Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

कई केंद्रीय तंत्रिका तंत्र क्षेत्रों से मुराइन ग्लिया का विच्छेदन और अलगाव

Published: June 4, 2020 doi: 10.3791/61345
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Neurosciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation, 2Brain Health Research Institute, Kent State University

Summary

यहां हम एक माउस सीएनएस से कई ग्लियल सेल आबादी के इन विट्रो अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि विभिन्न प्रकार की संस्कृति प्रणालियों में प्रत्येक के फेनोटाइप का अध्ययन करने के लिए क्षेत्रीय माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स के अलगाव की अनुमति देती है।

Abstract

यहां प्रस्तुत विधियां ग्लियल उप-आबादी के अलगाव के लिए मुराइन नवजात शिशुओं से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के चार अलग-अलग क्षेत्रों के विच्छेदन के लिए प्रयोगशाला प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करती हैं। प्रक्रिया का उद्देश्य माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज कोशिकाओं (ओपीसी), और एस्ट्रोसाइट्स को कॉर्टिकल, अनुमस्तिष्क, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से अलग करना है ताकि आगे इन विट्रो विश्लेषण की सुविधा मिल सके। सीएनएस क्षेत्र अलगाव प्रक्रियाएं कई सेल संस्कृति प्रणालियों में ग्लिया के बीच क्षेत्रीय विषमता के निर्धारण की अनुमति देती हैं। रैपिड सीएनएस क्षेत्र अलगाव किया जाता है, इसके बाद ग्लिया के मेनिंगियल सेल संदूषण को रोकने के लिए मेनिंगेस को यांत्रिक रूप से हटाया जाता है। यह प्रोटोकॉल सेल अखंडता और पालन को संरक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए एक निर्दिष्ट मैट्रिक्स पर कोमल ऊतक पृथक्करण और चढ़ाना को जोड़ता है। कई सीएनएस क्षेत्रों से मिश्रित ग्लिया को अलग करना व्यक्तिगत प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग को अधिकतम करते हुए संभावित हेटरोजेनस ग्लिया का व्यापक विश्लेषण प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, क्षेत्रीय ऊतक के पृथक्करण के बाद, मिश्रित ग्लिया को माइक्रोग्लिया, ओपीसी और एस्ट्रोसाइट्स सहित कई सेल प्रकारों में विभाजित किया जाता है, जो या तो एकल सेल प्रकार, सेल कल्चर प्लेट इंसर्ट, या सह-संस्कृति प्रणालियों में उपयोग के लिए होते हैं। कुल मिलाकर, प्रदर्शित तकनीकें मुराइन नवजात शिशुओं से चार अलग-अलग सीएनएस क्षेत्रों के सावधानीपूर्वक विच्छेदन के लिए व्यापक प्रयोज्यता का एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करती हैं और इसमें किसी भी संख्या में इन विट्रो सेल कल्चर सिस्टम या परख में क्षेत्रीय विषमता की जांच करने के लिए तीन अलग-अलग ग्लिया सेल प्रकारों के अलगाव के तरीके शामिल हैं।

Introduction

सीएनएस में उचित न्यूरोनल फ़ंक्शन के लिए ग्लिया आवश्यक हैं। वे तीन प्रमुख उप-आबादी, एस्ट्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया से बने होते हैं, जिनमें से प्रत्येक एक अलग, अभी तक अपरिहार्य भूमिका 1 के साथ होताहै। उचित ग्लियल सेल विविधता और गतिविधि के बिना, न्यूरोनल फ़ंक्शन गंभीर रूप से प्रभावित होगा, जिससे सीएनएस हानि होगी। ग्लिया न्यूरोट्रांसमिशन को प्रभावित करने में सक्षम हैं, और प्रत्येक सेल प्रकार एक अद्वितीय तरीके से ऐसा करता है। मस्तिष्क में ग्लियल कोशिकाओं में उचित सीएनएस फ़ंक्शन 2 की सुविधा के लिए आपस में, साथ ही न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ संवाद करने की क्षमता होतीहै। ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स एक माइलिन म्यान के गठन के माध्यम से विद्युत संचरण की गति को बढ़ाते हैं, जो रैनवियर के नोड्स पर आयन चैनलों के क्लस्टरिंग की सुविधा प्रदान करता है, जो न्यूरोनल एक्शन पोटेंशियल जनरेशन3 की साइटें हैं। माइक्रोग्लिया चोट के बाद सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और "रीवायरिंग" न्यूरोनल कनेक्शन की निगरानी करके सिनैप्स की छंटाईके लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, माइक्रोग्लिया सीएनएस की सबसे प्रचुर मात्रा में निवासी प्रतिरक्षा कोशिका है, जो रोगजनकों के खिलाफ मेजबान रक्षा के प्राथमिक रूप के रूप में कार्य करती है। एस्ट्रोसाइट्स बाह्य पोटेशियम 6 की एकाग्रता को संशोधित करके न्यूरॉन्स के बीच सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को नियंत्रित करसकते हैं। स्थानीय रक्त प्रवाह7 को नियंत्रित करने, न्यूरोमॉड्यूलेटरीतत्वों 8 को जारी करने और लेने में भी उनकी भूमिका है, और रक्त-मस्तिष्क बाधा रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिकाहै। इस प्रकार, प्रत्येक ग्लियल उपप्रकार सीएनएस फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि किसी भी प्रकार में दोष लंबे समय से विभिन्न प्रकार के पैथोलॉजिकल राज्यों से जुड़े हुए हैं, जिनमें मनोवैज्ञानिक रोग, मिर्गी और न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियांशामिल हैं।

सीएनएस पैथोबायोलॉजी के अध्ययन में सबसे बड़ी बाधा उनके माइक्रोएन्वायरमेंटल आला के संदर्भ में मानव कोशिकाओं की जांच करने में असमर्थता है। मानव बायोप्सी ऊतक सबसे अधिक एकत्र किया जाता है पोस्टमार्टम और निष्कर्षण और प्रसंस्करण के दौरान कोशिकाओं को आसानी से क्षतिग्रस्त या खो दिया जा सकता है। इसके अलावा, ट्यूमर से अमर सेल लाइनों को प्राप्त किए बिना किसी भी समय के लिए मानव कोशिकाओं को जीवित और व्यवहार्य रखना एक चुनौती है, जिस बिंदु पर वे अब अपने सामान्य शारीरिक गुणों को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इसके अतिरिक्त, व्यक्तिगत ग्लिया सेल प्रकार13,14,15 के बीच क्षेत्रीय विषमता की एक महत्वपूर्ण मात्रा है, और व्यक्तिगत रोगियों से क्षेत्रीय सीएनएस नमूने प्राप्त करना लगभग असंभव है। जैसे, विशिष्ट सीएनएस विकारों में क्षेत्रीय ग्लिया के योगदान का अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक मॉडल विकसित करना आवश्यक है।

यहां, हम माउस सीएनएस क्षेत्र-कई ग्लियल उप-आबादी के अलगाव का उपयोग करके एक इन विट्रो सिस्टम का वर्णन करते हैं, जिससे माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी) के हेरफेर और परिमाणीकरण की अनुमति मिलती है, जो परिपक्व ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स को जन्म देते हैं। प्रत्येक आबादी को स्वतंत्र रूप से अलग किया जा सकता है और प्रयोगात्मक आवश्यकता के आधार पर दवा या अणु उपचार, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, प्रोटीन / आरएनए निष्कर्षण और विश्लेषण, और अन्य सह-संस्कृति प्रणालियों सहित प्रयोगात्मक तकनीकों की एक विस्तृत विविधता के अधीन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह अलगाव तकनीक उच्च सेल संख्या उत्पन्न करती है, जिससे उच्च-थ्रूपुट तरीके से प्रत्येक ग्लियल आबादी के लक्षण वर्णन और जांच की अनुमति मिलती है। यह एक नियंत्रित तरीके से माइक्रोएन्वायरमेंटल उत्तेजनाओं की एक विस्तृत विविधता के जवाब में सीएनएस सेल भेदभाव, विकास और प्रसार के अध्ययन को भी सक्षम बनाता है ताकि भ्रमित कारकों से बचा जा सके जो आमतौर पर विवो सेटिंग में मौजूद होते हैं। अंत में, यह सेल अलगाव तकनीक विभिन्न सीएनएस क्षेत्रों के भीतर ग्लियल सेल आबादी के हेरफेर की सुविधा प्रदान करती है ताकि यह पता लगाया जा सके कि क्षेत्रीय ग्लिया एक-दूसरे के साथ कैसे बातचीत करती है और अलग-अलग उत्तेजनाओं का जवाब देती है, जिससे सटीकता और प्रजनन क्षमता की अनुमति मिलती है।

Protocol

नोट: सभी पशु अध्ययन क्लीवलैंड क्लिनिक लर्नर रिसर्च इंस्टीट्यूट संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अधिकृत और अनुमोदित किए गए थे।

1. विच्छेदन के लिए मीडिया और आपूर्ति तैयार करें

नोट: सभी बफर और मीडिया व्यंजनों तालिका 1 में प्रदान किए गए हैं। यह प्रक्रिया एक ऊतक संस्कृति नामित जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में की जाती है।

  1. मिश्रित ग्लिया मीडिया (एमजीएम) तैयार और बाँझ फ़िल्टर तैयार करें। यह एक दिन पहले किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. बाँझ एच2ओ के साथ 1: 100 एकाग्रता पर फाइब्रोनेक्टिन को पतला करें। पतला फाइब्रोनेक्टिन की मात्रा प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले पिल्ले और सीएनएस क्षेत्र की संख्या पर निर्भर करेगी। 1 कॉर्टेक्स के लिए एक टी 25 फ्लास्क, 2-4 सेरेबेला के लिए एक टी 25 फ्लास्क, 2-4 मस्तिष्क के तने के लिए एक टी 25 फ्लास्क और 2-4 रीढ़ की हड्डी के लिए एक टी 25 फ्लास्क का उपयोग करें।
    नोट: ऊपर सूचीबद्ध मानदंडों का उपयोग करके एक ही क्षेत्र से ऊतक का संयोजन नीचे वर्णित प्रोटोकॉल को बदलने के बिना पर्याप्त पृथक्करण की अनुमति देगा। चरण 1.2 में वर्णित की तुलना में अधिक ऊतक के संयोजन के लिए पृथक्करण अभिकर्मक सांद्रता के और अनुकूलन की आवश्यकता होगी।
  3. कमरे के तापमान पर टी 25 फ्लास्क में पतला फाइब्रोनेक्टिन के 3 एमएल पिपेट और 2 मिनट तक बैठने की अनुमति दें।
  4. फाइब्रोनेक्टिन को एस्पिरेट करें और फ्लास्क के ढक्कन ढीले होने के साथ फ्लास्क को रात भर सूखने दें।

2. कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी विच्छेदन

नोट: यह प्रक्रिया बेंचटॉप पर की जा सकती है और इसके लिए विच्छेदन दायरे की आवश्यकता होती है। प्रक्रिया के सभी चरणों के लिए सख्त सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करें और कमरे की हवा के ऊतक जोखिम को कम करें। अधिकतम ऊतक संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए विच्छेदन के दौरान सभी मीडिया को बर्फ पर ठंडा रखें। वैकल्पिक रूप से, यह प्रक्रिया एक हुड में की जा सकती है जो आंतरिक विच्छेदन दायरे के उपयोग की अनुमति देती है।

  1. 70% इथेनॉल के साथ सभी क्षेत्रों को पोंछें।
  2. एंटीबायोटिक समाधान (पीएएस) के 10 एमएल को 10 सेमी पेट्री डिश में बदलें। प्रत्येक पिल्ले को विच्छेदित करने के लिए एक पेट्री डिश तैयार करें। घोल को ठंडा रखने के लिए बर्फ पर सेट करें।
  3. एक कीटाणुरहित ऊतक संवर्धन हुड में, डीएमईएम के 9 एमएल (बिना एडिटिव्स के) को 4 अलग-अलग 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में विभाजित किया जाता है, प्रत्येक सीएनएस क्षेत्र के लिए एक, ट्यूब कैप को प्रतिस्थापित किया जाता है, और बर्फ पर रखा जाता है। विच्छेदन दायरे से पहुंचने की दूरी के भीतर ट्यूबों के साथ बर्फ की बाल्टी रखें।
  4. कीटाणुरहित विच्छेदन दायरे चरण पर चरण 2.2 में तैयार 10 सेमी पेट्री डिश रखें।
  5. संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार माउस पिल्ला को एनेस्थेटाइज और यूथेनाइज़ करें और तेज कैंची के साथ तेजी से सिर को हटा दें।
    नोट: प्रसवोत्तर दिन (पी) 3-5 पिल्ले का उपयोग किया जाता है। पुराने पिल्ले में अधिक विकसित सीएनएस होता है और ग्लियल कोशिकाओं के विस्तार का पर्याप्त स्रोत नहीं हो सकता है। छोटे पिल्ले (पी) 0-2 अधिक संख्या में ग्लिया उत्पन्न कर सकते हैं और इसका उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, आकार के कारण इस छोटी उम्र में रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को विच्छेदित करना बहुत मुश्किल है।
  6. 70% इथेनॉल का उपयोग करके पिल्ला की त्वचा को साफ करें।
  7. बारीक कैंची का उपयोग करके, जानवर के सिर की मध्य रेखा के साथ त्वचीय परत को काटें, पुच्छल रूप से शुरू करें और रोस्ट्रल को घुमाएं, जब तक कि स्नाउट तक नहीं पहुंच जाएं। किसी भी ऊतक क्षति से बचने के लिए खोपड़ी में गहराई से काटने से बचें।
  8. सिर को नीचे खींचना, त्वचीय परत को खोपड़ी के प्रत्येक तरफ खींचना और वसंत कैंची का उपयोग करके, खोपड़ी की मध्य रेखा के साथ एक चीरा लगाना, फोरमेन मैग्नम से शुरू करना, फिर से पुच्छल से रोस्ट्रल तक काटना।
  9. बारीक-बारीक बल के साथ, खोपड़ी के आधे हिस्से को दाईं और बाईं ओर खींचें, कॉर्टेक्स, सेरिबैलम और ब्रेनस्टेम को उजागर करें।
  10. एक बार उजागर होने के बाद, धीरे से मस्तिष्क को खोपड़ी से बाहर निकालें और चरण 2.2 में तैयार 10 सेमी पेट्री डिश में डालें। सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क शारीरिक संरचना को संरक्षित करने के लिए क्षतिग्रस्त न हो, जिसमें हिंडब्रेन जुड़ा हुआ है।
  11. ऊपर की ओर बल के बिंदु के साथ बारीक, घुमावदार बल का उपयोग करके, सेरिबैलम को काट दें। मेनिंग को हटा दें और बर्फ की बाल्टी में निर्दिष्ट 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  12. सुनिश्चित करें कि ब्रेनस्टेम सीधे सेरिबैलम के उदर है और सेरिबैलम को हटाने के बाद दिखाई देता है। इसे बारीक-बारीक बल के साथ हटा दें, मेनिंग को हटा दें, और बर्फ की बाल्टी में नामित 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  13. मिडब्रेन को कॉर्टेक्स से अलग करें, कॉर्टिकल मेनिंग को हटा दें, और बर्फ की बाल्टी में नामित 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  14. रीढ़ की हड्डी को हटाने के लिए, कटे हुए माउस पिल्ले को लापरवाह स्थिति (ऊपर की ओर लेटे हुए) में रखें, जिसमें कटा हुआ कशेरुक स्तंभ अन्वेषक की ओर ऊंचा हो।
  15. 70% इथेनॉल के साथ फिर से स्प्रे करें।
  16. रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के पार्श्व पक्षों के साथ, पसली के पिंजरे के माध्यम से, पिछले अंगों तक पहुंचने तक एक रोस्ट्रल से पुच्छल दिशा में काटें। काटते समय, आंतरिक अंगों को तब तक पीछे धकेलें जब तक कि कशेरुक स्तंभ दिखाई न दे।
  17. कशेरुक स्तंभ के प्रत्येक पार्श्व पक्ष के साथ काटें जब तक कि यह अलग न हो जाए और चरण 2.2 में तैयार 10 सेमी पेट्री डिश में रखें।
  18. उदर पक्ष के साथ, ठीक स्प्रिंग कैंची का उपयोग करके, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को उजागर करने के लिए काठ के क्षेत्र तक पहुंचने तक प्रत्येक कशेरुक के दाएं और बाएं किनारों को वैकल्पिक रूप से काटें।
  19. धीरे से रीढ़ की हड्डी और मेनिंगेस को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत बारीक-बारीक बल के साथ हटा दें। बर्फ की बाल्टी में नामित 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  20. प्रत्येक पिल्ला के लिए चरण 2.5.-2.19 दोहराएं, प्रत्येक तैयार टी 25 फ्लास्क के लिए चरण 1.2 में उल्लिखित मानदंडों को फिट करने के लिए एक ही क्षेत्र के ऊतक को मिलाएं।
    नोट: मेनिंगेस को यथासंभव पूरी तरह से हटा दें। यदि मेनिंगेस की एक महत्वपूर्ण मात्रा बनी रहती है, तो मेनिंगियल कोशिकाओं के फाइब्रोब्लास्ट जैसे फेनोटाइप सेल संस्कृति को आगे बढ़ाएंगे और अभिभूत कर देंगे। एक विशिष्ट सेल संस्कृति उत्पन्न करने के लिए समान फेनोटाइप के कई रीढ़ की हड्डी को जोड़ा जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखें कि कोशिकाओं की भीड़भाड़ न हो, जिससे ग्लियल एपोप्टोसिस और अंतर फेनोटाइप हो सकते हैं।

3. ऊतक पृथक्करण

नोट: निम्नलिखित सभी प्रक्रियाएं सड़न रोकनेवाला तकनीक और बाँझ सामग्री का उपयोग करके एक बाँझ ऊतक संस्कृति नामित जैव सुरक्षा कैबिनेट में की जाती हैं।

  1. ऊतक लाइसिस शुरू करने के लिए 9 एमएल डीएमईएम और ऊतक के प्रत्येक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 0.53 एमएम ईडीटीए युक्त 0.05% ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: डीएमईएम में कैल्शियम क्लोराइड की एक उच्च मात्रा होती है, जो ट्रिप्सिन के अवरोधक के रूप में कार्य कर सकती है। यदि उल्लिखित चरणों का पालन करते हुए पृथक्करण पूरा नहीं होता है, तो कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना हैंक्स के संतुलित नमक समाधान का उपयोग किया जा सकता है। ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद, एंजाइम को ट्रिप्सिन अवरोधक जोड़कर बेअसर किया जा सकता है, हालांकि कैल्शियम को समाधान में वापस जोड़ा जाना चाहिए क्योंकि यह DNase I के लिए एक कोफ़ेक्टर है, जिसका उपयोग बाद के चरणों में किया जाता है।
  2. लगभग 20 गुना 10 एमएल पिपेट के साथ ट्राइट्यूरेट करें।
  3. सेल सस्पेंशन को खाली 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  4. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर घोल को इनक्यूबेट करें, 8 मिनट के बाद धीरे से लाइसेट को उत्तेजित करें।
  5. 50 μg/mL की अंतिम सांद्रता के लिए प्रत्येक ट्यूब में 5 mL MGM और 200 μL (5 mg/mL) DNase I जोड़ें।
  6. प्रत्येक लाइसेट को 10 एमएल पिपेट 10x के साथ ट्राइट्यूरेट करें।
  7. सेल निलंबन को कमरे के तापमान पर 3 मिनट तक बैठने दें ताकि गैर-अलग ऊतक ट्यूबों के तल पर बस सकें।
  8. सेल निलंबन को नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें, गैर-विघटित ऊतक को पीछे छोड़ दें।
    नोट: ऊपर वर्णित लाइसिस और ट्राइट्यूरेशन चरण गैर-विघटित ऊतक की मात्रा को काफी सीमित करते हैं।
  9. बिना ब्रेक के 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. सुपरनैटेंट को एस्पायरेट करें और एमजीएम के 5 एमएल में शेष सेल छर्रों को पुन: निलंबित करें।
  11. गोली को 5 एमएल पिपेट 20x के साथ ट्राइट्यूरेट करें।
  12. लेपित टी 25 फ्लास्क पर 5 एमएल सेल सस्पेंशन प्लेट करें।
  13. कोशिका मलबे को हटाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और 24 घंटे के बाद शुरू में मीडिया बदलें।
    नोट: कुछ प्रोटोकॉल 72 घंटे के बाद प्रारंभिक मीडिया परिवर्तन की सलाह देते हैं। इस चरण का अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।
  14. एमजीएम के साथ हर 48-72 घंटे में 100% मीडिया परिवर्तन करें जब तक कि कोशिकाएं 80% कॉन्फ्लुएंट (लगभग 5-7 दिन) न हों।
    नोट: मीडिया बदलने से पहले सभी मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए।

4. माइक्रोग्लिया अलगाव

  1. एक बार मिश्रित ग्लिया संस्कृतियां 80% सामंजस्य तक पहुंच जाने के बाद, ढक्कन को कसकर हिलाने के लिए फ्लास्क तैयार करें और पैराफिन फिल्म के साथ सील करें।
  2. मिश्रित ग्लियल संस्कृतियों से माइक्रोग्लिया को हटाने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर एक कक्षीय शेकर पर क्षैतिज रूप से फ्लास्क सुरक्षित करें। 1 घंटे के लिए 15 x g पर फ्लास्क हिलाएं।
  3. मीडिया और पिपेट को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में निकालें। फ्लास्क को 3 एमएल गर्म एमजीएम के साथ दो बार धोएं, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में धो लें। ये माइक्रोग्लिया हैं।
  4. कल्चर फ्लास्क में 5 एमएल गर्म, ताजा एमजीएम जोड़ें।
  5. पैराफिन फिल्म के साथ रीसल फ्लास्क, शेकर पर क्षैतिज रूप से सुरक्षित फ्लास्क, और एस्ट्रोसाइट्स से ओपीसी को अलग करने के लिए 15 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 x g पर हिलाएं।
    नोट: यह कदम रातोंरात किया जा सकता है, लेकिन 15 घंटे का शेक समय महत्वपूर्ण है क्योंकि अतिरिक्त समय के परिणामस्वरूप कोशिका मृत्यु हो सकती है।
  6. चरण 4.3 से सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें। मानक प्रोटोकॉल16 या जैविक परख के लिए उपयोग के अनुसार 3 मिनट के लिए 300 x g पर और कल्चर माइक्रोग्लिया।

5. ओलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत सेल अलगाव

नोट: प्रारंभिक अलगाव के बाद ओपीसी चढ़ाते समय, उन्हें पॉली-डी-लाइसिन-लेपित सतह (बाँझ प्लेट या कवर स्लिप) पर चढ़ाया जाना चाहिए। इस खंड के पूरा होने से पहले इन सामग्रियों को तैयार करें।

  1. 15 घंटे के शेक के बाद, फ्लास्क से सुपरनैटेंट को हटा दें और बाँझ 100 मिमी पेट्री डिश पर प्लेट करें।
  2. शेष माइक्रोग्लिया को हटाने के लिए 15 मिनट के बाद घूमते हुए, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सुपरनैटेंट को इनक्यूबेट करें, क्योंकि ये बहुत जल्दी डिश का पालन करेंगे। इस चरण के लिए गैर-ऊतक संस्कृति-उपचारित पेट्री व्यंजनों का उपयोग किया जा सकता है।
  3. पॉली-डी-लाइसिन-लेपित सतह पर गैर-अनुयायी सेल सुपरनैटेंट, गिनती और प्लेट को हटा दें। आमतौर पर, 7,500-10,000 ओपीसी को चढ़ाया जाता है / सेमी2।
  4. कम से कम 1 घंटे (6 घंटे तक) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें, फिर धीरे से 95% मीडिया को उत्तेजित करें, और धीरे-धीरे गर्म ओपीसी मीडिया जोड़ें, ओपीसी के व्यवधान को कम करने के लिए कुएं की दीवार के खिलाफ पाइपिंग मीडिया जोड़ें। हर 48 घंटे में मीडिया बदलें जब तक कि कोशिकाएं उपयोग के लिए तैयार न हों।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि एक समय में केवल एक कुआं बदला जाए। ओपीसी संवेदनशील हैं और शुष्क परिस्थितियों के प्रति विशेष रूप से असहिष्णु हैं। ओपीसी मीडिया में पीडीजीएफ-एए के अलावा ओपीसी परिपक्वता को ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में देरी करना है। इस कारक को संस्कृति मीडिया से बाहर रखा जा सकता है यदि प्रयोगात्मक फोकस परिपक्व ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स है।

6. एस्ट्रोसाइट्स अलगाव

  1. 15 घंटे के शेक के बाद, सतह पर तैरने वाला निकालें और फ्लास्क को गर्म 1x PBS के साथ 2x कुल्ला करें।
  2. 0.53 mM EDTA युक्त 0.05% ट्रिप्सिन का 4 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर 5 मिनट के लिए या जब तक कोशिकाएं नहीं उठ जातीं तब तक इनक्यूबेट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि एस्ट्रोसाइट्स ने उठाया है, उन्हें एक मानक वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना करें। ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद एस्ट्रोसाइट्स गोलाकार दिखाई देंगे।
  3. एक बार एस्ट्रोसाइट्स अलग हो जाने के बाद, फ्लास्क को लंबवत रूप से खड़े करें और 4 एमएल एमजीएम जोड़ें। मिश्रण करने के लिए ट्रिट्यूरेट करें।
  4. पिपेट एस्ट्रोसाइट्स को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, सेंट्रीफ्यूज को 5 मिनट के लिए 300 x g पर।
  5. चरण 1.2 में वर्णित फाइब्रोनेक्टिन-लेपित सतह पर एस्ट्रोसाइट्स मीडिया और प्लेट में एस्ट्रोसाइट्स को पुन: निलंबित करें। या जैविक परख के लिए उपयोग।
    नोट: एस्ट्रोसाइट संस्कृति को स्थापित करने में मदद करने के लिए पहले मीडिया परिवर्तन के दौरान 20 एनजी / एमएल मुराइन फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक जोड़ा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, मानक जिलेटिन कोटिंग फाइब्रोनेक्टिन के लिए कम लागत वाला विकल्प हो सकता है।

7. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके माइक्रोग्लिया, ओपीसी, एस्ट्रोसाइट्स और परिपक्व ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स की पहचान और अलगाव

  1. एक बार जब प्लेटेड कोशिकाएं उपयुक्त संयोजन तक पहुंच जाती हैं, तो धीरे से मीडिया को हटा दें और 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करके अनुयायी कोशिकाओं को ठीक करें। इस चरण को जैव सुरक्षा कैबिनेट में करें।
    नोट: समाधान को एस्पिरेटिंग या जोड़ते समय, सेल डिटेचमेंट को रोकने के लिए कोमल दबाव के साथ पिपेट करें।
  2. धीरे-धीरे एस्पिरेट पीएफए फिर कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ 3x धोएं।
  3. 1x PBS में 10% सीरम और 0.1% ट्राइटन X-100 का उपयोग करके उचित ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें।
    नोट: सीरम स्रोत मेजबान जानवर को दर्शाता है जिसमें द्वितीयक एंटीबॉडी उठाया गया था। उदाहरण के लिए, यदि द्वितीयक एंटीबॉडी बकरी विरोधी खरगोश है, तो उपयुक्त अवरुद्ध सीरम सामान्य बकरी सीरम है। इसी तरह, यदि द्वितीयक एंटीबॉडी गधा विरोधी खरगोश है, तो अवरुद्ध सीरम सामान्य गधे का सीरम होना चाहिए।
  4. जब तक कोशिकाएं पूरी तरह से कवर न हो जाएं तब तक ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक करें।
  5. एक एंटीबॉडी डिल्यूएंट समाधान तैयार करें (1x PBS का 9 एमएल, 0.01 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन, 30 μL ट्राइटन एक्स -100)। वैकल्पिक रूप से, चरण 6.3 में वर्णित ब्लॉकिंग समाधान में एंटीबॉडी को पतला किया जा सकता है।
  6. एंटीबॉडी डिल्यूएंट या ब्लॉकिंग समाधान में निम्नलिखित के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें:
    1. माइक्रोग्लिया: आयनित कैल्शियम बाइंडिंग एडाप्टर अणु 1 (आईबीए 1) 1: 250 कमजोर पड़ने (2.4 μg / mL) पर।
    2. ओपीसी: न्यूरल/ग्लियल एंटीजन 2 (एनजी2) 1:200 कमजोर पड़ने (5 μg/mL) पर।
    3. परिपक्व ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स: माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) 1: 400 कमजोर पड़ने पर (एकाग्रता बहुत निर्भर है और अनुकूलन आवश्यक हो सकता है)।
    4. एस्ट्रोसाइट्स: ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) 1:400 कमजोर पड़ने (0.25 μg / mL) 17 पर।
      नोट: एक ही प्रजाति में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी को न मिलाएं।
      नोट: जीएफएपी विश्वसनीय रूप से सफेद पदार्थ एस्ट्रोसाइट्स को लेबल करेगा। ग्रे मैटर एस्ट्रोसाइट्स के लिए, एक वैकल्पिक मार्कर का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (कोमल आंदोलन के साथ बेहतर है)।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ 3x धोएं।
  9. प्रकाश से सुरक्षित एंटीबॉडी डिल्यूएंट या ब्लॉकिंग समाधान में 1:400 कमजोर पड़ने पर उचित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: द्वितीयक एंटीबॉडी को एक फ्लोरोफोरे से संयुग्मित किया जाता है जिसे उपलब्ध माइक्रोस्कोप मापदंडों के आधार पर आपस में बदला जा सकता है। एक बार फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी लागू हो जाने के बाद, जितना संभव हो सके प्रकाश से बचाएं।
  10. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी को इनक्यूबेट करें, प्रकाश के संपर्क को सीमित करें।
  11. अतिरिक्त द्वितीयक एंटीबॉडी को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ 3 बार धोएं।
  12. नाभिक को लेबल करने के लिए, 1: 1,000 DAPI / PBS समाधान का उपयोग करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  13. अंधेरे में 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ 3x धो लें।
  14. माउंट करने के लिए, माउंटिंग मीडिया लागू करें और इमेजिंग से पहले अंधेरे में सूखने की अनुमति दें।
    नोट: माउंटेड स्लाइड्स को 2-3 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर ले जाएं। अधिकतम संकेत के लिए एक सप्ताह के भीतर छवि। सभी प्रतिनिधि छवियों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया गया है; हालांकि, उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की भी सिफारिश की जाती है।

Representative Results

नीचे दिखाए गए प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है कि आईएफएन सिग्नलिंग ओपीसी भेदभाव और परिपक्वता को प्रभावित करता है। आईएफएन रिसेप्टर (आईएफएनआर) की उपस्थिति के बिना, कॉर्टिकल ओपीसी परिपक्व माइलिनेटेड ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में आसानी से अंतर नहीं करते हैं, जो एमबीपी धुंधला होने की अनुपस्थिति से स्पष्ट है (चित्रा 1)। चूंकि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स एक सामान्य पूर्वज से प्राप्त होते हैं, इसलिए हमने जीएफएपी अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया, जो एस्ट्रोसाइट्स को लेबल करता है। हमने पाया कि आईएफएनआर-कमी वाली कोशिकाएं दृढ़ता से जीएफएपी को व्यक्त करती हैं, यह सुझाव देते हुए कि वे एक एस्ट्रोसाइटिक फेनोटाइप को अपना सकते हैं, पहले की रिपोर्ट19 की पुष्टि करते हुए।

सीएनएस कोशिकाओं में क्षेत्रीय विषमता के लिए अतिरिक्त सबूत अलग-अलग एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान द्वारा प्रमाणित होते हैं जैसा कि कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी से एस्ट्रोसाइट्स में देखा जाता है (चित्रा 2)। ध्यान दें, एक ही क्षेत्र के एस्ट्रोसाइट्स भी रूपात्मक विषमता प्रदर्शित कर सकते हैं, इस धारणा का समर्थन करते हुए कि यह ग्लियल उपप्रकार अत्यधिक गतिशील है। सेलुलर वास्तुकला में अंतर कार्यात्मक विविधता का संकेत है और इस प्रकार माइक्रोएन्वायरमेंटल उत्तेजनाओं की अनुपस्थिति और उपस्थिति में फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए ग्लियल आबादी को अलग करने की क्षमता आवश्यक है।

ओलिगोडेंड्रोसाइट्स न्यूरोनल अक्षतंतु के माइलिनेशन के लिए महत्वपूर्ण हैं और उचित सीएनएस मरम्मत और कार्य के लिए आवश्यक हैं। ओपीसी अपने परिपक्व समकक्षों को जन्म देते हैं, जिससे अंतर करने की उनकी क्षमता के पीछे जीव विज्ञान को समझना महत्वपूर्ण हो जाता है। साइटोकिन सिग्नलिंग स्टेम और प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है। इस प्रकार, यह समझना महत्वपूर्ण है कि ओपीसी की क्षेत्रीय प्रतिक्रियाएं अंतर साइटोकिन उत्तेजना (चित्रा 3) में कैसे भिन्न हो सकती हैं, जो परिपक्व माइलिनेटेड ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में अंतर करने की उनकी क्षमता को प्रभावित कर सकती हैं।

Figure 1
चित्र 1: बहिर्जात आईएफएन की उपस्थिति में डब्ल्यूटी और आईएफएनआर-/- चूहों में ओपीसी भेदभाव दिखाने वाले प्रतिनिधि डेटा। ऊपर उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करते हुए कॉर्टिकल ओपीसी को (ए) डब्ल्यूटी और (बी) आईएफएनआर-/- पी 4 माउस पिल्ले से अलग किया गया था। कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 1 एनजी / एमएल आईएफएन के साथ इलाज किया गया था, फिर सेल भेदभाव को चित्रित करने के लिए तय और दाग दिया गया था। ओपीसी को एनजी 2 और जीएफएपी के लिए लेबल किया गया था ताकि उन लोगों की पहचान की जा सके जो एस्ट्रोसाइटिक फेनोटाइप को अपना रहे थे। इसी तरह, ओपीसी को एनजी 2 और एमबीपी के लिए भी लेबल किया गया था ताकि उन लोगों की पहचान की जा सके जो परिपक्व ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में अंतर कर रहे थे। स्केल बार = 20 μM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान में क्षेत्रीय विषमता का प्रदर्शन करने वाले प्रतिनिधि डेटा। कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी के एस्ट्रोसाइट्स को ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके पी 4 माउस पिल्ले से अलग किया गया था और संस्कृति में 48 घंटे के बाद इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा जीएफएपी (हरा) के लिए लेबल किया गया था। स्केल बार = 20 μM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: साइटोकिन्स के लिए क्षेत्रीय ओपीसी की अंतर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करने वाले प्रतिनिधि डेटा। ओपीसी को ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके पी 4 माउस पिल्ले के ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी से अलग किया गया था। कोशिकाओं को (ए) आईएफएन या (बी) इंटरल्यूकिन (आईएल) - 17 की बढ़ती सांद्रता (1-10 एनजी / एमएल ) के साथ इलाज किया गया था ताकि माइलिनिंग ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में अंतर करने के लिए क्षेत्रीय ओपीसी की क्षमता पर साइटोकिन के अंतर प्रभाव की जांच की जा सके। निर्दिष्ट साइटोकिन्स के साथ 48 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, ओपीसी को तय किया गया और एनजी 2 (हरा) और एमबीपी (लाल) के लिए लेबल किया गया। स्केल बार = 20 μM. डेटा प्रतिनिधित्व का अर्थ है ± SEM.**, p < 0.01; , पी < 0.001; , पी < 0.0001 2-तरफ़ा एनोवा द्वारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एंटीबायोटिक समाधान (पीएएस):
1.0 mL एंटीमाइकोटिक जिसमें 10,000 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन और 10,000 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है
25 मिलीग्राम / एम्फोटेरिसिन बी
99 mL 1X PBS
मिश्रित ग्लिया मीडिया (एमजीएम)
88 mL 1X DMEM (उच्च ग्लूकोज, w/ L-Glutamine, w / Na pyruvate)
10 mL हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस
1.0 mL एल-ग्लूटामाइन (100X)
1.0 mL एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक
OPC मीडिया (50mL)
49 mL न्यूरोबेसल मीडिया
1.0 mL B27 पूरक (50X)
10 ng/ml पीडीजीएफ-एए
नोट: पीडीजीएफ-एए प्रत्येक मीडिया परिवर्तन से पहले ताजा जोड़ा जाता है।
एस्ट्रोसाइट मीडिया (1 एल)
764 एमएल ग्लूटामाइन युक्त अर्ल के लवण के साथ एमईएम
36 mL ग्लूकोज (20 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए 100 mg / mL स्टॉक का उपयोग करें)
100 mL हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस
100 mL हीट-निष्क्रिय घोड़े सीरम
10 mL ग्लूटामाइन (स्टॉक माध्यम में शामिल नहीं होने पर 200 mM स्टॉक का उपयोग करें)
वैकल्पिक: 10 एनजी / एमएल पुनः संयोजक माउस एपिडर्मल विकास कारक
नोट: बाँझ फ़िल्टर सभी मीडिया और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

तालिका 1: बफर और मीडिया व्यंजनों।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम माउस सीएनएस से तीन प्रमुख ग्लियल सेल उप-आबादी के अलगाव का वर्णन करते हैं: माइक्रोग्लिया, ओपीसी और एस्ट्रोसाइट्स। न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोइन्फ्लेमेटरी सीएनएस रोगों की जांच के लिए एक बड़ा झटका प्राथमिक मानव कोशिकाओं और ऊतकों की कमी है, विशेष रूप से वे जो क्षेत्रीय और एक ही रोगी से हैं। ज्यादातर उदाहरणों में, मानव सीएनएस सेल लाइनें रूपांतरित, अमर कैंसर कोशिकाओं से प्राप्त होती हैं जो उनके सामान्य शारीरिक व्यवहार20,21,22 का सटीक प्रतिनिधित्व नहीं हो सकती हैं। इस प्रकार, नियंत्रित तरीके से सीएनएस सेल फेनोटाइप का अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक तरीके आवश्यक हैं। इसके अलावा, न्यूरोलॉजिकल ग्लियल सेल आबादी की विविधता प्रत्येक उपप्रकार को एक दूसरे से स्वतंत्र रूप से जांचना आवश्यक बनाती है, साथ ही साथ सह-संस्कृति स्थितियों में भी उनके सेल स्वायत्त और गैर-स्वायत्त कार्यों दोनों को पुन: व्यवस्थित करने के लिए। ग्लियल कोशिकाओं में न्यूरोनल समर्थन 23, सीखने / अनुभूति24,25 और सीएनएस इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं 26 से लेकर सीएनएस में महत्वपूर्ण कार्यों की एक विस्तृत विविधता है। जैसे, एक शारीरिक और रोग संबंधी संदर्भ में प्रत्येक ग्लियल उप-जनसंख्या के आणविक और सेलुलर कार्यों को समझना आवश्यक है। ऐसा करने के लिए, हम यहां व्यवहार्य ग्लिया उपप्रकारों के निष्कर्षण और अलगाव के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करते हैं। मानव विषय के अनुसंधान में व्यावहारिक और नैतिक बाधाओं के कारण, पशु मॉडल वर्तमान में मानव ग्लियल सेल जीव विज्ञान के लिए सबसे प्रासंगिक सरोगेट हैं। विशेष रूप से, चूहे आदर्श मॉडल जानवर हैं क्योंकि उनके जीनोम को स्वास्थ्य और बीमारी के अंतर्निहित विशेष आणविक तंत्र को आगे विच्छेदित करने के लिए हेरफेर और विश्लेषण किया जा सकता है। इसलिए, म्यूरिन माइक्रोग्लिया, ओपीसी और एस्ट्रोसाइट्स का सफल निष्कासन और पृथक्करण शारीरिक, न्यूरोडीजेनेरेटिव या न्यूरोइन्फ्लेमेटरी स्थितियों के दौरान ग्लिया के कार्यों की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

इस प्रोटोकॉल को सीएनएस सेल क्षेत्रीय विषमता का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि ग्लिया रूप और कार्य में क्षेत्रीय विषमता प्रदर्शित करता है। एस्ट्रोसाइट्स क्षेत्रीय रूप से विविध हैं और सीएनएस27 के भीतर उनके स्थान के आधार पर अलग-अलग आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स का घनत्व और उनके माइटोटिक इंडेक्स शारीरिक क्षेत्रों को परिभाषित कर सकते हैं, इस परिकल्पना का समर्थन करते हुए कि क्षेत्रीय एस्ट्रोसाइट विषमता सीएनएस28 के भीतर उनके स्थान के आधार पर आणविक और कार्यात्मक अंतर को प्रतिबिंबित कर सकती है। माइक्रोग्लियल क्षेत्रीय विषमता भी सक्रिय जांच के अधीन है, हालांकि सीएनएस विकास या व्यवहार में माइक्रोग्लिया विविधता के अंतर्निहित तंत्र और कार्यात्मक परिणाम वर्तमान में स्पष्ट नहीं हैं। हालांकि, यह ज्ञात है कि वयस्क माइक्रोग्लिया सेल संख्या, सेल और उपकोशिकीय संरचनाओं और आणविक हस्ताक्षर29 में विविधता प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, मल्टीप्लेक्स मास साइटोमेट्री में हालिया प्रगति ने माइक्रोग्लिया की क्षेत्रीय विषमता को और परिभाषित किया है, नौ मानव दाताओं के पांच अलग-अलग सीएनएस क्षेत्रों से सेलुलर फेनोटाइप का विश्लेषण किया है, जिससे मानव माइक्रोग्लिया30 के बड़े पैमाने पर इम्यूनोफेनोटाइपिंग की अनुमति मिलती है। वर्तमान में, ऐसे दृष्टिकोण अपने नवजात चरणों में हैं, जिससे सीएनएस रोग के विकास में क्षेत्रीय ग्लिया के अध्ययन के लिए पशु अध्ययन एक व्यवहार्य समाधान बन गया है। अंत में, क्षेत्रीय विषमता को हाल ही में ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में भी वर्णित किया गया है। किशोर और वयस्क सीएनएस के 10 क्षेत्रों से 5072 व्यक्तिगत कोशिकाओं पर एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमणने भेदभाव के विभिन्न चरणों में 13 अलग-अलग उप-आबादी की पहचान की। महत्वपूर्ण रूप से, यह भी पाया गया कि जैसे-जैसे ओलिगोडेंड्रोसाइट्स ओपीसी से परिपक्व हुए, उनके ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल अलग हो गए और उनके कार्यात्मक फेनोटाइप बदल गए, जिससे सीएनएस31 के भीतर ऑलिगोडेंड्रोसाइट विषमता पर प्रकाश डाला गया।

इस प्रकार, उनके विविध पड़ोसी न्यूरॉन्स और अन्य ग्लिया के संदर्भ में विभिन्न निवासी सीएनएस कोशिकाओं की क्षेत्रीय विविधता को समझना न्यूरोइन्फ्लेमेटरी और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के इलाज के लिए नए उपचारों के भविष्य के विकास के लिए महत्वपूर्ण तर्क प्रदान कर सकता है। जबकि यह प्रोटोकॉल ग्लियल उप-आबादी के निष्कर्षण, अलगाव और पहचान पर केंद्रित है, यह उनके कार्य की परीक्षा के लिए एक सुविधाजनक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। इसके अलावा, ग्लियल सेल जीव विज्ञान से जुड़े आनुवंशिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इसे ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के साथ अनुकूलित और जोड़ा जा सकता है। इसका उपयोग सह-संस्कृति परख में एक दूसरे के लिए ग्लियल कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। उल्लिखित चरण विभिन्न सीएनएस ग्लियल आबादी को निकालने और अलग करने की लागत-कुशल और उच्च-थ्रूपुट विधि का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसे बाद में प्रयोगात्मक मापदंडों की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए; हालांकि, यहां वर्णित विधि माइलिनेशन के निचले स्तर और ग्लिया के प्रसार के उच्च घनत्व के कारण नवजात शिशुओं का उपयोग करती है। इन कारणों से, वयस्क जानवरों की तुलना में नवजात शिशुओं से व्यवहार्य ग्लिया को अलग करना तकनीकी रूप से अधिक संभव है। वयस्क ग्लिया की तुलना में नवजात ग्लिया में फेनोटाइपिक अंतर को प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा व्याख्या के दौरान माना जाना चाहिए।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का टकराव है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि संपादन और चर्चा के लिए मॉर्गन सेनिका और आकृति स्वरूपण में सहायता के लिए डॉ ग्राहम किड को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएआईडी के 22 एआई 125466 (जेएलडब्ल्यू) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA Gibco 25300054 Tissue dissociation
12-Well Plates Greiner Bio-One 665 180 Cell culture plate
1X PBS pH 7.4 Gibco 10010031 Standard reagent
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S Fixative
50 mL, 25 cm2 cell culture flask Greiner Bio-One 690 175 Cell culture (T25) flask
Antibiotic-Antimycotic 100X Gibco 15240-096 Media component
B-27 Supplement 50X Gibco 17504-044 Media component
Bovine serum albumin Sigma A9647-50G Antibody diluent
Confocal Microscope Zeiss LSM 800 Confocal for imaging
DAPI ThermoFisher D1306 Nuclear stain
DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate Gibco 11995040 Media component
Dnase I Sigma 10104159001 Tissue dissociation
Fetal bovine serum heat inactivated Gibco A3840001 Media component
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-1MG Cell adherent
Fine stitch Scissors Sklar 64-3260 Dissection tools
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 Secondary staining antibody
Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 Invitrogen A21434 Secondary staining antibody
Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) ThermoFisher 14170120 Tissue dissociation
L-glutamine, 200mM Gibco 20530081 Media component
Murine epidermal growth factor ThermoFisher PMG8044 Media component
Murine IFN-γ Peprotech 315-05-20UG Media component
Murine PDGF-AA Peprotech 315-17 Media component
Neurobasal Gibco 21103-049 Media component
Normal goat serum Sigma G9023 Blocking solution component
Operating Scissors Surgi-OR 95-272 Dissection tools
Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip Corning Biocoatt 354086 Cell adherent
Prolong Gold Antifade Reagent Cell Signaling Technology 9071S Mounting Media
Rabbit anti-Iba1 Wako 019-19741 Primary antibody
Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan Millipore ab5320 Primary antibody
Rat anti-GFAP ThermoFisher 13-0300 Primary antibody
Rat anti-myelin basic protein Abcam ab7349 Primary antibody
Sharp Tip Scissors Surgi-OR 95-104 Dissection tools
Stereo Microscope Leica S4 E Stereo Zoom Microscope Microscope for dissection
Tissue Forceps Sklar 66-7644 Dissection tools
Triton X-100 Fisher Bioreagents BP151-100 Cell permabilization
Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) Sigma 10109878001 Tissue dissociation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, R. D., et al. Glial Biology in Learning and Cognition. The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
  2. Nuriya, M., Hirase, H. Involvement of astrocytes in neurovascular communication. Progress in Brain Research. 225, 41-62 (2016).
  3. Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
  4. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).
  5. Kierdorf, K., Prinz, M. Microglia in steady state. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3201-3209 (2017).
  6. Hertz, L., Chen, Y. Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning. Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).
  7. Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).
  8. Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R. Role of Astrocytes in the Neurogenic Niches. Methods Mol Biol. 1938, 19-33 (2019).
  9. Sharif, Y., et al. Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease. Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).
  10. von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. Glial Cells and Integrity of the Nervous System. Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).
  11. Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
  12. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  13. Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H. Astrocyte development and heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020362 (2015).
  14. Liu, R., et al. Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor. Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).
  15. Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  16. Witting, A., Moller, T. Microglia cell culture: a primer for the novice. Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).
  17. Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).
  18. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  19. Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma. Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).
  20. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  21. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).
  23. Stevens, B. Glia: much more than the neuron's side-kick. Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).
  24. Fields, R. D., et al. Glial biology in learning and cognition. Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
  25. Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).
  26. Hartenstein, V., Giangrande, A. Connecting the nervous and the immune systems in evolution. Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).
  27. Emsley, J. G., Macklis, J. D. Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS. Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).
  28. Chaboub, L. S., Deneen, B. Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development. Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).
  29. Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  30. Bottcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).
  31. Marques, S., et al. Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system. Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).

Tags

न्यूरोसाइंस अंक 160 ग्लिया क्षेत्रीय विषमता ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत सेल माइक्रोग्लिया एस्ट्रोसाइट इन विट्रो संस्कृति इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री
कई केंद्रीय तंत्रिका तंत्र क्षेत्रों से मुराइन ग्लिया का विच्छेदन और अलगाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinyuk, M., Williams, J. L.… More

Sinyuk, M., Williams, J. L. Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions. J. Vis. Exp. (160), e61345, doi:10.3791/61345 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter