 L sin fondo para servir como soporte de red, una pieza circular de malla de nylon (tamaño de poro de malla 60) con un diámetro doble que el de la parte inferior de la olla, una cubierta con orificios designados para drippers de planta y riego, un palo de fibra de vidrio blanco (polo) y un anillo de junta negra. (D) Ejemplo de un plan de tabla en el que se han aleatorizado los macetas. En el invernadero, cada mesa tenía 1-18 columnas y cuatro filas, aquí usamos 24 posiciones. Sin embargo, la estructura de la matriz se puede ajustar fácilmente a cualquier forma en función del tamaño del propio invernadero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración de la olla.
(A) Plantas que crecen en bandejas de cavidades. (Las plántulas de tomate que se muestran aquí son sólo un ejemplo; muchas otras especies de plantas podrían ser cultivadas de la misma manera). (B) Moldes de moldes para (C) creando cavidades en el medio de maceta que (D) se ajusten estrechamente a los tapones de tierra radicular de las plántulas, para asegurar el trasplante exitoso de (E) las plántulas en las macetas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Condiciones atmosféricas en el transcurso del experimento.
El eje Y de la derecha muestra el déficit diario de presión de vapor (VPD) y el eje Y de la izquierda muestra la radiación fotosintéticamente activa (PAR) durante los 29 días consecutivos del experimento. Este gráfico fue producido por el software de análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Contenido volumétrico de agua (VWC) medido por una sonda de suelo en el transcurso del experimento.
Los datos representan los valores VWC para un cv. Planta Indica que fue sometida al tratamiento de sequía durante todo el período del experimento, incluyendo la recuperación. Este gráfico fue producido por el software de análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Pesos de toda la planta (medios ± SE) durante todo el período experimental para cv. Karla en condiciones de bien irrigado (control) y sequía.
Los grupos se compararon utilizando ANOVA (HSD de Tukey; p < 0,05). Cada media ± SE representa al menos cuatro plantas. El gráfico y el análisis estadístico fueron producidos por el software de análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Ventanas de software operativas para configurar un experimento. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 2: Tabla 'Plantas' como hoja de cálculo; Software operativo. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 3: Ventana de software para calcular el peso seco del suelo; Software operativo. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 4: Ventana de software para configurar un tratamiento de riego; Software operativo. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 5: Ventana Visor de gráficos de análisis de datos. En nuestro experimento, utilizamos tres cultivares de arroz (es decir, Indica, Karla y Risotto) y dos escenarios de riego diferentes, bien irrigado (control) y sequía. Los datos brutos revelaron variación en el peso de las plantas a lo largo del experimento. Cada línea representa una planta/pot. Durante el día, las plantas transcurrieron, por lo que el sistema perdió peso, como se puede ver en las pendientes de las curvas diarias. Las macetas se regaban todas las noches a plena capacidad, tan representadas como los picos en las curvas. El evento de riego fue seguido por el drenaje de cualquier exceso de agua después de que el medio de maceta se había saturado. Inicialmente, todas las plantas estaban bien regadas (control). Desde el 7 de agosto de 2018, la mitad de las plantas fueron sometidas a un tratamiento de sequía. Al mismo tiempo, el resto de las plantas continuaron recibiendo un riego óptimo. La recuperación diferencial se logró restaurando el riego a las plantas tratadas por sequía, comenzando el 20 de agosto de 2018 (permitiendo que cada planta experimentara un grado similar de estrés) y continuando a través del final del experimento. Haga clic aquí para descargar esta figura.
La herramienta de retroalimentación-irrigación del sistema permite al usuario diseñar programas de riego para cada maceta individual en función del tiempo, el peso de la maceta, los datos de un sensor de suelo (por ejemplo, VWC) o la transpiración de plantas durante el día anterior. Cada planta se puede irrigar individualmente de forma personalizada en función de su propio rendimiento. Este riego diferencial minimiza las diferencias entre el contenido de agua del suelo de las plantas, de modo que todas las plantas están expuestas a un tratamiento de sequía controlado independientemente de sus demandas de agua individuales.
Figura complementaria 6: ventana Análisis de datos para el análisis de datos. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 7: Ventana del histograma del análisis de datos. Esta figura muestra una representación gráfica de la distribución de los valores de transpiración diaria en los tres cultivares de arroz diferentes (es decir, Indica, Karla y Risotto) en condiciones de bien irrigado (control). El diagrama inferior representa una visualización del mapa térmico de la transpiración diaria de las plantas basada en la ubicación física de las macetas en la tabla. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 8: Ventana de prueba T de análisis de datos. Las líneas representan las diferencias en la transpiración diaria (un rasgo fisiológico fundamental e importante) entre dos cultivares de arroz (es decir, Karla y Risotto) en condiciones de control bien irrigado. La ventana muestra la transpiración diaria de las plantas individuales (arriba a la derecha) y una comparación de los medios ± SE de cada grupo realizado utilizando la prueba tdel estudiante (abajo a la derecha). El software realizó el análisis estadístico automáticamente. Los puntos rojos representan diferencias significativas entre los tratamientos de acuerdo con las pruebas tdel estudiante; p < 0,05. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 9: Ventana ANOVA análisis de datos. (A) Representación gráfica de las diferencias en la transpiración diaria entre dos variedades de arroz (es decir, Karla y Risotto) en condiciones de bien irrigado (control) y sequía durante todo el período experimental. El tratamiento de sequía se inició 5 días después del inicio del experimento. Al hacer clic en cualquier día se presentará la comparación (B) Grupos utilizando ANOVA (HSD de Tukey; p < 0.05), aquí en AUG el 12. Cada media ± SE representa al menos cuatro plantas. Los mismos grupos también podrían presentarse como una (C) Tasa continua de transpiración de plantas enteras (Medios ± SE) durante todo el período experimental. Los gráficos y el análisis estadístico fueron producidos por el software de análisis de datos. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 10: Ventana de curva lineal de análisis de datos por piezas. Esta ventana muestra las curvas lineales de tres cultivares de arroz (es decir, Indica, Karla y Risotto) en condiciones de sequía. El software puede realizar un análisis de ajuste lineal por piezas de la relación entre cualquier parámetro fisiológico (aquí, transpiración diaria) y el contenido de agua volumétrica calculado (VWC) de las plantas sometidas al tratamiento de sequía. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Materiales Suplementarios. Haga clic aquí para descargar estos materiales.
| Medio | Descripción | |
| Arena gruesa | Arena de sílice 20-30 (pantallas de malla superior e inferior a través de las cuales se pasó la arena: 0.841 y 0.595 mm, respectivamente) | |
| Arena fina | Arena de sílice 75-90 (pantallas de malla superior e inferior por las que se pasó la arena: 0.291 y 0.163 mm, respectivamente) | |
| Suelo a base de turba | Klasmann 686 | |
| Suelo de loamy (suelo natural) | Suelo franco arenoso tomado de la capa superior de una parcela en la granja experimental de la Facultad de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente, Rehovot, Israel | |
| Vermiculita | Vermiculita 3G | |
| Perlita | Perlita 212 (Rango de tamaño: 0,5-2,5 mm) | |
| Compost | Bental 11 Suelo de maceta | |
| Porosa, cerámica, mediana de tamaño pequeño | Perfil Cerámica porosa 20-50 (pantallas de malla superior e inferior a través de las cuales se pasó la cerámica de tierra: 0.841 y 0.297 mm, respectivamente) | |
| Porosa, cerámica, mediana de tamaño mixto | Perfil Cerámica porosa 50% 20-50 malla y 50% malla 20-6, 0.841– 3.36 mm | |
Tabla 1: Medios de maceta.
| Tipo de soporte de suelo / Parámetros | Arena gruesa | Arena fina | Suelo de loamy | Perlita | Vermiculita | Cerámica porosa de tamaño mixto | Cerámica porosa de pequeño tamaño | Suelo a base de turba | Compost |
| Agua total (TW, ml) | 860 ± 7.2 (F) | 883.1 ± 24 (F) | 1076.3 ± 35.9 (E) | 1119.9 ± 8.5 (E) | 1286 ± 22,4 (D) | 1503.6 ± 15.4 (C) | 1713 ± 25,9 (B) | 1744.3 ± 8.2 (B) | 2089.6 ± 61.6 (A) |
| Contenido volumétrico de agua (VWC, ml3/ml3) | 0.26 (F) | 0.27 (F) | 0.33 (E) | 0.35 (E) | 0.4 (D) | 0.46 (C) | 0.53 (B) | 0.54 (B) | 0.65 (A) |
| Densidad a granel (BD, g/cm3) | 1.7 (A) | 1.6 (B) | 1.5(C) | 0.1 (H) | 0.2 (F) | 0.8 (D) | 0.7 (E) | 0.2 (G) | 0.1 (G) |
| Estabilidad del peso del suelo (SWS, g/d) | ±2,3 ± 0,3 (B) | ±4.3 ± 0,3 (B) | ±2,9 ± 0,9 (B) | ±14,9 ± 0,7 (A) | ±7.6 ± 2.8 (B) | ±1.3 ± 0.1 (B) | ±1.9 ± 0.4 (B) | ±6.7 ± 0.8 (B) | ±4.3 ± 1.2 (B) |
| Estabilidad del peso del suelo con agua reservada en el baño (g/día; consulte la Sección 6.14) | 3 ± 0,4 (B) | 3.3 ± 0,4 (B) | 3.2 ± 1.2 (B) | 6.3 ± 0,5 (A) | 2.7 ± 0,8 (B) | 1.6 ± 0,3 (B) | 1.9 ± 0,3 (B) | 10,6 ± 3 (A) | 1,5 ± 0,3 (B) |
| Contenido de humedad gravimétrica de capacidad de la olla (SWC; consulte la Sección 8.2) | 0.18 (G) | 0.23 (G) | 0.23 (G) | 3.79 (C) | 3.0 (D) | 0.74 (F) | 0.99 (E) | 4.25 (B) | 6.13 (A) |
| Capacidad de drenaje relativa | Excelente | Medio | Medio-bajo | Excelente | Excelente | Excelente | Excelente | Bajo | Medio |
| Tiempo relativo para alcanzar la capacidad de la olla | rápido | rápido | rápido | Lento | Lento | rápido | rápido | Lento | Lento |
| Capacidad relativa de intercambio catiónrico (CEC) | Bajo | Bajo | Bajo | Bajo | Alto | Alto | Alto | Alto | Alto |
| Compatibilidad con: | |||||||||
| Lavado de raíces (al final del experimento) | ++ | ++ | + | ++ | + | ++ | ++ | - | - |
| Tratamiento nutritivo/bioestimulante | ++ | ++ | - | ++ | + | + | + | - | - |
| Tratamientos de salinidad | ++ | ++ | + | ++ | + | ++ | ++ | + | - |
| Medición precisa de las tasas de crecimiento | ++ | ++ | + | -,+ | + | ++ | +++ | + | + |
| Recuperación física de la estructura del suelo después de la sequía | +++ | +++ | ++ | + | - | +++ | +++ | -,+ | - |
| * Agua total (TW, ml) - peso húmedo del suelo (a la capacidad de la olla) – peso seco del suelo. Contenido volumétrico de agua (VWC) - Volumen TW/suelo. | |||||||||
| Densidad a granel (BD) - peso seco del suelo/volumen del suelo. Estabilidad del peso del suelo (SWS) - Cambio medio en el peso húmedo del suelo durante 4 días consecutivos (medio a la capacidad de la olla sin planta después del último riego). | |||||||||
| Capacidad de la olla contenido de humedad gravimétrica (SWC); para el cálculo, véase la Sección 7.2. | |||||||||
Tabla 2: Características generales de 9 medios de maceta diferentes y su compatibilidad con la plataforma gravimétrica. Las mediciones se tomaron utilizando macetas de 4-L llenas de 3,2 L de medio a la capacidad de campo (capacidad de la olla). Los datos se muestran como medios ± SE. Diferentes letras en las columnas indican diferencias significativas entre los medios, según la prueba HSD de Tukey (P < 0.05; 3 ≤ n ≤ 5).
| Componentes de fertirrigación | Concentración final (ppm) | Concentración final (mM) |
| NaNO3 | 195.8 | 2.3 |
| H3PO4 | 209 | 0.000969 |
| KNO3 | 271.4 | 2.685 |
| MgSO4 | 75 | 0.623 |
| ZnSO4 | 0.748 | 0.0025 |
| CuSO4 | 0.496 | 0.00198 |
| MoO3 | 0.131 | 0.00081 |
| MnSO4 | 3.441 | 0.0154 |
| Bórax | 0.3 | 0.00078 |
| C10H12N2NaFeO8 (Fe) | 8.66 | 0.0204 |
| El pH de la solución de riego final del gotero (después de la dilución con agua del grifo) varió entre 6,5 y 7. | ||
Tabla 3: Componentes de fertirrigación.
Discussion
La brecha de conocimiento genotipo-fenotipo refleja la complejidad de las interacciones del entorno genotipo x (revisadas por18,24). Podría ser posible cerrar esta brecha mediante el uso de plataformas de diagnóstico telemétrico de alta resolución y de cribado fenotípico que se pueden utilizar para estudiar el rendimiento fisiológico de plantas enteras y la cinética de relación con el agua8,,9. La complejidad de las interacciones del genotipo x en el entorno hace que el fenotipado sea un desafío, especialmente a la luz de la rapidez con la que las plantas responden a sus entornos cambiantes. Aunque actualmente hay varios sistemas de fenotipado disponibles, la mayoría de esos sistemas se basan en la teledetección y las técnicas avanzadas de imagen. Aunque estos sistemas proporcionan mediciones simultáneas, en cierta medida, sus mediciones se limitan a los rasgos fisiológicos morfológicos e indirectos25. Los rasgos fisiológicos son muy importantes en el contexto de la capacidad de respuesta o la sensibilidad a las condiciones ambientales26. Por lo tanto, las mediciones directas tomadas continuamente y simultáneamente a una resolución muy alta (por ejemplo, intervalos de 3 minutos) pueden proporcionar una descripción muy precisa del comportamiento fisiológico de una planta. A pesar de estas ventajas sustanciales del sistema gravimétrico, también debe tenerse en cuenta el hecho de que este sistema tiene algunas desventajas potenciales. Las principales desventajas se derivan de la necesidad de trabajar con macetas y en condiciones de invernadero, lo que puede presentar grandes desafíos para la regulación del tratamiento (en particular la regulación de los tratamientos contra la sequía) y la repetibilidad experimental.
Con el fin de abordar estos problemas, uno debe estandarizar las tensiones aplicadas, crear una estructura experimental verdaderamente aleatoria, minimizar los efectos de la maceta y comparar múltiples comportamientos dinámicos de las plantas en condiciones ambientales cambiantes dentro de un corto período de tiempo. El enfoque de fenotipado funcional HTP-telemétrico descrito en este documento aborda esos problemas como se indica a continuación.
Con el fin de correlacionar la respuesta dinámica de la planta con su entorno dinámico y capturar un panorama completo y amplio de interacciones complejas entre plantas y entornos, tanto las condiciones ambientales (Figura 4) como las respuestas de las plantas (Figura complementaria 9B) deben medirse continuamente. Este método permite la medición de los cambios físicos en el medio de maceta y la atmósfera de forma continua y simultánea, junto con los rasgos de la planta (suelo-planta-atmósfera continuo, SPAC).
Para predecir mejor cómo se comportarán las plantas en el campo, es importante realizar el proceso de fenotipado en condiciones que sean lo más similares posibles a las que se encuentran en el campo18. Llevamos a cabo los experimentos en un invernadero en condiciones semicontroladas para imitar las condiciones del campo tanto como sea posible. Una de las condiciones más importantes es el medio de cultivo o maceta. La selección del medio de maceta más adecuado para el experimento del sistema gravimétrico es crucial. Es aconsejable elegir un medio de suelo que drene rápidamente, permite el rápido logro de la capacidad de la olla y tiene una capacidad de maceta altamente estable, ya que esas características permiten mediciones más precisas por el sistema gravimétrico. Además, también deben tenerse en cuenta los diferentes tratamientos que se aplicarán en el experimento. Por ejemplo, los tratamientos que involucran sales, fertilizantes o productos químicos requieren el uso de un medio de maceta inerte, preferiblemente uno con una baja capacidad de intercambio catiónicos. Los tratamientos de sequía aplicados a especies vegetales de baja transpiración funcionarían mejor con medios de maceta con niveles relativamente bajos de VWC. Por el contrario, los tratamientos de sequía lenta aplicados a plantas de alta transpiración funcionarían mejor con medios de maceta con niveles relativamente altos de VWC. Si las raíces son necesarias para el análisis post-experimento (por ejemplo, morfología de la raíz, peso seco, etc.), el uso de un medio con un contenido de materia orgánica relativamente bajo (es decir, arena, cerámica porosa o perlita) hará que sea más fácil lavar las raíces sin dañarlas. Para los experimentos que continuarán durante períodos más largos, es aconsejable evitar los medios que son ricos en materia orgánica, ya que esa materia orgánica puede descomponerse con el tiempo. Consulte la Tabla 1 y la Tabla 2 para obtener información más detallada sobre este tema.
El fenotipado de campo y el fenotipado de invernadero (pre-campo) tienen sus propios objetivos y requieren diferentes configuraciones experimentales. El fenotipado previo al campo ayuda a la selección de genotipos candidatos prometedores que tienen una alta probabilidad de hacerlo bien en el campo, para ayudar a que los ensayos de campo sean más enfocados y rentables. Sin embargo, el fenotipado previo al campo implica una serie de limitaciones (por ejemplo, efectos en la maceta) que pueden hacer que las plantas funcionen de manera diferente a como lo harían en las condiciones de campo18,,27. Tamaño pequeño de la olla, pérdida de agua por evaporación y calentamiento de las escalas de lysimeter son ejemplos de factores en experimentos de invernadero que pueden conducir a efectos de maceta18. El método descrito aquí está diseñado para minimizar esos efectos potenciales de la siguiente manera:
(a) El tamaño de la olla se elige en función del genotipo que se va a examinar. El sistema es capaz de soportar varios tamaños de maceta (hasta 25 L) y tratamientos de riego, lo que permite el examen de cualquier tipo de planta de cultivo.
(b) Las ollas y las básculas de lysimeter están aisladas para evitar que se transfiera calor y cualquier calentamiento de las ollas.
(c) Este sistema implica un sistema de riego y drenaje cuidadosamente diseñado.
(d) Hay un controlador separado para cada maceta, para permitir la verdadera aleatorización con tratamientos auto-irrigados y autocontrolados.
(e) El software tiene en cuenta el VPD local de las plantas para calcular la conductancia estomatal del dosel. Consulte la localización de varias estaciones VPD en la Figura 1J.
Este sistema implica mediciones fisiológicas directas en densidades vegetales similares a las de campo, lo que elimina la necesidad de grandes espacios entre las plantas o el movimiento de las plantas para el fenotipado basado en imágenes. Este sistema incluye el análisis de datos en tiempo real, así como la capacidad de detectar con precisión el punto de tensión fisiológica de cada planta. Esto permite al investigador monitorear las plantas y tomar decisiones sobre cómo se va a llevar a cabo el experimento y cómo se deben recoger las muestras en el transcurso del experimento. La calibración de peso fácil y sencilla del sistema facilita la calibración eficiente. Los sistemas de alto rendimiento generan grandes cantidades de datos, que presentan desafíos analíticos y de tratamiento de datos adicionales11,,12. El análisis en tiempo real del big data que se alimenta directamente al software desde el controlador es un paso importante en la traducción de datos al conocimiento14 que tiene un gran valor para la toma de decisiones prácticas.
Este método de fenotipado fisiológico HTP-telemétrico podría ser útil para llevar a cabo experimentos de invernadero en condiciones cercanas al campo. El sistema es capaz de medir y calcular directamente las respuestas fisiológicas relacionadas con el agua de las plantas a su entorno dinámico, mientras que la superación eficiente de la mayoría de los problemas asociados con el efecto de la olla. Las capacidades de este sistema son extremadamente importantes en la etapa de fenotipado previo al campo, ya que ofrecen la posibilidad de predecir penalizaciones por rendimiento durante las primeras etapas del crecimiento de la planta.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación conjunto ISF-NSFC (concesión No 2436/18) y también fue apoyado parcialmente por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Israel (Eugene Kandel Knowledge Centers) como parte de la Raíz de la Materia – El Centro de Conocimiento de la Zona Raíz para el Aprovechamiento de la Agricultura Moderna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atmospheric Probes | SpectrumTech/Meter group | 3686WD | Watchdog 2475 |
| 40027 | VP4 | ||
| Array Randomizer | None | The software "Array Randomizer" can be used for creating an experimental design of a randomized block design, or fully random design. It was developed to have better control over the random distribution of the experimental samples (plants) in order to normalize the atmospheric microvariation inside the greenhouse. | |
| Free download and more information, please click on the following link: https://drive.google.com/open?id=1y4QbTpxRK5Lx430xzu1RFdrlcL8pz_1q | |||
| Cavity trays | Danish size with curved rim for nursery | 30162 | 4X4X7 Cell, 84 cell per tray https://desch.nl/en/products/seed_propagation_trays/danish-size-with-curved-rim-for-nursery~p92 |
| Coarse sand | Negev Industrial Minerals Ltd., Israel | ||
| Compost | Tuff Marom Golan, Israel | ||
| Data Analysis software | Plant-Ditech Ltd., Israel | SPAC Analytics | |
| Drippers | Netafim | 21500-001520 | PCJ 8L/h |
| Fine sand | Negev Industrial Minerals Ltd., Israel | ||
| Loamy soil (natural soil) | |||
| Nylon mesh | Not relevant (generic products) | ||
| Operating software | Plant-Ditech Ltd., Israel | Plantarray Feedback Control (PFC) | |
| Peat-based soil | Klasmann-Deilmann GmbH, Germany | ||
| Perlite | Agrekal , Israel | ||
| Plantarray 3.0 system | Plant-Ditech Ltd., Israel | SCA400s | Weighing lysimeters |
| PLA300S | Planter unit container | ||
| CON100 | Control unit | ||
| part of the planter set | Fiberglass stick | ||
| part of the planter set | Gasket ring | ||
| Operating software | |||
| SPAC Analytics software | |||
| Porous, ceramic, mixed-sized medium | Greens Grade, PROFILE Products LLC., USA | ||
| Porous, ceramic, small-sized medium | Greens Grade, PROFILE Products LLC., USA | ||
| Pots | Not relevant (generic products) | ||
| Soil | Bental 11 by Tuff Marom Golan | ||
| Soil Probes | Meter group | 40567 | 5TE |
| 40636 | 5TM | ||
| 40478 | GS3 | ||
| Vermiculite | Agrekal , Israel |
References
- Ray, D. K., Mueller, N. D., West, P. C., Foley, J. A. Yield Trends Are Insufficient to Double Global Crop Production by 2050. PLoS One. 8, 66428 (2013).
- Food and Agriculture Organization of the United Nations. The future of food and agriculture: Trends and challenges. , Rome. (2017).
- Dhankher, O. P., Foyer, C. H. Climate resilient crops for improving global food security and safety. Plant, Cell & Environment. 41, 877-884 (2018).
- Chen, D., et al. Dissecting the phenotypic components of crop plant growthand drought responses based on high-throughput image analysis w open. Plant Cell. 26, 4636-4655 (2014).
- Ubbens, J. R., Stavness, I. Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks. Frontiers in Plant Science. , (2017).
- Danzi, D., et al. Can High Throughput Phenotyping Help Food Security in the Mediterranean Area. Frontiers in Plant Science. , (2019).
- Miflin, B. Crop improvement in the 21st century. Journal of Experimental Botany. 51, 1-8 (2000).
- Dalal, A., et al. Dynamic Physiological Phenotyping of Drought-Stressed Pepper Plants Treated With "Productivity-Enhancing" and "Survivability-Enhancing" Biostimulants. Frontiers in Plant Science. , (2019).
- Moshelion, M., Altman, A. Current challenges and future perspectives of plant and agricultural biotechnology. Trends in Biotechnology. 33, 337-342 (2015).
- Singh, A., Ganapathysubramanian, B., Singh, A. K., Sarkar, S. Machine Learning for High-Throughput Stress Phenotyping in Plants. Trends in Plant Science. 21, 110-124 (2016).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: The next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855-866 (2010).
- Fiorani, F., Schurr, U. Future Scenarios for Plant Phenotyping. Annual Review of Plant Biology. 64, 267-291 (2013).
- Tardieu, F., Cabrera-Bosquet, L., Pridmore, T., Bennett, M. Plant Phenomics, From Sensors to Knowledge. Current Biology. 27, 770-783 (2017).
- Negin, B., Moshelion, M. The advantages of functional phenotyping in pre-field screening for drought-tolerant crops. Functional Plant Biology. , (2017).
- Gebremedhin, A., Badenhorst, P. E., Wang, J., Spangenberg, G. C., Smith, K. F. Prospects for measurement of dry matter yield in forage breeding programs using sensor technologies. Agronomy. 9, 65 (2019).
- Roitsch, T., et al. New sensors and data-driven approaches-A path to next generation phenomics. Plant Science. 282, 2-10 (2019).
- Li, L., Zhang, Q., Huang, D. A review of imaging techniques for plant phenotyping. Sensors (Switzerland). 14, 20078-20111 (2014).
- Gosa, S. C., Lupo, Y., Moshelion, M. Quantitative and comparative analysis of whole-plant performance for functional physiological traits phenotyping: New tools to support pre-breeding and plant stress physiology studies. Plant Science. 282, 49-59 (2019).
- Araus, J. L., Cairns, J. E. Field high-throughput phenotyping: the new crop breeding frontier. Trends in Plant Science. 19, 52-61 (2014).
- Ito, V. C., Lacerda, L. G. Black rice (Oryza sativa L.): A review of its historical aspects, chemical composition, nutritional and functional properties, and applications and processing technologies. Food Chemistry. 301, 125304 (2019).
- Anjum, S. A., et al. physiological and biochemical responses of plants to drought stress. African Journal of Agricultural Research. , (2011).
- Halperin, O., Gebremedhin, A., Wallach, R., Moshelion, M. High-throughput physiological phenotyping and screening system for the characterization of plant-environment interactions. The Plant Journal. 89, 839-850 (2017).
- Yaaran, A., Negin, B., Moshelion, M. Role of guard-cell ABA in determining steady-state stomatal aperture and prompt vapor-pressure-deficit response. Plant Science. 281, 31-40 (2019).
- Dalal, A., Attia, Z., Moshelion, M. To produce or to survive: how plastic is your crop stress physiology. Frontiers in Plant Science. 8, 2067 (2017).
- Araus, J. L., Kefauver, S. C., Zaman-Allah, M., Olsen, M. S., Cairns, J. E. Translating High-Throughput Phenotyping into Genetic Gain. Trends in Plant Science. 23, 451-466 (2018).
- Ghanem, M. E., Marrou, H., Sinclair, T. R. Physiological phenotyping of plants for crop improvement. Trends in Plant Science. 20, 139-144 (2015).
- Sinclair, T. R., et al. Pot binding as a variable confounding plant phenotype: theoretical derivation and experimental observations. Planta. 245, 729-735 (2017).
