Summary
Her metoder præsenteres for at forstå anti-cancer virkninger af Lactobacillus celle-fri supernatant (LCFS). Kolorektal cancer cellelinjer viser celledødsfald, når de behandles med LCFS i 3D kulturer. Processen med at generere sfæroider kan optimeres afhængigt af stilladset, og de fremlagte analysemetoder er nyttige til evaluering af de involverede signalveje.
Abstract
Dette manuskript beskriver en protokol til at evaluere kræftcelledødsfald i tredimensionelle (3D) sfæroider af multicellulære typer kræftceller ved hjælp af supernatants fra Lactobacillus fermentumcellekultur , betragtes som probiotikakulturer. Brugen af 3D-kulturer til at teste Lactobacillus cellefri supernatant (LCFS) er en bedre mulighed end test i 2D monolayers, især da L. fermentum kan producere anti-cancer effekter i tarmen. L. fermentum supernatant blev identificeret til at besidde øget anti-proliferative virkninger mod flere kolorektal cancer (CRC) celler i 3D-kultur betingelser. Interessant nok var disse virkninger stærkt relateret til kulturmodellen, hvilket demonstrerede L. fermentums bemærkelsesværdige evne til at fremkalde kræftcelledød. Stabile sfæroider blev genereret fra forskellige CRCs (kolorektal cancerceller) ved hjælp af protokollen præsenteret nedenfor. Denne protokol til generering af 3D-sfæroid er tidsbesparende og omkostningseffektiv. Dette system blev udviklet til nemt at undersøge anti-cancer virkninger af LCFS i flere typer af CRC sfæroider. Som forventet, CRC sfæroider behandlet med LCFS stærkt induceret celledød under forsøget og udtrykt specifikke apoptose molekylære markører som analyseret af qRT-PCR, vestlige blotting, og FACS analyse. Derfor er denne metode værdifuld til at udforske celle levedygtighed og evaluere effekten af anti-cancer medicin.
Introduction
Probiotika er de mest fordelagtige mikroorganismer i tarmen, der forbedrer immunhomøostase og vært for energimetabolisme1. Probiotika fra Lactobacillus og Bifidobacterium er de mest avancerede af sin art, der findes i tarmen2,3. Tidligere undersøgelser har vist, at Lactobacillus har hæmmende og antiproliferative virkninger på flere kræftformer, herunder kolorektal cancer4. Desuden forhindrer probiotika inflammatoriske tarmsygdomme, Crohns sygdom og colitis ulcerosa5,6. Men de fleste undersøgelser med probiotika blev udført i todimensionelle (2D) monolag, der dyrkes på faste overflader.
Kunstige kultursystemer mangler miljømæssige træk, hvilket ikke er naturligt for kræftceller. For at overvinde denne begrænsning er der udviklet tredimensionelle (3D) kultursystemer7,8. Kræftceller i 3D viser forbedringer med hensyn til grundlæggende biologiske mekanismer, såsom celle levedygtighed, spredning, morfologi, cellecellekommunikation, lægemiddelfølsomhed og in vivo relevans9,10. Desuden er sfæroider fremstillet af flercellede typer af kolorektal cancer og er afhængige af cellecelleinteraktioner og den ekstracellulære matrix (ECM)11. Vores tidligere undersøgelse har rapporteret, at probiotiske celle-fri supernatant (CFS) produceret ved hjælp af Lactobacillus fermentum viste anti-cancer virkninger på 3D kulturer af kolorektal cancer (CRC) celler12. Vi foreslog, at CFS er en passende alternativ strategi til test af probiotiske virkninger på 3D-sfæroider12.
Her præsenterer vi en tilgang, der kan rumme flercellede typer af 3D-kolorektal cancer til analyse af terapeutiske virkninger af probiotisk cellefri supernatant (CFS) på flere 3D-kolorektal cancer-efterligningssystemer. Denne metode giver et middel til analyse af relaterede probiotiske og anti-cancer effekter in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriecellekulturer og forberedelse af Lactobacillus cellefri supernatant (LCFS)
BEMÆRK: Trin 1.2 – 1.9 udføres i et anaerobt kammer.
- Forbered en MRS agar plade og bouillon, der indeholder L-cystein og sterilisere ved autoklavering.
- Forinkubat MRS agar-pladen i H2 anaerobt kammer, der holdes ved 37 °C med 20 ppm ilt.
- Tø Lactobacillus bakteriebestand og pod agarpladen med bakteriekulturen(figur 1A i)).
- Inkuber bakterier i 2 - 3 dage i H2 anaerobt kammer ved 37 °C og 20 ppm ilt, indtil der opnås enkelte bakteriekolonier.
- Vask og tør Hungate type anerobisk kultur rør. Dyrkningsrøret skal autoklavers ved 121 °C i 15 min.
- Derefter inkuberes røret i H2 anaerobt kammer ved 37 °C og 20 ppm ilt for at fjerne ilt.
- Placer 2 - 3 mL MRS bouillon i røret. Forsegl røret med en butylgummiprop og skru hætten.
- Få en enkelt koloni med en løkke og læg den i 1,5 mL dyrkningsrøret med 500 μL 1x PBS. (Figur 1A (ii)).
- Kolonien suspenderes med en 1 mL sprøjte(figur 1A iii). Gør dette ved at indsætte nålen på 1 mL sprøjten i midten af rørlåget, indsugning af den suspenderede koloni og derefter genbruge den tilbage i MRS bouillonmediet. (Figur 1A (iv)).
- Inkuber MRS-bouillonmediet i en shakerinkubator i 2 dage (37 °C, 5% CO2, 200 omdrejninger i minuttet).
- Den optiske massefylde måles ved hjælp af et spektrofotometer til overvågning af bakterielle vækstkurver, indtil absorbansen ved OD620 når op på 2,0.
- Adskil bakteriepillerne og det betingede medie ved centrifugering ved 1.000 x g i 15 min. De opsamlede bakteriepiller vaskes med 1x PBS og genbruges i 4 mL RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt kvægserum. Medtag ikke antibiotika i mediet.
- Bakteriepillerne opbevares i RPMI og inkuberes i en shakerinkubator i 4 timer ved 37 °C med 5% CO2 ved en hastighed på 100 omdrejninger i minuttet.
- Til fremstilling af det probiotiske supernatant fjernes bakteriepillen via centrifugering ved 1000 x gi 15 minutter ved 4 °C. Sterilt filter det genvundne supernatant med et 0,22 μm filter og opbevares ved −80 °C, indtil det bruges.
2. Generation af sfæroider
-
Forberedelse af kolorektal cancer cellelinjer
- DLD-1-, HT-29- og WiDr-cellelinjerne vokses som monolag indtil 70-80 % sammenløb og inkuberer pladen ved 37 °C i en5 % CO 2-inkubator (Vækstmedium: RPMI indeholdende 10 % føtalt kvægserum (FBS) og 1 % penicillin-streptomycin).
- For celler, der dyrkes i 100 mm petriskål, vaskes pladen to gange med 4 mL 1x PBS. Der tilsættes 1 mL på 0,25% trypsin-EDTA, og petriskålen inkuberes i 2 minutter ved 37 °C i en 5% CO 2-inkubator for at adskille cellerne.
- Efter inkubation skal du kontrollere celleafstyreringen under et mikroskop og neutralisere trypsin-EDTA med 5 mL vækstmedium.
- De dissociated celler overføres til et 15 mL konisk rør og centrifuge i 3 min ved 300 x g.
- Den supernatant kasseres og genbruges forsigtigt med 3 mL vækstmedier.
- Tæl cellerne med trypan blå for at bestemme levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer. (Figur 1B i)
-
Sfærisk dannelse
- I et konisk rør på 15 mL fortyndes cellerne fra 2.1.5 for at opnå 1 - 2 x 105 celler/mL (figur 1B (ii))
- Tilsæt endelig koncentration på 0,6% methylcellulose til cellesuspensionen og overfør de fortyndede celler til et sterilt reservoir.
BEMÆRK: For hver cellelinje skal den nødvendige mængde methylcellulose titreres og bestemmes i overensstemmelse hermed. - Brug en multikanalpipette til at dispensere 200 μL celler til hver brønd af en ultralav fastgørelse 96-brønds rund bundmikroplade. (Figur 1B iii))
- Pladen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator i 24 - 36 timer.
- Efter 24 - 36 timer skal du observere pladen under et let mikroskop for at sikre sfæroiddannelse.
3. Behandling af 3D-kolorektal cancerceller med LCFS
- Generer sfæroider som beskrevet i trin 2 og 3.
- Før LCFS-behandlingen udføres, optøs den frosne LCFS ved stuetemperatur (RT) i 10 - 20 min.
- Pod LCFS-lageropløsningen i et vækstmedium. Fortyndes serielt til 25%, 12,5% og 6% i vækstmediet (dvs. 25% LCFS = 150 μL vækstmedium + 50 μL LCFS).
- Tag cellekulturpladen, der indeholder sfæroider, ud af inkubatoren, og fjern så meget af vækstmediet som muligt fra hver brønd ved hjælp af en 200 μL pipette.
- Vækstmediet tilsættes med LCFS på cellerne og inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator i 24 - 48 timer.
BEMÆRK: Det volumen, der skal anvendes, afhænger af pladestørrelsen som følger: 2 mL for 6-brønds cellekulturplader; 200 μL for 96-brønds cellekulturplader.
4. Celle levedygtighed for sfæroider
- Forbered 8 - 10 LCFS-behandlede kolorektal cancer sfæroider i uigennemsigtig-walled multi-well plader (celle levedygtighed assays udføres 48 timer efter LCFS behandling).
- Cellens levedygtighedsreagens (se materialetabel)optøs ved 4 °C natten over.
- Cellens levedygtighedsreagens udjævnet til stuetemperatur inden brug.
- Før du udfører analysen, skal du fjerne 50% af vækstmedierne fra sfæroiderne.
- Der tilsættes 100 μL reagens for celleerygtighed til hver brønd.
BEMÆRK: Det volumen, der skal anvendes, afhænger af pladestørrelsen som følger: 100 μL for 96-brønds cellekulturplader. - Bland reagenset kraftigt i 5 minutter for at fremme celle lysis.
- Inkuber i 30 min – 2 timer ved 37 °C.
- Optag luminescensen.
5. Kvantitativ polymerasekædereaktionsanalyse i realtid for sfæroider
- For hver tilstand skal du forberede 10 - 15 sfæroider i et 2 mL rør og centrifuge i 3 minutter ved 400 x g.
- Supernatanten kasseres og spheroiderne vaskes to gange i 1 mL iskold 1x PBS.
BEMÆRK: Undgå centrifugering, lad spheroiderne slå sig ned. - Aspirat så meget af 1x PBS som muligt og isolere RNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit.
- Syntetiser cDNA fra 1 μg RNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt i henhold til producentens protokol.
- Forbered en masterblanding til at køre alle prøver i tre eksemplarer (se tabel 1 og tabel 2).
- Forstærkningen udføres i en 20 μL af skabelonmasterblandingen i hver qPCR-pladebrønd.
- Bland reaktioner godt og spin om nødvendigt.
- Der udtages prøver i henhold til instrumentfabrikantens anbefalinger (tabel 3).
6. Vestlig blotting fra sfæroider
BEMÆRK: Når du opsamler kugleider, skal du bruge en 200 μL pipette og skære enden af spidserne for at undgå at forstyrre deres struktur.
- For hver tilstand skal du forberede 30 - 40 sfæroider i et 2 mL rør.
- Placer røret på is og lad spheroids slå sig ned til bunden af 2 mL røret.
- Kassér supernatanten og vask spheroiderne to gange i 1 mL iskold 1x PBS
BEMÆRK: Undgå centrifugering, lad spheroiderne slå sig ned. - Aspirat så meget af 1x PBS som muligt og tilsæt RIPA buffer med en protease inhibitor cocktail (10 sfæroider = 30 μL RIPA buffer).
- Lys cellerne ved at pipettere op og ned og udføre sonikering i 30 s med 30 s hvile på is i 10 cyklusser.
- Proteinet centrifuges ved 15000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Bestem proteinkoncentrationen for hvert cellelysat.
- Før indlæsning koges hvert cellelysat i en prøvebuffer ved 100 °C i 10 min.
- Læg lige store mængder protein i SDS-PAGE gelens brønde, og kør gelen i 1 - 2 timer ved 100 V.
- Overfør proteinet fra gelen til PVDF-membranen.
- Efter overførsel skal membranen blokeres i 1 time ved stuetemperatur ved hjælp af en blokeringsbuffer (5% skummetmælk + TBS med 0,05% Tween-20).
- Membranen inkuberes med 1:1.000 fortyndinger af primært antistof (tabel 4) i 1x TBST med 5% BSA-buffer ved 4 °C natten over.
- Vask membranen tre gange med TBST, 15 min for hver vask.
- Membranen inkuberes med 1:2.500 fortyndinger af sekundært antistof i blokeringsbufferen ved stuetemperatur i 2 timer (se Materialetabel).
- Vask membranen tre gange med TBST, 15 min for hver vask.
- Forbered membranen til HRP-detektion med et chemiluminescent substrat.
- Erhverve chemiluminescent billeder.
7. Propidium Iodide (PI) farvning af sfæroider
- Forbered 5-10 sfæroider som beskrevet i trin 4.1, og placer kugleformerne i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
- En 1 mg/mL bestand pi 1:100 fortyndes i 1x PBS.
- Fjern 50% af mediet fra hver brønd af 96-brøndspladen.
- Der tilsættes 100 μL PI-opløsningen til hver brønd, og brøndene anbringes i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i 10 - 15 min.
- Pi-opløsningen vaskes af med 1x PBS.
- Tilsæt 200 μL vækstmedium og tag et billede ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Analyser fluorescensintensiteten ved hjælp af billede J for at få fat i kræmoidens levedygtighedsantal.
8. FACS-analyse af sfæroider
- Generer sfæroider som beskrevet tidligere.
- For hver tilstand, forberede 30 - 40 sfæroider i en FACS rør og centrifuge i 3 min ved 400 x g og RT.
- Supernatanten aspireres, og spheroiderne vaskes i 3 mL 1x PBS, hvorefter de centrifuges ved 400 x g i 3 min ved 4 °C.
- Aspirere supernatanten og tilsæt 200 μL på 0,25% Trypsin-EDTA, og inkubter derefter ved RT i 2 -3 min.
BEMÆRK: Inkubationstiden afhænger af kuglestørrelsen og celletypen. - Der tilsættes 1 mL FACS-buffer, og spheroiderne adskilles forsigtigt ved hjælp af en 200 μL pipette.
- Centrifuge de dissociated celler ved 400 x g og 4 °C i 3 min.
BEMÆRK: FACS buffer = 1x PBS + 2,5% FBS, filtreret med et 0,22 μm topfilter. - Supernatanten kasseres, og der tilsættes 7-AAD/Annexin V-reagens (7AAD (5 μL), bilag V (5 μL)/prøve).
- Forsigtigt vortex cellerne og inkubere i 13 - 30 min på RT i mørke.
- Der tilsættes 500 μL FACS-buffer, og cellerne filtreres ved hjælp af koniske polystyrentestrør for at fjerne aggregerede celler.
- Centrifuge ved 400 x g og 4 °C i 3 min.
- Der tilsættes 500 μL af bilag I V-bindingsbufferen til hvert rør og opsættes igen.
- Analyser ved hjælp af et flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver protokollen for at opnå sfæroider fra forskellige kolorektal cancer cellelinjer. Tilskud med methylcellulose var påkrævet for at generere sfæroider. Vi præsenterer også en metode til LCFS forberedelse og præsentere en model til at studere sammenhængen mellem probiotika og kolorektal cancer. Dannelse af kugleformede og LCFS-forberedelsesprotokoller er skematisk illustreret i figur 1A,B. Som vist i figur 2Aomdanner methylcellulosekoncentrationen på 0,6% kræftcellerne til kompakte sfæroider. Dette resultat indikerer, at sfæroider kan genereres fra flere typer af kolorektal cancer ved hjælp af vores methylcellulose protokol. Dernæst blev sfæroiderne behandlet med 25% LCFS, og morfologien blev undersøgt efter 48 timer ved hjælp af et let mikroskop. Som vist i figur 3Audviste sfæroiderne i de grupper, der blev behandlet med LCFS, forstyrrede overflader. For at undersøge virkningerne af kræft i LCFS i passende koncentrationer blev sfæroiderne behandlet i 48 timer med forskellige doser LCFS: 0 (kontrol), 6%, 12,5% og 25%. Forstyrrelser i sfæroidmorfologien blev observeret i sfæroider behandlet med 25% LCFS, som vist i figur 3B. Derudover blev sfæroiderne behandlet med 25% LCFS i 24 timer og 48 timer, og forstyrrelser i sfæroidmorfologi blev observeret efter 48 timers behandling. Mikroskopiske billeder af spheroiderne er vist i figur 3C.
Efter 48 timer blev prøverne vurderet med celle levedygtighed assay, og kolorektal cancer celledød blev observeret ved behandling med LCFS i en dosis afhængig måde, højere LCFS beløb højere observeret celledød (Figur 3D). Vi farvede derefter prøverne med propidium jod (PI) for at observere apoptose. Som forventet var induktionen af apoptose afhængig af LCFS-dosis (figur 4A, B, C). RT-PCR blev udført for at påvise ændringer i molekylære markører for apoptose,dvs. Endelig blev apoptosemarkører undersøgt ved hjælp af vestlig blotting og Annexin V/7AAD gennem FACS(figur 6A, B, C, D). Disse observationer viser, at LCFS effektivt induceret apoptose i 3D-modellen.
Figur 1: Skematisk repræsentation af sfæroiddannelse og LCFS-præparat.
(A) Skematiske repræsentationsbilleder af LCFS-genereringsprotokollen er markeret med (i-iv) (B) Skemaer over den methylcellulosemedierede sfæroiddannelse er markeret med (i-iii). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Methylcellulose-medieret sfæroiddannelse.
(A) Repræsentative billeder af methylcellulose-medieret sfæroiddannelse af HT-29, DLD1 og WiDr. Celler blev seedet i ultra-lav vedhæftet fil 96-godt runde bundplader med methylcellulose koncentrationer på 0,1-1,2% for 48 timer. Skalabjælke 10 μm (n=3 for hvert forsøg). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vurdering af LCFS-koncentration og sfæroidmorfologi.
(A)Repræsentative billeder af HT-29 behandlet med LCFS i 48 timer. Skalastang 100 μm. (B) HT-29, DLD1 og WiDr-sfæroider behandlet med stigende doser LCFS i 48 timer. Alle sfæroider havde forstyrret kanter på 12,5-25% LCFS. Skalabjælke 20 μm (n=3 for hvert forsøg) (C) Sfæroid morfologier af HT-29, DLD1 og WiDr-sfæroider behandlet med 25% LCFS i 24 og 48 timer. Skalalinje 20 μm (n = 3) (D) Målt celle levedygtighed, vist som middel ± SEM. ***, P < 0,05 (n = 3 for hvert eksperiment). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Farvning af spheroiderne af propidium jod.
Repræsentative billeder af PI farvning i (A) HT-29, (B) DLD1, og (C) WiDr sfæroider efter 48 timer af LCFS behandling. Billederne blev erhvervet ved hjælp af et fluorescensmikroskop, og stigningen i PI-intensiteten blev målt ved hjælp af Image J. Scale bar 10 μm. Middelværdi ± SEM vises. , P < 0,05 (n = 3 for hvert forsøg). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Apoptosemarkører blev identificeret ved hjælp af qRT-PCR.
Apoptosemarkører, såsom BAX, BAK og NOXA, blev kvantificeret. mRNA-kvantificering præsenteres som et relativt udtryk normaliseret til (A) β-actin og (B) 18s rRNA. Middelværdi ± SEM vises. , P < 0,05 (n=3 for hvert eksperiment). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Apoptosemarkører blev bestemt ved hjælp af vestlig blotting og FACS-analyse af sfæroiderne.
Vist i figuren er vestlige blots af (A) HT-29, (B) DLD1, og (C) WiDr celler efter LCFS behandling. PARP1, BCL-XL og p-IκBα blev fundet. β blev brugt som intern kontrol. (D) FACS-analyse af apoptose i HT-29, DLD1 og WiDr-sfæroider, der inkuberes med LCFS. Apoptotiske celler blev påvist ved stigningen i fluorescensintensiteten i Annexin V-FITC. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reaktion | Volumen pr. enkelt 20 μL |
| 2X qPCR-blanding | 10 μL |
| Fremad primer (10 pmols/μL) | 1 μL |
| Omvendt primer (10 pmols/μL) | 1 μL |
| cDNA (50 ng/μL) | 1 μL |
| PCR-kvalitet vand | 7 μL |
Tabel 1: PCR-reaktionsblanding.
| Primer | Sekvens |
| BAX-Fremad | CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG |
| BAX-omvendt | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT |
| BAK-Forward | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA |
| BAK-omvendt | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| NOXA-Fremad | ACCAAGKTRINGSTGCGATT |
| NOXA-omvendt | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| 18s rRNA-Forward | GATGGGCGGCGGAAAATAG |
| 18s rRNA-omvendt | GCGTGGATTCTGCATAATGGT |
| β-Akt i-Forward | TCCTGTGGCATCCACGAAACT |
| β-Actin-omvendt | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
Tabel 2: Primer-sekvenser, der anvendes i qRT-PCR-analyse.
| Stadie | Temp (ºC) | Tidspunkt |
| Indledende denaturering | 95 | 10 min. |
| 40 cyklusser: | ||
| Trin 1 | 95 | 15 sek. |
| Trin 2 | 60 | 60 sek. |
| Smeltningskurvestadie | 95 | 15 sek. |
| 60 | 60 sek. | |
| 95 | 15 sek. | |
Tabel 3: QRT-PCR-betingelser.
| Antistof | Fortynding |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β (C4) | 1:1000 |
| Ged Anti-Mouse IgG (H +L) | 1:2500 |
| Ged Anti-Kanin IgG (H +L) | 1:2500 |
Tabel 4: Antistoffer, der anvendes i western blot-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vævsmikromiljøet, herunder naboceller og den ekstracellulære matrix (ECM), er grundlæggende for vævsgenerering og afgørende for kontrollen med cellevækst og vævsudvikling13. 2D-kulturer har dog flere ulemper, såsom afbrydelse af cellulære interaktioner samt ændringer i cellemorfologi, ekstracellulære miljøer og tilgangen til division14. 3D-cellekultursystemer er blevet grundigt undersøgt for bedre at reproducere in vivo-effekter og er blevet bevist som mere præcise systemer til in vitro-kræfttest15,16. Der er behov for modelsystemer til mere præcist at forudsige personlige reaktioner på kemoterapeutik17.
3D stilladser blev udviklet til vævsteknik. Det fungerer som et surrogat tab af ECM, der repræsenterer den tilgængelige plads af tumorceller. Desuden giver stilladset fysiske interaktioner for cellevedhæftning og spredning og får celler til at danne passende rumlige fordelinger og celle-ECM- eller cellecelleinteraktioner18. Den methylcellulose (MC) polymer er løbende blevet undersøgt for at bestemme dens egnethed til at generere MC-baserede hydrogel systemer til applikationer i 3D celle kultur engineering19,20. Men den intakte inkorporering af disse hydrogels i biomaterialer som 3D-cellenetværk forbliver teknisk udfordrende21. Derfor anbefaler den sfæroiddannelsesprotokol, der præsenteres her, titreringen af MC-koncentrationer og optimering med forskellige tidspunkter for hver CRC-cellelinje. Cellelinjespecifikke egenskaber, såsom cellesammenlægning, levedygtighed og død, kan påvirke hver af de betingelser, vi testede, betydeligt. Denne metode kan give et middel til at generere ensartede sfæroider til test af LCFS på kræftceller.
Probiotika, som er gavnlige bakterier, producerer aktive metabolitter, der potentielt kan efterligne anti-cancer effekter. Således var vores undersøgelse designet til at isolere mælkesyrebakterier (LAB) og teste anti-cancer-virkningerne af deres metaboliske ekstrakter fra cellefrie supernatants (CFS). Vores undersøgelser gav en metode til at observere virkningerne af L. fermentum celle-fri supernatants, der fremkalder apptotisk celledød i kolorektal cancer celler i et 3D-system. MRNA-niveauerne af apoptosemarkører, der er involveret i apptotiske veje, induceres dramatisk efter LCFS-eksponering i 3D-tilstande. Desuden blev der udtrykt et reduceret niveau af PARP1 og BCL-XL i den LCFS-behandlede 3D-sfæroidkontrol sammenlignet med styringen i figur 4C, D,E. Hæmning af NF-κB aktivering blev også observeret i 3D-kulturer efter behandling med LCFS. Samlet set omfatter fordelene ved at dyrke celler i 3D stigende cellecelleinteraktioner og reaktioner på signalmolekyler for bedre at efterligne in vivo-systemer. Vestlig blotting ved hjælp af sfæroider kan føre til kvantitativ indsigt i tilstanden af forskellige signalmolekyler.
Cellelinjer har visse begrænsninger som prækliniske modeller af kræftforskning. For nylig, kræft organoider er blevet udnyttet i modellering af personlig anti-cancer terapi22,23. Behandlingen af LCFS med probiotika i organoider forventes at blive brugt som en kraftfuld platform til at teste anti-cancer effekter. Desuden testede vi kun en af Lactobacillus-arten blandt de forskellige probiotika i kræftmodellen. Forskellige probiotika testes også for forebyggelse af metabolisk syndrom, immunologiske og neurologiske lidelser24,25,26. LCFS fra Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, Enterococcusog Akkermansia arter er potentielle kandidater til testning af sundhedsmæssige fordele gennem forskellige typer sygdomsmodeller27,28,29.
Baseret på denne undersøgelse kan det konkluderes, at forståelsen af signalering i sfæroider og de forskellige reaktioner på LCFS-behandling i 3D-modeller kan være gavnlig for test af kræftrelaterede virkninger ved hjælp af den metode, vi foreslog. Derudover kan 3D-kræftmodeller give flere fordele, der ikke er mulige med traditionelle 2D-monolag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante finansielle oplysninger.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af "Etablering af målestandarder for kemi og stråling", tilskudsnummer KRISS-2020-GP2020-0003 og "Udvikling af målestandarder og teknologi til biomaterialer og medicinsk konvergens", tilskudsnummer KRISS-2020-GP2020-0004-programmer, finansieret af Korea Research Institute of Standards and Science. Denne forskning blev også støttet af Ministeriet for Videnskab og IKT (MSIT), National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), Ministeriet for Sundhed og Velfærd (MOHW), Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), Ministeriet for Handel, Industri & Energi (MOTIE) og Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350). ORCID ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Vi takker Chang Woo Park for hjælp med eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
- Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
- Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
- Harish, K., Varghese, T.
- Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
- Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
- Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
- Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
- Drost, J., Clevers, H.
- Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
- Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F.
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
- Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
- Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).
