Summary
Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.
Abstract
Burada sunulan yöntemler, glial alt popülasyonların izolasyonu için merkezi sinir sisteminin (CNS) dört farklı bölgesinin murin yenidoğanlardan diseksiyonu için laboratuvar prosedürlerini göstermektedir. İşlemin amacı, in vitro analizi kolaylaştırmak için mikroglia, oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC'ler) ve astrositleri kortikal, serebellar, beyin sapı ve omurilik dokusundan ayırmaktır. CNS bölgesi izolasyon prosedürleri, çoklu hücre kültürü sistemlerinde glia arasında bölgesel heterojenliğin belirlenmesine izin verir. Hızlı CNS bölgesi izolasyonu gerçekleştirilir, ardından glia'nın meningeal hücre kontaminasyonunu önlemek için meninkslerin mekanik olarak çıkarılması gerçekleştirilir. Bu protokol, hücre bütünlüğünü ve yapışkanlığını korumak için tasarlanmış belirli bir matris üzerinde nazik doku ayrışmasını ve kaplamayı birleştirir. Karışık glia'yı birden fazla CNS bölgesinden izole etmek, bireysel deney hayvanlarının kullanımını en üst düzeye çıkarırken, potansiyel olarak heterojen glia'nın kapsamlı bir analizini sağlar. Ek olarak, bölgesel dokunun ayrışmasını takiben, karışık glia, tek hücre tipi, hücre kültürü plakası ekleri veya ko-kültür sistemlerinde kullanılmak üzere mikroglia, OPC'ler ve astrositler dahil olmak üzere çoklu hücre tiplerine ayrılır. Genel olarak, gösterilen teknikler, dört ayrı CNS bölgesinin murin yenidoğanlardan dikkatli bir şekilde diseksiyonu için kapsamlı bir uygulanabilirlik protokolü sağlar ve herhangi bir sayıda in vitro hücre kültürü sisteminde veya tahlilinde bölgesel heterojenliği incelemek için üç ayrı glia hücre tipinin izolasyonu için yöntemler içerir.
Introduction
Glia, CNS'de uygun nöronal fonksiyon için gereklidir. Her biri farklı, ancak vazgeçilmez bir role sahip üç ana alt popülasyon, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia'dan oluşurlar1. Uygun glial hücre çeşitliliği ve aktivitesi olmadan, nöronal fonksiyon ciddi şekilde etkilenecek ve CNS bozukluğuna yol açacaktır. Glia nörotransmisyonunu etkileyebilir ve her hücre tipi bunu benzersiz bir şekilde yapar. Beyindeki glial hücreler, uygun CNS fonksiyonunu kolaylaştırmak için kendi aralarında ve nöronal hücrelerle iletişim kurma kapasitesine sahiptir2. Oligodendrositler, nöronal aksiyon potansiyeli nesil3'ün bölgeleri olan Ranvier'in düğümlerinde iyon kanallarının kümelenmesini kolaylaştıran bir miyelin kılıfının oluşumu yoluyla elektriksel iletim hızını arttırır. Mikroglia, sinaptik iletimi izleyerek ve yaralanma sonrası nöronal bağlantıları "yeniden kablolayarak" sinapsların budaması için kritiköneme sahiptir 4. Ek olarak, mikroglia, CNS'nin en bol bulunan yerleşik bağışıklık hücresidir ve patojenlere karşı konakçı savunmasının birincil formu olarak işlev görür5. Astrositler, hücre dışı potasyum6 konsantrasyonunu değiştirerek nöronlar arasındaki sinaptik iletimi düzenleyebilir. Ayrıca lokal kan akışını kontrol etmede7, nöromodülatör elementlerin salınmasında ve alınmasındarollere sahiptirler 8 ve kan-beyin bariyeri bakımı9'da kilit bir role sahiptirler. Bu nedenle, her glial alt tip CNS fonksiyonu için kritiktir, çünkü herhangi bir tipteki kusurlar uzun zamandır psikiyatrik hastalıklar, epilepsi ve nörodejeneratif durumlar dahil olmak üzere çok çeşitli patolojik durumlarla ilişkilendirilmiştir10.
CNS patobiyolojisinin incelenmesindeki en büyük engel, insan hücrelerinin mikroçevresel nişleri bağlamında araştırılamamasıdır. İnsan biyopsi dokusu en çok ölüm sonrası toplanır ve hücreler ekstraksiyon ve işleme sırasında kolayca hasar görebilir veya kaybolabilir. Dahası, insan hücrelerini tümörlerden ölümsüzleştirilmiş hücre hatları elde etmeden herhangi bir süre boyunca in vitro olarak canlı ve canlı tutmak bir zorluktur, bu noktada artık normal fizyolojik özelliklerini doğru bir şekilde yansıtmamaktadırlar11,12. Ek olarak, bireysel glia hücre tipleri13,14,15 arasında önemli miktarda bölgesel heterojenlik vardır ve bireysel hastalardan bölgesel CNS örnekleri almak neredeyse imkansızdır. Bu nedenle, spesifik CNS bozukluklarında bölgesel glia'nın katkısını incelemek için alternatif modeller geliştirmek gerekir.
Burada, çoklu glial alt popülasyonların fare CNS bölgesine özgü izolasyonunu kullanarak, olgun oligodendrositlere ve astrositlere yol açan mikroglia, oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) manipülasyonuna ve nicelleştirilmesine izin veren in vitro bir sistemi tanımlamaktayız. Her popülasyon bağımsız olarak izole edilebilir ve deneysel gerekliliğe bağlı olarak ilaç veya molekül tedavisi, immünositokimya, protein / RNA ekstraksiyonu ve analizi ve diğer ko-kültür sistemleri dahil olmak üzere çok çeşitli deneysel tekniklere tabi tutulabilir. Ek olarak, bu izolasyon tekniği yüksek hücre sayısı verir ve her glial popülasyonun yüksek verimli bir şekilde karakterize edilmesine ve araştırılmasına izin verir. Ayrıca, tipik olarak in vivo bir ortamda bulunan kafa karıştırıcı faktörlerden kaçınmak için çok çeşitli mikroçevresel uyaranlara yanıt olarak CNS hücre farklılaşmasının, büyümesinin ve çoğalmasının kontrollü bir şekilde incelenmesini sağlar. Son olarak, bu hücre izolasyon tekniği, bölgesel glia'nın birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini araştırmak ve değişen uyaranlara nasıl tepki verdiğini araştırmak için farklı CNS bölgelerindeki glial hücre popülasyonlarının manipülasyonunu kolaylaştırır, bu da hassasiyet ve tekrarlanabilirliğe izin verir.
Protocol
NOT: Tüm hayvan çalışmaları Cleveland Clinic Lerner Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından yetkilendirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Diseksiyon için ortam ve malzeme hazırlayın
NOT: Tüm tampon ve ortam tarifleri Tablo 1'de verilmiştir. Bu prosedür, biyogüvenlik kabini olarak adlandırılan bir doku kültüründe steril koşullar altında yapılır.
- Karışık glia ortamını (MGM) hazırlayın ve sterilize edin. Bu, bir gün önce yapılabilir ve 4 ° C'de saklanabilir.
- Fibronektin'i sterilH2O ile 1:100 konsantrasyonda seyreltin. Seyreltilmiş fibronektinin hacmi, deney için kullanılan yavru sayısına ve CNS bölgesine bağlı olacaktır. 1 korteks için bir T25 şişe, 2-4 serebella için bir T25 şişe, 2-4 beyin sapı için bir T25 şişe ve 2-4 omurilik için bir T25 şişe kullanın.
NOT: Yukarıda listelenen kriterleri kullanarak aynı bölgedeki dokuyu birleştirmek, aşağıda açıklanan protokolü değiştirmeden yeterli ayrışmaya izin verecektir. Adım 1.2'de açıklanandan daha fazla dokunun birleştirilmesi, ayrışma reaktif konsantrasyonlarının daha fazla optimizasyonunu gerektirecektir. - Pipet 3 mL seyreltilmiş fibronektin T25 şişelere oda sıcaklığında ve 2 dakika bekletin.
- Fibronektini aspire edin ve şişelerin şişe kapağı gevşetilerek gece boyunca kurumasına izin verin.
2. Korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik diseksiyonu
NOT: Bu prosedür tezgah üstünde yapılabilir ve diseksiyon kapsamı gerektirir. İşlemin tüm adımları için sıkı aseptik teknik kullanın ve oda havasına doku maruziyetini en aza indirin. Maksimum doku korumasını sağlamak için diseksiyon sırasında tüm ortamları buz üzerinde soğutulmuş halde tutun. Alternatif olarak, bu prosedür bir iç diseksiyon kapsamının kullanılmasına izin veren bir davlumbazda yapılabilir.
- Tüm alanları% 70 etanol ile silin.
- 10 cm'lik bir Petri kabına 10 mL PBS/antibiyotik çözeltisi (PAS) pipetin. Her yavru için disseke edilecek bir Petri kabı hazırlayın. Çözeltiyi soğuk tutmak için buz üzerine koyun.
- Dezenfekte edilmiş bir doku kültürü başlığında, her CNS bölgesi için bir tane olmak üzere 4 ayrı 15 mL konik tüpe 9 mL DMEM (katkı maddesi içermeyen) pipetin, tüp kapaklarını değiştirin ve buz üzerine koyun. Tüplerle buz kovasını diseksiyon kapsamından ulaşacak mesafeye yerleştirin.
- Adım 2.2'de hazırlanan 10 cm Petri kabını dezenfekte diseksiyon kapsamı aşamasına yerleştirin.
- Fare yavrusunu kurumsal protokole göre anestezi ve ötenazi yapar ve keskin makasla hızlı bir şekilde kafa keserek kafayı çıkarır.
NOT: Doğum sonrası gün (P) 3-5 yavru kullanılır. Yaşlı yavrular daha gelişmiş bir CNS'ye sahiptir ve genişleyen glial hücreler için yeterli bir kaynak olmayabilir. Daha genç yavrular (P) 0-2 daha fazla sayıda glia verebilir ve kullanılabilir; ancak omurilik dokusunun büyüklüğü nedeniyle bu genç yaşta diseke edilmesi çok zordur. - Yavrunun cildini% 70 etanol kullanarak temizleyin.
- İnce makas kullanarak, kutanöz tabakayı hayvanın başının orta çizgisi boyunca kesin, kaudal olarak başlayın ve buruna ulaşana kadar rostral hareket ettirin. Herhangi bir doku hasarını önlemek için kafatasını derinlemesine kesmekten kaçının.
- Kafayı aşağı doğru açılandırmak, kafatasının her iki tarafına kutanöz tabakayı çekmek ve yay makası kullanmak, kafatası orta hattı boyunca bir kesi yapın, foramen magnumundan başlayarak, yine kaudalden rostral'a kesin.
- İnce uçlu forsepslerle, kafatası yarısını sağ ve sol taraflara çekerek korteks, beyincik ve beyin sapını açığa çıkarın.
- Maruz kaldıktan sonra, beyni yavaşça kafatasından çıkarın ve Adım 2.2'de hazırlanan 10 cm'lik Petri kabına kaldırın. Arka beyin bağlı olarak anatomik yapıyı korumak için beynin hasar görmediğinden emin olun.
- Forsepslerin noktası yukarı bakacak şekilde ince, kavisli uçlu forseps kullanarak, beyinciği sıkıştırın. Meninksleri çıkarın ve buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin.
- Beyin sapının doğrudan beyinciğin ventral olduğundan ve beyincik çıkarıldıktan sonra görülebildiğinden emin olun. İnce uçlu forsepslerle çıkarın, meninksleri çıkarın ve buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin.
- Orta beyni korteksten ayırın, kortikal meninksleri çıkarın ve buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin.
- Omuriliği çıkarmak için, kafası kesilmiş fare yavrusunu sırtüstü pozisyonda (yukarı doğru uzanan) yerleştirin ve kopmuş vertebral kolon araştırmacıya doğru yükseltilir.
- % 70 etanol ile tekrar püskürtün.
- Vertebral kolonun yanal tarafları boyunca, rostral ila kaudal yönde, göğüs kafesinden arka bacaklara ulaşana kadar kesin. Kesim yaparken, vertebral kolon görünene kadar iç organları geri itin.
- Vertebral kolonun her bir yan tarafı boyunca izole edilene kadar kesin ve Adım 2.2'de hazırlanan 10 cm'lik Petri kabına yerleştirin.
- Ventral tarafı yukarı, ince yay makası kullanarak, omurilik dokusunu açığa çıkarmak için bel bölgesine ulaşana kadar her omurların sağ ve sol taraflarını alternatif olarak kesin.
- Omuriliği ve meninksleri diseksiyon mikroskobu altında ince uçlu forseps ile nazikçe çıkarın. Buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin.
- Her yavru için 2.5.-2.19 adımlarını tekrarlayın ve hazırlanan her T25 şişesi için adım 1.2'de belirtilen kriterlere uyacak şekilde aynı bölgedeki dokuyu birleştirin.
NOT: Meninksleri mümkün olduğunca tamamen çıkarın. Önemli miktarda meninks kalırsa, meningeal hücrelerin fibroblast benzeri fenomeni büyüyecek ve hücre kültürünü ezecektir. Eşit fenotipteki çoklu omurilikler, spesifik bir hücre kültürü oluşturmak için birleştirilebilir. Hücrelerin aşırı kalabalıklaşmasının meydana gelmediğinden emin olun, bu da glial apoptoza ve diferansiyel fenotiplere yol açabilir.
3. Doku ayrışması
NOT: Aşağıdaki tüm prosedürler, aseptik teknik ve steril malzemeler kullanılarak biyogüvenlik kabini olarak belirlenmiş steril doku kültüründe gerçekleştirilir.
- Doku lizisine başlamak için her 15 mL'lik 9 mL DMEM konik tüpüne ve dokuya 0.53 mM EDTA içeren 1 mL% 0.05 tripsin ekleyin.
NOT: DMEM, tripsin inhibitörü olarak işlev görebilen yüksek miktarda kalsiyum klorür içerir. Belirtilen adımları izleyerek ayrışma tamamlanmazsa, Hanks'in kalsiyum veya magnezyum içermeyen Dengeli Tuz Çözeltisi kullanılabilir. Tripsinizasyondan sonra, enzim bir tripsin inhibitörü eklenerek nötralize edilebilir, ancak sonraki adımlarda kullanılan DNaz I için bir kofaktör olduğu için çözeltiye kalsiyum tekrar eklenmelidir. - 10 mL'lik bir pipetle yaklaşık 20x tritüratlayın.
- Hücre süspansiyonlarını boş 50 mL konik tüplere aktarın.
- Çözeltiyi 37 ° C'de, 15 dakika boyunca% 5 CO2'de inkübe edin, 8 dakika sonra lizatları hafifçe çalkalayın.
- 50 μg / mL'lik bir son konsantrasyon için her tüpe 5 mL MGM ve 200 μL (5 mg / mL) DNaz I ekleyin.
- Her lizatı 10 mL'lik pipet 10x ile tritüre edin.
- Ayrışmamış dokunun tüplerin dibine yerleşmesine izin vermek için hücre süspansiyonlarının oda sıcaklığında 3 dakika oturmasına izin verin.
- Hücre süspansiyonlarını yeni 50 mL konik tüplere aktarın ve ayrışmamış dokuyu geride bırakın.
NOT: Yukarıda açıklanan lizis ve tritürasyon adımları, ayrışmamış doku miktarını önemli ölçüde sınırlar. - Tüpleri frensiz 4 °C'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı aspire edin ve kalan hücre peletlerini 5 mL MGM'de yeniden askıya alın.
- Peleti 5 mL pipet 20x ile tritüre edin.
- 5 mL hücre süspansiyonlarını kaplamalı T25 şişelere plakalayın.
- Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe edin ve hücre kalıntılarını gidermek için başlangıçta 24 saat sonra ortamı değiştirin.
NOT: Bazı protokoller 72 saatten sonra ilk ortam değişikliğini önerir. Bu adımın optimizasyonu gerekebilir. - MGM ile hücreler% 80 kaynaşana kadar (yaklaşık 5-7 gün) her 48-72 saatte bir% 100 ortam değişikliği yapın.
NOT: Ortam değişmeden önce tüm ortamlar 37 °C'ye ısıtılmalıdır.
4. Mikroglia izolasyonu
- Karışık glia kültürleri% 80 akıcılığa ulaştığında, kapakları sıkarak ve parafin filmle kapatarak sallamak için şişeler hazırlayın.
- Mikroglia'yı karışık glial kültürlerden çıkarmak için, şişeleri 37 ° C'lik bir inkübatörün içindeki yörüngesel bir çalkalayıcıya yatay olarak sabitleyin. Şişeleri 1 saat boyunca 15 x g'de sallayın.
- Ortam ve pipeti 15 mL'lik konik bir tüpe çıkarın. Şişeleri 3 mL ılık MGM ile iki kez durulayın, 15 mL konik tüplere yıkama ekleyin. Bunlar mikroglia.
- Kültür şişelerine 5 mL sıcak, taze MGM ekleyin.
- Şişeleri parafin filmle yeniden kapatın, şişeleri çalkalayıcı üzerinde yatay olarak sabitleyin ve OPC'lerin astrositlerden ayrılması için 15 saat boyunca 37 ° C'de 15 x g'de çalkalayın.
NOT: Bu adım gece boyunca yapılabilir, ancak 15 saatlik sarsıntı süresi kritik öneme sahiptir, çünkü fazla zaman hücre ölümüne neden olabilir. - Süpernatantı adım 4.3'ten itibaren santrifüj edin. 3 dakika boyunca 300 x g'da ve standart protokollere göre kültür mikroglia16 veya biyolojik bir tahlil için kullanın.
5. Oligodendrosit öncü hücre izolasyonu
NOT: OPC'leri ilk izolasyondan sonra kaplarken, poli-D-lizin kaplı bir yüzeye (steril plaka veya kapak kayması) kaplanmalıdır. Bu bölümü tamamlamadan önce bu materyalleri hazırlayın.
- 15 saatlik sallamanın ardından, süpernatantı şişelerden çıkarın ve steril 100 mm Petri kabı üzerindeki plakayı çıkarın.
- Süpernatantı 37 ° C'de, 30 dakika boyunca% 5 CO2'de kuluçkaya yatırın, kalan mikroglia'yı çıkarmak için 15 dakika sonra döndürün, çünkü bunlar yemeğe çok hızlı bir şekilde yapışacaktır. Bu adım için doku kültürü ile tedavi edilmemiş Petri kapları kullanılabilir.
- Poli-D-lizin kaplı bir yüzeydeki yapışkan olmayan hücre süpernatanı, sayımını ve plakasını çıkarın. Tipik olarak, 7.500-10.000 OPC kaplanır /cm2.
- 37 °C'de, en az 1 saat (6 saate kadar) için% 5 CO2'yi inkübe edin, ardından ortamın% 95'ini yavaşça aspire edin ve OPC'lerin bozulmasını en aza indirmek için ortamı kuyunun duvarına pipetleyerek yavaşça sıcak OPC Ortamı ekleyin. Hücreler kullanıma hazır olana kadar medyayı her 48 saatte bir değiştirin.
NOT: Aynı anda yalnızca bir kuyunun değiştirilmesi çok önemlidir. OPC'ler hassastır ve özellikle kuru koşullara karşı toleranssızdır. OPC ortamına PDGF-AA'nın eklenmesi, OPC olgunlaşmasını oligodendrositlere geciktirmektir. Bu faktör, deneysel odak olgun oligodendrositler ise kültür medyasından dışlanabilir.
6. Astrosit izolasyonu
- 15 saatlik sallamanın ardından, süpernatantı çıkarın ve şişeleri ılık 1x PBS ile 2x durulayın.
- 0.53 mM EDTA içeren 4 mL% 0.05 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 5 dakika veya hücreler kalkana kadar inkübe edin. Astrositlerin kalktığından emin olmak için, standart bir geniş alan mikroskobu kullanarak onları görselleştirin. Astrositler tripsinizasyondan sonra küresel olarak görünecektir.
- Astrositler ayrıldıktan sonra, şişeyi dikey olarak durun ve 4 mL MGM ekleyin. Karıştırmak için tritürat.
- Pipet astrositleri 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin, 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
- Astrosit Ortamındaki astrositleri ve fibronektin kaplı yüzeydeki plakayı adım 1.2'de açıklandığı gibi yeniden askıya alın. veya biyolojik tahlil için kullanın.
NOT: 20 ng / mL murin fibroblast büyüme faktörü, astrosit kültürünün oluşturulmasına yardımcı olmak için ilk ortam değişikliği sırasında eklenebilir. Ek olarak, standart jelatin kaplama, fibronektin'e düşük maliyetli bir alternatif olabilir.
7. İmmünositokimya kullanılarak mikroglia, OPC'ler, astrositler ve olgun oligodendrositlerin tanımlanması ve izolasyonu
- Kaplanmış hücreler uygun akıcılığa ulaştığında, ortamı nazikçe çıkarın ve 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) kullanarak yapışkan hücreleri sabitleyin. Bu adımı bir biyogüvenlik kabininde yapın.
NOT: Aspire ederken veya çözelti eklerken, hücre ayrılmasını önlemek için hafif basınçlı pipet. - PFA'yı yavaşça aspire edin, ardından hücreleri 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kat yıkayın.
- 1x PBS'de% 10 serum ve% 0.1 Triton X-100 kullanarak uygun blokaj çözeltisi hazırlayın.
NOT: Serum kaynağı, sekonder antikorun yükseldiği konakçı hayvanı yansıtır. Örneğin, ikincil antikor keçi anti-tavşanı ise, uygun bloke edici serum normal keçi serumudur. Aynı şekilde, ikincil antikor eşek anti-tavşanı ise, bloke edici serum normal eşek serumu olmalıdır. - Hücreler tamamen kaplanana kadar bloke edici çözelti ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edin.
- Bir antikor seyreltici çözeltisi hazırlayın (9 mL 1x PBS, 0.01 g sığır serum albümini, 30 μL Triton X-100). Alternatif olarak, antikorlar adım 6.3'te açıklanan blokaj çözeltisinde seyreltilebilir.
- Antikor seyreltici veya bloke edici çözeltide aşağıdakilere özgü birincil antikorları seyreltin:
- Mikroglia: 1:250 seyreltmede (2.4 μg / mL) iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba1).
- OPC'ler: 1:200 seyreltmede (5 μg / mL) nöral / glial antijen 2 (NG2).
- Olgun oligodendrositler: 1:400 seyreltmede miyelin bazik proteini (MBP) (konsantrasyon çok bağımlıdır ve optimizasyon gerekli olabilir).
- Astrositler: 1:400 seyreltmede glial fibriler asidik protein (GFAP) (0.25 μg / mL)17.
NOT: Aynı türde yetiştirilen birincil antikorları karıştırmayın.
NOT: GFAP beyaz cevher astrositlerini güvenilir bir şekilde etiketleyecektir. Gri madde astrositleri için alternatif bir işaretleyici kullanılması gerekebilir.
- Primer antikoru gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (hafif ajitasyon tercih edilir).
- Birincil antikoru çıkarmak için 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3x yıkayın.
- Uygun sekonder antikorlara sahip hücreleri, ışıktan korunan antikor seyrelticisinde veya bloke edici çözeltide 1:400 seyreltmede inkübe edin.
NOT: Sekonder antikorlar, mevcut mikroskop parametrelerine bağlı olarak değiştirilebilen bir florofora konjuge edilir. Floresan sekonder antikorlar uygulandıktan sonra, mümkün olduğunca ışıktan koruyun. - Sekonder antikoru oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe ederek ışığa maruz kalmayı sınırlayın.
- Fazla sekonder antikoru çıkarmak için 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Çekirdekleri etiketlemek için 1:1.000 DAPI/PBS çözeltisi kullanın ve karanlıkta oda sıcaklığında hücreleri 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Karanlıkta 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3x yıkayın.
- Montaj için, montaj ortamını uygulayın ve görüntülemeden önce karanlıkta kurumaya bırakın.
NOT: Monte edilmiş kızaklar oda sıcaklığında 2-3 gün saklanabilir. Uzun süreli depolama için slaytları 4 °C'ye taşıyın. Maksimum sinyal için bir hafta içinde görüntü. Tüm temsili görüntüler konfokal mikroskopta görüntülenmiştir; Bununla birlikte, ters floresan mikroskoplar da önerilir.
Representative Results
Aşağıda gösterilen temsili veriler, IFNγ sinyallemesinin OPC farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkilediğini göstermektedir. IFNγ reseptörü (IFNγR) varlığı olmadan, kortikal OPC'ler olgun miyelinizan oligodendrositlere kolayca farklılaşmaz, bu da MBP boyamasının yokluğu ile kanıtlanır (Şekil 1). Oligodendrositler ve astrositler ortak bir progenitörden türetildiğinden, astrositleri etiketleyen GFAP ekspresyonunu analiz ettik. IFNγR eksikliği olan hücrelerin, GFAP'yi güçlü bir şekilde eksprese ettiklerini, astrositik bir fenotipi benimsemiş olabileceklerini ve daha önceki raporları19'u doğruladıklarını düşündürdüğünü bulduk.
CNS hücrelerinde bölgesel heterojenite için ek kanıtlar, korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilikten astrositlerde görüldüğü gibi değişen astrosit morfolojisi ile kanıtlanmıştır (Şekil 2). Aynı bölgedeki astrositler de morfolojik heterojenlik sergileyebilir ve bu glial alt tipin oldukça dinamik olduğu fikrini destekleyebilir. Hücresel mimarideki farklılıklar fonksiyonel çeşitliliği düşündürmektedir ve bu nedenle glial popülasyonları izole etme yeteneği, mikroçevresel uyaranların yokluğunda ve varlığında fenotipik yanıtları incelemek için gereklidir.
Oligodendrositler, nöronal aksonların miyelinasyonu için kritik öneme sahiptir ve uygun CNS onarımı ve fonksiyonu için gereklidir. OPC'ler olgun meslektaşlarına yol açar ve farklılaşma yeteneklerinin arkasındaki biyolojiyi anlamayı kritik hale getirir. Sitokin sinyalizasyonu kök ve immün hücre davranışını önemli ölçüde etkiler. Bu nedenle, OPC'lerin bölgesel tepkilerinin diferansiyel sitokin stimülasyonuna nasıl değişebileceğini anlamak önemlidir (Şekil 3), bu da olgun miyelinizan oligodendrositlere farklılaşma yeteneklerini etkileyebilir.
Şekil 1: Eksojen IFNγ varlığında WT ve IFNγR-/- farelerde OPC farklılaşmasını gösteren temsili veriler. Kortikal OPC'ler, yukarıda özetlenen prosedürü izleyerek (A ) WT ve (B) IFNγR-/- P4 fare yavrularından izole edildi. Hücreler 48 saat boyunca 1 ng / mL IFNγ ile tedavi edildi, daha sonra hücre farklılaşmasını tanımlamak için sabitlendi ve boyandı. OPC'ler, astrositik bir fenotipi benimseyenleri tanımlamak için NG2 ve GFAP için etiketlendi. Benzer şekilde, OPC'ler de olgun oligodendrositlere farklılaşanları tanımlamak için NG2 ve MBP için etiketlendi. Ölçek çubuğu = 20 μM. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Astrosit morfolojisinde bölgesel heterojenliği gösteren temsili veriler. Korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilikten astrositler, yukarıda açıklanan protokol kullanılarak P4 fare yavrularından izole edildi ve kültürde 48 saat sonra immünositokimya ile GFAP (yeşil) için etiketlendi. Ölçek çubuğu = 20 μM. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bölgesel OPC'lerin sitokinlere ayırıcı yanıtlarını gösteren temsili veriler. OPC'ler, yukarıda açıklanan protokol kullanılarak P4 fare yavrularının beyin sapından ve omuriliğinden izole edildi. Hücreler, sitokinin bölgesel OPC'lerin miyelinizan oligodendrositlere farklılaşma yeteneği üzerindeki diferansiyel etkisini araştırmak için artan konsantrasyonlarda (1-10 ng / mL) ( A ) IFNγ veya (B ) interlökin (IL)-17 ile tedavi edildi. Belirtilen sitokinlerle 48 saatlik bir inkübasyonun ardından, OPC'ler sabitlendi ve NG2 (yeşil) ve MBP (kırmızı) için etiketlendi. Ölçek çubuğu = 20 μM. Veriler, SEM ± anlamına gelir. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p 0.0001 < 2-yönlü ANOVA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| PBS / Antibiyotik Çözeltisi (PAS): | ||
| 1,0 mL | 10.000 ünite/mL penisilin ve 10.000 mg/mL streptomisin içeren 100X Antibiyotik/Antimikotik | |
| 25 mg/mL | Amfoterisin B | |
| 99 mL | 1X PBS | |
| Karışık glia Medya (MGM) | ||
| 88 mL | 1X DMEM (yüksek glukoz, L-glutamin, Na piruvat ile) | |
| 10 mL | Isı ile inaktive edilmiş FBS | |
| 1,0 mL | L-Glutamin (100X) | |
| 1,0 mL | Antibiyotik/Antimikotik | |
| OPC Medya (50mL) | ||
| 49 mL | Nörobazal medya | |
| 1,0 mL | B27 takviyesi (50X) | |
| 10 ng/ml | PDGF-AA | |
| NOT: PDGF-AA, her medya değişikliğinden önce yeni eklenir. | ||
| Astrosit Medya (1 L) | ||
| 764 mL | Glutamin içeren Earle tuzları ile MEM | |
| 36 mL | Glikoz (20 mM'lik son konsantrasyon için 100 mg/mL stok kullanın) | |
| 100 mL | Isı ile inaktive edilmiş FBS | |
| 100 mL | Isı ile inaktive edilmiş at serumu | |
| 10 mL | Glutamin (stok ortamına dahil değilse 200 mM stok kullanın) | |
| İSTEĞE BAĞLI: 10 ng/mL rekombinant fare epidermal büyüme faktörü | ||
| NOT: Tüm ortamları steril olarak filtreleyin ve kullanılıncaya kadar 4°C'de saklayın. | ||
Tablo 1: Tampon ve Medya Tarifleri.
Discussion
Bu protokolde, üç büyük glial hücre alt popülasyonunun fare CNS'sinden izolasyonunu açıklıyoruz: mikroglia, OPC'ler ve astrositler. Nörodejeneratif ve nöroinflamatuar SSS hastalıklarının araştırılmasında önemli bir gerileme, birincil insan hücrelerinin ve dokularının, özellikle de bölgesel ve aynı hastadan gelenlerin eksikliğidir. Çoğu durumda, insan CNS hücre çizgileri, normal fizyolojik davranışlarının doğru temsilleri olmayabilecek dönüştürülmüş, ölümsüzleşmiş kanser hücrelerinden türetilir20,21,22. Bu nedenle, CNS hücre fenotiplerini kontrollü bir şekilde incelemek için alternatif yöntemler gereklidir. Ayrıca, nörolojik glial hücre popülasyonlarının çeşitliliği, her bir alt tipin hem birbirinden bağımsız olarak hem de hem hücre özerk hem de otonom olmayan işlevlerini özetlemek için ortak kültür koşullarında araştırılmasını gerekli kılmaktadır. Glial hücreler, CNS'de nöronal destek23, öğrenme / biliş 24,25 ve CNS immünolojik yanıtları26 arasında değişen çok çeşitli kritik fonksiyonlara sahiptir. Bu nedenle, her bir glial alt popülasyonun moleküler ve hücresel fonksiyonlarını fizyolojik ve patolojik bir bağlamda anlamak gerekir. Bunu yapmak için, burada canlı glia alt tiplerinin ekstraksiyonu ve izolasyonu için güvenilir bir yöntem sunuyoruz. İnsan deneğin araştırmasındaki pratik ve etik kısıtlamalar nedeniyle, hayvan modelleri şu anda insan glial hücre biyolojisi için en uygun vekillerdir. Özellikle, fareler ideal model hayvanlardır, çünkü genomları sağlık ve hastalığın altında yatan belirli moleküler mekanizmaları daha da incelemek için manipüle edilebilir ve analiz edilebilir. Bu nedenle, murin mikroglia, OPC'ler ve astrositlerin başarılı bir şekilde çıkarılması ve ayrılması, fizyolojik, nörodejeneratif veya nöroinflamatuar durumlar sırasında glia'nın işlevlerini araştırmak için önemli bir araçtır.
Bu protokol, CNS hücresinin bölgesel heterojenliğini keşfetmek için optimize edilebilir. Glia'nın biçim ve işlev olarak bölgesel heterojenlik sergilediği giderek daha açık hale gelmektedir. Astrositler bölgesel olarak çeşitlidir ve CNS27 içindeki konumlarına bağlı olarak farklı morfoloji gösterirler. Ayrıca, astrositlerin yoğunluğu ve mitotik indeksleri anatomik bölgeleri tanımlayabilir ve bölgesel astrosit heterojenliğinin CNS28 içindeki konumlarına bağlı olarak moleküler ve fonksiyonel farklılıkları yansıtabileceği hipotezini destekleyebilir. Mikroglial bölgesel heterojenite de aktif olarak araştırılmaktadır, ancak MSS gelişimi veya davranışındaki mikroglia çeşitliliğinin altında yatan mekanizmalar ve fonksiyonel sonuçlar şu anda belirsizdir. Bununla birlikte, yetişkin mikroglia'nın hücre sayısında, hücre ve hücre altı yapılarında ve moleküler imzalarda çeşitlilik gösterdiği bilinmektedir29. Ayrıca, çoklanmış kütle sitometrisindeki son gelişmeler, dokuz insan donörünün beş farklı CNS bölgesinden hücresel fenotipi analiz ederek, insan mikroglia30'un büyük ölçekli immünofenotipine izin vererek, mikroglia'nın bölgesel heterojenliğini daha da tanımlamıştır. Şu anda, bu tür yaklaşımlar yeni ortaya çıkma aşamalarındadır ve hayvan çalışmalarını CNS hastalığı gelişiminde bölgesel glia çalışması için uygun bir çözüm haline getirmektedir. Son olarak, bölgesel heterojenite son zamanlarda oligodendrositlerde de tanımlanmıştır. Juvenil ve yetişkin CNS'nin 10 bölgesinden 5072 bireysel hücre üzerinde tek hücreli RNA dizilimi, farklılaşmanın farklı aşamalarında 13 farklı alt popülasyon tanımladı31. Önemli olarak, oligodendrositlerin OPC'lerden olgunlaştıkça, transkripsiyonel profillerinin farklılaştığı ve fonksiyonel fenotiplerinin değiştiği ve CNS31 içindeki oligodendrosit heterojenliğini vurguladığı bulunmuştur.
Bu nedenle, çeşitli yerleşik CNS hücrelerinin bölgesel heterojenliğini, çeşitli komşu nöronları ve diğer gliaları bağlamında anlamak, nöroinflamatuar ve nörodejeneratif bozuklukları tedavi etmek için yeni tedavilerin gelecekteki gelişimi için önemli bir gerekçe sağlayabilir. Bu protokol, glial alt popülasyonların ekstraksiyonu, izolasyonu ve tanımlanmasına odaklanırken, işlevlerinin incelenmesi için uygun bir başlangıç noktası sağlar. Ayrıca, glial hücre biyolojisi ile ilişkili genetik mekanizmaları incelemek için transgenik fare modelleriyle uyarlanabilir ve birleştirilebilir. Ayrıca, glial hücrelerin ko-kültür tahlillerinde birbirlerine verdikleri yanıtları incelemek için de kullanılabilir. Özetlenen adımlar, daha sonra çok çeşitli deneysel parametrelere uyarlanabilen farklı CNS glial popülasyonlarının çıkarılması ve izole edilmesi için uygun maliyetli ve yüksek verimli bir yöntemi temsil etmektedir. Unutulmamalıdır ki; Bununla birlikte, burada açıklanan yöntem, daha düşük miyelinasyon seviyeleri ve çoğalan gliaların yüksek yoğunluğu nedeniyle yenidoğanları kullanır. Bu nedenlerden dolayı, canlı glia'yı yenidoğanlardan izole etmek yetişkin hayvanlara kıyasla teknik olarak daha uygundur. Bu nedenle, yenidoğan gliasındaki yetişkin gliaya kıyasla fenotipik farklılıklar deneysel tasarım ve veri yorumlama sırasında göz önünde bulundurulmalıdır.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları vardır.
Acknowledgments
Morgan Psenicka'ya el yazması düzenleme ve tartışma için ve Dr. Grahame Kidd'e şekil biçimlendirme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIAID K22 AI125466 (JLW) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
| 12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
| 50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
| B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
| DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
| Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
| Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
| Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
| Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
| Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
| L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
| Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
| Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
| Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
| Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
| Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
| Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
| Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
| Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
| Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
| Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
| Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
| Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |
References
- Fields, R. D., et al. Glial Biology in Learning and Cognition. The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Nuriya, M., Hirase, H.
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).
- Kierdorf, K., Prinz, M.
- Hertz, L., Chen, Y. Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning. Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).
- Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).
- Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R.
- Sharif, Y., et al. Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease. Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).
- von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. Glial Cells and Integrity of the Nervous System. Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H.
- Liu, R., et al. Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor. Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Witting, A., Moller, T. Microglia cell culture: a primer for the novice. Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).
- Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma. Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).
- Stevens, B. Glia: much more than the neuron's side-kick. Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).
- Fields, R. D., et al. Glial biology in learning and cognition. Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).
- Hartenstein, V., Giangrande, A. Connecting the nervous and the immune systems in evolution. Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).
- Emsley, J. G., Macklis, J. D. Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS. Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).
- Chaboub, L. S., Deneen, B. Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development. Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bottcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).
- Marques, S., et al. Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system. Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).
