Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Røntgenkrystallografi for å studere oligomerisk tilstand overgang av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61288
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology, Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

Denne protokollen er utviklet for å studere dimer-dodecamer overgangen av TmPep1050, en M42 aminopeptidase, på strukturelt nivå. Det er en enkel rørledning som starter fra proteinrensing til røntgendatabehandling. Krystalllogenese, datasettindeksering og molekylær erstatning har blitt vektlagt gjennom et tilfelle av studier, TmPep1050H60A H307A-variant.

Abstract

M42 aminopeptidaser danner funksjonelt aktive komplekser laget av 12 underenheter. Deres monteringsprosess ser ut til å være regulert av deres metallionkofaktorer som utløser en dimer-dodecamer overgang. Ved binding av metallion forekommer flere strukturelle modifikasjoner på det aktive stedet og på interaksjonsgrensesnittet, og former dimers for å fremme selvmonteringen. For å observere slike modifikasjoner må stabile oligomerer isoleres før strukturstudier. Rapportert her er en metode som tillater rensing av stabile dodecamers og dimers av TmPep1050, en M42 aminopeptidase av T. maritima, og deres struktur bestemmelse av røntgenkrystallografi. Dimers ble utarbeidet fra dodecamers ved å fjerne metallioner med et chelating middel. Uten sin kofaktor ble dodecamers mindre stabile og ble fullstendig dissosiert ved oppvarming. De oligomeriske strukturene ble løst ved den enkle molekylære erstatningstilnærmingen. For å illustrere metodikken presenteres strukturen til en TmPep1050-variant, helt svekket i metallionbinding, som ikke viser ytterligere nedbryting av dimers til monomerer.

Introduction

Oligomerisering er en dominerende prosess som dikterer de biologiske funksjonene til mange proteiner. I Escherichia colier det anslått at bare 35% av proteinene er monomeriske1. Noen proteiner, kalt morfoseiner, kan til og med vedta flere oligomeriske tilstander med underenheter som har distinkt struktur i hver oligomeriske tilstand2. Overgangen mellom deres oligomeriske tilstander er ofte et middel til å regulere proteinaktivitet, da hver oligomeriske tilstand kan ha en annen spesifikk aktivitet eller funksjon. Flere eksempler på morfoeiner har blitt godt dokumentert i litteraturen, spesielt porphobilinogen synthase3, HPr kinase / fosfat dehydrogenase7, pyruvat dehydrogenase6, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase7, pyruvat kinase8, citrate synthase9, og ribonuclease A10. Nylig beskrev vi M42 aminopeptidase TmPep1050, et annet eksempel på enzym med morfeeinlignende oppførsel, hvis aktivitet avhenger av oligomeriske tilstander11. Overgangen mellom de oligomeriske statene er mediert av sine metalliske kofaktorer som induserer flere strukturelle modifikasjoner av underenhetene.

M42 aminopeptidase familien tilhører MH klanen12,13, og er utbredt blant bakterier og Arkaea14. M42 aminopeptidasene er ekte dinukleærenzymer som nedbryter peptider opptil 35 aminosyrerester i lengde15. De vedtar en særegen tetrahedron-formet struktur laget av 12 underenheter med sine aktive steder orientert mot et indre hulrom. Et slikt arrangement blir ofte beskrevet som en nano-compartmentalization av aktiviteten for å unngå ukontrollert proteolyse. Den fysiologiske funksjonen til M42 aminopeptidasene kan være forbundet med proteasom, hydrolyserende peptider som følge av proteinnedbrytning16,17. Pyrococcus horikoshii har fire M42 aminopeptidaser, hver presenterer distinkte, men komplementære spesifisiteter18,19,20,21. Entall, heterocomplexes laget av to forskjellige typer underenheter har blitt beskrevet i P. horikoshii, noe som tyder på eksistensen av peptidasome komplekser22,23.

Flere strukturer av M42 aminopeptidaser har blitt beskrevet ilitteraturen 11,16,18,19,20,24,25,26. Underenheten består av to forskjellige domener, et katalytisk domene og et dimmeriseringsdomene. Det katalytiske domenet vedtar en felles α / β fold bevart i hele MH-klanen, det arketypiske katalytiske domenet er aminopeptidase Ap1 av Vibrio proteolyticus27. Dimeriseringdomenet vedtar en PDZ-lignende fold16 og kan ha, i tillegg til sin rolle i oligomeriseringen, en rolle i å kontrollere substrattilgang og binding i det indrehulrommet 11. Som den grunnleggende byggesteinen er en dimer, blir dodecamer ofte beskrevet som foreningen av seks dimers, hver dimer blir plassert på hver kant av tetrahedron16. Oligomeriseringen av M42-aminopeptidasene er avhengig av tilgjengeligheten av metallkofaktorene. Divalente metallioner, ofte Zn2+ og Co2+, er katalytisk involvert i peptidbindingen og hydrolysen. De finnes i to forskjellige bindingssteder, nemlig M1 og M2 nettsteder. De to metallionene kjører og finjusterer også oligomeriseringen som demonstrert for PhTET2, PhTET3, PfTET3 og TmPep105011,24,28,29. Når metallkofaktorene er tømt, demonteres dodecameren i dimers, som i PhTET2, PhTET3 og TmPep105011,16,28eller til og med monomerer, som i PhTET2 og PfTET324,29.

Presentert her er en protokoll som brukes for å studere strukturene til TmPep1050 oligomers. Denne protokollen er et sett med vanlige metoder, inkludert proteinrensing, proteolytisk aktivitetsscreening, krystallisering, røntgendiffraksjon og molekylær erstatning. Finesser som er iboende til å håndtere metalloenzymer, protein oligomerisering, proteinkrystallisering og molekylær erstatning er vektlagt. Et tilfelle av studier er også presentert for å vise om TmPep1050 dodecamers kan ytterligere dissosiere til monomerer eller ikke. For å løse dette spørsmålet har en TmPep1050-variant, TmPep1050H60A H307A, blitt studert hvis metallbindingssteder er svekket ved å mutere His-60 (M2-området) og His-307 (M1-området) til Ala-rester. Denne protokollen kan innkvarteres for å studere andre M42 aminopeptidaser eller metalloenzymer med morfoein-lignende atferd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produksjon og rensing av rekombinant TmPep1050

MERK: Heretter er beskrevet kloning prosedyre og rensing av vill-type TmPep1050 tilpasset fra en tidligere studie11. Alternativt kan kloningen gjøres ved hjelp av et syntetisk gen. Hvis du vil generere TmPep1050-varianter, kan områderettet mutagenese utføres følgende, for eksempel én primerreaksjonene i parallellprotokoll (SPRINP)-metoden30. Renseprotokollen kan brukes for TmPep1050-varianter. Bruken av His-tag bør unngås da det forstyrrer metallionbinding.

  1. Uttrykk vektor design
    1. Erverv genomisk DNA av Thermotoga maritima MSB8 (ATCC 43589) eller TmCD00089984 (Joint Center for Structural Genomics).
    2. Forsterke den TM_1050 leserammen (ORF) ved hjelp av enten genomisk DNA eller malplasmid, en high-fidelity DNA polymerase, og følgende primere: ocej419 (5'- TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATACCCATGAAGGAACTGATCAGAAAGCTG) og ocej420 (5'- ATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGGAGACCGTTTACGCCCCCAGATATGATGAG). Kjør polymerasekjedereaksjonen (PCR) screening i henhold til følgende skjema: 5 min ved 95 °C, 30 sykluser på 3 trinn (30 s ved 95 °C, 30 s ved 55 °C, 90 s ved 72 °C) og 10 min ved 72 °C som siste trinn.
    3. Klone PCR-fragmentet i en passende uttrykksvektor (Materialstabell ) ved homolog rekombinasjon (figur 1) i E. coli i henhold til SLiCE-protokollen31. Til 50 ng av lineærisert vektor, legg til PCR fragment i en 10:1 molar forholdet mellom fragment og vektor, 1 μL PPY-stammeekstrakt, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2,10 mM ATP og 10 mM dithiothreitol (DTT) for et reaksjonsvolum på 10 μL. Inkuber i 1 t ved 37 °C.
    4. Forvandle kjemisk kompetent E. coli XL1 blå stamme (eller en hvilken som helst recA- egnet belastning) med 1 μL rekombinasjonsreaksjon. Plate cellene på LB medium som inneholder 100 μg / ml ampicillin. Inkuber platene over natten ved 37 °C.
    5. Plukk kolonier på ferske LB plater med 100 μg / ml ampicillin. Inkuber platene ved 37 °C i minst 8 timer.
    6. Skjerm for positive kandidater av koloniEN PCR ved hjelp av egnet primer par (5'- ATGCCATAGCATTTTTATCC og 5 '- ATTTAATCTGTATCAGGC hvis du bruker den anbefalte vektoren oppført i Materials tabell). Med en mikrotipsende riper du en plukket koloni og overfører cellene til 20 μL reaksjonsblanding som inneholder 0,5 μM av hver primer og 10 μL av en kommersiell Taq DNA polymeraseblanding.
    7. Kjør PCR screening i henhold til følgende skjema: 5 min ved 95 °C som denaturation trinn, 30 sykluser på 3 trinn (30 s ved 95 °C, 30 s ved 55 °C, 90 s ved 72 °C), og 10 min ved 72 °C som siste trinn.
      MERK: PCR-reaksjonene kan oppbevares over natten i PCR-maskinen ved 12 °C.
    8. Legg 10 μL av hver PCR-reaksjon på en 0,8 % agarosegel tilberedt i Tris-acetat-EDTA (TAE)-buffer. Kjør elektroforesen i 25 min ved 100 V.
      MERK: En 1,1 kbp amplicon forventes.
    9. Trekk ut plasmider fra kandidater ved hjelp av et kommersielt sett (Table of Materials) og sekvenser dem ved hjelp av samme primerpar som ble brukt i trinn 1.1.6.
  2. Cellekultur
    MERK: Når en passende kandidat er identifisert ved sekvensering, kan klone brukes direkte som uttrykk hvis du bruker den anbefalte vektoren (Materialsekk). I så fall styres uttrykket av den arabinose-induserbare PBAD-arrangøren 32.
    1. Inokuler 10 ml LB medium som inneholder 100 μg/ml ampicillin med kandidaten og inkubere prekulturen over natten ved 37 °C under orbital risting. Tilsett 5 ml av forkulturen til 1 L LB medium med 100 μg /ml ampicillin. Husk å respektere et luft-til-væskeforhold på 3.
    2. La cellene vokse ved 37 °C under orbital risting. Overvåk den optiske tettheten ved 660 nm (OD660).
    3. Når OD660 har nådd 0,5-0,6, kjøler du kulturen raskt i 5 min på is og overfører den til en inkubator satt til 18 °C.
    4. Tilsett 0,2 g/L arabinose for å indusere genuttrykk og inkubere i 12–18 timer ved 18 °C.
    5. Høst celler ved å sentrifugere kulturen ved 6000 x g i 30 min ved 4 °C. Kast de overnaturlige og vask cellene med 100 ml på 0,9 % (w/v) NaCl.
    6. Sentrifuge igjen ved 6000 x g i 15 min ved 4 °C og kast supernatanten.
      MERK: Cellepellets kan brukes direkte til proteinekstraksjon eller oppbevares ved -80 °C.
  3. Proteinrensing
    1. Resuspend celle pellets i 40 ml av 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2,pH 7.2. Tilsett 1 μL av 25 U/μL DNA/RNA-endonukleær og én tablett proteasehemmercocktail som ikke inneholder EDTA. Sonicate suspensjonen i pulsmodus under kjøling i 30 min.
    2. Sentrifuger råoljeekstraktet ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C. Samle supernatant og varme den i et vannbad ved 70 °C i 10 min.
    3. Sentrifuger den denaturerte celleekstraktet ved 20 000 x g i 30 min ved 4 °C og samle supernatanten for rensing.
    4. Bruk egnet anion utveksling harpiks (Table of Materials) pakket i en kolonne på ~ 15 ml volum. Se produsentens anbefalinger for arbeidsstrømningshastigheten og kolonnetrykkgrensen. Likevekt harpiksen med 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2,pH 7.2.
    5. Last supernatanten som er samlet inn fra trinn 1.3.3 inn i kolonnen. Overvåk absorbansen til eluatet ved 280 nm. Når den har nådd grunnlinjen, fortsett til elution.
    6. Påfør en gradering fra 0 til 0,5 M NaCl i 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2,pH 7.2 for 5 kolonnevolumer (CV). Vent til konduktiviteten er stabilisert og absorbansen har nådd grunnlinjen.
    7. Påfør en endelig gradient fra 0,5 til 1 M NaCl i 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2,pH 7.2 for 1 CV.
    8. Analyser noen fraksjoner (se figur 2A for veiledning) ved natrium dodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).
      MERK: TmPep1050 vises som et 36 kDa-band etter Coomassie-farging. Alternativt kan tilstedeværelsen av TmPep1050 bekreftes ved aktivitetsanalyse (se pkt. 2.1). På dette trinnet kan fraksjoner lagres ved 4 °C over natten.
    9. Legg sammen brøkene som inneholder TmPep1050 og tilsett fint malt pulver av (NH4)2SO4 for å oppnå en konsentrasjon på 1,5 M (NH4)2SO4. Bland forsiktig ved å snu røret opp ned til fullstendig oppløsning.
    10. Bruk hydrofobe interaksjonsharpiks (Table of Materials) pakket i en kolonne på ~ 30 ml volum. Se produsentens anbefalinger for arbeidsstrømningshastigheten og kolonnetrykkgrensen. Likevekt harpiksen med 50 mM MOPS, 1,5 M (NH4)2SO4,1 mM CoCl2,pH 7.2.
    11. Legg prøven på kolonnen og overvåk absorbansen av eluatet ved 280 nm. Når absorbansen har nådd baseline, elute bundet proteiner ved å bruke en gradient fra 1,5 M til 0 M (NH4)2SO4 i 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2 for 5 CV.
    12. Analyser noen brøker (se Figur 2B for veiledning) av SDS-PAGE.
      MERK: TmPep1050 vises som et 36 kDa-band etter Coomassie-farging. Alternativt kan tilstedeværelsen av TmPep1050 bekreftes ved aktivitetsanalyse (se pkt. 2.1). På dette trinnet kan fraksjoner lagres ved 4 °C over natten.
    13. Pool brøkene som inneholder TmPep1050 og konsentrere seg til 2 ml ved hjelp av ultrafiltrering enheter med 30 kDa cutoff (Table of Materials). Fortsett til pkt. 1.4 for å bestemme den molekylære vekten.
  4. Størrelse eksklusjon kromatografi
    1. Bruk størrelse ekskluderingharpiks( Table of Materials ) pakket i en kolonne på ~ 120 ml volum. Se produsentens anbefalinger for arbeidsstrømningshastigheten og kolonnetrykkgrensen. Likevekt harpiksen med 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4,1 mM CoCl2,pH 7.2.
    2. Legg prøven på kolonnen og overvåk absorbansen av eluatet ved 280 nm. Fraksjoner fra kolonnen dødt volum (~0,33 CV) til slutten av elution (1 CV).
    3. Mål elutionvolumet for hver observerte topp.
      MERK: For veiledning, dodecameric TmPep1050 elutes på ~ 82 ml (Figur 3A) under gjeldende eksperimentelle forhold, mens dimeric TmPep1050, for eksempel TmPep1050H60A H307A variant, elutes på ~ 95 ml (Figur 3B). Noen TmPep1050 kan vedta både oligomeriske former, for eksempel TmPep1050H60A (Figur 3C).
    4. Analyser brøker som tilsvarer maxima og haler av observerte topper ved hjelp av SDS-PAGE.
      MERK: TmPep1050 vises som et 36 kDa-band etter Coomassie-farging.
    5. Pool brøkdeler av hver topp og konsentrere seg ved hjelp av ultrafiltrering enheter med 30 kDa cutoff(Table of Materials) for å oppnå en konsentrasjon på ~ 300 μM.
    6. Mål absorbansen ved 280 nm på et nanovolumspektrofotometer og beregn konsentrasjonen ved hjelp av den molekylære utryddelseskoeffisienten på 18 910 M-1 cm-1.
    7. Oppbevar det rensede proteinet ved -18 °C.
    8. For å bestemme den molekylære vekten kalibrerer du kolonnen for størrelseekskludering kromatografi (SEC) ved hjelp av molekylære vektstandarder (Table of Materials). Analyser standardene ved hjelp av 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4,1 mM CoCl2 pH 7.2 som løpebuffer.

2. Aktivitetsanalyse og apo-enzympreparat

MERK: Opprinnelig ble apo-enzymet tilberedt ved å fortynne 1 volum TmPep1050 i 10 volumer på 2,1 M eplesyre pH 7.0 og konsentrere seg tilbake til 1 volum før dialyse11. Nedenfor presenteres en alternativ prosedyre ved hjelp av 110-fenantroid, en metallionchelator. Denne prosedyren reduserer proteintap og gir de samme resultatene enn den tidligere publiserte metoden.

  1. Aktivitetsanalyse
    1. Forbered en lagerløsning på 100 mM L-Leucine-p-nitroanilid (Table of Materials) i metanol.
    2. Tilsett 25 μL på 100 mM L-Leucine-p-nitroanilid i 965 μL på 50 mM MOPS, 250 μM CoCl2,pH 7,2, 10% metanol. Forhåndsdebatt reaksjonsblandingen ved 75 °C i et tørt bad.
    3. Fortynn enzymet i 50 mM MOPS pH 7,2 til en konsentrasjon på 1 μM. Tilsett 10 μL i reaksjonsblandingen, virvelen og inkuber ved 75 °C enten til det har blitt gulaktig eller i 1 time.
    4. Stopp reaksjonen ved å tilsette 1 ml 20% eddiksyre. Vortex godt og la den avkjøles til romtemperatur.
    5. Overfør reaksjonsblandingen i en spektrofotometercelle. Les absorbansen ved 410 nm mot en negativ kontroll (inkubert reaksjonsblanding uten enzym).
  2. Apo-enzympreparat
    1. Forbered en lagerløsning på 1 M 1,10-fenantrolin i etanol. Tilsett 10 μL μL 1,10-fenantroid lagerløsning til 890 μL på 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4,pH 7,2. Tilsett 100 μL renset TmPep1050 (300 μM–1 mM konsentrasjon).
    2. Kontroller aktivitetstapet ved hjelp av aktivitetsanalysen som er beskrevet i pkt. 2.1 uten å legge til CoCl2 i reaksjonsblandingen.
    3. Overfør prøven i et dialyserør. Dialyser mot 200 ml på 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4,pH 7,2 ved 4 °C. Byr tre ganger dialysatet med frisk buffer under 48-h dialyse.
    4. Samle prøven fra dialyserøret og konsentrat tilbake til 100 μL ved hjelp av ultrafiltreringsenheter med 30 kDa cutoff (Table of Materials). Kontroller konsentrasjonen ved å lese absorbansen ved 280 nm ved hjelp av et nanovolumspektrofotometer.
  3. Dimer forberedelse
    1. Fortynn apo-enzymet til en konsentrasjon på 1 μM i 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4,pH 7,2. Inkuber i 2 timer ved 75 °C i et tørt bad, og la prøven avkjøles til romtemperatur.
    2. Konsentrer prøven til en enzymkonsentrasjon på minst 50 μM. Kontroller den molekylære vekten av SEC (se pkt. 1.4). Elution toppen må skifte fra ~ 82 ml til ~ 95 ml (under gjeldende eksperimentelle forhold).

3. TmPep1050 krystallisering

MERK: Proteinkrystallisering forblir en empirisk vitenskap, da det er et multifaktorielt fenomen33. Mens noen parametere kan identifiseres og kontrolleres (for eksempel temperatur, pH, nedbørsmiddelkonsentrasjon), kan andre påvirke krystalliseringen unnvikende (som protein og kjemisk renhet, proteolyse, prøvehistorikk). I dag håndteres proteinkrystallisering på en rasjonell og systematisk måte takket være en haug med kommersielle krystalliseringsscreeningsforhold og automatisering. Optimaliseringen av en krystalliseringstilstand er imidlertid for det meste avhengig av en prøvings-og-feiling-tilnærming. Heretter er beskrevet en blåkopi for krystallisering av proteiner og flere tips for å optimalisere krystalliseringsforholdene.

  1. Krystallisering screening
    MERK: Ved hjelp av kommersielle krystalliseringssett er krystaller av dodecameric TmPep1050 oppnådd i 2,2 M DL-malsyre pH 7,0, 0,1 M Bis-Tris propan pH 7,0 og 0,18 M tri-ammoniumsitrat, 20% polyetylenglykol (PEG) 3350. Krystaller av dimerisk TmPep1050 er oppnådd i 0,1 M natriumsitrat pH 5,6, 0,2 M ammoniumacetat, 30 % PEG4000. Krystaller av dodecamers vises innen en uke og nå sin fulle størrelse i en måned. Krystaller av dimers vises vanligvis innen 24 timer og vokser til full størrelse i en uke.
    1. Skaff deg flere kommersielle krystalliseringssett (se Eksempler).
    2. Sett opp krystalliseringsplater (Materialtabell )for hengende slippmetoden. Fyll brønnene med 500 μL av hver løsning av et krystalliseringsscreeningssett.
    3. For hver brønn, sett opp en krystalliseringsstøtte. På støtten, deponer en 1 μL dråpe renset protein (vanligvis ~ 10 mg / ml).
    4. Umiddelbart pipet 1 μL krystalliseringsløsning fra brønnen. Tilsett det forsiktig til proteindråpen og bland forsiktig ved å pipetter opp ned tre ganger. Dråpen må forbli semispherical uten bobler.
    5. Skru støtten oppå den tilsvarende brønnen. Gjenta operasjonen for hele settet.
    6. Etter å ha satt opp platene, observere hver dråpe med kikkert. Se brukerhåndboken for krystalliseringssettet for tolkning (klar dråpe, faseseparasjon, utfelling, nåler osv.).
    7. Inkuber platene ved 20 °C. Kontroller platene én gang per dag i løpet av den første uken og én gang i uken etterpå.
    8. Score hver brønn ved hjelp av resultatarket og brukerhåndboken som følger med krystalliseringssettene.
  2. Optimalisering av krystallisering
    MERK: De første krystalliseringsforholdene for dodecameric TmPep1050 er optimalisert til 2,1 M DL-malsyre pH 6,75 og 0,18 M tri-ammonium citrate pH 7,5, 40 % (w/v) PEG3350 mens krystalliseringstilstanden til dimerisk TmPep1050 er flyttet til 0,1 M natriumsitrat pH 6,0, 10 % (w/v) PEG3350. En syklus av såing har vært nødvendig for å forbedre krystalliniteten. Heretter er beskrevet hvordan krystallisering av TmPep1050H60A H307A varianten er optimalisert.
    1. Klargjør lagerløsninger på 0,5 M natriumsitratbuffer ved ulike pH-løsninger (4,5, 5,2 og 6,0) og 50 % (w/v) PEG3350-oppløsning.
    2. Sett opp en krystalliseringsplate som en matrise av pH vs. nedbørsmiddel (se figur 4A).
    3. Inkuber platen ved 20 °C. Vær oppmerksom på hver brønn med kikkert en gang per dag i løpet av en uke.
    4. Score hver brønn i henhold til krystall størrelse og form. Velg en tilstand som gir krystaller på minst 50 μm. Fortsett til mikroseeding.
  3. Microseeding
    MERK: Microseeding er en kraftig metode for å forbedre formen, størrelsen og krystalliniteten til proteinkrystaller34. En raskere seeding tilnærming er strek seeding ved hjelp av en katt whisker. Se figur 4 som et eksempel på hvordan optimalisering av krystallisering og mikroseeding har forbedret krystallformen og størrelsen for TmPep1050H60A H307A.
    1. Forbered frøene ved hjelp av den valgte brønnen i trinn 3.2.4.
    2. Øk volumet av en dråpe som inneholder krystaller til 10 μL ved å legge krystalliseringsløsning fra brønnen. Rør dråpen og tilsett 90 μL krystalliseringsløsning fra brønnen. Vortex grundig og hold frøene på is.
    3. Forbered flere fortynninger av frøene: 1x, 10x, 25x og 100x. Vortex godt frøene før pipettering. Hold fortynningene på is.
    4. For hver frøfortynning, sett opp en krystalliseringsplate som en matrise av pH vs. nedbørsmiddel (se figur 4B). Bruk lagerløsningene som er utarbeidet i trinn 3.2.1.
    5. Når du gjør dråpen, tilsett 0,2 μL frø for en 2 μL dråpe. Inkuber platen ved 20 °C. Vær oppmerksom på hver brønn med kikkert en gang per dag i løpet av en uke.
      MERK: Distribusjon og form for krystallstørrelse må forbedres, se figur 4C som et eksempel for TmPep1050H60A H307A. For videre bruk kan frø lagres ved -20 °C.

4. Røntgendiffraksjon

  1. Krystall plukking
    MERK: Prøveklargjøring avhenger av røntgenkildeanlegget (hjemmeanlegg vs. synchrotron). Bruk oppbevaringsenheter (hetteglass og kurv med hetteglassholder) tilsvarende. Tilsetning av kryobeskyttende (som glyserol) kan være nødvendig avhengig av konsentrasjonen av salt/nedbørsmiddel. For TmPep1050 krystaller er det ikke nødvendig med kryobeskyttende middel, da PEG eller bufferkonsentrasjon er høy nok til å unngå vannkrystaller.
    1. Forbered et bad fylt med flytende nitrogen, stup eventuelle hetteglass eller kurv som brukes til prøvehåndtering.
    2. Definer prøveplukkingsløkker av forskjellige størrelser: 100, 150 og 200 μm (Materialtabell). Velg størrelsene i henhold til krystallstørrelsen.
    3. Bruk en kikkert, sjekk dråpen som inneholder krystaller og spot isolerte krystaller (den enkleste å plukke). Med en løkke, velg forsiktig en krystall fra bunnen. Kast umiddelbart løkken i flytende nitrogen og legg løkken i et passende hetteglass.
  2. Datainnsamling
    MERK: Datainnsamlingen kan variere sterkt avhengig av røntgenkilden (hjemmeanlegget vs. synchrotron) og detektorfølsomhet. Innsamlingsstrategien kan også avvike sterkt fra et utvalg til et annet, avhengig av oppløsning, spotintensitet, romgruppe, etc. Emnet har blitt grundig gjennomgått av Dauter35.
    1. Monter løkken som bærer krystallen på goniometerhodet på diffraktometeret.
    2. Still inn goniometerhodet langs XYZ-akser for å justere krystallen etter røntgenstrålebanen.
    3. Sett bølgelengden til 0,98 Å og flytt detektoren for å få 2 Å oppløsning.
    4. Start en kort datainnsamling ved å anskaffe bilder i minst to forskjellige krystallretninger. Ta 10 bilder (1 bilde per 0,1°) ved 0° og 90°.
    5. Kontroller de innsamlede bildene med egnet programvare (f.eks. ADXV, XDS-Viewer eller Albula Viewer). Bestem spotintensiteten og den høyeste oppløsningen der flekker ses. Kontroller også monokrystalliniteten og flekkseparasjonen.
    6. Gjenta til slutt trinn 4.2.3−4.2.5 ved å endre detektorposisjonen for høyere eller lavere oppløsning og eksponeringstiden i henhold til observasjonen.
    7. Start datainnsamling rundt 360° med 1 bilde tatt per 0,1°. Husk å stille inn detektorposisjonen og eksponeringstiden optimalt.

5. Indeksering, molekylær utskifting og modellbygging

  1. Indeksering
    MERK: Indeksering er en metode for måling av diffraksjonspunkter intensitet, noe som gir amplitudene til strukturfaktorer36. Fire programvarepakker brukes ofte til behandling av innsamlede bilder: Mosflm37,HKL200038,DIALS39og XDS40. Sistnevnte har blitt brukt til å indeksere datasettene hentet fra TmPep1050 krystalldiffraksjon.
    1. Installer XDS-pakken og XDSME41. Hvis du behandler HDF5-filer, installerer du XDS Neggia plugin (tilgjengelig på Dectris nettside). Hvis du vil ha mer informasjon, kan du gå til XDS wiki https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page og XDSME nettside https://github.com/legrandp/xdsme.
    2. Før du behandler data, oppretter du en mappe der XDS skal kjøres. Finn banen til bildene.
    3. Hvis du vil kjøre XDSME, skriver du inn xdsme /path_to_images/image.extension i et terminalvindu.
    4. Når XDS er avsluttet jobben, kontrollerer du riktig. LP-fil. Legg merke til sannsynligheten for plassgruppebestemmelse, dataopp kompletthet, høyeste oppløsning, krystallmosaikkitet og datakvalitet. Sjekk også XDS_pointless.log for å oppnå sannsynligheten for plass grupper.
      MERK: Se figur 5 som et eksempel på utgang.
    5. Kjøre XDSME på nytt med forskjellige plassgruppeløsninger foreslått av XDS i egen mappe for å unngå å overskrive den forrige prosessen. Skriv inn xdsme -s space_group_name -c "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.extension (f.eks. xdsme -s P21 -c "43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000).
    6. Kontroller riktig. LP-filer og velg den beste løsningen basert på datastatistikk.
    7. Kjør XSCALE ved å skrive xscale.py XDS_ASCII. HKL. Kjør XDSCONV ved å skrive xdsconv.py XSCALE. HKL ccp4.
      MERK: I noen tilfeller klarer ikke XDSME å identifisere plassgruppen eller ikke klarer å kutte oppløsningsområdet riktig eller genererer rare datastatistikker. Hvis et slikt problem oppstår, er det verdt å kjøre XDS opprinnelig. Flere parametere må innføres i XDS. INP-initieringsfil (se XDS wiki-side). Når du bruker XDS, kan sannsynligheten for mulige plassgrupper kontrolleres ved hjelp av Meningsløs, en del av CCP4-pakken42. For å kutte datasettoppløsningen godtas ofteR-mål < 60 % og I/σ ~2 for å fastslå den høyesteoppløsningen 43. Den molekylære utskiftingen og modellraffinementet kan imidlertid forbedres ved å utvide oppløsningen til I/σ ~0,5−1,5 og CC1/2 ned til 0,2–0,444.
  2. Molekylær utskifting
    MERK: Eksperimentelle data gir tilgang til amplituden av strukturelle faktorer, men uten å vite fasen er de ubrukelige. Fasen kan bestemmes eksperimentelt ved ulike metoder som er avhengige av et uregelmessig signal (fra et tungt atom, for eksempel)45. Molekylær erstatning er en annen metode for å bestemme fasen uten et uregelmessig spredningsatom46,47. Denne metoden bruker koordinatene til et beslektet molekyl for å finne og forbedre fasen iterativt. Vi bruker Phaser48 i Phenix GUI49 for molekylær erstatning.
    1. Klargjør startmodellen for molekylær erstatning ved hjelp av 4P6Y-koordinater. Fra pdb-filen, pakk ut monomer A og avkorte sine aminoacids i alanin ved hjelp av PDB fil editor i Phenix (under modellverktøy kategorien).
    2. Kjør Xtriage i Phenix (under kategorien Dataanalyse) med refleksjonsfilen generert av XDSCONV (5.1.9) og sekvensen som innganger.
    3. Sjekk loggfilen fra Xtriage. Legg merke til fullstendigheten, antall underenheter i asymmetrisk enhet, anisotropien, tilstedeværelsen av isringer og twinning forekomst.
    4. Kjør Phaser-MR i Phenix (under Molecular replacement tab) for molekylær erstatning ved hjelp av refleksjonsfilen, sekvensen og startmodellen 4P6Y avkortet i poly alanin (trinn 5.2.1).
    5. Ved ferdigstillelse, sjekk om en modell er funnet og poengsummen av molekylær erstatning. En oversettelsesfaktor Z-score (TFZ) på minst 8 indikerer at løsningen er definitivt riktig.
  3. Modell bygning
    MERK: Etter å ha bestemt fasen ved molekylær utskifting, må modellen bygges og raffineres. Denne protokollen bruker Phenix GUI49 for automatisk bygging og iterative forbedringer, og Coot50 for manuell strukturbygging og raffinement.
    1. Etter molekylær erstatning ved hjelp av Phase-MR i Phenix, velger du Kjør Autobuild. Alle nødvendige filer vil bli automatisk lagt til. Bare trykk på Kjør for å starte autobuild.
    2. Når du er ferdig, sjekk modellen i Coot. Bygg og finjuster modellen manuelt i henhold til kartet for elektrontetthet i Coot.
    3. Finjuster den manuelt kurerte modellen i Phenix (i kategorien Finjustering) ved hjelp av modellen, sekvensen og diffraksjonsdataene som innganger. Se Phenix bidra til å velge riktig strategi.
    4. Etter raffinement, sjekk resultatene: Rgratis ogR arbeid må reduseres, Molprobity51 indikatorer må respekteres, og outliers med lav real-space korrelasjon må være begrenset.
    5. Gjenta trinn 5.3.2−5.3.4 til den beste raffinerte modellen genereres.
    6. Kjør Molprobity på serveren: http://molprobity.biochem.duke.edu/. Sjekk eventuelle outliers identifisert av Molprobity.
    7. Gjenta til slutt trinn 5.3.2−5.3.6 til den beste raffinerte modellen er oppnådd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å studere en mulig dodecamer dissosiasjon til monomerer i TmPep1050, ble His-60 og His-307 codons erstattet av alaninkodon ved hjelp av et syntetisk gen. Dette genet ble deretter klonet i pBAD vektor for uttrykk og rensing av den tilsvarende TmPep1050-varianten senere kalt TmPep1050H60A H307A. Størrelse eksklusjon kromatografi (Figur 3B) viste at renset protein hadde en tilsynelatende molekylvekt på 56 kDa (molekylvekt av monomer er 36,0 kDa). En lignende tilsynelatende molekylvekt, 52 kDa, er rapportert for TmPep1050 dimer11. Derfor kan den oligomeriske tilstanden TmPep1050H60A H307A utledes som dimerisk. Når det gjelder sin spesifikke aktivitet, var TmPep1050H60A H307A helt inaktiv på L-Leu-pNA som substrat, selv i nærvær av koboltioner. Dette resultatet tyder sterkt på at variantene ikke kan binde noen metallioner.

Krystalliseringstilstanden til TmPep1050H60A H307A ble optimalisert ved varierende pH vs. PEG-konsentrasjon (figur 4) rundt tilstanden til dimeren (dvs. 0,1 M natriumsitrat pH 6,0 10 % PEG3350). De beste krystallene i TmPep1050H60A H307A ble oppnådd i 0,1 M natriumsitrat pH 5,2 20 % PEG3350 med én syklus mikroseeding for å forbedre monokrystalliniteten. Et komplett datasett ble samlet inn på Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) med en oppløsning 2,36 Å (tabell 1). Dataindeksering viste at romgruppen til TmPep1050H60A H307A-krystallen er C2221, men XDS foreslo en annen løsning, mP-romgruppen (se figur 5). Ifølge Pointless var sannsynligheten for C2221 og P21 romgrupper henholdsvis 0,711 og 0,149. Ifølge datakvalitetsanalysen finnes to monomerer i den asymmetriske enheten. Analysen av Xtriage viste at datasettet sannsynligvis er twinned men twinning i C2221 plass gruppe er usannsynlig52. Twinning resultater fra krystall vekst anomali der flere bestemte domener har noen av sine gitter retninger parallelt med hverandre53. Twinning kan også skyldes en høyere krystallsymmetri, noe som indikerer en feilaktig dataindeksering. Derfor kan en pseudo-merohedral tvilling eksistere slik at en P21 krystall gitter ser ut som en C2221. Datasettet ble deretter indeksert i romgruppe P21 og testet i molekylær erstatning. Xtriage analyse av datasettet indeksert i P21 avslørte en pseudo-merohedral tvilling etter en tvilling lov h, -k, -h-l.

Ved hjelp av koordinatene til en monomer fra dodecameric TmPep1050 (PDB-kode 4P6Y), ble det funnet en molekylær erstatningsløsning for datasettet indeksert bare i P21, med en TFZ-score på 28,9. Derfor ble diffraksjonsdataene behandlet som et twinned datasett for modellbygging. For å minimere skjevheten av molekylær erstatning, ble en første modell bygget ved hjelp av phenix.autobuild54,55. Strukturen til TmPep1050H60A H307A ble fullført etter flere sykluser med automatisert og manuell raffinement i Phenix og Coot (tabell 1 og figur 6A). Strukturen bekreftet den oligomeriske tilstanden med en grensesnittoverflate på 1710 Å2 mellom både monomerer og en Δ i Gpå-16,2 kcal mol-1 som beregnet av PDBe Pisa56. Til sammenligning er grensesnittoverflaten og ΔiG av dimeric TmPep10502-mer henholdsvis 1673 Å2 og -16,7 kcal mol-1.

Strukturen av TmPep1050H60A H307A er svært lik wild-type dimer struktur med RMS på 0,774 Å ved justering. Det er viktig at de samme strukturelle modifikasjonene observeres i begge strukturene: høy fleksibilitet i α8- og α10-helices, det uordende aktive stedet Gln-196–Val-202, og forskyvningen av Lys-229–Ala-235 og Lys-247–Ser 254. Disse modifikasjonene ble korrelert tidligere med hindringen av dodecamer dannelse i fravær av sin metallkofaktor11. De to mutasjonene av His-60 og His-307 hadde imidlertid en liten effekt på sidekjedene til Asp-168 og Asp-62. De syntes å være låst i en konformasjon forskjellig fra vill-type dimer (Figur 6B). Asp-168 karboksylat roteres med 40° på grunn av fravær av Hans-60 og Hans-307. Derfor er begge histidinrester viktige for å posisjonere Asp-168 karboksylat riktig for å bygge bro over de to metallionene. Asp-62 sidekjedet er orientert mot Glu-18 karboksylat, utenfor det katalytiske stedet. Asp-62 kan ha en viktig rolle i katalyse som det antas å modulere pKen av Hans-60 og dermed påvirke metallionbinding i M2-området. I tillegg kan det være innblandet strukturelt i stabiliseringen av det katalytiske stedet ved metallionbinding, favoriserer dannelsen av dodecamer.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk representasjon av TM_1050 ORF kloning i pBAD vektor ved homolog rekombinasjon.
ORF er flankert av to 30 bp sekvenser homolog til arrangøren BAD slutten og sekvensen oppstrøms PmeI begrensning nettsted. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kromatrammer av TmPep1050 rensing.
(A)Anion utveksling kromatografi. (B)Hydrofobe interaksjon kromatografi. Absorbansen (Abs), uttrykt i millienheter av absorbans (mUA), er vist i vanlig linje. Konduktiviteten, uttrykt i mS cm-1, vises i stiplet linje. Den grå boksen angir hvor TmPep1050 eluates på kromatrammene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Størrelse ekskludering kromatografi av (A) TmPep1050 dodecamer, (B) TmPep1050H60A H307A,og (C) TmPep1050H60A.
Eksemplene ble analysert ved hjelp av SEC-harpiks pakket i en 120 ml-kolonne. Absorbans (Abs) uttrykkes i milliunits av absorbans (mUA). (D)Kalibrering av SEC-kolonnen ved hjelp av tyroglobulin (T), ferritin (F), aldolase (Ald), conalbumin (C) og albumin (Alb) som standarder. Korrelasjonen mellom logaritmen til den relative massen og elutionvolumet er lineær, med en R2 på 0,91. Konfidensintervallene på 95 % representeres som prikker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Optimalisering av TmPep1050H60A H307A krystallisering.
(A)Den første optimaliseringsstrategien består av varierende pH (mellom 4,5 og 6,0) vs. PEG3350 konsentrasjon (mellom 5% og 25%). Krystalliseringsplaten er skjematisert, og brønnene er fargekodet: rød for bunnsplitt, gul for polykrystaller og grønt for monokrystaller. (B)Den andre optimaliseringsstrategien inkluderer bruk av frø fortynnet 25x med en smalere variasjon av pH vs PEG3350. (C) Krystallform og størrelse før (øvre bilde) og etter (lavere bilde) krystalliseringsoptimalisering og mikroseeding. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Utdrag fra loggutgangen CORRECT. LP av TmPep1050H60A H307A dataindeksering av XDS.
Øvre panel, de mulige Bravais gitter, den mest sannsynlige er mC, mP, og oC. Midtre panel, samlet statistikk over data indeksert i C2221 plassgruppe. Lavere panel, samlet statistikk over data indeksert i P21 romgruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Strukturen til TmPep1050H60A H307A.
(A)Strukturell justering av en TmPep1050H60A H307A-underenhet (rød, PDB-kode 5NE9) vs. en dodecamer-underenhet (hvit, PDB-kode 6NW5) og en dimer-underenhet (blå, PDB-kode 5NE6). Piler indikerer de strukturelle ulikhetene mellom dodecamers og dimers. (B) Nærbilde av TmPep1050H60A H307A aktivt sted (rød) sammenlignet med det aktive stedet for TmPep1050 dimer (blå) og dodecamer (hvit). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

TmPep1050H60A H307A Leilighet
Datainnsamling
Temperatur (K) 100
Stråling kilde Soleil Proxima 2 Leilighet
Bølgelengde (Å) 0.9801
Detektor Destris Eiger X 9M
Oscillasjonsområde (°) 0.1
Eksponeringstid (er) 0.025
Romgruppe P 1 21 1
Parametere for enhetsceller
α, β, γ (°) 90.00, 110.69, 90.00
a, b, c (Å) 43.24, 137.79, 61.11
Oppløsning 43.99 – 2.37 (2.52-2.37)
Unike refleksjoner 26.902
Rmerge (%) 0.14
Redundans 6,815
8.64 (2.12)
Fullstendighet (%) 99.6 (97.9)
CC1/2 (%) 99.2 (84.1)
Raffinement
Oppløsning 43.99 – 2.37
Refleksjoner 26.9
Rgratis sett testantall 1345
Rarbeid/Rgratis 0.206/0.234
Proteinmolekyler per ASU 2
VM (Å3/Da) 2.37
Løsemiddelinnhold (%) 49.0
Protein/løsemiddelatomer 4,559/96
r.m.s.d. obligasjonslengder (Å) 0.31
r.m.s.d. bindingsvinkler (°) 0.51
Gjennomsnittlige B-faktorer (Å2) 57.0
Favorisert /forbudt Ramachandran φ/ψ (%) 95.02 / 0.17
Twin lov h, -k, -h-l
PDB-kode 5NE9 (andre personer)

Tabell 1: Datainnsamlings- og avgrensingsstatistikk. Verdier i parentes er for skallet med høyest oppløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som er beskrevet her, gjør det mulig å forstå den dimer-dodecamer overgangen til TmPep1050 på strukturnivå. Metodikken ble opplevd tidligere for å bestemme strukturen til både TmPep1050 oligomers11. Det mest utfordrende trinnet var å finne forhold som fremmet dissosiasjon av dodecamers til stabile dimers. Slike forhold måtte være milde nok til å tillate reassociation av dimers i dodecamers når metallionkofaktoren ble lagt til. Separasjonen av oligomerer var også et kritisk skritt da det tilstander de strukturelle studiene og ytterligere biokjemisk karakterisering (f.eks. studere dodecamer reassociation i ulike doser av Co2 +). Molekylær erstatning, en bevist metode for fasebestemmelse, ble brukt til å løse strukturene til TmPep1050 oligomers og dets varianter. Den foreslåtte protokollen kan tilpasses for å studere andre metallo-enzymer hvis oligomeriseringsstater avhenger av tilgjengeligheten av deres metallkofaktorer.

For å illustrere protokollen ble det presentert et studiested, TmPep1050H60A H307A hvis metallbindingssteder ble svekket ved å mutere His-60 og His-307 til alanin. Disse rester binder Co2+ på M2- og M1-anleggene. Inngripende metallbinding kunne ha gjennomsyret oligomeriseringstilstanden og ført til en fullstendig dissosiasjon til monomerer. Tegn på et slikt fenomen er rapportert for PhTET2 og PfTET3, to M42 aminopeptidaser fra P. horikoshii og P. furiosus,henholdsvis 24,29. TmPep1050H60A H307A oppførte seg ikke som forventet, da denne varianten bare dannet dimers. Strukturen viste de samme modifikasjonene som wild-type dimer, men med to små unntak. Faktisk syntes sidekjedene til Asp-168 og Asp-62 å være låst i en ukonvensjonell orientering som forhindrer stabilisering av det aktive stedet. Deres orientering syntes å bli pålagt av His-60 og His-307 som slike modifikasjoner ble ikke observert i enkeltpunktmutasjonsvariantene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Martine Roovers for korrekturlesing av dette papiret og gi konstruktive kommentarer. Tilgang til Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) var innenfor Block Allocation Groups 20151139.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , Jan 26, 2018. Zenodo (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

Biokjemi Utgave 159 protein oligomerisering M42 aminopeptidase oligomerisk tilstand overgang metalloenzyme proteinrensing proteinkrystallisering røntgenkrystallografi databehandling molekylær erstatning
Røntgenkrystallografi for å studere oligomerisk tilstand overgang av <em>Thermotoga maritima</em> M42 Aminopeptidase TmPep1050
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder,… More

Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter