Summary
يوضح البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لتتبع إسقاطات الغلوتامات للمنطقة البطنية (VTA) إلى قرن آمون. تم الجمع بين التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA مع تسجيل CA1 لإظهار كيفية محطات الغلوتامات VTA تعدل CA1 معدل إطلاق الهرمي المفترض في الجسم الحي.
Abstract
وقد سمح التشكيل البصري للخلايا العصبية الفرعية في الدماغ للباحثين بتشريح الدوائر العصبية في الجسم الحي وفيفو السابق. وهذا يوفر فرضية لتحديد دور أنواع الخلايا العصبية داخل الدائرة العصبية، وأهميتها في ترميز المعلومات بالنسبة للتعلم. وبالمثل، يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار الأهمية الفسيولوجية لاثنين أو أكثر من مناطق الدماغ المتصلة في الحيوانات المستيقظة والمخدرة. توضح الدراسة الحالية كيف تعدل الخلايا العصبية الغلوتامات VTA معدل إطلاق الخلايا العصبية الهرمية المفترضة في CA1 (قرن آمون) من الفئران المخدرة. يستخدم هذا البروتوكول الوسم المرتبط بالفيروسات (AAV) المعتمد على VTA الخلايا العصبية الغلوتامات لتتبع محطات الغلوتامات المبتسرة في طبقات قرن آمون. التعبير عن الأوبسين التي تسيطر عليها الضوء (channelrhodopsin; hChR2) وبروتين الفلورية (eYFP) التي تؤويها ناقلات AAV يسمح تتبع أنتيروزغراد من محطات الغلوتامات VTA, والتشويه الضوئي من VTA الجلوتامات الخلايا العصبية الهيئات (في VTA). تم وضع أقطاب السيليكون الحادة عالية المقاومة في CA1 للكشف عن استجابات متعددة الوحدات ووحدة واحدة للتحوير الضوئي VTA في الجسم الحي. تظهر نتائج هذه الدراسة التوزيع المعتمد على الطبقة لمحطات الغلوتامات VTA المشبكية في قرن آمون (CA1 و CA3 و DG). أيضا، فإن التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA زيادة معدل إطلاق النار وانفجار وحدات هرمية CA1 المفترضة في الجسم الحي.
Introduction
في العقد الماضي، تم تطوير مجموعة من الأدوات الوراثية لزيادة خصوصية التشكيل من نوع الخلايا العصبية، ورسم خرائط الشبكات العصبية المعقدة1. وتجدر الإشارة إلى أن الفيروسات العصبية ذات القدرة المتأصلة على العدوى والتكاثر في الخلايا العصبية قد تم نشرها للتعبير عن أو إلغاء بروتينات محددة في الأنواع الفرعية من الخلايا العصبية. عند إيواء البروتينات الفلورية أو مؤشرات النشاط المتشابك المشفرة وراثيا ، تسمية ناقلات AAV المصابة وتحديد الشبكات العصبية عبر مناطق الدماغ2،3. اختيار المروج في بناء AAV يوجه التعبير عن المتجه في أنواع الخلايا العصبية مع مستوى معين من خصوصية (التعبيرالمعتمد على المروج). ومع ذلك، من خلال إعادة تركيب Cre-lox، يتم نشر بناء AAV مع خصوصية أكبر لوضع العلامات العصبية4،5 ،6،7. من الجدير بالذكر، يمكن التعبير عن opsins الميكروبية النشطة ضوئيا والبروتينات الفلورية المعبأة في ناقلات AAV في الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا العصبية8،وهي مثالية للتصوير، وتتبع الدوائر من نوع الخلايا العصبية، والتحوير الضوئي9،10.
AAVs يبني حقن مجسمة في منطقة الدماغ (أو نواة) يدفع التعبير عن البروتين مراسل في سوما، dendrite، ومحطات المحاور. التعبير العصبي للAV إيواء الجينات مراسل (eYFP) يسهل وضع العلامات على أجسام الخلايا العصبية وتتبع التشريحية من التوقعات من وإلى مناطق الدماغ الأخرى11,12,13,14. AAV-eYFP يبني تحمل opsin الضوء التي تسيطر عليها (على سبيل المثال، hChR2)، يمكن نشرها كأداة للتصوير6،15 والتحفيز القائم على تتبع الفسيولوجية من التوقعات العصبية لاستهداف مناطق الدماغ في الجسم الحي16. اعتمادا على النمط المصلي AAV، قد يكون اتجاه وضع العلامات العصبية قبل التحلل أوالرجعية 11،12. وقد أثبتت الدراسات السابقة أن AAV5 يسافر anterogradely في الخلايا العصبية12. وهكذا، فإن التحفيز الضوئي لأجسام الخلايا التي تعبر عن hChR2 ينتج تأثيرات متبصرة في مكان آخر في الدماغ (الهدف)17.
هنا، تم استخدام AAV (النمط المصلي 5) مع المروج CaMKIIα للتعبير عن eYFP (مراسل) وhChR2 (opsin) في الخلايا العصبية الغلوتامات VTA والتوقعات المحورية. تظهر نتائج هذه الدراسة التوزيع المعتمد على الطبقة لمحطات VTA-glutamate presynaptic في مناطق CA1 و CA3 و DG فرس النهر. أيضا، زيادة التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA CA1 متعددة وحدة ووحدة واحدة معدلات إطلاق النار في الجسم الحي بالمقارنة مع القيم الأساسية. يستخدم هذا البروتوكول أدوات ميسورة التكلفة وبرامج متاحة تجاريا يمكن أن تزيد من جودة البيانات التي تم الحصول عليها من تجارب تتبع الدوائر العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية والتعامل مع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) التابعة لكلية الطب البيطري بجامعة ولاية لويزيانا.
1. الحيوان التجريبي
- استخدام الفئران 5-6 أسابيع من العمر.
- منزل 3-5 الحيوانات في قفص في ظل ظروف قياسية من 12 ساعة بالتناوب الضوء ودورة الظلام. وينبغي توفير الغذاء والماء ل libitum الإعلانية.
2. استئصال القحف وإعداد الحيوان
ملاحظة: يصف هذا القسم الإجراءات قبل و peri-operative لعملية استئصال القرنية الماوس. استخدام جهاز مجسم القياسية والإحداثيات المناسبة (أنتيروبوستيريور: AP, Mediolateral: ML, ودورسوفنترال: DV). الرجوع إلى أطلس دماغ الماوس لتحديد الإحداثيات لمنطقة الدماغ ذات الاهتمام.
- تخدير الفئران عن طريق الكيتامين داخل الصفاق (100 ملغم /كجم) / xylazine (10 ملغ / كجم) حقن كوكتيل. إجراء اختبار قرصة إصبع القدم لضمان عدم وجود إحساس قبل بدء الجراحة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أيضا استخدام التخدير Isoflurane مع غرفة الأنف المناسبة لهذه الخطوة. - إصلاح بلطف رأس الحيوان على جهاز ستيريوتاكسيك.
ملاحظة: من المهم التعامل مع الحيوانات بحذر أثناء هذه العملية. أيضا، تحقق من معدل التنفس والحيوية الأخرى قبل الشروع في الجراحة. السماح للحيوان للراحة لمدة ~ 7 دقائق للحد من التوتر.- ضع وسادة تدفئة على الإطار المجسم بحيث يرقد جسم الحيوان عليه. وهذا سوف يساعد على الحفاظ على درجة حرارة الجسم والحفاظ على الحيوان دافئة على الرغم من خارج الإجراء. احتفظ بوسادة التدفئة للرعاية بعد الجراحة والتعافي.
- استخدم مقصا لإزالة الشعر فوق فروة الرأس وتنظيف البشرة بمحلول اليود.
- تطبيق الليدوكائين الموضعي لمنع الإحساس على فروة الرأس.
- استخدم مشرطا لإجراء شق فروة رأس متوسط يمتد من الجبهة إلى المنطقة القذالية.
- تنظيف منطقة شق مع محلول اليود، ثم فضح الجلفاريا.
ملاحظة: يمكن تطبيق كمية صغيرة من محلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لإزالة البيريوستيوم من الجلفاريا. وهذا سيزيد من رؤية المعالم (البريغما وال لامدا) والغرز. - باستخدام أطلس مجسمة الدماغ الماوس، وتحديد AP وML إحداثيات نسبة إلى bregma.
- لحقن VTA، ضع حقنة إبرة حادة الدقة (على سبيل المثال، حقنة الأعصاب) في الإحداثيات AP: -3.08 مم/مل: 0.5 مم نسبة إلى البريغما.
- استخدم أداة حفر لحفر ثقب 1 مم (استئصال القحف) في الجمجمة عند تنسيق AP/ML المميز.
ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة مستوى كبير من الحذر. وينبغي تطبيق الحد الأدنى من الضغط أثناء الحفر لمنع بت الحفر من سحق أنسجة الدماغ. في الدراسة الحالية، كان بت الحفر 0.8 ملم وتم تعيين سرعة الحفر إلى 15،000 دورة في الدقيقة.
تنبيه: إذا تم استخدام بيروكسيد الهيدروجين في تنظيف الشق أو الجلجلة، فتأكد من الإزالة الكاملة للمحلول أو اسمح بالجفاف الكامل قبل الحفر.
3. AAV كوكتيل حقن
ملاحظة: يصف هذا القسم عملية حقن AAV في VTA للفئران C57BL/6 البالغة (23-27 جرام). يمكن استخدام الطريقة الموصوفة لحقن AAV في أي منطقة من مناطق الدماغ باستخدام جهاز مجسم قياسي وإحداثيات مناسبة. لإثبات هذا البروتوكول، تم التعبير عن eYFP و hChR2 في الخلايا العصبية الغلوتامات VTA باستخدام العدوى AAV5 بوساطة تحت المروج CaMKIIα (الشكل 1). يمكن أيضا استخدام إعادة تركيب Cre-lox لهذه الخطوة.
- تركيب حقنة مع إبرة حادة فائقة الدقة (32 G; 5 قدرة μL مع دقة 100 nL) على حاقن. إصلاح حامل الحقنة على ميكرومانيبولاتور.
ملاحظة: لهذا الإجراء، تم استخدام حامل حقنة يدوية، مع معايرة 1.6 nL. ويمكن أيضا استخدام حاقن الآلي. - ملء الحقنة بالماء المقطر مزدوجة لتنظيف واختبار تدفق السوائل.
- تذوب aliquots من AAV (النمط المصلي 5) كوكتيل على الجليد. يتم تخزين أفضل AAVs في -80 درجة مئوية للحفاظ على التيتر الفيروسي للتعبير الجيد.
- املأ المحاقن المركبة ب 1000 nL من محلول AAV (10 mM في محلول ملحي عازل بالفوسفات (PBS)، درجة الحموضة 7.4). الاستغناء عن 10 nL من محلول AAV لتأكيد تدفق السائل قبل خفض الإبرة في موقع الحقن.
- استخدام micromanipulator لخفض الإبرة مجسمة في العمق المطلوب (DV تنسيق). بعد خفض الإبرة إلى العمق المطلوب، اسمح للمحقنة بالبقاء في مكانها لمدة 10 دقائق قبل الحقن.
ملاحظة: لهذا الإجراء، تم تخفيض الإبرة في VTA على عمق (DV) من 4.5 مم من سطح الظنس في الدماغ. بالنسبة لمناطق الدماغ الأخرى، استخدم التنسيق الظهري المناسب (راجع أطلس دماغ الماوس). - حقن 600-800 nL من AAV في VTA. يمكن تعديل حجم الحقن اعتمادا على حجم الموقع المستهدف.
- تقديم حل AAV بمعدل 60 nL/min (فاصل زمني 3 دقائق).
- للتعبير عن eYFP و hChR2 في الخلايا العصبية الغلوتامات VTA والتوقعات، حقن AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام طريقة إعادة التركيب Cre-lox اعتمادا على هدف التجربة. - السماح للإبرة أن تبقى في مكانها لمدة 15 دقيقة بعد حقن AAV. وهذا من شأنه أن يقلل من الانتشار والتدفق الخلفي.
- سحب إبرة الحقنة، ومن ثم خياطة شق لإغلاق الجرح.
- إعطاء المضادات الحيوية والتسكين كجزء من الرعاية بعد الجراحة. ضع الماوس على منصات مبطنة دافئة وراقب الحيوان حتى يستيقظ.
ملاحظة: بعد 3 أسابيع من الحقن، يمكن ملاحظة تعبير AAV عن طريق الكشف الفلوري عن بروتين المراسل (eYFP) في أقسام دماغ الماوس. أيضا، يمكن إجراء تجارب التحفيز الضوئي بعد 3 أسابيع(الشكل 2).
4. إعداد التسجيلات العصبية في الجسم الحي مع optogenetics
ملاحظة: يصف هذا القسم خطوات التسجيل العصبي الحاد مع التتبع البصري لدائرة الدماغ (إسقاط الخلايا العصبية الغلوتامات VTA إلى CA1). إذا لزم الأمر، تحقق من النظام (مكبر للصوت والاتصالات) للضوضاء الكهربائية وقضايا التأريض قبل البدء في هذه الخطوة. يمكن أن يساعد تنفيذ هذه الخطوة في قفص فاراداي في القضاء على الضوضاء الكهربائية في التسجيل.
- في 3 أسابيع بعد حقن AAV، تخدير الفئران عن طريق حقن يوريثان داخل الصفاق (0.2 ملغم /كجم).
تنبيه: يوريثان مسرطن ويجب التعامل معه بحذر أثناء ارتداء معدات الحماية. أيضا, إعطاء التخدير يوريثان في هذا التركيز هو عدم البقاء على قيد الحياة. - لصق رأس الحيوان على إطار مجسم كما هو موضح سابقا (الخطوة 2.2، الشكل 3A). إجراء عملية استئصال القحف لفضح دورا (الشكل 3A). استخدم أداة الحفر (حجم البت: 0.8 مم، السرعة: 15000 دورة في الدقيقة) لإزالة جزء من العظم الجداري.
- يجب أن يكون طول القحف حوالي 3 مم × 4 مم. ضعي قطرات السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) فوق هذه المنطقة لمنع الجفاف.
- تحت المجهر تشريح (الرقمية) ، واستخدام طرف إبرة عازمة (27 غرام) لاستئصال دورا المكشوفة. يجب الحرص على عدم سحب بعيدا غطاء الظنس الحساس والأنسجة القشرية في هذا المجال.
- تحمل ثقبا في عظم القذالي (حجم بت: 0.8 ملم، والسرعة: 10،000 دورة في الدقيقة) لعقد المسمار الأرض (عموم رئيس فيليبس المسمار؛ M0.6 × 2.0 مم).
- قم بتوصيل سلك أرضي من الفولاذ المقاوم للصدأ.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أنواع أخرى من الأسلاك(الشكل 3ب). - للتحفيم الضوئي المشترك (VTA) والتسجيل العصبي (CA1)، استخدم جهازا ستيريوتاكويك متعدد السكك الحديدية مزودا بأجهزة دقيقة فائقة الدقة (10 ميكرومتر أو 1 ميكرومتر). تركيب الألياف البصرية وتسجيل المسبار العصبي على نطاق 10 ميكرومتر و 1 ميكرومانيبواتور 1 ميكرومتر، على التوالي.
- إذا لزم الأمر، استخدم محول مسبار مرحلة الرأس(الشكل 3c).
ملاحظة: في البروتوكول الحالي، تم تركيب مرحلة رأس 32 قناة مع محول لعقد قطب تسجيل 4 قنوات(الشكل 3D). تم لحام السلك الأرضي الفولاذ المقاوم للصدأ إلى منفذ الاتصال الأرضي للمحول.
- إذا لزم الأمر، استخدم محول مسبار مرحلة الرأس(الشكل 3c).
- في تنسق AP: -3.08 ملم مل: 0.5 ملم، وانخفاض الألياف البصرية قطرها 400 ميكرومتر في VTA.
- قبل خفض الألياف البصرية، قم بتوصيل النمس بكابل ألياف بصرية (مع الفولاذ المقاوم للصدأ أو الحديد الخزفي) المرتبط بمصدر LED مقترن بالألياف.
ملاحظة: تأكد من تعيين كثافة الضوء والتركيز على النحو المطلوب. اختيار مصدر ضوء LED يجب أن تتوافق مع opsins يجري استهدافها. هنا، تم استخدام 470 نانومتر (الضوء الأزرق) سائق الصمام لhChR2 الضوئي(الشكل 4a). - لمزامنة نبض الضوء مع التسجيل العصبي، قم بتوصيل برنامج تشغيل LED ومنفذ وحدة التحكم الرقمية IN بمنفذ ترانزستور ترانزستور (TTL) نبض(الشكل 4ب). ويمكن تحقيق ذلك باستخدام مقسم BNC.
ملاحظة: يوفر استخدام نبضات TTL مرونة ضبط تردد ومدة قطار النبض المطلوبين رقميا. في البروتوكول الحالي، تم تشغيل نبضات الضوء 10 مللي ثانية في 50 هرتز18. للتحكم TTL من برنامج تشغيل LED، قم بتبديل برنامج التشغيل إلى "المشغل". في هذا الوضع، يمكن تنظيم كثافة الضوء عن طريق تحويل "مقبض الباب". ويمكن تعديل تردد التحفيز لاستيعاب المتغيرات التجريبية ويمكن أن يتراوح من 1 إلى 100 هرتز. لتتبع الدائرة العصبية، ينصح بتردد تحفيزي >20 هرتز. - ضبط مقبض لتحديد كثافة فعالة يمكن أن تولد استجابة دون إنتاج التحف الكهروضوئية. إذا لزم الأمر، وإعادة وضع الألياف البصرية للقضاء على القطع الأثرية19.
ملاحظة: ينتج برنامج تشغيل LED المستخدم للبروتوكول الحالي طاقة خفيفة بقوة ~21.8 ميجاوات.
- قبل خفض الألياف البصرية، قم بتوصيل النمس بكابل ألياف بصرية (مع الفولاذ المقاوم للصدأ أو الحديد الخزفي) المرتبط بمصدر LED مقترن بالألياف.
5. تسجيل العصبية
- استخدم مسبارا عصبيا حادا مع ساق سمكه 15-50 ميكرومترا، يبلغ طوله 5 ملم على الأقل.
ملاحظة: التسجيل من هياكل الدماغ العميقة سيتطلب تحقيقات عصبية مع ساق أطول. في الدراسة الحالية، تم استخدام مسبار بطول ساق 20 ملم. - قم بتوصيل مرحلة رأس ما قبل مكبر الصوت بوحدة التحكم في التسجيل عبر كابل واجهة طرفية تسلسلية (SPI). تحقق من إضاءة ألوان المصابيح على منافذ وحدة تحكم التسجيل. تشير المصابيح الخضراء والصفراء إلى الجهد المناسب على لوحة مكبر الصوت المتصلة. يشير أحمر LED إلى عنصر تحكم مرحلة رأس البرنامج العامل(الشكل 5ب).
- باستخدام المتلاعب الدقيق، ضع مواقع الاتصال بالقطب الكهربائي في طبقة الخلية الهرمية للCA1 (AP: -1.94 مم، ML: +1.0 مم، DV: +1.1 إلى 1.2 مم).
ملاحظة: يمكن وضع الألياف البصرية والقطب الكهربائي في مناطق الدماغ الأخرى المرغوبة للتحفيم الضوئي والتسجيل.
6. إعدادات مكبر الصوت والمرشح
- قم بتوصيل نظام مكبر صوت وحدة تحكم التسجيل بجهاز كمبيوتر من خلال منفذ USB 3.0. قم بتوصيل مرحلة الرأس بالمكبر باستخدام كابل SPI. تشغيل برنامج وحدة التحكم. إذا لم يتم توصيله بشكل صحيح، سيعرض النظام رسالة "لم يتم العثور على الجهاز".
- انقر فوق تشغيل لعرض النشاط على القنوات. يتم رسم كل شكل موجي كجهد (محور ص) مقابل الوقت (المحور س). اعتمادا على المنطقة ذات الاهتمام، قم بضبط مقياس الجهد والوقت لضبط العرض الموجي.
- إذا كانت قنوات قليلة فقط نشطة، قم بتعطيل القنوات غير المستخدمة لتقليل حجم الملف على قرص التخزين.
- تعيين معدل أخذ العينات وترددات القطع عن طريق تحرير معلمات عرض النطاق الترددي على برنامج الاستحواذ. لتسجيل وحدة واحدة، تعيين الترددات قطع العلوي والسفلي إلى 300 هرتز و 5000 هرتز على التوالي. تغيير معدل أخذ العينات مكبر للصوت إلى 30 kS/s.
ملاحظة: سيؤدي اختيار معدل أخذ عينات عالي إلى إنتاج حجم ملف أكبر. - قبل التسجيل، تحقق من سلامة قنوات القطب الكهربائي عن طريق قياس المعاوقة عند 1000 هرتز. ويمكن القيام بذلك عن طريق إطلاق وظيفة في واجهة المستخدم (برنامج وحدة تحكم). يجب أن يكون لقناة العمل قيمة مقاومة تتراوح من 0.1 إلى 5 MΩ.
- إذا كان إخراج الصوت (مكبر الصوت) متصلا بمنفذ تناظري OUT، فاضبط المكسب والكاتم للحصول على صوت الارتفاع الأمثل.
- لعرض علامة قطار نبض TTL في تسجيل الارتفاع، قم بتمكين الشاشة لعلامة DIGITAL IN. لتسجيل الطابع الزمني قطار النبض تمكين عرض قناة DIGITAL IN قبل التجربة الرئيسية.
ملاحظة: عادة ما يكون هناك أكثر من قناة "DIGITAL IN" (1 أو 2). تأكد من توصيل كبل BNC من جهاز نبض TTL بمنفذ "DIGITAL IN" المحدد للعرض في برنامج وحدة تحكم التسجيل. - لعرض الموجي ارتفاع في الوقت الحقيقي، افتح إطار نطاق spike وتعيين عتبة باستخدام النقر بالماوس.
- فحص مستوى الضوضاء من خلال رصد الجذر متوسط مربع (RMS في μV). لتسجيل ارتفاع نظيفة، فمن المفضل أن عتبة ارتفاع العصبية هو على الأقل 5x RMS.
- بمجرد اكتمال الإعداد، حدد تنسيق إخراج الملف.
ملاحظة: هنا، تم تسجيل ارتفاع CA1 العصبية في شكل .rhd. يمكن أيضا تحديد تنسيقات الملفات الأخرى (.rhs و .dat) لمطابقة تنسيقات الملفات المسموح بها بواسطة برنامج التحليل.
7. في تسجيل فيفو البصرية والإعدادات
- افتح برنامج التحكم في النبض (TTL) الذي يعرض معلمات نبض قابلة للتعديل. حدد منفذ COM المناسب على البرنامج. تعيين معلمات النبض عن طريق ضبط إعدادات القطار والمجموعة.
ملاحظة: يجب تحديد حالة النبض من خلال النظر في المتغيرات التجريبية والتصميم. - على برنامج وحدة تحكم مكبر للصوت، انقر فوق تشغيل للكشف عن المسامير العصبية في قرن آمون أو منطقة الدماغ المطلوبة. إذا لزم الأمر، ضبط عمق القطب للكشف عن الخلايا العصبية قابلة للحياة ونشطة.
- بمجرد اكتشاف نشاط الجهد خارج الخلية ، لاحظ طفرات خط الأساس لمدة 15 دقيقة وراقب حيوية الحيوان. أيضا، اختبار نبض الضوء للكشف عن الخلايا العصبية استجابة داخل CA1 أو المنطقة المستهدفة التشريحية المطلوبة.
ملاحظة: تحقق من وجود قطع أثرية كهربائية ضوئية والقضاء عليها عن طريق ضبط كثافة الضوء أو موضع الألياف البصرية. - سجل النشاط الأساسي ل ~ 10 دقيقة قبل تشغيل نبض الضوء في التردد المطلوب(الشكل 5a، b). وهذا سيسمح للمقارنة بين معدلات إطلاق النار أو انفجار مع وبدون إضاءة.
ملاحظة: في الدراسة الحالية، تم تسجيل النشاط الأساسي لمدة 10 دقائق دون إضاءة، تليها الإضاءة في 50 هرتز(فيلم 1).
8. تحليل
- تحويل الملف.rhd إلى تنسيق الإخراج Nex5.
- اسم ملف العملية. Nex5 ملف في برنامج الفرز حاليا للكشف عن وحدة واحدة القطارات النقطية وأشكال الموجات(الشكل 5أ ب).
- حدد القناة المطلوبة من النافذة المنسدلة.
ملاحظة: يمكن عرض بيانات spike المسجلة باستمرار على إطار منفصل من OFSS. ويمكن أيضا تعديل المقياس الزمني. إذا تم استخدام tetrode، يمكن تعيين OFSS لفرز القنوات 4 ك tetrode. - تعيين مستوى الجهد لاستخراج عتبة عبور الموجي.
تنبيه: استخدم الحد الأدنى من 5x RMS للكشف عن المسامير المناسبة. - الكشف عن الأشكال الموجية، ثم إجراء فرز ارتفاع باستخدام وادي تسعى (التلقائي) أو K-يعني (شبه التلقائي) الأسلوب. عند الضرورة، دمج الوحدات التي تشغل مناطق مشابهة من مساحة تحليل المكونات الأساسية ثلاثية الأبعاد (PCA).
- تصدير مفروز . Nex5 ملفات لمزيد من التحليل (الشكل 5ج د).
ملاحظة: يمكن تصدير نتائج التحليل للفاصل الزمني بين البينية ومعدل الإطلاق ومعدل الاندفاع إلى منصات تحليل أخرى.
- حدد القناة المطلوبة من النافذة المنسدلة.
9. الكشف عن الفلورية للتعبير AAV
- بعد التسجيل، قتل الحيوان في غرفة isoflurane.
- أداء التغلغل عبر القلب مع 10 MM PBS (~ 10 مل)، تليها 4٪ الفوسفات العازلة paraformaldehyde (PB-PFA، ~ 10 مل).
- إزالة الدماغ كله سليمة وإصلاحه في 4٪ PB-PFA لمدة 48 ساعة.
- نقل الدماغ الثابت إلى 4٪ PB-PFA تحتوي على 30٪ سكروز لحفظ التبريد عند 4 درجة مئوية. بعد 72 ساعة، قسم الدماغ في cryostat وجبل شرائح على شريحة مغلفة الجيلاتين.
ملاحظة: في البروتوكول الحالي، تم اختيار المقاطع التي تحتوي على الجزء المغلق من الحصين (rostral) لإظهار المحطات الطرفية المسماة AAV في DG وCA3 وCA1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تتبع أنتيروغراد
تم التحقق من التعبير AAV عن طريق التصوير immunofluorescence من البروتين مراسل (eYFP) في VTA من C57BL/6 الفئران 21 يوما بعد الحقن (الشكل 2). كما تم التحقق من وضع علامات سابقة للتحلل الناجح لتوقعات الغلوتامات VTA presynaptic في قرن آمون من خلال الكشف عن eYFP في طبقات من DG، CA3، وCA1 (الشكل 6a-d; فيلم 2 و 3).
توقعات الغلوتامات VTA إلى الحصين تعدل نشاط CA1
التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA زيادة نشاط الخلايا العصبية CA1 الهرمية المفترضة. وهذا واضح كزيادة في الأحداث التصاعد خلال مرحلة الضوء على (فيلم 1) بالمقارنة مع ضوء OFF المرحلة (الشكل 5أ ب). ولدعم هذه النتيجة، كشفت المقارنة الإحصائية لمعدلات إطلاق شبكة CA1 قبل (الضوء إيقاف التشغيل؛ خط الأساس) وبعد التحفيز الضوئي (LIGHT ON) عن زيادة كبيرة لفترة ما بعد التحفيز(الشكل 7a؛ p = 0.0002). تحليل لاحق للقطار النقطية للكشف عن رشقات نارية (2-4 طفرات في <16 مللي ثانية) يوضح أيضا زيادة معدل انفجار للخلايا العصبية الهرمية CA1 المفترضة بعد التحفيز الضوئي الغلوتامات VTA (الشكل 7b; p = 0.0025). تم إجراء التحليل الإحصائي (اختبار الطالب t)باستخدام برنامج قياسي. هنا، تمت مقارنة معدل إطلاق النار أو الانفجار الأساسي (LIGHT OFF) بقيم LIGHT ON (التحفيز الضوئي).
الشكل 1: رسم تخطيطي لحقن AAV-CaMKII-ChR2-eYFP في VTA من الماوس C57BL/6.
وضع العلامات Anterograde من الخلايا العصبية VTA والتوقعات المحورية إلى قرن آمون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور مضان تظهر AAV-CaMKII-ChR2-eYFP التعبير في VTA، ومسار الألياف البصرية.
DK: نواة Darkschewitsch، scp: peduncle المخيخ متفوقة، VTA: منطقة تيغمنتال البطنية، وجمهورية مقدونيا: نواة الرجعية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عرض توضيحي لاستئصال القحف، ووضع القطب الكهربائي، ووضع الألياف البصرية.
(أ) شق خط الوسط تعريض الجمجمة (ب: بريغما، أوك: عظم القذالي). (ب) وضع المسمار الأرض (غ) في عظم القذالي والأسلاك الصلب المقاوم للصدأ متصلة الأرض (gw). (ج) تحديد المواقع المجسمة من قنية الألياف البصرية (foc: كابل الألياف البصرية). (D) تحديد المواقع المجسمة من قنية الألياف البصرية وساق التحقيق العصبي (فوك: كابل الألياف البصرية، adp: محول، MS: التزاوج كم، PRS: ساق التحقيق، ح: مرحلة الرأس). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: BNC تقسيم الاتصال للنبض الضوء مجتمعة ومكبر للصوت (الزناد) الطوابع الزمنية.
(أ) مظاهرة من انبعاثات ضوء LED من غيض من قنية الألياف البصرية. (B) نبض TTL من خلال محول تقسيم BNC للتحكم في تسجيل مكبر صوت الطوابع الزمنية (ampl) LED والوقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قطار المسامير المسجل باستمرار (البيانات الأولية) مع الكشف عن وحدة واحدة.
(أ) Screengrab من تسجيل الخام من قرن آمون من الماوس تخدير. (ب) إضاءة الصورة TTL يحركها من VTA في التسجيل الخام. خطوط زرقاء فاتحة توضح الطوابع الزمنية لفترات Light ON (λ = 470nm) وتكرار التحفيز. (C-D) سجلت باستمرار ارتفاع القطار ووحدات الخلايا العصبية المستمدة من الفرز ارتفاع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور مضان تمثيلية توضح التعبير عن AAV-CaMKII-ChR2-eYFP في قرن آمون.
(أ) DG (GCL: طبقة الخلية الحبيبية، هيل: هيلوس). (ب) جزء من CA3 بالقرب من DG (SL: طبقة لاكونوسوم، بير: طبقة الخلية الهرمية). (ج)CA3 السليم. (D) CA1 (لذلك: طبقة oriens، المحرقة: طبقة الخلية الهرمية، راد: الطبقة الراديكالاتا). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: المقارنة الإحصائية لمعدل إطلاق النار قبل وبعد التحفيز الضوئي.
(أ) الرسم البياني شريط يدل على زيادة متوسط معدل اطلاق النار (هرتز) لوحدات الخلايا العصبية الهرمية المفترضة في CA1 (*** ع = 0.0002) بعد إضاءة الصورة. (ب) شريط الرسم البياني مما يدل على زيادة معدل انفجار الخلايا العصبية CA1 المفترضة بعد إضاءة الصورة (** ع = 0.0025). شريط الخطأ: خطأ قياسي في المتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1: تسجيل Screengrab من وحدة تحكم مكبر للصوت وبرنامج نبض. الفيلم يوضح تسجيل خط الأساس (ضوء إيقاف) تليها التحفيز الضوئي (ضوء ON, λ = 470 نانومتر) التي يشار إليها مع الطوابع الزمنية الزرقاء. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
الفيلم 2 والفيلم 3 : 3D التوضيح من محطات الغلوتامات VTA في DG من الماوس. DAPI-الأزرق: التسمية النووية في طبقة الخلية الحبيبية (GCL)؛ eYFP-Green: محطات AAV المسماة VTA في هيلوس DG. يرجى الضغط هنا لتحميل هذه الفيديوهات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في العقد الماضي ، تقدم تصميم بنى AAV بشكل كبير. على هذا النحو، تم دمج المزيد من المروجين الخلايا العصبية محددة في مجموعة من الأنماط المصلية AAV لتحسين خصوصية العدوى14. من خلال الجمع بين الجينات للبروتينات الفلورية، والنقل، والمستقبلات، والقنوات الأيونية، توجد الآن مكتبات AAV للتصوير، والتشكيل العصبي، والكشف عن النشاط متشابك. في البنى AAV المتاحة تجاريا ، يسمح مزيج من الفلوروفور المشفر وراثيا والقنوات الأيونية (opsin) بتتبع الأعصاب والفيزيولوجيا الكهربية المشتركة للدوائر العصبية14و18و19. وبالمثل، فإن اختيار المروج (أو طريقة إعادة تركيب cre-lox) يمكن أن يسمح بتتبع إسقاطات نوع الخلايا العصبية المحددة داخل الدائرة. في الدراسة الحالية، تم نشر هذا البروتوكول للتقييم التشريحي والكهربائي للتوقعات العصبية الغلوتامات VTA إلى قرن آمون (CA1 المنطقة).
الدائرة العصبية VTA-قرن آمون
وVTA هو جزء من المسار المتوسط mesocorticolimbic. وقد أظهرت توقعات VTA لمناطق الدماغ المشاركة في مكافأة والنفور التعلم على نطاق واسع20،21،22،23،24،25. في حين أن VTA يحتوي على الدوبامين, الغلوتامات, والخلايا العصبية GABA, السكان الخلايا العصبية الدوبامين هي المهيمنة تشريحيا. ويعزى وظيفة رئيسية من VTA في النفور ومكافأة التعلم إلى إسقاط الدوبامين VTA قوية لنواة accumbens ونواة رافالظهرية 22,24,25,26,27,28. على الرغم من أن VTA الدوبامين والغلوتامات الخلايا العصبية المشروع إلى قرن آمون, وظيفة محطات الغلوتامات VTA المهيمنة تشريحيا هو أقل دراسة بالمقارنة مع محطات الدوبامين VTA في قرن آمون29,30.
يصف البروتوكول الحالي استخدام بناء AAV5 الذي يؤوي فلوروفورا (eYFP) وأوبسين خفيف التحكم (hChR2) لرسم خرائط لمحطات VTA (الغلوتامات) المعبرة عن CaMKIIα في قرن آمون. وقد أثبتت الدراسات السابقة أن محطات الغلوتامات VTA هي المهيمنة تشريحيا في قرن آمون بالمقارنة مع محطات الدوبامين VTA29. لإثبات محطات VTA الغلوتامات المشبكية في قرن آمون، تم تحويل AAV (5) -CaMKIIα-hChR2-eYFP إلى أجسام خلايا الخلايا العصبية VTA. هذا المسمى الخلايا الهيئات VTA الخلايا العصبية الغلوتامات (داخل VTA) وأوجز محطات الغلوتامات VTA داخل طبقات من قرن آمون.
على الرغم من أن محطات VTA الغلوتامات presynaptic innervate DG، CA3، وCA1، تظهر النتائج الاختلافات التي تعتمد على طبقة لهذه المناطق الثلاث(الشكل 6a-d). في DG، AAV المسمى محطات الغلوتامات VTA هي المهيمنة تشريحيا في hilus بالمقارنة مع طبقة الخلية الحبيبية. في CA3 ، محطات الغلوتامات VTA وفيرة نسبيا في لاكونوسوم الطبقة بالمقارنة مع طبقة الخلية الهرمية وطبقة oriens. في حين أنه في CA1 ، محطات الغلوتامات VTA innervate بشكل كبير الطبقات dendritic (طبقة oriens و radiatum) بالمقارنة مع طبقة الخلية الهرمية. نتائج هذه الدراسة يوضح أيضا أن التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA الهيئات تعدل نشاط الشبكة العصبية CA1 في الجسم الحي. أدى التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA إلى زيادة كبيرة في معدل إطلاق CA1 ومعدل الانفجار خلال حقبة التحفيز الضوئي(الشكل 7a-b). هذا يتفق مع التوزيع التشريحي لمحطات الغلوتامات VTA في الطبقات التشجرية من CA1(الشكل 6D)حيث قد تمارس تأثيرات على ترميز المعلومات فرس النهر. ودعما لهذه الملاحظة، أظهرت دراسات أخرى أن VTA هو المحدد الرئيسي لترميز الذاكرة العاملة فرس النهر، وينظم اختيار المعلومات التي سيتم تخزينها في الذاكرة على المدى الطويل من خلال حلقة VTA-قرن آمون22،23،24،25،26،27،28،29،31،32، 33،34.
الاعتبارات التقنية
لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، يجب تحديد اختيار بنيات AAV استنادا إلى نوع الخلايا العصبية التي سيتم استهدافها. يجب على الباحث تحديد المروج المناسب (منتج جيني) فريد من نوعه لنوع الخلايا العصبية التي سيتم استهدافها. في الدراسة الحالية، تم استخدام مروج CaMKIIα لدفع التعبير عن eYFP و hChR2 في CaMKIIα التعبير عن الخلايا العصبية. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام طريقة إعادة التركيب cre-lox. في هذه الحالة، يمكن التعبير عن AAV5 مزدوجة floxed في VTA من الفئران CaMKIIα-Cre. المروج و cre-lox أساليب التعبير القائمة تنطبق أيضا على أنواع الخلايا العصبية الأخرى35,36,37.
يجب فحص النظام للتأكد من وجود ضوضاء كهربائية. يمكن القيام بذلك عن طريق تقييم RMS في نطاق spike أثناء جلسة تسجيل تجريبية. إذا لزم الأمر ، يجب أن يكون النظام والجهاز المجسم في قفص فاراداي ، في حين أن أرضية مكبر الصوت متصلة بالقفص. يمكن ترتيب مواقع الاتصال بالأقطاب الكهربائية خطيا أو tetrode. وينبغي تحديد اختيار تصميم المسبار على أساس هدف التجربة. صفيف خطي يكشف الخلايا العصبية عبر طبقات متعددة. كما تتوفر التحقيقات ذات المواصفات المختلفة للمسافات (بالميكرونات) تجاريا. وينبغي النظر في طول الساق والمسافة بين مواقع الاتصال التحقيق أثناء إجراء التسجيل والتحليل. عند اكتمال الإعداد، يجب فحص نبض الضوء أثناء التسجيل التجريبي للقضاء على القطع الأثرية الكهروضوئية. ويمكن أيضا تحسين هذا عن طريق ضبط موقف القطب بالنسبة لعمق الألياف البصرية والموقع.
القيود
على الرغم من أن يتم التعبير عن CaMKIIα في المقام الأول في الخلايا العصبية الإفراج عن الغلوتامات, البروتين موجود أيضا في بعض السكان من الخلايا العصبية الدوبامين التي تشارك في الافراج عن الغلوتامات. وهكذا، فإن استخدام AAV5-CaMKIIα في الغالب تسمية الخلايا العصبية الغلوتامات وبعض الخلايا العصبية الدوبامين التي تعبر عن CaMKIIα. بروتوكولات التحفيز الضوئي LED مدفوعة بأسعار معقولة ويمكن تجميعها بسهولة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن بروتوكول التحفيز الضوئي بالليزر أكثر فعالية38و39و40. محلول AAV حقن في نفس منطقة الدماغ لحيوانات مختلفة تسفر عن عتبات التعبير متفاوتة. ومع ذلك، الانتظار لمدة 3 أسابيع أو أكثر بعد الحقن يمكن أن تقلل من هذا الاختلاف عن طريق السماح لالعاب امثل. محلول AAV حقن في منطقة الدماغ قد تنتشر أيضا إلى مناطق الدماغ المحيطة بها. مراقبة فترة الانتظار بعد الإبرة قد خفضت, وبين حقن بولس يمكن أن تقلل من انتشار محلول AAV من موقع الحقن.
وباختصار ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع الدوائر العصبية في أدمغة القوارض. على الرغم من أن البروتوكول الحالي يصف في تتبع الدائرة العصبية الحية في الفئران المخدرة ، يمكن أيضا نشر الإجراء للتسجيل المزمن في الفئران المستيقظة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
يتم تمويل هذا العمل من قبل CBS بريدجينج غرانت الممنوحة ل OOM. قام OOM و PAA و AS بتصميم الدراسة وإجراء التجارب. AS وPAA تحليل النتائج. أعد أوم وPAA المخطوطة. نشكر الدكتور كارل ديسروث (جامعة ستانفورد) على إتاحة AAV لاستخدامنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
- Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
- Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
- Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
- Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
- Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
- Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
- Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
- Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
- Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
- Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
- Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
- Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
- Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
- Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
- McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
- McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
