Summary
Le protocole actuel démontre une méthode simple pour tracer les projections de glutamate de l’aire tegmentale ventrale (VTA) vers l’hippocampe. La photostimulation des neurones du glutamate VTA a été combinée à l’enregistrement CA1 pour démontrer comment les terminaux VTA glutamate modulent la vitesse de tir pyramidale putative CA1 in vivo.
Abstract
La modulation optogénétique des sous-populations de neurones dans le cerveau a permis aux chercheurs de disséquer des circuits neuronaux in vivo et ex vivo. Cela fournit une prémisse pour déterminer le rôle des types de neurones dans un circuit neuronal et leur importance dans le codage de l’information par rapport à l’apprentissage. De même, la méthode peut être utilisée pour tester la signification physiologique de deux ou plusieurs régions cérébrales connectées chez les animaux éveillés et anesthésiés. La présente étude démontre comment les neurones de glutamate VTA modulent la vitesse de déclenchement des neurones pyramidaux putatifs dans le CA1 (hippocampe) des souris anesthésisées. Ce protocole utilise le profilage dépendant du virus adéno-associé (AAV) des neurones du glutamate VTA pour le traçage des terminaux de glutamate présynaptique VTA dans les couches de l’hippocampe. L’expression de l’opsine contrôlée par la lumière (channelrhodopsine; hChR2) et de la protéine de fluorescence (eYFP) hébergée par le vecteur AAV a permis le traçage antérograde des terminaux de glutamate VTA et la photostimulation des corps cellulaires des neurones du glutamate VTA (dans le VTA). Des électrodes de silicium aigu à haute impédance ont été positionnées dans le CA1 pour détecter les réponses multi-unités et uni-unités à la photostimulation VTA in vivo. Les résultats de cette étude démontrent la distribution dépendante de la couche des terminaux de glutamate VTA présynaptiques dans l’hippocampe (CA1, CA3 et DG). En outre, la photostimulation des neurones de glutamate VTA a augmenté le taux de déclenchement et d’éclatement des unités pyramidales CA1 putatives in vivo.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, un ensemble d’outils génétiques a été développé pour augmenter la spécificité de la modulation de type neurone et la cartographie des réseaux neuronaux complexes1. Notamment, des virus neurotropes ayant une capacité inhérente à infecter et à se répliquer dans les cellules neuronales ont été déployés pour exprimer ou ablater des protéines spécifiques dans des sous-types de neurones. Lorsqu’ils hébergent des protéines de fluorescence ou des indicateurs d’activité synaptique génétiquement codés, les vecteurs AAV transfectés marquent et délimitent les réseaux neuronaux dans les régions du cerveau2,3. Le choix d’un promoteur dans la construction AAV dirige l’expression du vecteur dans les types de neurones avec un certain niveau de spécificité (expressiondépendante du promoteur). Cependant, grâce à la recombinaison Cre-lox, les constructions AAV sont déployées avec une plus grande spécificité pour le labeling desneurones4, 5,6,7. Il convient de noter que les opsines microbiennes photoactivées et les protéines de fluorescence emballées dans des vecteurs AAV peuvent être exprimées dans divers sous-types de neurones8et sont idéales pour l’imagerie, le traçage de circuits de type neurone et la photomodulation9,10.
Les constructions AAV injectées stéréotacment dans une région du cerveau (ou noyau) entraînent l’expression de la protéine rapporteure dans les terminaux soma, dendrite et axones. L’expression neuronale de l’AAV hébergeant un gène rapporteur (eYFP) facilite le profilage des corps cellulaires des neurones et le traçage anatomique des projections vers et depuis d’autres régions du cerveau11,12,13,14. Les constructions AAV-eYFP transportant des opsines contrôlées par la lumière (par exemple, hChR2), peuvent être déployées comme un outil pour l’imagerie6,15 et le traçage physiologique basé sur la stimulation des projections neuronales pour cibler les zones du cerveau in vivo16. Selon le sérotype de l’AAV, la direction du profilage des neurones peut être antérograde ou rétrograde11,12. Des études antérieures ont établi que l’AAV5 se déplace antérogradement dans les neurones12. Ainsi, la photostimulation des corps cellulaires exprimant hChR2 produit des effets présynaptiques ailleurs dans le cerveau (cible)17.
Ici, l’AAV (sérotype 5) avec un promoteur CaMKIIα a été utilisé pour exprimer eYFP (reporter) et hChR2 (opsine) dans les neurones du glutamate VTA et les projections axonales. Les résultats de cette étude démontrent la distribution dépendante de la couche des terminaux présynaptiques VTA-glutamate dans les régions hippocampiques CA1, CA3 et DG. En outre, la photostimulation des neurones de glutamate VTA a augmenté les taux de déclenchement CA1 multi-unités et uni-unités in vivo par rapport aux valeurs de base. Ce protocole utilise des outils abordables et des logiciels disponibles dans le commerce qui peuvent augmenter la qualité des données obtenues à partir d’expériences de traçage de circuits neuronaux.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales et de manipulation des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Louisiana State University School of Veterinary Medicine.
1. Animal expérimental
- Utilisez des souris âgées de 5 à 6 semaines.
- Hébergez 3 à 5 animaux par cage dans des conditions standard de 12 h alternant cycle clair et sombre. De la nourriture et de l’eau doivent être fournies ad libitum.
2. Craniotomie et préparation animale
REMARQUE: Cette section décrit les procédures pré- et péri-opératoires pour la craniotomie de souris. Utilisez un appareil stéréotaxique standard et les coordonnées appropriées (antéropostérieur: AP, médiolétéral: ML et dorsoventral: DV). Reportez-vous à un atlas du cerveau d’une souris pour déterminer les coordonnées de la région cérébrale d’intérêt.
- Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg). Effectuez un test de pincement des orteils pour vous assurer de l’absence de sensation avant le début de la chirurgie.
REMARQUE: Alternativement, l’anesthésie Isoflurane avec une chambre nasale appropriée peut également être utilisée pour cette étape. - Fixez doucement la tête de l’animal sur l’appareil stéréotaxique.
REMARQUE: Il est important de manipuler les animaux avec prudence pendant ce processus. En outre, vérifiez la fréquence respiratoire et d’autres signes vitaux avant de procéder à la chirurgie. Laissez l’animal se reposer pendant environ 7 minutes pour réduire le stress.- Placez un coussin chauffant sur le cadre stéréotaxique de sorte que le corps de l’animal soit couché dessus. Cela aidera à maintenir la température corporelle et à garder l’animal au chaud tout au fait de la procédure. Conservez le coussin chauffant pour les soins postopératoires et la récupération.
- Utilisez une tondeuse pour enlever les poils sur le cuir chevelu et nettoyez la peau avec une solution d’iode.
- Appliquer la lidocaïne topique pour bloquer la sensation sur le cuir chevelu.
- Utilisez un scalpel pour faire une incision médiane du cuir chevelu s’étendant de la région frontale à la région occipitale.
- Nettoyez la zone d’incision avec une solution d’iode, puis exposez la calvaire.
REMARQUE: Une petite quantité de solution de peroxyde d’hydrogène à 3% peut être appliquée pour éliminer le périoste de la calvaire. Cela augmentera la visibilité des points de repère (bregma et lambda) et des sutures. - À l’aide d’un atlas stéréotaxique du cerveau de souris, déterminez les coordonnées AP et ML par rapport au bregma.
- Pour l’injection de VTA, placez une seringue à aiguille émoussée ultrafine (par exemple, la seringue Neuros) aux coordonnées AP: -3,08 mm / ML: 0,5 mm par rapport à la bregma.
- Utilisez un outil de perçage pour percer un trou de 1 mm (craniotomie) dans le crâne à la coordonnée AP/ ML marquée.
REMARQUE : Cette étape nécessite un niveau de prudence important. Une pression minimale doit être appliquée pendant le forage pour empêcher le foret d’écraser le tissu cérébral. Dans la présente étude, le foret était de 0,8 mm et la vitesse de forage était réglée à 15 000 tr / min.
ATTENTION : Si du peroxyde d’hydrogène a été utilisé pour nettoyer l’incision ou la calvaire, assurez-vous de l’élimination totale de la solution ou laissez sécher complètement avant le forage.
3. Injection de cocktail AAV
REMARQUE: Cette section décrit le processus d’injection d’AAV dans le VTA de souris adultes C57BL / 6 (23-27 g). La méthode décrite peut être utilisée pour l’injection d’AAV dans n’importe quelle région du cerveau en utilisant un appareil stéréotaxique standard et des coordonnées appropriées. Pour démontrer ce protocole, eYFP et hChR2 ont été exprimés dans les neurones du glutamate VTA en utilisant la transfection médiée par AAV5 sous un promoteur CaMKIIα (Figure 1). La recombinaison Cre-lox peut également être utilisée pour cette étape.
- Montez une seringue avec une aiguille ultrafine à pointe émoussée (32 G; capacité de 5 μL avec une précision de 100 nL) sur un injecteur. Fixez le porte-seringue sur un micromanipulateur.
REMARQUE: Pour cette procédure, un porte-seringue manuel, avec un étalonnage de 1,6 nL, a été utilisé. Un injecteur automatisé peut également être utilisé. - Remplissez la seringue avec de l’eau distillée double pour nettoyer et tester l’écoulement du fluide.
- Décongeler les aliquotes du cocktail AAV (sérotype 5) sur glace. Il est préférable de conserver les AAV à -80 °C pour maintenir le titre viral pour une bonne expression.
- Remplissez la seringue montée avec 1 000 nL de solution aAV (10 mM dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4). Distribuer 10 nL de la solution AAV pour confirmer l’écoulement du liquide avant d’abaisser l’aiguille dans un site d’injection.
- Utilisez un micromanipulateur pour abaisser l’aiguille stéréotactiquement à la profondeur souhaitée (coordonnée DV). Après avoir abaissé l’aiguille à la profondeur souhaitée, laissez la seringue rester en place pendant 10 minutes avant l’injection.
REMARQUE: Pour cette procédure, l’aiguille a été abaissée dans le VTA à une profondeur (DV) de 4,5 mm de la surface piale du cerveau. Pour les autres zones du cerveau, utilisez la coordonnée dorsoventrale appropriée (reportez-vous à l’atlas du cerveau de la souris). - Injectez 600 à 800 nL d’AAV dans le VTA. Le volume d’injection peut être ajusté en fonction de la taille du site cible.
- Fournir la solution AAV à raison de 60 nL/min (intervalle de 3 min).
- Pour exprimer eYFP et hChR2 dans les neurones et les projections de glutamate VTA, injectez AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
REMARQUE: La méthode de recombinaison Cre-lox peut également être utilisée en fonction de l’objectif de l’expérience. - Laissez l’aiguille rester en place pendant 15 minutes après l’injection d’AAV. Cela réduira la diffusion et le refoulement.
- Retirez l’aiguille de la seringue, puis suturez l’incision pour fermer la plaie.
- Administrer des antibiotiques et de l’analgésie dans le cadre de soins postopératoires. Placez la souris sur une plateforme rembourrée chaude et surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il soit réveillé.
REMARQUE: Après 3 semaines d’injection, l’expression de l’AAV peut être observée par détection par fluorescence de la protéine rapporteure (eYFP) dans les sections du cerveau de souris. En outre, des expériences de photostimulation peuvent être effectuées après 3 semaines(Figure 2).
4. Mise en place d’enregistrements neuronaux in vivo avec optogénétique
REMARQUE: Cette section décrit les étapes de l’enregistrement neuronal aigu avec le traçage optogénétique d’un circuit cérébral (projection de neurones de glutamate VTA vers le CA1). Si nécessaire, vérifiez le système (amplificateur et connexions) pour les problèmes de bruit électrique et de mise à la terre avant de commencer cette étape. Effectuer cette étape dans une cage de Faraday peut aider à éliminer le bruit électrique dans l’enregistrement.
- 3 semaines après l’injection d’AAV, anesthésier les souris par injection intrapéritonéale d’uréthane (0,2 mg/kg).
ATTENTION : L’uréthane est cancérigène et doit être manipulé avec prudence lors du port d’un équipement de protection. En outre, l’administration d’une anesthésie à l’uréthane à cette concentration est une non-survie. - Apposez la tête de l’animal sur un cadre stéréotaxique comme décrit précédemment (étape 2.2, figure 3A). Effectuer une craniotomie pour exposer la dura (Figure 3A). Utilisez un outil de perçage (taille du mèche : 0,8 mm, vitesse : 15 000 tr/min) pour enlever une partie de l’os pariétal.
- La craniotomie doit avoir une largeur d’environ 3 mm x 4 mm. Appliquer des gouttes de liquide céphalorachidien artificiel (FSA) sur cette zone pour prévenir la sécheresse.
- Sous un microscope à dissection (numérique), utilisez une pointe d’aiguille pliée (27 G) pour exciser la dura exposée. Veillez à ne pas séparer le délicat revêtement pial et les tissus corticaux dans cette zone.
- Percer un trou dans l’os occipital (taille du mors: 0,8 mm, vitesse: 10 000 tr / min) pour maintenir la vis de terre (vis cruciforme à tête de casserole; M0,6 x 2,0 mm).
- Connectez un fil de terre en acier inoxydable.
REMARQUE : D’autres types de fils peuvent également être utilisés (Figure 3b). - Pour la photostimulation combinée (VTA) et l’enregistrement neuronal (CA1), utilisez un appareil stéréotaxique multi-rails équipé de micromanipulateurs ultra-fins (10 μm ou 1 μm). Montez la fibre optique et la sonde neuronale d’enregistrement sur un micromanipulateur de 10 μm et de 1 μm, respectivement.
- Si nécessaire, utilisez un adaptateur tête-sonde d’étage (Figure 3c).
REMARQUE: Dans le protocole actuel, un étage de tête à 32 canaux était équipé d’un adaptateur pour contenir une électrode d’enregistrement à 4 canaux (Figure 3d). Le fil de terre en acier inoxydable a été soudé au port de connexion à la terre de l’adaptateur.
- Si nécessaire, utilisez un adaptateur tête-sonde d’étage (Figure 3c).
- Aux coordonnées AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, abaissez la fibre optique de 400 μm de diamètre dans le VTA.
- Avant d’abaisser la fibre optique, connectez la férule à un câble à fibre optique (avec une ferrule en acier inoxydable ou en céramique) relié à une source LED couplée à une fibre.
REMARQUE: Assurez-vous que l’intensité lumineuse et la mise au point sont réglées comme vous le souhaitez. Le choix de la source lumineuse LED doit correspondre aux opérations ciblées. Ici, un pilote LED de 470 nm (lumière bleue) a été utilisé pour la photoactivation hChR2 (Figure 4a). - Pour synchroniser l’impulsion lumineuse avec l’enregistrement neuronal, connectez le pilote LED et le port IN numérique du contrôleur d’enregistrement à un pulseur logique transistor-transistor (TTL) (Figure 4b). Cela peut être réalisé à l’aide d’un répartiteur BNC.
REMARQUE: L’utilisation d’un pulseur TTL offre la flexibilité de régler numériquement la fréquence et la durée souhaitées du train d’impulsions. Dans le protocole actuel, des impulsions lumineuses de 10 ms ont été déclenchées à 50 Hz18. Pour le contrôle TTL du pilote LED, basculez le pilote sur « trigger ». Dans ce mode, l’intensité lumineuse peut être réglée en tournant le « bouton ». La fréquence de stimulation peut être ajustée pour s’adapter aux variables expérimentales et peut varier de 1 à 100 Hz. Pour le traçage des circuits neuronaux, une fréquence de stimulation de >20 Hz est recommandée. - Ajustez le bouton pour déterminer l’intensité effective qui peut générer une réponse sans produire d’artefacts photoélectriques. Si nécessaire, repositionnez la fibre optique pour éliminer les artefacts19.
REMARQUE: Le pilote LED utilisé pour le protocole actuel produit une puissance lumineuse d’environ 21,8 mW.
- Avant d’abaisser la fibre optique, connectez la férule à un câble à fibre optique (avec une ferrule en acier inoxydable ou en céramique) relié à une source LED couplée à une fibre.
5. Enregistrement neuronal
- Utilisez une sonde neurale aiguë avec une tige de 15 à 50 μm d’épaisseur, mesurant au moins 5 mm de longueur.
REMARQUE: L’enregistrement à partir de structures cérébrales profondes nécessitera des sondes neuronales avec un jarret plus long. Dans la présente étude, une sonde d’une longueur de tige de 20 mm a été utilisée. - Connectez l’étage de tête du préamplificateur au contrôleur d’enregistrement via un câble SPI (Serial Peripheral Interface). Vérifiez l’éclairage couleur des voyants sur les ports du contrôleur d’enregistrement. Les LED vertes et jaunes indiquent la tension appropriée sur la carte d’amplification connectée. Le voyant rouge indique une commande d’étage de tête logicielle fonctionnelle (Figure 5b).
- À l’aide d’un micro-manipulateur, positionnez les sites de contact des électrodes dans la couche de cellules pyramidales du CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: +1,1 à 1,2 mm).
REMARQUE: La fibre optique et l’électrode peuvent être positionnées dans d’autres régions cérébrales souhaitées pour la photostimulation et l’enregistrement.
6. Paramètres de l’amplificateur et du filtre
- Connectez le système d’amplification du contrôleur d’enregistrement à un ordinateur via un port USB 3.0. Connectez l’étage de tête à l’amplificateur à l’aide du câble SPI. Lancez le logiciel du contrôleur. S’il n’est pas correctement connecté, le système affichera un message « périphérique introuvable ».
- Cliquez sur Exécuter pour afficher l’activité sur les canaux. Chaque forme d’onde est tracée sous forme de tension (axe des y) par rapport au temps (axe des x). En fonction de la région d’intérêt, ajustez les échelles de tension et de temps pour ajuster l’affichage de la forme d’onde.
- Si seuls quelques canaux sont actifs, désactivez les canaux inutilisés pour réduire la taille des fichiers sur le disque de stockage.
- Définissez la fréquence d’échantillonnage et les fréquences de coupure en modifiant les paramètres de bande passante sur le logiciel d’acquisition. Pour l’enregistrement sur une seule unité, réglez les fréquences de coupure supérieure et inférieure sur 300 Hz et 5 000 Hz respectivement. Modifiez la fréquence d’échantillonnage de l’amplificateur à 30 kS/s.
REMARQUE: Le choix d’un taux d’échantillonnage élevé produira une taille de fichier plus grande. - Avant d’enregistrer, vérifiez l’intégrité des canaux de l’électrode en mesurant l’impédance à 1 000 Hz. Cela peut être fait en lançant la fonction dans l’interface utilisateur (logiciel du contrôleur). Un canal de travail doit avoir une valeur d’impédance comprise entre 0,1 et 5 MΩ.
- Si une sortie audio (haut-parleur) est connectée au port ANALOG OUT, réglez le gain et le silencieux pour un son de pointe optimal.
- Pour afficher le marqueur de train d’impulsions TTL dans l’enregistrement de pointe, activez l’affichage du marqueur DIGITAL IN. Pour enregistrer l’horodatage du train d’impulsions, activez l’affichage du canal DIGITAL IN avant l’expérience principale.
REMARQUE: Il y a généralement plus d’un canal « DIGITAL IN » (1 ou 2). Assurez-vous que le câble BNC du pulseur TTL est connecté au port « DIGITAL IN » sélectionné pour l’affichage dans le logiciel du contrôleur d’enregistrement. - Pour afficher en temps réel la forme d’onde du pic, ouvrez la fenêtre de l’étendue du pic et définissez le seuil à l’aide du clic de souris.
- Inspectez le niveau de bruit en surveillant le carré moyen racine (RMS en μV). Pour l’enregistrement de pics propres, il est préférable que le seuil de pic neuronal soit d’au moins 5x RMS.
- Une fois l’installation terminée, sélectionnez le format de sortie du fichier.
REMARQUE: Ici, le pic neuronal CA1 a été enregistré au format .rhd. D’autres formats de fichiers (.rhs et .dat) peuvent également être sélectionnés pour correspondre aux formats de fichiers autorisés par le logiciel d’analyse.
7. Enregistrement et réglages optogénétiques in vivo
- Ouvrez le logiciel de contrôle d’impulsion (TTL) qui affiche divers paramètres d’impulsion réglables. Sélectionnez le port COM approprié sur le logiciel. Définissez les paramètres d’impulsion en ajustant les paramètres Train et Groupe.
REMARQUE : L’état du pouls doit être déterminé en tenant compte des variables expérimentales et de la conception. - Sur le logiciel du contrôleur de l’amplificateur, cliquez sur Exécuter pour détecter les pics neuronaux dans l’hippocampe ou la zone cérébrale souhaitée. Si nécessaire, ajustez la profondeur de l’électrode pour détecter les neurones viables et actifs.
- Une fois l’activité de tension extracellulaire détectée, observez les pics de base pendant 15 minutes et surveillez les signes vitaux de l’animal. Testez également l’impulsion lumineuse pour détecter les neurones réactifs dans le CA1 ou la région cible anatomique souhaitée.
REMARQUE: Vérifiez les artefacts photoélectriques et éliminez-les en ajustant l’intensité lumineuse ou la position de la fibre optique. - Enregistrez l’activité de base pendant environ 10 minutes avant de déclencher l’impulsion lumineuse à la fréquence souhaitée(Figure 5a, b). Cela permettra de comparer les taux de tir ou d’éclatement avec et sans éclairage.
REMARQUE: Dans la présente étude, l’activité de base a été enregistrée pendant 10 minutes sans éclairage, suivie d’un éclairage à 50 Hz (Film 1).
8. Analyse
- Convertissez le fichier .rhd au format de sortie Nex5.
- Traiter le nom du fichier. Nex5 dans un logiciel de tri hors ligne pour détecter les trains raster et les formes d’onde d’une seule unité (Figure 5a–b).
- Sélectionnez le canal souhaité dans la fenêtre déroulante.
REMARQUE: Les données de pointe enregistrées en continu peuvent être visualises dans une fenêtre séparée de l’OFSS. L’échelle de temps peut également être ajustée. Si une tétrode est utilisée, l’OFSS peut être réglé pour trier les 4 canaux en tant que tétrode. - Définissez le niveau de tension pour l’extraction de forme d’onde traversant le seuil.
ATTENTION : Utilisez un minimum de 5x RMS pour une détection correcte des pics. - Détectez les formes d’onde, puis effectuez le tri des pics à l’aide de la méthode de recherche de vallée (automatique) ou de K-moyennes (semi-automatique). Si nécessaire, fusionnez des unités qui occupent des régions similaires de l’espace d’analyse en composantes principales (PCA) 3D.
- Exporter trié . Fichiers Nex5 pour une analyse plus approfondie (Figure 5c–d).
REMARQUE : Les résultats de l’analyse de l’intervalle entre les tirs, de la cadence de tir et de la vitesse d’éclatement peuvent être exportés vers d’autres plates-formes d’analyse.
- Sélectionnez le canal souhaité dans la fenêtre déroulante.
9. Détection par fluorescence de l’expression de l’AAV
- Après l’enregistrement, euthanasier l’animal dans une chambre d’isoflurane.
- Effectuer une perfusion transcardique avec 10 mM de PBS (~10 mL), suivie de 4% de paraformaldéhyde tamponné au phosphate (PB-PFA, ~10 mL).
- Retirez tout le cerveau intact et fixez-le dans 4% de PB-PFA pendant 48 h.
- Transférer le cerveau fixe dans du PB-PFA à 4 % contenant 30 % de saccharose pour la cryoconservation à 4 °C. Après 72 h, section du cerveau dans un cryostat et monter des tranches sur une lame recouverte de gélatine.
REMARQUE: Dans le protocole actuel, des sections contenant la partie fermée de l’hippocampe (rostral) ont été sélectionnées pour démontrer les terminaux marqués AAV dans le DG, CA3 et CA1.
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Representative Results
Traçage antérograde
L’expression de l’AAV a été vérifiée par imagerie par immunofluorescence de la protéine rapporteure (eYFP) dans le VTA de souris C57BL/6 21 jours après l’injection(Figure 2). Le succès du étiquetage antérograde des projections présynaptiques de glutamate VTA dans l’hippocampe a également été vérifié par détection d’eYFP dans les couches de DG, CA3 et CA1 (Figure 6a–d; Film 2 et 3).
Les projections de glutamate VTA vers l’hippocampe modulent l’activité de CA1
La photostimulation des neurones VTA glutamate a augmenté l’activité des neurones CA1 pyramidaux putatifs. Ceci est évident comme une augmentation des événements de pic pendant la phase ON de la lumière (Film 1) par rapport à la phase OFF de la lumière (Figure 5a–b). Pour étayer ce résultat, la comparaison statistique des taux de déclenchement du réseau CA1 avant (lumière OFF; ligne de base) et après (lumière ON) photostimulation a révélé une augmentation significative pour la période post-stimulation (Figure 7a; p = 0,0002). Une analyse ultérieure du train raster pour détecter les sursauts (2 à 4 pics dans <16 ms) démontre également une augmentation du taux de rafale pour les neurones pyramidaux putatifs CA1 après photostimulation du glutamate VTA (Figure 7b; p = 0,0025). L’analyse statistique (Student’s t-test) a été effectuée avec un logiciel standard. Ici, la vitesse de déclenchement ou d’éclatement de base (light OFF) a été comparée aux valeurs de lumière ON (photostimulation).
Figure 1 : Illustration schématique de l’injection d’AAV-CaMKII-ChR2-eYFP dans le VTA de la souris C57BL/6.
Étiquetage antérograde des neurones VTA et des projections axonales vers l’hippocampe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images de fluorescence montrant l’expression AAV-CaMKII-ChR2-eYFP dans le VTA et la piste de fibre optique.
Dk: noyau de Darkschewitsch, scp: pédoncule cérébelleux supérieur, VTA: aire tegmentale ventrale et RM: noyau rétromamillaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Démonstration de la craniotomie, du placement des électrodes et du placement des fibres optiques.
(A) Incision médiane exposant le crâne (b: bregma, oc: os occipital). (B) Placement de la vis de terre (gs) dans l’os occipital et du fil de terre en acier inoxydable connecté (gw). (C) Positionnement stéréotaxique de la canule à fibre optique (foc: câble à fibre optique). (D) Positionnement stéréotaxique de la canule à fibre optique et de la tige de la sonde neurale (foc: câble à fibre optique, adp: adaptateur, ms: manchon d’accouplement, prs: tige de sonde, hs: étage de tête). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Connexion fractionnée BNC pour les horodatages combinés des impulsions lumineuses et de l’amplificateur (déclencheur).
(A) Démonstration de l’émission de lumière LED à partir de la pointe d’une canule à fibre optique. (B) Impulsion TTL à travers un adaptateur divisé BNC pour contrôler l’enregistrement de la LED et de l’amplificateur d’horodatage (ampl). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Train de pointes enregistré en continu (données brutes) avec détection d’une seule unité.
(A) Capture d’écran de l’enregistrement brut de l’hippocampe d’une souris anesthésisée. (B) Éclairage photo TTL du VTA dans l’enregistrement brut. Les lignes bleu clair montrent les horodatages des périodes Light ON (λ = 470 nm) et la fréquence de stimulation. (C–D) Unités de trains de pics et de neurones enregistrées en continu dérivées par tri de pointes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Images de fluorescence représentatives démontrant l’expression de l’AAV-CaMKII-ChR2-eYFP dans l’hippocampe.
(A) DG (GCL: couche cellulaire granulaire, hile: hilus). (B) Partie du CA3 proche de la DG (SL: stratum lacunosum, pyr: couche cellulaire pyramidale). (C) CA3 proprement dit. (D) CA1 (so: stratum oriens, pyr: couche cellulaire pyramidale, rad: stratum radiculata). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Comparaison statistique de la cadence de tir avant et après la photostimulation.
(A) Graphique à barres démontrant une augmentation de la vitesse de tir moyenne (Hz) pour les unités de neurones pyramidaux putatifs dans le CA1 (***p = 0,0002) après l’éclairage photo. (B) Graphique à barres démontrant une augmentation du taux de rafale pour les neurones CA1 putatifs après l’éclairage photo (**p = 0,0025). Barre d’erreur : erreur type de moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Film 1: Enregistrement de capture d’écran du contrôleur d’amplificateur et du logiciel d’impulsion. Le film montre l’enregistrement de base (lumière OFF) suivi de la photostimulation (lumière ON, λ = 470 nm) qui est indiquée par des horodatages bleus. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Film 2 et Film 3 : Illustration 3D de terminaux de glutamate VTA dans le DG d’une souris. DAPI-bleu: étiquette nucléaire dans la couche cellulaire granulaire (GCL); eYFP-Green: terminaux VTA étiquetés AAV dans le hilus DG. Veuillez cliquer ici pour télécharger ces vidéos.
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Discussion
Au cours de la dernière décennie, la conception des constructions AAV a considérablement progressé. En tant que tels, plus de promoteurs spécifiques aux neurones ont été incorporés dans un ensemble de sérotypes AAV pour améliorer la spécificité de transfection14. En combinant des gènes pour les protéines de fluorescence, les transporteurs, les récepteurs et les canaux ioniques, des bibliothèques d’AAV existent maintenant pour l’imagerie, la neuromodulation et la détection de l’activité synaptique. Dans les constructions AAV disponibles dans le commerce, une combinaison d’un fluorophore et de canaux ioniques génétiquement codés (opsine) permet un traçage neuroanatomique et électrophysiologique combiné des circuits neuronaux14,18,19. De même, la sélection d’un promoteur (ou méthode de recombinaison cre-lox) peut permettre le traçage de projections spécifiques à un type de neurone au sein d’un circuit. Dans la présente étude, ce protocole a été déployé pour l’évaluation anatomique et électrophysiologique des projections neuronales de glutamate VTA vers l’hippocampe (région CA1).
Circuit neuronal VTA-Hippocampe
Le VTA fait partie de la voie mésocorticyllabique du mésencéphale. Les projections VTA aux zones du cerveau impliquées dans l’apprentissage de la récompense et de l’aversion ont étélargement démontrées20,21,22 , 23,24,25. Alors que le VTA contient de la dopamine, du glutamate et des neurones GABA, la population de neurones dopaminergiques est anatomiquement dominante. Une fonction majeure de la VTA dans l’apprentissage de l’aversion et de la récompense est attribuée à une projection robuste de la dopamine VTA vers le noyau accumbens et le noyau raphé dorsal22,24,25,26,27,28. Bien que les neurones de la dopamine VTA et du glutamate se projettent vers l’hippocampe, la fonction des terminaux de glutamate VTA anatomiquement dominants est moins étudiée que celle des terminaux dopaminergiques VTA dans l’hippocampe29,30.
Le protocole actuel décrit l’utilisation d’une construction AAV5 hébergeant un fluorophore (eYFP) et une opsine contrôlée par la lumière (hChR2) pour la cartographie des terminaux VTA (glutamate) exprimant CaMKIIα dans l’hippocampe. Des études antérieures ont établi que les terminaux de glutamate VTA sont anatomiquement dominants dans l’hippocampe par rapport aux terminaux de dopamine VTA29. Pour démontrer les terminaux présynaptiques du glutamate VTA dans l’hippocampe, AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP a été transfecté dans les corps cellulaires neuronaux VTA. Cela a marqué les corps cellulaires des neurones de glutamate VTA (dans le VTA) et a décrit les terminaux de glutamate VTA dans les couches de l’hippocampe.
Bien que les terminaux présynaptiques du glutamate VTA innervent DG, CA3 et CA1, les résultats montrent des variations dépendantes de la couche pour ces trois régions(Figure 6a–d). Dans le DG, les terminaux de glutamate VTA marqués AAV sont anatomiquement dominants dans le hilus par rapport à la couche cellulaire granulaire. Dans le CA3, les terminaux de glutamate VTA sont relativement abondants dans la couche laconsum par rapport à la couche cellulaire pyramidale et à la strate oriens. Alors que dans le CA1, les terminaux de glutamate VTA innervent significativement les couches dendritiques (stratum oriens et radiatum) par rapport à la couche cellulaire pyramidale. Le résultat de cette étude démontre également que la photostimulation des corps cellulaires neuronaux du glutamate VTA module l’activité du réseau neuronal CA1 in vivo. La photostimulation des neurones du glutamate VTA a entraîné une augmentation significative de la vitesse de tir et de la vitesse d’éclatement de CA1 au cours de l’époque de la photostimulation(Figure 7a–b). Ceci est en accord avec la distribution anatomique des terminaux de glutamate VTA dans les couches dendritiques du CA1(Figure 6d)où il peut exercer des effets sur le codage de l’information hippocampique. À l’appui de cette observation, d’autres études ont montré que le VTA est un déterminant primaire du codage de la mémoire de travail hippocampique, et régule la sélection des informations à stocker dans la mémoire à long terme à travers la boucle VTA-hippocampe22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Considérations techniques
Pour mettre en œuvre avec succès ce protocole, le choix des constructions AAV doit être déterminé en fonction du type de neurone à cibler. Le chercheur doit identifier un promoteur approprié (un produit génique) qui est unique au type de neurone à cibler. Dans la présente étude, un promoteur CaMKIIα a été utilisé pour piloter l’expression de l’eYFP et de l’hChR2 dans les neurones exprimant CaMKIIα. Cependant, une méthode de recombinaison cre-lox peut également être utilisée. Dans ce cas, un AAV5 double floxé peut être exprimé dans le VTA des souris CaMKIIα-Cre. Les méthodes d’expression à base de promoteur et de cre-lox sont également applicables à d’autres types deneurones35,36,37.
Le système doit être vérifié pour le bruit électrique. Cela peut être fait en évaluant le RMS dans la portée du pic au cours d’une session d’enregistrement d’essai. Si nécessaire, le système et l’appareil stéréotaxique doivent être logés dans une cage de Faraday, tandis que le sol de l’amplificateur est connecté à la cage. Les sites de contact des électrodes peuvent être disposés linéairement ou une tétrode. Le choix de la conception de la sonde doit être déterminé en fonction de l’objectif de l’expérience. Un réseau linéaire détecte les neurones sur plusieurs couches. Des sondes avec différentes spécifications d’espacement (en microns) sont également disponibles dans le commerce. La longueur de la tige et la distance entre les sites de contact de la sonde doivent être prises en compte lors de la procédure d’enregistrement et pour l’analyse. Lorsque la configuration est terminée, l’impulsion lumineuse doit être vérifiée lors d’un enregistrement d’essai pour éliminer les artefacts photoélectriques. Cela peut également être optimisé en ajustant la position de l’électrode par rapport à la profondeur et à l’emplacement de la fibre optique.
Limitations
Bien que CaMKIIα soit exprimé principalement dans les neurones libérant du glutamate, la protéine est également présente dans certaines populations de neurones dopaminergiques qui co-libèrent du glutamate. Ainsi, l’utilisation d’AAV5-CaMKIIα marquera principalement les neurones du glutamate et certains neurones dopaminergiques qui expriment CaMKIIα. Les protocoles de photostimulation pilotés par LED sont abordables et peuvent être facilement assemblés. Cependant, il est important de noter qu’un protocole de photostimulation piloté par laser est plus efficace38,39,40. La solution d’AAV injectée dans la même région du cerveau pour différents animaux donne des seuils d’expression variables. Cependant, attendre 3 semaines ou plus après l’injection peut réduire cette variation en permettant une transfection optimale. La solution d’AAV injectée dans une région du cerveau peut également se diffuser dans les zones cérébrales environnantes. L’observation de la période d’attente après l’abaissement de l’aiguille et entre les injections de bolus peut réduire la diffusion de la solution d’AAV à partir du site d’injection.
En résumé, cette méthode peut être utilisée pour tracer les circuits neuronaux dans le cerveau des rongeurs. Bien que le protocole actuel décrive le traçage in vivo des circuits neuronaux chez les souris anesthésiées, la procédure peut également être déployée pour l’enregistrement chronique chez les souris au comportement éveillé.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est financé par la subvention de transition de la SCS accordée à OOM. OOM, PAA et AS ont conçu l’étude et effectué les expériences. AS et PAA ont analysé les résultats. OOM et PAA ont préparé le manuscrit. Nous remercions le Dr Karl Disseroth (Université de Stanford) d’avoir mis l’AAV à notre disposition.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
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