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Neuroscience

हिप्पोकैम्पस में वेंट्रल टेगमेंटल एरिया ग्लूटामेट टर्मिनल्स के वीवो शारीरिक और कार्यात्मक ट्रेसिंग में संयुक्त

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61282
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस के लिए वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र (वीटीए) ग्लूटामेट अनुमानों का पता लगाने के लिए एक सरल विधि को दर्शाता है। वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोटिमुलेशन को सीए1 रिकॉर्डिंग के साथ जोड़ा गया था ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनल वीवो में CA1 ख्यात पिरामिड फायरिंग दर को कैसे मिलाते हैं।

Abstract

मस्तिष्क में न्यूरॉन उप-आबादी के ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन ने शोधकर्ताओं को वीवो और पूर्व वीवो में तंत्रिका सर्किट को विच्छेदन करने की अनुमति दी है । यह एक तंत्रिका सर्किट के भीतर न्यूरॉन प्रकार की भूमिका का निर्धारण करने के लिए एक आधार प्रदान करता है, और सीखने के सापेक्ष जानकारी एन्कोडिंग में उनका महत्व है। इसी तरह, इस विधि का उपयोग जागने और एनेस्थेटाइज्ड जानवरों में दो या अधिक जुड़े मस्तिष्क क्षेत्रों के शारीरिक महत्व का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन दर्शाता है कि कैसे वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स एनेस्थेटाइज्ड चूहों के CA1 (हिप्पोकैम्पस) में ख्यात पिरामिड न्यूरॉन्स की गोलीबारी दर को संशोधित करता है। यह प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस की परतों में वीटीए प्रेसिनैप्टिक ग्लूटामेट टर्मिनलों की ट्रेसिंग के लिए वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) को रोजगार देता है। एएवी वेक्टर द्वारा बंदरगाह वाले प्रकाश-नियंत्रित ऑप्सिन (चैनलरोडोप्सिन; एचएचआर 2) और फ्लोरेसेंस प्रोटीन (ई वाईएफपी) की अभिव्यक्ति ने वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों के एंटेरोग्रेड ट्रेसिंग की अनुमति दी, और वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन सेल निकायों (वीटीए में) की फोटोटिमुलेशन की अनुमति दी। वीवो में वीटीए फोटोसिमुलेशन के लिए मल्टी-यूनिट और सिंगल-यूनिट प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए उच्च बाधा तीव्र सिलिकॉन इलेक्ट्रोड सीए1 में तैनात किए गए थे । इस अध्ययन के परिणाम हिप्पोकैम्पस (CA1, CA3, और डीजी) में प्रेसिनैप्टिक वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों के परत-निर्भर वितरण को प्रदर्शित करते हैं। साथ ही वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोस्मिमुलेशन ने वीवो में ख्यात CA1 पिरामिड इकाइयों की फायरिंग और फट दर को बढ़ाया।

Introduction

पिछले एक दशक में, न्यूरॉन-प्रकार मॉड्यूलेशन की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए आनुवंशिक उपकरणों की एक सरणी विकसित की गई थी, और जटिल तंत्रिका नेटवर्क1की मैपिंग। विशेष रूप से, न्यूरोट्रोपिक वायरस को संक्रमित करने और न्यूरोनल कोशिकाओं में दोहराने की अंतर्निहित क्षमता वाले न्यूरोट्रॉपिक वायरस को न्यूरॉन उप-प्रकारों में विशिष्ट प्रोटीन को व्यक्त करने या फिर से शुरू करने के लिए तैनात किया गया है। फ्लोरेसेंस प्रोटीन या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सिनैप्टिक गतिविधि संकेतकों को शरण देते समय, संक्रमित एएवी वैक्टर लेबल और मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका नेटवर्क को चित्रित करते हैं2,3। एएवी निर्माण में प्रमोटर का चुनाव कुछ स्तर की विशिष्टता(प्रमोटर-निर्भर अभिव्यक्ति) के साथ न्यूरॉन प्रकारों में वेक्टर की अभिव्यक्ति को निर्देशित करता है। हालांकि, क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन के माध्यम से, एएवी संरचनाओं को न्यूरॉन लेबलिंग 4,5,6,7के लिए अधिक विशिष्टता के साथ तैनात कियाजाताहै। ध्यान दें, एएवी वैक्टर में पैक किए गए फोटोएक्टिवेटेड माइक्रोबियल ऑप्सिन और फ्लोरेसेंस प्रोटीन को विभिन्न न्यूरॉन उपप्रकार8में व्यक्त किया जा सकता है, और इमेजिंग, न्यूरॉन-प्रकार सर्किट ट्रेसिंग और फोटोमॉडुलेशन9,10के लिए आदर्श हैं।

AAVs एक मस्तिष्क क्षेत्र (या नाभिक) में स्टीरियोटैकली इंजेक्शन का निर्माण सोमा, डेंड्राइट, और एक्सॉन टर्मिनलों में रिपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइव करता है। एएवी की तंत्रिका अभिव्यक्ति एक रिपोर्टर जीन (ईवाईएफपी) को शरण देने से न्यूरॉन सेल निकायों की लेबलिंग और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों11 , 12,13,14से अनुमानों का शारीरिक पता लगाने में सुविधा होती है । एएवी-ईवाईएफपी प्रकाश नियंत्रित ऑप्सिन (जैसे, एचएचआर 2) को ले जाने वाले निर्माणों को वीवो16में मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए तंत्रिका अनुमानों के इमेजिंग6,15 और उत्तेजना आधारित शारीरिक ट्रेसिंग के लिए एक उपकरण के रूप में तैनात किया जा सकता है। एएवी सेरोटाइप के आधार पर, न्यूरॉन लेबलिंग की दिशा एंटेरोग्रेड या प्रतिगामी11,12हो सकती है। पिछले अध्ययनों से यह सिद्ध हुआ है कि AAV5 न्यूरॉन्स12में एंटीरोग्रेडी यात्रा करता है । इस प्रकार, एचसीआर 2 व्यक्त करने वाले कोशिका निकायों की फोटोस्मिमुलेशन मस्तिष्क (लक्ष्य)17में कहीं और प्रेसिनैप्टिक प्रभाव पैदा करता है।

यहां, CaMKIIα प्रमोटर के साथ एएवी (सेरोटाइप 5) का उपयोग वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स और अक्षीय अनुमानों में eYFP (रिपोर्टर) और एचएचआर 2 (ऑप्सिन) व्यक्त करने के लिए किया गया था। इस अध्ययन के परिणाम सीए1, सीए 3 और डीजी हिप्पोकैम्पल क्षेत्रों में वीटीए-ग्लूटामेट प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों के परत-निर्भर वितरण को प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोटिमुलेशन ने बेसलाइन मूल्यों की तुलना में वीवो में CA1 मल्टी-यूनिट और सिंगल-यूनिट फायरिंग दरों में वृद्धि की। यह प्रोटोकॉल किफायती उपकरणों और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है जो तंत्रिका सर्किट ट्रेसिंग प्रयोगों से प्राप्त डेटा की गुणवत्ता को बढ़ा सकता है।

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Protocol

लुइसियाना स्टेट यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ वेटरनरी मेडिसिन की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा सभी प्रायोगिक और पशु हैंडलिंग प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई ।

1. प्रायोगिक पशु

  1. 5-6 सप्ताह पुराने चूहों का प्रयोग करें।
  2. 12 एच बारी प्रकाश और अंधेरे चक्र की मानक शर्तों के तहत पिंजरे प्रति घर 3-5 जानवरों। भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम प्रदान किया जाना चाहिए।

2. क्रैनिओटॉमी और पशु तैयारी

नोट: यह अनुभाग माउस क्रैनिओटॉमी के लिए पूर्व और पेरी-ऑपरेटिव प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। मानक स्टीरियोटैक्टिक उपकरण और उपयुक्त निर्देशांक (एंटेरोपोस्टेर: एपी, मीडियोलेटरल: एमएल, और डोरसोटेस्ट्रल: डीवी) का उपयोग करें। ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के लिए निर्देशांक निर्धारित करने के लिए एक माउस मस्तिष्क एटलस को देखें।

  1. इंट्रापेरिटोनियल केटामाइन (100 मिलीग्राम/किलो) /जाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलो) कॉकटेल इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें। सर्जरी शुरू होने से पहले सनसनी की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए एक टो चुटकी परीक्षण करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक उपयुक्त नाक कक्ष के साथ Isoflurane संज्ञाहरण भी इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. धीरे-धीरे स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर जानवर के सिर को ठीक करें।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान सावधानी के साथ जानवरों को संभालना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सर्जरी के साथ आगे बढ़ने से पहले श्वास दर और अन्य नब्ज की जांच करें। तनाव को कम करने के लिए जानवर को ~ 7 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दें।
    1. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर एक हीटिंग पैड रखें ताकि जानवर का शरीर उस पर पड़ा हो। यह शरीर के तापमान को बनाए रखने में मदद करेगा और प्रक्रिया को बाहर रखते हुए जानवर को गर्म रखेगा। पश्चात देखभाल और वसूली के लिए हीटिंग पैड बनाए रखें।
  3. सिर के ऊपर बालों को हटाने और आयोडीन के घोल से त्वचा को साफ करने के लिए क्लिपर का इस्तेमाल करें।
    1. खोपड़ी पर सनसनी को ब्लॉक करने के लिए सामयिक लिडोकेन लागू करें।
    2. ललाट से ओसीपिटल क्षेत्र तक फैली मिडलाइन खोपड़ी चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
    3. चीरा क्षेत्र को आयोडीन समाधान के साथ साफ करें, फिर कैलवेरिया का पर्दाफाश करें।
      नोट: कैल्वरिया से पेरिओस्टियम को हटाने के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान की एक छोटी राशि लागू की जा सकती है। इससे लैंडमार्क (ब्रेग्मा और लैम्ब्डा) और टांके की दृश्यता बढ़ेगी।
    4. माउस मस्तिष्क स्टीरियोटाटिक एटलस का उपयोग करना, एपी और एमएल का निर्धारण ब्रेग्मा के सापेक्ष निर्देशांक करता है।
    5. वीटीए इंजेक्शन के लिए, निर्देशांक एपी पर एक अल्ट्राफाइन कुंद-बिंदु सुई सिरिंज (जैसे, न्यूरोजिंज) की स्थिति: -3.08 मिमी/
    6. चिह्नित एपी/एमएल समन्वय पर खोपड़ी में 1 मिमी छेद (क्रैनियोटॉमी) बोर करने के लिए एक ड्रिलिंग उपकरण का उपयोग करें ।
      नोट: इस कदम के लिए एक महत्वपूर्ण स्तर की सावधानी की आवश्यकता है। मस्तिष्क के ऊतकों को कुचलने से ड्रिलिंग बिट को रोकने के लिए ड्रिलिंग करते समय न्यूनतम दबाव लागू किया जाना चाहिए। वर्तमान अध्ययन में ड्रिल बिट 0.8 मिमी था और ड्रिल की गति 15,000 आरपीएम तक निर्धारित की गई थी।
      सावधानी: यदि चीरा या कैल्वरिया की सफाई में हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग किया जाता था, तो समाधान को पूरी तरह से हटाना सुनिश्चित करें या ड्रिलिंग से पहले पूर्ण सूखापन की अनुमति दें।

3. एएवी कॉकटेल इंजेक्शन

नोट: यह अनुभाग वयस्क C57BL/6 चूहों (23-27 ग्राम) के वीटीए में एएवी इंजेक्शन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। वर्णित विधि मानक स्टीरियोटायेक्टिक उपकरण और उचित निर्देशांक का उपयोग कर किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र में एएवी इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए, EYFP और hChR2 को एक CaMKIIα प्रमोटर(चित्रा 1)के तहत AAV5-मध्यस्थता ट्रांसफैक्शन का उपयोग करके वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था। इस स्टेप के लिए क्रे-लोक्स रिकॉम्बिनेशन का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. एक इंजेक्टर पर अल्ट्राफाइन कुंद-बिंदु सुई (32 जी; 100 एनएल सटीकता के साथ 5 माइक्रोन क्षमता) के साथ एक सिरिंज माउंट करें। माइक्रोमैनीपुलेटर पर सिरिंज धारक को ठीक करें।
    नोट: इस प्रक्रिया के लिए, 1.6 एनएल अंशांकन के साथ एक मैनुअल सिरिंज धारक का उपयोग किया गया था। एक स्वचालित इंजेक्टर का भी उपयोग किया जा सकता है।
  2. सिरिंज को साफ करने और तरल पदार्थ के प्रवाह का परीक्षण करने के लिए डबल आसुत पानी से भरें।
  3. बर्फ पर एएवी (सेरोटाइप 5) कॉकटेल के गल एलिकोट्स। अच्छी अभिव्यक्ति के लिए वायरल टाइटर बनाए रखने के लिए AAVs को -80 डिग्री सेल्सियस पर सबसे अच्छा संग्रहीत किया जाता है।
  4. एएवी समाधान के 1,000 एनएम (फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस), पीएच 7.4 में 10 एमएम) के साथ घुड़सवार सिरिंज भरें। एक इंजेक्शन साइट में सुई को कम करने से पहले तरल के प्रवाह की पुष्टि करने के लिए एएवी समाधान के 10 एन एल वितरित करें।
  5. वांछित गहराई (डीवी समन्वय) में सुई स्टीरियोटैकली को कम करने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करें। सुई को वांछित गहराई तक कम करने के बाद, सिरिंज को इंजेक्शन से पहले 10 मिनट तक जगह में रहने दें।
    नोट: इस प्रक्रिया के लिए, सुई मस्तिष्क की पायल सतह से 4.5 मिमी की गहराई (डीवी) पर वीटीए में उतारा गया था। अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए, उपयुक्त डोरसौवेंट्रल समन्वय का उपयोग करें (माउस मस्तिष्क एटलस को देखें)।
  6. वीटीए में एवी का 600-800 एनएल इंजेक्ट करें। इंजेक्शन की मात्रा लक्ष्य साइट के आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
    1. एएवी समाधान 60 एनएल/न्यूनतम (3 मिनट अंतराल) की दर से वितरित करें।
    2. वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स और अनुमानों में eYFP और hChR2 व्यक्त करने के लिए, एएवी-CaMKIIα-ChR2-eYFP इंजेक्ट करें।
      नोट: प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन विधि का भी उपयोग किया जा सकता है।
    3. एएवी इंजेक्शन के बाद सुई को 15 मिनट तक जगह में रहने दें। इससे डिफ्यूजन और बैकफ्लो कम होगा।
  7. सिरिंज सुई वापस ले, और फिर घाव को बंद करने के लिए चीरा सीवन।
  8. पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल के एक हिस्से के रूप में एंटीबायोटिक्स और एनाल्जेसिया का प्रशासन करें। माउस को एक गर्म गद्देदार प्लेटफार्मों पर रखें और जागने तक जानवर की निगरानी करें।
    नोट: इंजेक्शन के 3 सप्ताह के बाद, एएवी अभिव्यक्ति माउस मस्तिष्क वर्गों में रिपोर्टर प्रोटीन (eYFP) का फ्लोरेसेंस डिटेक्शन द्वारा देखा जा सकता है। इसके अलावा, फोटोटिमुलेशन प्रयोग 3 सप्ताह(चित्रा 2) केबाद किया जा सकता है।

4. ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ वीवो तंत्रिका रिकॉर्डिंग में सेट करें

नोट: यह अनुभाग मस्तिष्क सर्किट (सीए1 के लिए वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन प्रक्षेपण) के ऑप्टोजेनेटिक ट्रेसिंग के साथ तीव्र तंत्रिका रिकॉर्डिंग के लिए कदमों का वर्णन करता है। यदि आवश्यक हो, तो इस कदम को शुरू करने से पहले बिजली के शोर और ग्राउंडिंग मुद्दों के लिए सिस्टम (एम्पलीफायर और कनेक्शन) की जांच करें। एक फैराडे पिंजरे में इस कदम को अंजाम देने से रिकॉर्डिंग में बिजली के शोर को खत्म करने में मदद मिल सकती है।

  1. एएवी इंजेक्शन के 3 सप्ताह बाद, इंट्रापेरिटोनियल यूरेथेन इंजेक्शन (0.2 मिलीग्राम/किलो) द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
    सावधानी: यूरेथेन कैंसरजनक है और सुरक्षात्मक गियर पहनते समय सावधानी से संभाला जाना चाहिए। इसके अलावा, इस एकाग्रता पर यूरिथेन संज्ञाहरण का प्रशासन गैर-अस्तित्व है।
  2. पहले वर्णित स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर जानवर के सिर को प्रत्यय (चरण 2.2, चित्रा 3 ए)। ड्यूरा(चित्रा 3 ए)का पर्दाफाश करने के लिए एक क्रेनिओटॉमी करें। पैराटिटल हड्डी के हिस्से को हटाने के लिए ड्रिलिंग टूल (बिट आकार: 0.8 मिमी, गति: 15,000 आरपीएम) का उपयोग करें।
    1. क्रैनियोटॉमी लगभग 3 मिमी x 4मिमी चौड़ा होना चाहिए। सूखापन को रोकने के लिए इस क्षेत्र पर कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (एसीएसएफ) की बूंदें लगाएं।
  3. एक विच्छेदन (डिजिटल) माइक्रोस्कोप के तहत, उजागर ड्यूरा को उत्पादित करने के लिए एक तुला सुई टिप (27 जी) का उपयोग करें। इस क्षेत्र में नाजुक पियाल कवर और कॉर्टिकल ऊतकों को अलग न खींचने के लिए सावधान रहें।
  4. जमीन पेंच (पैन हेड फिलिप्स स्क्रू) को पकड़ने के लिए ऑक्सीपिटल हड्डी (बिट आकार: 0.8 मिमी, गति: 10,000 आरपीएम) में एक छेद बोर करें; M0.6 x 2.0 मिमी)।
  5. एक स्टेनलेस स्टील जमीन तार कनेक्ट करें।
    नोट: अन्य प्रकार के तारों का भी उपयोग किया जासकता है (चित्रा 3b)।
  6. संयुक्त फोटोस्मुलेशन (वीटीए) और न्यूरल रिकॉर्डिंग (सीए1) के लिए, अल्ट्रा-फाइन (10 माइक्रोन या 1 माइक्रोन) माइक्रोमैनिपलेटर के साथ लगे बहु-रेल स्टीरियोटैक्सिक उपकरण का उपयोग करें। ऑप्टिकल फाइबर माउंट और रिकॉर्डिंग तंत्रिका जांच क्रमशः 10 μm-रेंज और 1 μm-रेंज माइक्रोमैनीपुलेटर पर, ।
    1. यदि आवश्यक हो, तो हेड स्टेज-प्रोब एडाप्टर(चित्रा 3सी) काउपयोग करें।
      नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, एक 32-चैनल हेड स्टेज को 4-चैनल रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड(चित्रा 3 डी)रखने के लिए एक एडाप्टर के साथ फिट किया गया था। स्टेनलेस-स्टील ग्राउंड वायर को एडाप्टर के ग्राउंड कनेक्शन पोर्ट पर मिलाप किया गया था ।
  7. एपी को-ऑर्डिनेट करने पर: -3.08 मिमी एमएल: 0.5 मिमी, वीटीए में 400 माइक्रोन व्यास ऑप्टिक फाइबर कम करें।
    1. ऑप्टिक फाइबर को कम करने से पहले, फेरुल को फाइबर-युग्मित एलईडी स्रोत से जुड़े फाइबर ऑप्टिक केबल (स्टेनलेस स्टील या सिरेमिक फेरुल के साथ) से कनेक्ट करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्रकाश तीव्रता और ध्यान वांछित के रूप में सेट कर रहे हैं । एलईडी लाइट सोर्स का चुनाव लक्षित किए जा रहे ऑप्सिन के अनुरूप होना चाहिए। यहां एचसीआर2 फोटोएक्टिवेशन(चित्रा 4ए)के लिए 470 एनएम (नीली बत्ती) एलईडी ड्राइवर का इस्तेमाल किया गया।
    2. न्यूरल रिकॉर्डिंग के साथ लाइट पल्स को सिंक्रोनाइज करने के लिए, एलईडी ड्राइवर और रिकॉर्डिंग कंट्रोलर डिजिटल इन पोर्ट को ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर लॉजिक (टीटीएल) पल्सर(चित्रा 4b)से कनेक्ट करें। इसे बीएनसी स्प्लिटर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।
      नोट: टीटीएल दाल का उपयोग वांछित पल्स ट्रेन आवृत्ति और अवधि को डिजिटल रूप से स्थापित करने का लचीलापन प्रदान करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, 10 एमएस हल्की दालें 50 हर्ट्ज18पर शुरू हुई थीं। एलईडी ड्राइवर के टीटीएल नियंत्रण के लिए, ड्राइवर को "ट्रिगर" पर स्विच करें। इस मोड में, प्रकाश तीव्रता को "घुंडी" को बदलकर विनियमित किया जा सकता है। उत्तेजक आवृत्ति को प्रयोगात्मक चर को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है और 1 से 100 हर्ट्ज तक हो सकता है। तंत्रिका सर्किट ट्रेसिंग के लिए, >20 हर्ट्ज की उत्तेजना आवृत्ति की सिफारिश की जाती है।
    3. प्रभावी तीव्रता निर्धारित करने के लिए घुंडी को समायोजित करें जो फोटोइलेक्ट्रिक कलाकृतियों के उत्पादन के बिना प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकता है। यदि आवश्यक हो, तो कलाकृतियों को खत्म करने के लिए ऑप्टिक फाइबर को फिर से स्थान19।
      नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किया जाने वाले एलईडी ड्राइवर ~ 21.8 एमडब्ल्यू की हल्की शक्ति पैदा करता है।

5. तंत्रिका रिकॉर्डिंग

  1. 15-50 माइक्रोन मोटी टांग के साथ एक तीव्र तंत्रिका जांच का उपयोग करें, लंबाई में कम से कम 5 मिमी मापने।
    नोट: गहरी मस्तिष्क संरचनाओं से रिकॉर्डिंग एक लंबी टांग के साथ तंत्रिका जांच की आवश्यकता होगी । वर्तमान अध्ययन में, 20 मिमी टांग लंबाई के साथ एक जांच का उपयोग किया गया था।
  2. सीरियल पेरिफेरल इंटरफेस (एसपीआई) केबल के माध्यम से रिकॉर्डिंग नियंत्रक के लिए पूर्व एम्पलीफायर हेड स्टेज कनेक्ट करें। रिकॉर्डिंग नियंत्रक बंदरगाहों पर एलईडी रंग प्रकाश की जांच करें। हरे और पीले रंग की एलईडी कनेक्टेड एम्पलीफायर बोर्ड पर उचित वोल्टेज का संकेत देती है। लाल एलईडी एक काम सॉफ्टवेयर-हेड स्टेज कंट्रोल(चित्रा 5b) इंगितकरता है ।
  3. माइक्रो-मैनिपुलेटर का उपयोग करके, सीए1 (एपी: -1.94 मिमी, एमएल: + 1.0 मिमी, डीवी: +1.1 से 1.2 मिमी) के पिरामिड सेल परत में इलेक्ट्रोड संपर्क साइटों की स्थिति करें।
    नोट: ऑप्टिक फाइबर और इलेक्ट्रोड फोटोस्मुलेशन और रिकॉर्डिंग के लिए अन्य वांछित मस्तिष्क क्षेत्रों में तैनात किया जा सकता है।

6. एम्पलीफायर और फ़िल्टर सेटिंग्स

  1. यूएसबी 3.0 पोर्ट के माध्यम से रिकॉर्डिंग कंट्रोलर एम्पलीफायर सिस्टम को कंप्यूटर से कनेक्ट करें। एसपीआई केबल का उपयोग करके सिर के चरण को एम्पलीफायर से कनेक्ट करें। कंट्रोलर सॉफ्टवेयर लॉन्च करें। यदि ठीक से कनेक्ट नहीं किया जाता है, तो सिस्टम "डिवाइस नहीं मिला" संदेश प्रदर्शित करेगा।
  2. चैनलों पर गतिविधि देखने के लिए रन पर क्लिक करें. प्रत्येक तरंग को वोल्टेज (वाई-एक्सिस) बनाम समय (एक्स-एक्सिस) के रूप में प्लॉट किया जाता है। ब्याज के क्षेत्र के आधार पर, तरंग प्रदर्शन को समायोजित करने के लिए वोल्टेज और समय तराजू को समायोजित करें।
  3. यदि केवल कुछ चैनल सक्रिय हैं, तो स्टोरेज डिस्क पर फ़ाइल आकार को कम करने के लिए अप्रयुक्त चैनलों को अक्षम करें।
  4. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर बैंडविड्थ मापदंडों को संपादित करके नमूना दर और कट-ऑफ आवृत्तियों को सेट करें। सिंगल यूनिट रिकॉर्डिंग के लिए, ऊपरी और निचले कटऑफ आवृत्तियों को क्रमशः 300 हर्ट्ज और 5,000 हर्ट्ज के लिए सेट करें। एम्पलीफायर सैंपलिंग रेट को बदलकर 30 केएस/एस कर दिया जाए।
    नोट: एक उच्च नमूना दर का चयन एक बड़ा फ़ाइल आकार का उत्पादन होगा ।
  5. रिकॉर्डिंग से पहले, 1,000 हर्ट्ज पर बाधा को मापकर इलेक्ट्रोड चैनलों की अखंडता की जांच करें। यह यूजर इंटरफेस (कंट्रोलर सॉफ्टवेयर) में फंक्शन लॉन्च करके किया जा सकता है। एक कार्य चैनल में एक बाधा मूल्य होना चाहिए जो 0.1 से 5 एमΩ तक है।
  6. यदि कोई ऑडियो आउटपुट (स्पीकर) एनालॉग आउट पोर्ट से जुड़ा हुआ है, तो इष्टतम स्पाइक ध्वनि के लिए लाभ और साइलेंसर को समायोजित करें।
  7. स्पाइक रिकॉर्डिंग में टीटीएल पल्स ट्रेन मार्कर प्रदर्शित करने के लिए, डिजिटल इन मार्कर के लिए प्रदर्शन को सक्षम करें। पल्स ट्रेन टाइम स्टैंप रिकॉर्ड करने के लिए, मुख्य प्रयोग से पहले डिजिटल इन चैनल डिस्प्ले को सक्षम करें।
    नोट: आमतौर पर एक से अधिक "डिजिटल इन" चैनल (1 या 2) होता है। सुनिश्चित करें कि टीटीएल पल्सर से बीएनसी केबल रिकॉर्डिंग नियंत्रक सॉफ्टवेयर में प्रदर्शन के लिए चयनित "डिजिटल इन" पोर्ट से जुड़ा हुआ है।
  8. स्पाइक तरंग के वास्तविक समय को देखने के लिए, स्पाइक स्कोप विंडो खोलें, और माउस क्लिक का उपयोग करके सीमा निर्धारित करें।
  9. रूट मीन स्क्वायर (μV में आरएमएस) की निगरानी करके शोर के स्तर का निरीक्षण करें। साफ स्पाइक रिकॉर्डिंग के लिए, यह पसंद किया जाता है कि तंत्रिका स्पाइक सीमा कम से कम 5x आरएमएस है।
  10. सेटअप पूरा हो जाने के बाद फाइल आउटपुट फॉर्मेट का चयन करें।
    नोट: यहां, CA1 तंत्रिका स्पाइक . rhd प्रारूप में दर्ज किया गया था । अन्य फ़ाइल प्रारूपों (.rhs और .dat) को भी विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा अनुमत फ़ाइल प्रारूपों से मेल खाने के लिए चुना जा सकता है।

7. वीवो ऑप्टोजेटिक रिकॉर्डिंग और सेटिंग्स में

  1. पल्स कंट्रोल सॉफ्टवेयर (टीटीएल) खोलें जो विभिन्न समायोज्य पल्स मापदंडों को प्रदर्शित करता है। सॉफ्टवेयर पर उपयुक्त कॉम पोर्ट का चयन करें। ट्रेन और समूह सेटिंग्स को समायोजित करके पल्स पैरामीटर सेट करें।
    नोट: नाड़ी की स्थिति प्रयोगात्मक चर और डिजाइन पर विचार करके निर्धारित किया जाना चाहिए ।
  2. एम्पलीफायर कंट्रोलर सॉफ्टवेयर पर, हिप्पोकैम्पस या वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में तंत्रिका स्पाइक्स का पता लगाने के लिए रन पर क्लिक करें। यदि आवश्यक हो, तो व्यवहार्य और सक्रिय न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए इलेक्ट्रोड गहराई को समायोजित करें।
  3. एक बार एक्स्ट्रासेलुलर वोल्टेज एक्टिविटी का पता चलने के बाद, 15 मिनट के लिए बेसलाइन स्पाइक्स का निरीक्षण करें और जानवर की नब्ज की निगरानी करें। इसके अलावा, CA1 या वांछित शारीरिक लक्ष्य क्षेत्र के भीतर उत्तरदायी न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए प्रकाश नाड़ी का परीक्षण करें।
    नोट: फोटोइलेक्ट्रिक कलाकृतियों की जांच करें और प्रकाश तीव्रता या ऑप्टिक फाइबर स्थिति को समायोजित करके खत्म करें।
  4. वांछित आवृत्ति(चित्रा 5ए, बी)पर प्रकाश नाड़ी को ट्रिगर करने से पहले ~ 10 मिनट के लिए बेसलाइन गतिविधि रिकॉर्ड करें। यह रोशनी के साथ और बिना गोलीबारी या फट दरों की तुलना के लिए अनुमति देगा।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, आधारभूत गतिविधि रोशनी के बिना 10 मिनट के लिए दर्ज की गई थी, इसके बाद 50 हर्ट्ज(मूवी 1)में रोशनी हुई।

8. विश्लेषण

  1. .rhd फ़ाइल को नेक्स5 आउटपुट फॉर्मेट में परिवर्तित करें।
  2. प्रक्रिया फाइलनेम। नेक्स5 एक ऑफलाइन सॉर्टर सॉफ्टवेयर में फाइल करने के लिए एकल इकाई raster गाड़ियों और तरंग रूपों का पता लगाने के लिए(चित्रा 5a-b)।
    1. ड्रॉप-डाउन विंडो से वांछित चैनल चुनें।
      नोट: लगातार दर्ज स्पाइक डेटा को ओएफएसएस की एक अलग विंडो पर देखा जा सकता है। टाइम स्केल को भी एडजस्ट किया जा सकता है। यदि टेट्राड का उपयोग किया जाता है, तो ओएफएसएस को 4 चैनलों को टेट्राड के रूप में सॉर्ट करने के लिए सेट किया जा सकता है।
    2. थ्रेसहोल्ड क्रॉसिंग वेवरफॉर्म एक्सट्रैक निष्कर्षण के लिए वोल्टेज स्तर निर्धारित करें।
      सावधानी: उचित स्पाइक डिटेक्शन के लिए कम से कम 5x आरएमएस का उपयोग करें।
    3. तरंग रूपों का पता लगाएं, फिर घाटी की मांग (स्वचालित) या कश्मीर-साधन (अर्ध-स्वचालित) विधि का उपयोग करके स्पाइक छंटाई करें। जहां आवश्यक हो, 3डी-प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (पीसीए) स्पेस के समान क्षेत्रों पर कब्जा करने वाली इकाइयों को मर्ज करें।
    4. निर्यात हल । आगे के विश्लेषण के लिए नेक्स5 फाइलें(चित्रा 5सी-डी)।
      नोट: इंटरस्पिक अंतराल, फायरिंग दर और फट दर के लिए विश्लेषण परिणामों को अन्य विश्लेषण प्लेटफार्मों में निर्यात किया जा सकता है।

9. एएवी अभिव्यक्ति का फ्लोरेसेंस डिटेक्शन

  1. रिकॉर्डिंग के बाद, एक आइसोफ्लुरेन कक्ष में जानवर को इच्छामृत्यु दें।
  2. 10 एमएमएम पीबीएस (~ 10 एमएल) के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन करें, इसके बाद 4% फॉस्फेट-बफर पैराफॉर्मलडिहाइड (पीबी-पीएफए, ~ 10 एमएल)।
  3. पूरे मस्तिष्क को बरकरार निकालें और इसे 48 घंटे के लिए 4% पीबी-पीएफए में ठीक करें।
  4. क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए 30% सुक्रोज युक्त फिक्स्ड ब्रेन को 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफर करें। 72 घंटे के बाद, मस्तिष्क को क्रायोस्टेट में सेक्शन करें और जिलेटिन-लेपित स्लाइड पर स्लाइस माउंट करें।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, हिप्पोकैम्पस (रोस्ट्रल) के बंद हिस्से वाले वर्गों को डीजी, CA3 और CA1 में एएवी-लेबल टर्मिनल प्रदर्शित करने के लिए चुना गया था।

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Representative Results

एंटेरोग्रेड ट्रेसिंग

AAV अभिव्यक्ति C57BL/6 चूहों के वीटीए में रिपोर्टर प्रोटीन (eYFP) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा सत्यापित किया गया था 21 दिन बाद इंजेक्शन(चित्रा 2)। हिप्पोकैम्पस में प्रेसिनैप्टिक वीटीए ग्लूटामेट अनुमानों की सफल एंटीरोग्रेड लेबलिंग को डीजी, सीए 3 और सीए1(चित्रा 6ए-डी; की परतों में ई वाईएफपी डिटेक्शन द्वारा भी सत्यापित किया गया था; फिल्म 2 और 3)।

वीटीए ग्लूटामेट अनुमानों को हिप्पोकैम्पस ने CA1 गतिविधि को मिलाना

वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोसमिमुलेशन ने ख्यात पिरामिड CA1 न्यूरॉन्स की गतिविधि को बढ़ा दिया। लाइट ऑफ फेज(चित्रा 5ए-बी)की तुलना में लाइट ऑन फेज(मूवी 1)के दौरान स्पाइकिंग इवेंट्स में यह वृद्धि के रूप में स्पष्ट है। इस परिणाम का समर्थन करने के लिए, CA1 नेटवर्क फायरिंग दरों की सांख्यिकीय तुलना से पहले (लाइट ऑफ; बेसलाइन) और बाद (लाइट ऑन) फोटोस्टिमुलेशन ने उत्तेजना के बाद की अवधि(चित्रा 7a;पी = 0.0002) के लिए एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला। फटने का पता लगाने के लिए रैस्टर ट्रेन के बाद के विश्लेषण (<16 एमएस में 2-4 स्पाइक्स) भी वीटीए ग्लूटामेट फोटोसमिमुलेशन(चित्रा 7b;पी = 0.0025) के बाद CA1 ख्यात पिरामिड न्यूरॉन्स के लिए एक वृद्धि की फट दर को दर्शाता है । सांख्यिकीय (छात्र का टी-टेस्ट) विश्लेषण मानक सॉफ्टवेयर के साथ किया गया था। यहां, बेसलाइन (लाइट ऑफ) फायरिंग या फट दर की तुलना लाइट ऑन (फोटोटिमुलेशन) मूल्यों से की गई थी।

Figure 1
चित्रा 1: C57BL/6 माउस के वीटीए में AAV-CaMKII-ChR2-eYFP इंजेक्शन का योजनाबद्ध चित्रण ।
हिप्पोकैम्पस के लिए वीटीए न्यूरॉन्स और अक्षीय अनुमानों की एंटेरोग्रेड लेबलिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरेसेंस वीटीए में एएवी-CaMKII-ChR2-eYFP अभिव्यक्ति, और ऑप्टिक फाइबर ट्रैक दिखा छवियों ।
डीके: डार्कस्चेविच, एससीपी के नाभिक: बेहतर सेरिबेलर पेडकल, वीटीए: वेंट्रल टेगमेंटल एरिया, और आरएम: रेट्रोमेट्री न्यूक्लियस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: क्रैनियोटॉमी, इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट और ऑप्टिक फाइबर प्लेसमेंट का प्रदर्शन।
(A)मिडलाइन चीरा कपाल को उजागर (b: ब्रेग्मा, ओसी: ऑक्सीपिटल हड्डी) । (ख)ऑक्सीपिटल बोन में ग्राउंड स्क्रू (जीएस) का प्लेसमेंट और कनेक्टेड स्टेनलेस स्टील ग्राउंड वायर (जीडब्ल्यू) । (ग)ऑप्टिक फाइबर कैनुला (एफओसी: फाइबरऑप्टिक केबल) की स्टीरियोटैक्टिक पोजिशनिंग। (घ)ऑप्टिक फाइबर कैनुला और तंत्रिका जांच टांग की स्टीरियोटैक्टिक पोजिशनिंग (foc: फाइबरऑप्टिक केबल, एडीपी: एडाप्टर, एमएस: संभोग आस्तीन, पीआरएस: जांच टांग, एचएस: सिर चरण) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: संयुक्त प्रकाश स्पंदन और एम्पलीफायर (ट्रिगर) समय टिकटों के लिए बीएनसी विभाजन कनेक्शन।
(क)ऑप्टिक फाइबर कैनुला की नोक से एलईडी लाइट उत्सर्जन का प्रदर्शन। (B)एलईडी और टाइम स्टांप एम्पलीफायर (एम्पल) रिकॉर्डिंग को नियंत्रित करने के लिए बीएनसी स्प्लिट एडाप्टर के माध्यम से टीटीएल पल्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: लगातार दर्ज स्पाइक ट्रेन (कच्चे डेटा) एकल इकाई का पता लगाने के साथ ।
(A)एक एनेस्थेटाइज्ड माउस के हिप्पोकैम्पस से रॉ रिकॉर्डिंग का स्क्रीनग्रैब । (ख)टीटीएल संचालित फोटो रोशनी की वीटीए कच्ची रिकार्डिंग में। हल्की नीली रेखाएं लाइट ऑन (λ = 470एनएम) अवधि और उत्तेजना की आवृत्ति के लिए समय टिकटों का प्रदर्शन करती हैं। (सी-डी) स्पाइक छंटाई द्वारा प्राप्त स्पाइक ट्रेन और न्यूरॉन इकाइयों को लगातार दर्ज किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: हिप्पोकैम्पस में एएवी-CaMKII-ChR2-eYFP की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस छवियों।
(A)डीजी (जीसीएल: दानेदार सेल लेयर, हिल: हिलस)। (ख)डीजी के करीब CA3 का हिस्सा (SL: स्तर लैकुनोसम, pyr: पिरामिड सेल परत) । (C)CA3 उचित । (घ)CA1 (तो: स्ट्रैटम ओरियंस, पाइर: पिरामिड सेल लेयर, रेड: स्ट्रैटम रेडिकुलेटा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: फोटोसिमुलेशन से पहले और बाद में फायरिंग दर की सांख्यिकीय तुलना।
(A)फोटो रोशनी के बाद CA1 (*p = 0.0002) में ख्यात पिरामिड न्यूरॉन इकाइयों के लिए एक बढ़ी हुई मतलब फायरिंग दर (हर्ट्ज) का प्रदर्शन बार ग्राफ। (ख)बार ग्राफ फोटो रोशनी के बाद ख्यात CA1 न्यूरॉन्स के लिए एक वृद्धि की फट दर का प्रदर्शन (**p = 0.0025) । त्रुटि बार: मतलब की मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 1: एम्पलीफायर कंट्रोलर और पल्सर सॉफ्टवेयर की स्क्रीनग्रैब रिकॉर्डिंग। फिल्म बेसलाइन रिकॉर्डिंग (लाइट ऑफ) को दर्शाती है जिसके बाद फोटोस्मुलेशन (लाइट ऑन, λ = 470 एनएम) है जो ब्लू टाइम स्टैंप के साथ इंगित किया जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 2 और मूवी 3: माउस के डीजी में वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों का 3डी चित्रण। DAPI-नीला: दानेदार सेल परत (जीसीएल) में परमाणु लेबल; eYFP-ग्रीन: डीजी हिलस में एएवी लेबल-वीटीए टर्मिनल। इन वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पिछले एक दशक में, एएवी निर्माण का डिजाइन काफी उन्नत हो गया है। इस प्रकार, बेहतर ट्रांसफेक्शन विशिष्टता14के लिए एएवी सेरोटाइप की एक सरणी में अधिक न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटरों को शामिल किया गया है। फ्लोरेसेंस प्रोटीन, ट्रांसपोर्टरों, रिसेप्टर्स और आयन चैनलों के लिए जीन के संयोजन से, एएवी के पुस्तकालय अब इमेजिंग, न्यूरोमोडुलेशन और सिनैप्टिक गतिविधि का पता लगाने के लिए मौजूद हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एएवी-निर्माणों में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोफोर और आयन चैनलों (ऑप्सिन) का संयोजन तंत्रिका सर्किट14, 18,19के संयुक्त न्यूरोएनाटॉमिकल और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल ट्रेसिंग के लिए अनुमति देता है। इसी तरह, प्रमोटर (या क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन विधि) का चयन एक सर्किट के भीतर न्यूरॉन टाइप-विशिष्ट अनुमानों का पता लगाने की अनुमति दे सकता है। वर्तमान अध्ययन में, इस प्रोटोकॉल को हिप्पोकैम्पस (CA1 क्षेत्र) के लिए वीटीए ग्लूटामेट तंत्रिका अनुमानों के शारीरिक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल आकलन के लिए तैनात किया गया था।

वीटीए-हिप्पोकैम्पस न्यूरल सर्किट

वीटीए मिडब्रेन मेसोकॉर्टिकोलिम्बिक पाथवे का एक हिस्सा है। पुरस्कार और घृणा सीखने में शामिल मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए वीटीए अनुमानों का बड़े पैमाने पर प्रदर्शन किया गया है20,21,22, 23,24,25. जबकि वीटीए में डोपामाइन, ग्लूटामेट और गाबा न्यूरॉन्स होते हैं, डोपामाइन न्यूरॉन जनसंख्या शारीरिक रूप से प्रभावी होती है। प्रतिकूल और इनाम सीखने में वीटीए का एक प्रमुख कार्य नाभिक एक्यूबेन्स और पृष्ठीय रैपे नाभिक 22 , 24 , 25 ,26,27, 28,28के लिए एक मजबूत वीटीए डोपामाइन प्रक्षेपण के लिए जिम्मेदार ठहरायागयाहै । यद्यपि वीटीए डोपामाइन और ग्लूटामेट न्यूरॉन्स परियोजना हिप्पोकैम्पस के लिए, शारीरिक रूप से प्रमुख वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों के कार्य का हिप्पोकैम्पस29,30में वीटीए डोपामाइन टर्मिनलों की तुलना में कम अध्ययन किया जाता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस में CaMKIIα-एक्सप्रेसिंग वीटीए (ग्लूटामेट) टर्मिनलों के मानचित्रण के लिए एक फ्लोरोफोर (eYFP) और प्रकाश नियंत्रित ऑप्सिन (एचएचआर 2) को शरण देने वाले AAV5 निर्माण के उपयोग का वर्णन करता है। पिछले अध्ययनों से यह सिद्ध हुआ है कि वीटीए डोपामाइन टर्मिनल29की तुलना में हिप्पोकैम्पस में वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनल शारीरिक रूप से प्रभावी होते हैं । हिप्पोकैम्पस में वीटीए ग्लूटामेट प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों को प्रदर्शित करने के लिए, एएवी (5)- CaMKIIα-hChR2-eYFP वीटीए न्यूरोनल सेल निकायों में संक्रमित था। इसने सेल निकायों वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स (वीटीए के भीतर) को लेबल किया और हिप्पोकैम्पस की परतों के भीतर वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों को रेखांकित किया।

हालांकि वीटीए ग्लूटामेट प्रेसिनैप्टिक टर्मिनल इनरवेट डीजी, सीए 3 और सीए 1, परिणाम इन तीन क्षेत्रों (चित्र 6ए-डी)के लिए परत-निर्भर विविधताओंको दिखाते हैं। डीजी में, वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनल लेबल किए गए एएवी कण कोशिका परत की तुलना में हिलस में शारीरिक रूप से प्रमुख होते हैं। CA3 में, पिरामिड सेल लेयर और स्ट्रैटम ओरियंस की तुलना में स्ट्रैटम लैक्नोसम में वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनल अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में होते हैं। जबकि सीए1 में, वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनल पिरामिड सेल लेयर की तुलना में डेंड्रिटिक परतों (स्ट्रैटम ओरियंस और रेडिएटम) को काफी आंतरिक रूप से इनरवेट करते हैं। इस अध्ययन के परिणाम यह भी दर्शाता है कि वीटीए ग्लूटामेट न्यूरोनल सेल निकायों की फोटोटिमुलेशन वीवो में CA1 तंत्रिका नेटवर्क की गतिविधि को संशोधित करता है। वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोस्टिमुलेशन के कारण फोटोसमिमुलेशन युग(चित्र 7ए-बी)के दौरान CA1 फायरिंग दर और फट दर में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। यह CA1(चित्रा 6d)की डेंड्रिटिक परतों में वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों के शारीरिक वितरण से सहमत है जहां यह हिप्पोकैम्पस जानकारी एन्कोडिंग पर प्रभाव डाल सकता है। इस अवलोकन के समर्थन में, अन्य अध्ययनों से पता चला है कि वीटीए हिप्पोकैम्पस वर्किंग मेमोरी एन्कोडिंग का प्राथमिक निर्धारक है, औरवीटीए-हिप्पोकैम्पस लूप22, 23, 24, 25,26,27,27, 27,29,31, 32,के माध्यम से दीर्घकालिक स्मृति में संग्रहीत की जाने वाली जानकारी के चयन को नियंत्रित करताहै। 33,34.

तकनीकी विचार

इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक लागू करने के लिए, एएवी निर्माणों का चुनाव लक्षित किए जाने वाले न्यूरॉन प्रकार के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए। शोधकर्ता को एक उपयुक्त प्रमोटर (एक जीन उत्पाद) की पहचान करनी चाहिए जो लक्षित होने के लिए न्यूरॉन प्रकार के लिए अद्वितीय है। वर्तमान अध्ययन में, एक CaMKIIα प्रमोटर का उपयोग न्यूरॉन्स को व्यक्त करने वाले CaMKIIα में eYFP और hChR2 की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए किया गया था। हालांकि, एक क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन विधि का भी उपयोग किया जा सकता है। इस मामले में, CaMKIIα-Cre चूहों के वीटीए में एक डबल फ़्लॉक्सेड AAV5 व्यक्त किया जा सकता है। प्रमोटर और क्रे-लोक्स आधारित अभिव्यक्ति विधियां अन्य न्यूरॉन प्रकार 35 ,36,37पर भी लागू होती हैं .

बिजली के शोर के लिए सिस्टम की जांच की जानी चाहिए। यह एक परीक्षण रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान स्पाइक स्कोप में आरएमएस का मूल्यांकन करके किया जा सकता है। जरूरत पड़ने पर सिस्टम और स्टीरियोटाटिक उपकरण को फैराडे पिंजरे में रखे जाएं, जबकि एम्पलीफायर ग्राउंड पिंजरे से जुड़ा हो। इलेक्ट्रोड संपर्क साइटों को रैकरली या टेट्राड की व्यवस्था की जा सकती है। जांच डिजाइन का चुनाव प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए । एक रैखिक सरणी कई परतों में न्यूरॉन्स का पता लगाती है। विभिन्न रिक्ति (माइक्रोन में) विनिर्देशों के साथ जांच भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। टांग लंबाई और जांच संपर्क स्थलों के बीच की दूरी रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान और विश्लेषण के लिए विचार किया जाना चाहिए । जब सेटअप पूरा हो जाता है, तो फोटोइलेक्ट्रिक कलाकृतियों को खत्म करने के लिए एक परीक्षण रिकॉर्डिंग के दौरान प्रकाश नाड़ी की जांच करने की आवश्यकता होती है। यह ऑप्टिक फाइबर गहराई और स्थान के सापेक्ष इलेक्ट्रोड की स्थिति को समायोजित करके भी अनुकूलित किया जा सकता है।

सीमाओं

यद्यपि CaMKIIα मुख्य रूप से ग्लूटामेट-रिलीजिंग न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है, प्रोटीन डोपामाइन न्यूरॉन्स की कुछ आबादी में भी मौजूद है जो ग्लूटामेट को सह-रिलीज करते हैं। इस प्रकार, AAV5-CaMKIIα का उपयोग ज्यादातर ग्लूटामेट न्यूरॉन्स और कुछ डोपामाइन न्यूरॉन्स लेबल होगा जो CaMKIIα व्यक्त करते हैं। एलईडी चालित फोटोस्मुलेशन प्रोटोकॉल सस्ती हैं और आसानी से इकट्ठा किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लेजर-चालित फोटोटिमुलेशन प्रोटोकॉल अधिक प्रभावी है38,39,40. विभिन्न जानवरों के लिए एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में इंजेक्ट किए गए एएवी समाधान अलग-अलग अभिव्यक्ति थ्रेसहोल्ड उत्पील्ड करते हैं। हालांकि, इंजेक्शन के बाद 3 सप्ताह या उससे अधिक के लिए प्रतीक्षा इष्टतम ट्रांसफैक्शन की अनुमति देकर इस तरह के बदलाव को कम कर सकते हैं। मस्तिष्क क्षेत्र में इंजेक्ट किए गए एएवी समाधान भी आसपास के मस्तिष्क क्षेत्रों में फैल सकता है। सुई कम होने के बाद प्रतीक्षा अवधि को देखते हुए, और बीच में बोलस इंजेक्शन इंजेक्शन साइट से एएवी समाधान के प्रसार को कम कर सकते हैं।

संक्षेप में, इस विधि का उपयोग कृंतक के दिमाग में तंत्रिका सर्किट का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यद्यपि वर्तमान प्रोटोकॉल एनेस्थेटाइज्ड चूहों में वीवो तंत्रिका सर्किट ट्रेसिंग में वर्णन करता है, लेकिन प्रक्रिया को जागने वाले व्यवहार चूहों में पुरानी रिकॉर्डिंग के लिए भी तैनात किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम OOM को दिए गए सीबीएस ब्रिजिंग ग्रांट द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। OOM, PAA, और के रूप में अध्ययन डिजाइन और प्रयोगों का प्रदर्शन किया । के रूप में और PAA परिणामों का विश्लेषण किया । OOM और PAA पांडुलिपि तैयार की। हम हमारे उपयोग के लिए एएवी उपलब्ध कराने के लिए डॉ कार्ल डिसेरोथ (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3% Hydrogen peroxide Fisher chemical H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP Addgene Plasmid #26969
BNC cable Amazon
BNC Splitter Amazon
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. Thorlabs ADAL1-5
Drill Dremel LR 39098
Gelatin coated slides Fisher scientific OBSLD01CS
Hamilton's syringe (Neuros) WPI Inc. 06H
Head stage adapter Neuronexus Adpt-Q4-OM32
High impedance silicon probe Neuronexus Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording Controller INTAN RHD2000
Iodine solution Dynarex 1425
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Ketamine Spectrum K1068
LED Driver Thorlabs LEDD1B
LED light source (470 nm)-blue light Thorlabs M470F3
Micromanipulator Narishige M0-203
Optic fiber Thorlabs CFMLC14L05
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) Amazon M0.6 X 2mm
Pre-amplifier headstage (32 Channel) INTAN C3314
Stereotaxic frame Kopf 1530
TTL pulser Prizmatix 4031
Urethane Sigma U2500
Xylazine Alfa Aesar J61430
Software Company Version
Graphpad Prism GraphPad Software version 8
Intan Recording Controller Intantech version 2.07
Neuroexplorer Nex Technologies version 5.215
Plexon Offline Spike Sorter Plexon Inc version 4.5
ACSF Composition:
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).

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References

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

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न्यूरोसाइंस अंक 163 सर्किट ऑप्टोजेनेटिक्स एएवी फायरिंग दर वीवो में रिकॉर्डिंग
हिप्पोकैम्पस में वेंट्रल टेगमेंटल एरिया ग्लूटामेट टर्मिनल्स के वीवो शारीरिक और कार्यात्मक ट्रेसिंग में संयुक्त
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Shrestha, A., Adeniyi, P. A.,… More

Shrestha, A., Adeniyi, P. A., Ogundele, O. M. Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus. J. Vis. Exp. (163), e61282, doi:10.3791/61282 (2020).

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