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Biochemistry

साइटोसोलिक ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरास के संभावित अवरोधकों के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक स्क्रीनिंग

Published: October 10, 2020 doi: 10.3791/61347
Automatic Translation
1,2, *1,3, *1,3
1Research platform of Pediatric Onco-Hematology, Department of Paediatrics, Gynaecology and Obstetrics, Faculty of Medicine, University of Geneva, 2Section of Biology, Faculty of Science, University of Geneva, 3Onco-Hematology Unit, Department of Women, Children-Adolescents, University Hospitals of Geneva
* These authors contributed equally

Summary

ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेस (जीटीएस) कई कीमोथेर्यूटिक दवाओं के मेटाबोलिज्म में शामिल विषहरण एंजाइम हैं। जीटीएस का अतिव्यवसंबंध कैंसर कीमोथेरेपी प्रतिरोध से सहसंबद्ध है। इस फेनोटाइप का मुकाबला करने का एक तरीका अवरोधकों का उपयोग करना है। यह प्रोटोकॉल संभावित जीएसटी अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख का उपयोग करके एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेस (जीटीएस) मेटाबोलिक एंजाइम हैं जो ग्लूटाथिएक (जीएसएच) कंजूगेशन द्वारा अंतर्जात या बहिर्जात इलेक्ट्रोफिलिक यौगिकों के उन्मूलन के लिए जिम्मेदार हैं। इसके अलावा, जीटीएस माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनासेस (एमएपीके) के नियामक हैं जो एपोटोटिक रास्तों में शामिल हैं। जीटीएस का अतिव्यवसंगत विद्युत एल्किलाटिंग एजेंटों के साथ कीमोथेरेपी से गुजरने वाले रोगियों के बीच कम चिकित्सीय प्रभावकारिता से सहसंबद्ध है। जीएसटी अवरोधकों का उपयोग करना इस प्रवृत्ति को पलटने और उपचार शक्ति को बढ़ाने के लिए एक संभावित समाधान हो सकता है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक सटीक, त्वरित और आसान एंजाइम परख के साथ ऐसे यौगिकों की खोज की आवश्यकता होती है। 1-क्लोरो-2,4-डिनिट्रोबेनजेन (सीडीएनबी) का उपयोग करके एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक प्रोटोकॉल साहित्य में सबसे अधिक नियोजित विधि है। हालांकि, पहले से ही वर्णित जीएसटी निषेध प्रयोग एक इष्टतम निषेध परख के प्रत्येक चरण का ब्यौरा प्रोटोकॉल प्रदान नहीं करते हैं, जैसे सीडीएनबी के लिए माइकलिस-मेंटेन स्थिर (KM)का माप या नियोजित एंजाइम एकाग्रता का संकेत, एक परीक्षण यौगिक की निषेध शक्ति का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के साथ, हम संभावित अवरोधकों के पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए एक अनुकूलित स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक जीएसटी एंजाइम परख के प्रत्येक चरण का वर्णन करते हैं। हम आधा अधिकतम अवरोधक एकाग्रता (IC50) और अवरोध के निरंतर (K i) की गणना की व्याख्याकरते हैं-एंजाइम अवरोधक की शक्ति को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली दो विशेषताएं। वर्णित विधि को कोशिकाओं या शुद्ध पुनर्संयोजन मानव जीटीएस से निकाले गए जीटीएस के पूल का उपयोग करके लागू किया जा सकता है, नामत जीएसटी अल्फा 1 (जीएसटीए1), जीएसटी म्यू 1 (जीएसटीएम1) या जीएसटी पीआई 1 (जीएसटीपी1)। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को जीएसटी थीटा 1 (जीएसटीटी1) पर लागू नहीं किया जा सकता है, क्योंकि सीडीएनबी इस आइसोफॉर्म के लिए सब्सट्रेट नहीं है। इस विधि का उपयोग घोड़े के जिगर से जीटीएस का उपयोग करके करक्यूमिन की निषेध शक्ति का परीक्षण करने के लिए किया गया था। करक्यूमिन कैंसर विरोधी गुणों का प्रदर्शन करने वाला एक अणु है और सिलिको डॉकिंग भविष्यवाणियों के बाद जीएसटी आइसोफॉर्म के प्रति आत्मीयता दिखाई। हमने दिखा दिया कि करक्यूमिन एक शक्तिशाली प्रतिस्पर्धी जीएसटी अवरोधक है, जिसमें 31.6 ± 3.6 माइक्रोनएमका आईसी50 और 23.2 ± 3.2 माइक्रोन की एक के आई है। करक्यूमिन में अपनी प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए इलेक्ट्रोफिलिक कीमोथेरेपी दवा के साथ संयुक्त होने की क्षमता है।

Introduction

साइटोसोलिक ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेस एंजाइम (जीटीएस, ईसी 2.5.1.18) ने ग्लूटाथिएक (जीएसएच) के संयुग्मण को विभिन्न इलेक्ट्रोफिलिक यौगिकों जैसे कीमोथैरेपी एजेंटों में उत्प्रेरित किया, ताकि उन्हें शरीर से आसानी से डिटॉक्सिफाई और खत्म किया जा सके1। साइटोसोलिक जीएसटी के सात आइसोफॉर्म की पहचान अल्फा, एमयू, पीआई, सिग्मा, ओमेगा, थेटा और जीटा के रूप में की गई है। जीटीएस मुख्य रूप से यकृत, वृषण, फेफड़ों और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट 2 में व्यक्त किएजातेहैं। जीएसटी अल्फा 1 (जीएसटीए1) आइसोफॉर्म हेपेटोसाइट्स में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। शरीर विषम रूप से मस्तिष्क, हृदय और फेफड़ों में जीएसटी पीआई 1 (जीएसटीपी1) और यकृत में जीएसटी म्यू 1 (जीएसटीएम1) सहित अन्य उपप्रकारों को व्यक्त करता है और3टेस्ट करता है। यद्यपि जीएसटी आइसोफॉर्म के बीच उच्च अनुक्रम होमोलॉजी है, प्रत्येक अपनी अंतर अभिव्यक्ति4, 5,के अनुसार, विशिष्टता को दर्शाता है और विभिन्न तरीकों से दवा चयापचय और कैंसर में फंसायाजाताहै।

इलेक्ट्रोफिलिक यौगिक या तो शरीर में एक्सोजेनोसी रूप से प्रवेश करते हैं या अंतर्जात रूप से उत्पादित होते हैं। कीटनाशक, प्रोस्टाग्लैंडिन, कार्सिनोजन और कीमोथैरेप्टिक दवाएं ग्लूटाथिएक कंजूगेशन प्रतिक्रियाओं6के लिए कुछ संभावित सब्सट्रेट्स हैं। उदाहरण के लिए, एक कोशिका के भीतर गठित किसी भी इलेक्ट्रॉन की कमी प्रतिक्रियाशील यौगिक एक इलेक्ट्रोफिलिक सब्सट्रेट बनने की संभावना है । क्लोरैम्बुसिल या मेलफालन जैसे एल्किलेटिंग एजेंटों को जीटीएस द्वारा उत्प्रेरित जीएसएच के संजूगेट के रूप में समाप्त कर दिया जाता है, और इन एंजाइमों के बढ़े हुए स्तर को इन यौगिकों के प्रतिरोध के साथ सहसंबद्ध किया गया है6,,7।

साइटोसोलिक जीटीएस की एक और महत्वपूर्ण भूमिका मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनासेस (एमएपीके) जैसे MAPK8 (जिसे सी-जून एन-टर्मिनल किनेज़, या जेएनके 1 के रूप में भी जाना जाता है) और MAP3K5 (जिसे एपोप्टोसिस सिग्नल-विनियमन किनेज 1, या ASK1 के रूप में भी जाना जाता है)8की गतिविधि को विनियमित करना है। उनके मोनोमेरिक संरचना में कुछ आइसोफॉर्म इन प्रोटीन से बांधेंगे और इस तरह फॉस्फोरिलेशन झरना को ब्लॉक कर देंगे। सामान्य परिस्थितियों में, GSTP1 आइसोफॉर्म MAPK8 (सी-जून प्रोटीन का सक्रियक) को अलग करेगा। सी-जून को सी-फोस प्रोटीन के साथ मिलाकर एक्टिवेटर प्रोटीन 1 (एपी-1) ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बनाता है, जो प्रो-एपोटोटिक जीन को पार करने के लिए जिम्मेदार है । तनावग्रस्त कोशिकाओं में, GSTP1 और MAPK8 द्वारा गठित परिसर अलग हो जाता है, सी-जून सक्रिय होता है, और एपोप्टोसिस के लिए अग्रणी जीन9व्यक्त किए जाने लगते हैं। इसलिए इस जीएसटी आइसोफॉर्म की अधिक अभिव्यक्ति मार्ग को अवरुद्ध कर सकती है, जिससे सेल व्यवहार्यता में वृद्धि, अधिक सेलुलर प्रसार और कीमोथेरेपी के प्रति कम सेलुलर संवेदनशीलता हो सकती है। इसी तरह के परिदृश्य GSTP1 के पैरालॉग के साथ हो सकते हैं, उदाहरण के लिए, GSTM1, जो MAP3K510के साथ बातचीत करता है।

जीटीएस द्वारा नशीली दवाओं के चयापचय और एमएपीके के ज़ब्ती में निभाई गई भूमिकाओं से यह परिकल्पना हुई कि जीटीएस की अधिक अभिव्यक्ति कीमोथैरेपी उपचार6,11के लिए ट्यूमर प्रतिरोध तंत्र का संकेत हो सकती है । उदाहरण के लिए, जीएसटीपी 1 कई कैंसरों में अधिक अनुमानित है और इसकी उपस्थिति खराब पूर्वानुमान और पतन8की बढ़ी हुई घटनाओं से सहसंबद्ध है। इन जीनों में बहुरूपता ने विभिन्न रोगों को पेश करने वाले रोगियों के लिए अंतर दवा जोखिम और जीवित रहने की दर भी दिखाई है, इस विचार को मजबूत किया है कि ये एंजाइम दवा प्रतिरोध के तंत्र के लिए महत्वपूर्ण हैं । उदाहरण के लिए, जीएसटीएम1 नल जीनोटाइप वाले व्यक्ति कम दवा निकासी और बेहतर अस्तित्व12, 13,से जुड़ेहुएहैं। इस अतिव्यक्तता का मुकाबला करने के कई संभावित साधन हैं, जैसे जीएसएच एनालॉग का उपयोग, प्रोड्रग जो जीटीएस के साथ संयुग्मण द्वारा सक्रिय होते हैं, या प्रत्यक्ष जीएसटी अवरोधक14,,15।

इन सभी तरीकों की जांच की जा रही है, और कुछ यौगिकों रोगियों के बीच अपने संभावित उपयोग के लिए नैदानिक परीक्षण शुरू कर दिया है । हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, नैदानिक सेटिंग्स15में जीएसटी अवरोधक के रूप में उपयोग में कोई यौगिक नहीं हैं। दरअसल, कुछ आइसोफॉर्म के लिए विशिष्टता की कमी या सामान्य कोशिकाओं में जीएसएच की कमी, जो अंग प्रणालियों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के संचय के कारण विषाक्तता का कारण बन सकती है, कुछ कमियां हैं जो जीएसटी अवरोधकों की क्षमता को कम करती हैं14,,15। जोखिम है कि इन यौगिकों शरीर पर अन्य फार्माकोडायनामिक प्रभाव डालती हो सकता है भी उनके उपयोग को सीमित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, एथाक्र्रिनिक एसिड प्रयोगशाला वातावरण में सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया गया जीएसटी अवरोधक है, लेकिन क्योंकि यह मुख्य रूप से एक मजबूत मूत्रवर्धक के रूप में उपयोग किया जाता है, यह संपत्ति नैदानिक सेटिंग्स में अन्य दवाओं के संयोजन में इसके उपयोग को सीमित करती है। करक्यूमिन एक और प्राकृतिक यौगिक है जो सफलतापूर्वक जीएसटी अवरोधक के रूप में दिखाई जाती है। यह अणु हल्दी की करक्यूमा लोंगा प्रजाति से निकाला गया पॉलीफेनॉल ईथर है। इसने विभिन्न प्रकार के ट्यूमर सेल लाइनों16,17के एपोप्टोसिस को प्रेरित करके कैंसर के खिलाफ संभावित उपचार विकल्प के रूप में आशाजनक परिणाम दिखाए हैं । यह यौगिक विभिन्न सेलुलर रास्तों को विनियमित कर सकता है, जैसे टायरोसिन किनेज18 या जीएसटी मार्ग। शुद्ध प्रोटीन वाले अध्ययनों ने जीएसटीए1, जीएसटीएम1 और जीएसटीपी19,,20पर अपनी अवरोध शक्ति को दर्शाया है। हालांकि, कैंसर कोशिकाओं में परस्पर विरोधी परिणाम देखे गए, जहां कोशिकाओं को करक्यूमिन21के साथ इलाज किए जाने पर अधिक अंतरकोशिकीय जीएसटी गतिविधि को मापा गया था। इस प्रकार, किसी भी आगे सेलुलर प्रयोगों की योजना बनाने से पहले उचित नियंत्रण के साथ स्पष्ट रूप से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किसी भी ख्यात जीएसटी अवरोधक के आधे अधिकतम अवरोधक एकाग्रता (IC50) और किसी भी ख्यात जीएसटी अवरोधक के निरंतर अवरोध (केआई)की जांच करना महत्वपूर्ण है।

स्क्रीनिंग और परीक्षण संभावित नए जीएसटी अवरोधकों इसलिए महत्वपूर्ण नैदानिक हित के हैं, और किसी भी नए यौगिक पाया विद्युत दवाओं के साथ संयोजन में उपयोग के लिए सुरक्षित और कुशल होना चाहिए । आइसोफॉर्म-विशिष्ट अवरोधकों पर शोध केंद्रित करने से जीएसटी अभिव्यक्ति के विशिष्ट पैटर्न का प्रदर्शन करने वाले ट्यूमर ऊतकों में जीएसटी अवरोध सक्षम हो सकता है, इस प्रकार एक प्रभावी संयोजन चिकित्सा के विकास की अनुमति मिल सकती है। अवरोध के अंतर मोड के साथ अवरोधकों को ढूंढना भी रुचि का हो सकता है। उदाहरण के लिए, एक प्रतिस्पर्धी अवरोधक जो जीएसएच को सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करता है, इसकी कमी को प्रेरित कर सकता है। कोशिकाओं में जीएसएच एकाग्रता की यह कमी न्यूरॉन्स में ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करने के लिए दिखाई गई थी, जिससे एपोप्टोसिस होता है। अवरोध का एक और सामान्य तरीका- अप्रतिस्पर्धी अवरोध- भले ही सब्सट्रेट उच्च सांद्रता में मौजूद हो।

एंजाइमेटिक गतिविधि की दर का प्रतिनिधित्व माइकलिस-मेंटेन स्थिर (केएम)और अधिकतम वेग (वीमैक्स)द्वारा किया जाता है, जिसे माइकलिस-मेंटेन ग्राफ की साजिश रचने से निर्धारित किया जा सकता है, प्रतिक्रिया23के वेग के खिलाफ सब्सट्रेट एकाग्रता के साथ। कश्मीरएम आधे एंजाइमैटिक सक्रिय साइटों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट की एकाग्रता है, जिसका अर्थ है कि एक उच्च कश्मीरएम कम आत्मीयता का प्रतिनिधित्व करता है। वीमैक्स प्रतिक्रिया के अधिकतम वेग का प्रतिनिधित्व करता है, जब सभी सक्रिय साइटों पर सब्सट्रेट द्वारा कब्जा कर लिया जाता है। कश्मीरएम आधा वीअधिकतमके बराबर है । अवरोध के तीन सबसे आम तरीके हैं: प्रतिस्पर्धी, अप्रतिस्पर्धी, और गैर प्रतिस्पर्धी। प्रतिस्पर्धी अवरोध के मामले में, अवरोधक एंजाइम की सक्रिय साइट से बांधता है और सब्सट्रेट के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। इसलिए, वीमैक्स अवरोधक के अलावा के बाद नहीं बदलता है, लेकिन कश्मीरएम बढ़ जाता है, क्योंकि अवरोध का मुकाबला करने के लिए अधिक सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है। अप्रतिस्पर्धी अवरोध तभी होता है जब सब्सट्रेट एंजाइम के साथ एक जटिल बनाता है। इस मामले में, अवरोध का स्तर सब्सट्रेट और एंजाइम एकाग्रता पर निर्भर करता है, जब अवरोधक प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है तो वीमैक्स और केएम कम हो जाते हैं। अवरोध का अंतिम तरीका गैर-प्रतिस्पर्धी है और दो अन्य अवरोध पैटर्न का मिश्रण है। अवरोधक एंजाइम की सक्रिय साइट से बांध सकता है कि एंजाइम अपने सब्सट्रेट से बंधा हुआ है या नहीं। यहां वीअधिकतम अवरोधक के अलावा के बाद कम हो जाती है, लेकिन कश्मीरएम 24नहीं बदलता है ।

जीएसटी गतिविधि को मापा जाने वाला एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख पहली बार हबिग एट अल द्वारा विकसित किया गया था। 1 9 74 में 1-क्लोरो-2,4-डिनिट्रोबेनजेन (सीडीएनबी) का उपयोग करके प्रतिक्रिया22के लिए सब्सट्रेट के रूप में। जीएसएच और सीडीएनबी के बीच संजुर्गन जीएस-डीएनबी बनाता है, जो 340 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर अधिकतम प्रकाश अवशोषण प्रदर्शित करता है, जो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ रिकॉर्ड किया जा सकता है। नीचे बताई गई अधिकांश तकनीक हबिग एट अल से ली गई है, जिसमें एक निरोधात्मक परख के लिए सर्वोत्तम सेटिंग्स और महत्वपूर्ण अनुकूलन बिंदुओं के बारे में जानकारी शामिल है। इस तकनीक को संभावित जीएसटी अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है, चाहे वह कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियों का उपयोग करके तर्कसंगत दवा चयन द्वारा चुना गया हो या साहित्य की समीक्षा द्वारा। प्रोटोकॉल को नए संश्लेषित जीएसटी प्रोटीन या विशिष्ट आइसोफॉर्म में कैसे ढाला जाए, इस पर भी चर्चा की जाती है। उदाहरण के लिए, रोगी-विशिष्ट जीसीटी को लक्षित करते हुए, इस प्रोटोकॉल के लिए संभावित उपयोग हो सकता है, जो चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक बहुरूपता या एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNPs) का प्रदर्शन करने वाले जीएसटी आइसोफॉर्म की निरोधात्मक शक्ति का परीक्षण करना संभावित उपयोग हो सकता है।

यह प्रोटोकॉल किसी भी अन्य कार्यात्मक अध्ययन से पहले विट्रो में संभावित जीएसटी अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए एक त्वरित, व्यवहार्य और प्रभावी तरीका प्रदान करता है। एक एंजाइमेटिक अवरोधक की सबसे अधिक मापी गई विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक कदमों का वर्णन किया गया है: निरोधात्मक एकाग्रता 50 (IC50) जो एंजाइमेटिक गतिविधि को आधे से कम करने के लिए आवश्यक अवरोधक की एकाग्रता है; और अवरोध का निरंतर (केआई)जो अवरोधक और एंजाइम के बीच विघटन के संतुलन के संतुलन का प्रतिनिधित्व करता है, इन दो अणुओं के बीच आत्मीयता की विशेषता है। इन दो मूल्यों को गैर-रैखिक प्रतिगमन द्वारा मापा जाता है और क्रमशः अवरोध के प्रत्येक मोड के लिए विशिष्ट समीकरणों का उपयोग करके। हम अवरोध के इस पैटर्न का आकलन भी प्रदर्शित करते हैं, माइकलिस-मेंटेन भूखंडों,का उपयोग करके अवरोधक23, 25,,26के अलावा वीमैक्स और केएम के परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए।26

Protocol

1. जीएसटी एंजाइम समाधान की तैयारी

नोट: एंजाइम समाधान तैयार करने की प्रक्रिया इस बात पर निर्भर करती है कि एंजाइमेटिक गतिविधि की इकाइयों को परख से पहले जाना जाता है या नहीं। एक एंजाइम इकाई प्रति मिनट उत्पाद के 1 माइक्रोमोल को संश्लेषित करने के लिए आवश्यक एंजाइम की मात्रा है। एंजाइमेटिक गतिविधि इकाई/एमएल या μmol/min/ml में प्रतिनिधित्व किया है और एंजाइमेटिक समाधान के कमजोर पड़ने पर निर्भर करता है । विशिष्ट एंजाइमेटिक गतिविधि इकाई/मिलीग्राम या μmol/min/mg में प्रतिनिधित्व किया है और समाधान की शुद्धता पर पूरी तरह से निर्भर करता है । इन दोनों विशेषताओं के नीचे निर्धारित कर रहे हैं । यदि एक अलग जीएसटी आइसोफॉर्म की एंजाइमेटिक इकाई अज्ञात है, तो प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए एंजाइमेटिक सांद्रता को समायोजित करने और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करने का अनुमान लगाया जाना चाहिए।

  1. यदि परख में उपयोग किए जाने वाले जीएसटी की एंजाइमेटिक इकाई ज्ञात है:
    1. पानी में 01 यू/एमएल पर जीएसटी एंजाइम का नए सिरे से स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और फिर स्टेप 2 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: इस समाधान को कई महीनों के लिए अलीकोट में -20 डिग्री सेल्सियस पर या लंबी अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन फ्रीज/गल चक्र से बचा जाना चाहिए।
  2. यदि परख में उपयोग किए जाने वाले जीएसटी की एंजाइमेटिक इकाई अज्ञात है:
    1. एक बाइसिनकोनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख, या किसी अन्य किट का उपयोग करके एंजाइम समाधान की प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।
    2. प्रोटीन समाधान को 0.02 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम प्रोटीन एकाग्रता के लिए पतला करें।
    3. एंजाइम समाधान के 20 माइक्रोन, जीएसएच 25 एमएम (आणविक वजन: 307.32 ग्राम/मोल) के 20 माइक्रोन जोड़ें, और 96-अच्छी प्लेट में डलबेको के फॉस्फेट-बफर नमकीन (डीपीबीएस) के 150 माइक्रोन जोड़ें। ब्लैंक के लिए एंजाइम सॉल्यूशन के बजाय 20 माइक्रोन पानी डालें।
    4. प्रत्येक कुएं में सीडीएनबी 50 एमएमएम (आणविक वजन: 202.55 ग्राम/मोल) सब्सट्रेट के 10 माइक्रोन जोड़ें।
    5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माइक्रोप्लेट रीडर पर, 340 एनएम पर कुओं को पढ़ने के लिए पैरामीटर निर्धारित करें। 10 मिनट के लिए हर मिनट अवशोषण को मापने की सिफारिश की जाती है।
    6. माइक्रोप्लेट रीडर में प्लेट डालें, और चरण 1.2.5 की सेटिंग्स के अनुसार पढ़ना शुरू करें।
    7. एंजाइमेटिक नमूनों और खाली के लिए प्रति मिनट अवशोषित में परिवर्तन की गणना करें।
      नोट: सत्यापित करें कि प्रतिक्रिया वाई-एक्सिस पर अवशोषित और एक्स-एक्सिस पर मिनटों की साजिश रचने से रैखिक है। यदि प्रतिक्रिया रैखिक नहीं है और एक पठार तक पहुंचती है, तो इसका मतलब है कि सभी सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है और प्रतिक्रिया बहुत जल्दी होती है। इस प्रकार, स्टॉक समाधान को दो से कमजोर करके कुएं में जोड़े गए एंजाइम की मात्रा को कम करें।
    8. परीक्षण नमूनों के अवशोषण रीडिंग को खाली-सही करें।
    9. समीकरण 1 के साथ, बीयर-लैम्बर्ट कानून का प्रतिनिधित्व करते हुए, प्रत्येक मिनट की प्रतिक्रिया से जीएस-डीएनबी (माइक्रोन में) की एकाग्रता की गणना करें।
      समीकरण 1:
      Equation 1
      जहां सी माइक्रोन में सब्सट्रेट की एकाग्रता है, एक340/मिनट प्रति मिनट अवशोषण में परिवर्तन है, के रूप में कदम १.२.७ में मापा जाता है, ε ३४० एनएम (०.००९६ μM-1 *सेमी-1)पर सीडीएनबी संयोजित के लिए मोलर विलुप्त होने गुणांक है, और एल कुएं में प्रकाश पथ की लंबाई है (सेमी में) ।-1 एंजाइमेटिक समाधान के 200 μL से भरी 96-अच्छी प्लेट के लिए, पथ की लंबाई लगभग 0.55 सेमी है। यह मूल्य प्लेट मॉडल के अनुसार भिन्न हो सकता है और निर्माता के साथ सत्यापित किया जाना चाहिए।
    10. μmol/min में एक अच्छी तरह से मौजूद उत्पाद की मात्रा निर्धारित करने के लिए, समाधान की मात्रा, 2 x10-4 एल द्वारा समीकरण 1 का उपयोग करके पाए गए परिणामों को गुणा करें।
    11. चरण 1.2.9 के परिणामों को 4 x 10-4 मिलीग्राम द्वारा विभाजित करके उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा के अनुसार गतिविधि को सामान्य करें। परिणाम इकाई/मिलीग्राम या μmol/min/mg में विशिष्ट एंजाइमेटिक गतिविधि है ।
      नोट: यदि कमजोर पड़ने को चरण 1.2.6 में बदल दिया गया था, क्योंकि एक गैर-रैखिक प्रतिक्रिया के कारण, प्रोटीन की मात्रा को तदनुसार समायोजित करें।
    12. एंजाइमेटिक गतिविधि को खोजने के लिए, 0.002 मिलीग्राम/एमएल द्वारा चरण 1.2.10 में पाए जाने वाले विशिष्ट एंजाइमेटिक गतिविधि को गुणा करके एमजी/एमएल में प्रोटीन एकाग्रता के परिणामों को समायोजित करें। इससे यूनिट/एमएल या माइक्रोमोल/मिन/एमएल में एंजाइमेटिक एक्टिविटी मिलेगी।
      नोट: एंजाइमेटिक गतिविधि के विपरीत, यह उपाय प्रोटीन समाधान के कमजोर पड़ने के आधार पर नहीं बदलेगा। चरण 1.2.10 के रूप में एक ही नोट लेकिन प्रोटीन एकाग्रता के लिए।
    13. पानी में 01 यूनिट/एमएल पर जीएसटी एंजाइम का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और फिर स्टेप 2 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: इस समाधान को कई महीनों के लिए अलीकोट में -20 डिग्री सेल्सियस पर या लंबी अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन फ्रीज/गल चक्र से बचा जाना चाहिए। यदि प्रयोग प्रोटीन समाधान के क्षरण के रूप में समय की एक विस्तारित अवधि के दौरान आयोजित किए जाते हैं तो एंजाइमेटिक गतिविधि के नियंत्रण की सिफारिश की जाती है।

2. सीडीएनबी के लिए जीएसटी आइसोफॉर्म के माइकल्स-मेंटेन का मापन स्थिर

नोट: प्रक्रिया एक सीडीएनबी सब्सट्रेट के लिए समझाया गया है, लेकिन इस तरह के GSH के रूप में किसी भी अंय सब्सट्रेट के लिए लागू किया जा सकता है । सीडीएनबी की प्रत्येक एकाग्रता को अपने खाली होने की आवश्यकता होती है, क्योंकि सीडीएनबी एकाग्रता के अनुसार 340 एनएम पर अवशोषण बढ़ जाएगा।

  1. सीएनएनबी की छह अलग-अलग सांद्रता तैयार करें, जिसमें 10 mm से लेकर 100 mm तक, इथेनॉल 95% (v/v) में शामिल हैं।
  2. परख समाधान तैयार करें, सीडीएनबी के 10 माइक्रोन, जीएसटी एंजाइम के 20 माइक्रोन, जीबीएस 25 एमएम के 20 माइक्रोन और 150 माइक्रोन डीपीबीएस के साथ। खाली के लिए, सीडीएनबी समाधान के बजाय, इथेनॉल 95% के केवल 10 माइक्रोन जोड़ें।
  3. प्रत्येक सीडीएनबी एकाग्रता के लिए एक खाली तैयार करें, जिसमें सीडीएनबी के 10 माइक्रोन, पानी के 20 माइक्रोन, जीएचएच 25 एमएम के 20 माइक्रोन और 150 माइक्रोन डीपीबीएस हैं।
  4. एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ 10 मिनट के लिए हर मिनट 340 एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड करें।
  5. सही अन्य परीक्षण कुओं से रिक्त परिणामों को घटाकर अवशोषित को खाली करें। मापा मूल्यों के अनुसार, समीकरण 2 का उपयोग कर प्रतिक्रिया के वेग की गणना करें।
    समीकरण 2:
    Equation 2
    जहां A340/min प्रति मिनट अवशोषित में प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित परिवर्तन है, वीकुल (कुल मात्रा) ०.२ मिलीएल के बराबर है, वीएंजाइम (एंजाइम की मात्रा) ०.०२ मिलीएल है, औरε जीएस-डीएनबी ३४० एनएम (९.६ mm(1 *सेमी-1)पर जीएस-DNB conjugate के मोलर विलुप्त होने गुणांक है ।-1 96-अच्छी प्लेट के 200 माइक्रोन कुएं में, पथ की लंबाई 0.55 सेमी (प्लेट प्रकार के आधार पर) है और विलुप्त होने वाले गुणांक 5.3 mM-1के बराबर है। वेग का प्रतिनिधित्व या तो μmol/mL/min या mM/min द्वारा किया जा सकता है ।
  6. सब्सट्रेट एकाग्रता (एक्स-एक्सिस पर) के खिलाफ वेग (वाई-एक्सिस पर) के साथ माइकलिस-मेंटेन ग्राफ को प्लॉट करें।
  7. प्रतिक्रिया के अधिकतम वेग (वीमैक्स)और माइकलिस-मेंटेन स्थिर (केएम)(यानी, वीमैक्सके आधे हिस्से पर सब्सट्रेट एकाग्रता) को परिभाषित करें।
    नोट: ग्राफपैड प्रिज्म जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, एंजाइम काइनेटिक्स वक्र को माइकलिस-मेंटेन एंजाइम गतिज मापदंडों की गणना के लिए गैर-रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके फिट किया जा सकता है, जैसे वीमैक्स और केएम।
  8. इथेनॉल 95% (v/v) में गणना किए गए कश्मीरमीटर के 20 गुना पर एक सीडीएनबी स्टॉक समाधान तैयार करें।

3. संभावित जीएसटी अवरोधक का अवशोषण

नोट: यह कदम इस बात की जांच करने के लिए किया जाता है कि क्या प्रतिक्रिया में उपयोग किया जाने वाला संभावित जीएसटी अवरोधक मेटाबोलाइट पैदा करता है जो मापा जा रहा तरंगदैर्ध्य पर अवशोषण को बढ़ाता है। यदि ऐसा होता है, तो उपयोग किए गए अवरोधक की मात्रा का परिणामों पर प्रभाव पड़ेगा और प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक विशिष्ट रिक्ता तैयार किया जाना चाहिए।

  1. अवरोधक को आवश्यक सांद्रता में पतला करें।
    नोट: तीन अलग-अलग कमजोर पड़ने, अधिमानतः अवरोध परख के दौरान परीक्षण की गई सबसे कम, मध्यम और उच्चतम सांद्रता तैयार करें। कुएं में अधिकतम डीएमएसओ एकाग्रता 1% (v/v) के बराबर या उससे कम होनी चाहिए। हमने अपनी प्रयोगशाला में परख पर डीएमएसओ एकाग्रता के प्रभाव का परीक्षण किया, और 1% ने जीएसटी गतिविधि में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं किया।
  2. 96-वेल प्लेट में, संभावित जीएसटी अवरोधक के 2 माइक्रोन, जीएचएच 25 एमएम के 20 माइक्रोन और डीपीबीएस के 168 माइक्रोन जोड़ें। अवरोधक नमूनों के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉल्वेंट की बराबर मात्रा जोड़कर, कोई अवरोधक के साथ एक उपयुक्त नियंत्रण का उपयोग करें।
  3. एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए, 10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस चरण को विभिन्न इनक्यूबेशन बार परीक्षण करके अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें सब्सट्रेट की कुल कमी से बचते हुए प्रतिक्रिया शुरू करने का जुड़वां उद्देश्य है।
  4. चरण 2 में पाए जाने वाले कश्मीरएम में अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं में सीडीएनबी के 10 माइक्रोल जोड़ें।
  5. कुछ सेकंड के लिए थाली हिलाएं।
  6. एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ 10 मिनट के लिए हर मिनट 340 एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड करें।
  7. प्रति मिनट अवशोषण में परिवर्तन की गणना करें।
  8. कोई अवरोधक के साथ खाली प्रतिक्रिया और नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया दोनों की तुलना में अवशोषण में परिवर्तन को सत्यापित करें।
    1. यदि कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन है, तो परिणामों को समायोजित करने के लिए प्रत्येक अवरोधक एकाग्रता के लिए खाली उपयोग करें।
      नोट: यह परिणाम इंगित करता है कि प्रतिक्रिया के घटक, जिसमें कोई जीएसटी एंजाइम नहीं है, अनायास प्रतिक्रिया करते हैं और एक मेटाबोलाइट का उत्पादन करते हैं जो 340 एनएम पर अवशोषण को बढ़ाता है। इस अतिरिक्त अवशोषण के लिए सही करने के लिए, प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक विशिष्ट खाली मापा जाना चाहिए।
    2. यदि अवशोषण में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं है, तो सभी सांद्रता के लिए जीएसटी अवरोधक कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले केवल सॉल्वेंट को युक्त एक सामान्य खाली का उपयोग करें।

4. जीएसटी और IC50 मूल्यांकन का अवरोध परख

  1. संभावित जीएसटी अवरोधक की नौ सांद्रता तैयार करें।
    नोट: सांद्रता परिणामों के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है । इसका उद्देश्य गैर-रैखिक प्रतिगमन वक्र के नीचे और शीर्ष पठारों को परिभाषित करना है। इस चरण के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
  2. डीपीबीएस के 148 माइक्रोन के साथ 25 एमएम पर जीईएच समाधान के 20 माइक्रोन को कमजोर करके परख समाधान तैयार करें। परख में इस्तेमाल कुओं की संख्या के अनुसार मात्रा को अनुकूलित करें।
  3. एक स्पष्ट 96-अच्छी प्लेट में, 1 9 0 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया तैयार करें। इन चरणों के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    1. परीक्षण कुओं के लिए, एंजाइम समाधान के 20 माइक्रोन, संभावित जीएसटी अवरोधक समाधान के 2 माइक्रोन और परख समाधान के 168 माइक्रोन जोड़ें।
    2. नियंत्रण के लिए, एंजाइम समाधान के 20 माइक्रोन, जीएसटी अवरोधक के लिए उपयोग किए जाने वाले मंदक के 2 माइक्रोन और परख समाधान के 168 माइक्रोन जोड़ें।
    3. खाली कुओं के लिए, 20 माइक्रोन पानी, संभावित जीएसटी अवरोधक के 2 माइक्रोन और परख समाधान के 168 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: यदि जीएसटी अवरोधक 340 एनएम तरंगदैर्ध्य को अवशोषित करता है, तो प्रत्येक एकाग्रता परीक्षण के लिए एक विशिष्ट खाली तैयार किया जाना चाहिए।
  4. खाली सहित प्रत्येक अच्छी तरह से 20x Kमीटर पर सीडीएनबी समाधान के 10 μL जोड़ें। इस चरण के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  5. कुछ सेकंड के लिए थाली हिलाएं।
  6. एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग कर 10 मिनट के लिए हर मिनट 340 एनएम पर अवशोषित उपाय।
  7. परीक्षण अच्छी तरह से रिक्त स्थान से परिणामों को घटाकर अवशोषित को खाली-सही करें।
  8. कोई अवरोधक के साथ प्रति मिनट नियंत्रण के अवशोषण द्वारा जीएसटी अवरोधक समाधान का उपयोग कर प्राप्त मूल्यों को विभाजित करके परिणामों को सामान्य करें।
  9. जीएसटी गतिविधि (वाई-एक्सिस) के खिलाफ अवरोधक के लॉगरिथम एकाग्रता (एक्स-एक्सिस) के गैर-रैखिक प्रतिगमन ग्राफ को प्लॉट करें, और इस प्रकार आईसी50 निर्धारित करें।
    नोट: ग्राफपैड चश्मे एकाग्रता की भविष्यवाणी करके गैर-रैखिक प्रतिगमन भूखंडों से आईसी50 की गणना करता है जो नियंत्रण में एंजाइमेटिक गतिविधि का 50% दिखाएगा। भविष्यवाणी नीचे और शीर्ष पठारों पर आधारित है, साथ ही सिग्माइड ग्राफ द्वारा गठित ढलान की वक्र भी है।

5. कश्मीरiका आकलन और निषेध के प्रकार

  1. चार अलग-अलग सीडीएनबी सांद्रता तैयार करें: तीन उच्च और एक पहले पाए गए कश्मीरएम के बराबर है।
  2. पहले पाए गए IC50 के बराबर या नीचे तीन अलग-अलग जीएसटी अवरोधक सांद्रता तैयार करें।
  3. चरण 4.2 से 4.7 में वर्णित अवरोध परख करें।
  4. समीकरण 2का उपयोग करके प्रतिक्रियाओं के वेग की गणना करें ।
  5. प्रत्येक अवरोधक एकाग्रता के लिए माइकलिस-मेंटेन रेखांकन की साजिश करें और प्रत्येक प्रतिक्रिया के वीमैक्स और केएम की गणना करें।
  6. विभिन्न सांद्रता का उपयोग करते समय वीमैक्स और केएम में परिवर्तन के अनुसार, निषेध के जीएसटी अवरोधक के मोड का आकलन करें।
    नोट: इस कदम के परिणामों और चर्चा वर्गों में अधिक विस्तार से समझाया गया है ।
  7. अवरोध के तरीके के आधार पर, कश्मीर की गणनाकरें।
    नोट: ग्राफपैड चश्मे में, अवरोध की प्रकृति केअनुसार कश्मीर की गणना करने के लिए विभिन्न समीकरणों का उपयोग किया जाएगा। उपयोग किए गए समीकरण अवरोधक के अतिरिक्त के बाद देखे गए केएम और वीमैक्स पर आधारित होते हैं और नियंत्रण के केएम और वी मैक्स की तुलना मेंहोतेहैं।

Representative Results

घोड़े के जिगर से जीएसटी के साथ सीडीएनबी के माइकल्स-मेंटेन स्थिर (Km)
करक्यूमिन एक सुरक्षित प्राकृतिक यौगिक है , जो अधिक मात्रा में घूस लेने के बाद भी27 को कैंसर रोधी गुणों कोदिखाताहै । इस अणु की निरोधात्मक शक्ति मानव पुनः संयोजन जीटीएस19,20पर प्रदर्शित की गई है . वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने घोड़े के जिगर से जीएसटी आइसोफॉर्म के पूल का उपयोग करके जीएसटी गतिविधि पर करक्यूमिन के प्रभाव का मूल्यांकन किया। सप्लायर के मुताबिक, प्रोटीन के इस मिक्स की स्पेसिफिक एक्टिविटी 25 यू/एमजी है । 01 यू/एमएल का स्टॉक घोल तैयार किया गया था, जिसमें ल्योफिलाइज्ड पाउडर को उचित मात्रा में पानी में घोलकर तैयार किया गया था। एथाक्रनिक एसिड का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में समानांतर रूप से किया जाता था क्योंकि यह यौगिक अध्ययन में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला जीएसटी अवरोधक है। जीएसटी गतिविधि परख और अवरोधकों के परीक्षण की स्थापना में कदम चित्र 1में उल्लिखित है ।

केएमm को प्रत्येक एंजाइम सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के लिए परिभाषित किया जाना चाहिए क्योंकि केएम के बराबर सब्सट्रेट एकाग्रता का उपयोग करने से अवरोध के तरीके के निर्धारण के संबंध में कोई पूर्वाग्रह सुनिश्चित नहीं होगा28. 2.5 एमएम जीएसएच की एक निश्चित एकाग्रता का उपयोग करके, इस पैरामीटर को मापने के लिए सीडीएनबी की छह अलग-अलग सांद्रता का परीक्षण किया गया था।

प्रतिक्रिया की अंतिम मात्रा २०० μL था, एक ९६ अच्छी तरह से थाली में । प्रत्येक प्रयोग के लिए एक विशिष्ट रिक्त स्थान का उपयोग किया गया था, परीक्षण के रूप में सीडीएनबी की समान एकाग्रता का उपयोग करके अच्छी तरह से क्योंकि सीडीएनबी और जीएसएच का सहज संजीदशन हो सकता है और अवशोषण में वृद्धि हो सकती है। परख मिश्रण करने के लिए स्टॉक समाधान के 20 माइक्रोन जोड़कर, सभी प्रतिक्रियाओं के लिए 0.01 इकाई/एमएल की अंतिम एंजाइम एकाग्रता का उपयोग किया गया था। 340 एनएम पर अवशोषण 10 मिनट के लिए हर मिनट दर्ज किया गया था। प्रतिक्रिया के वेग (एमएमए/मिनट में) समीकरण 2का उपयोग करके गणना की गई थी । एक माइकलिस-मेंटेन ग्राफ को वेग (μM/min)(चित्रा 2)के खिलाफ सब्सट्रेट एकाग्रता (एमएम) की साजिश रची गई थी, और प्रतिक्रिया के कश्मीरएम की गणना की गई थी। इस प्रयोग को तब तक दोहराया गया जब तक कि डेटा के कम से तीन सेटों ने इसी तरह के परिणाम नहीं दिखाए । घोड़े के जिगर से जीएसटी के साथ सीडीएनबी केएम को 0.26 ± 0.08 m M मापा गया था। जीटीएस के इस बैच का उपयोग करके प्रत्येक निरोधात्मक परख के लिए सीडीएनबी के 0.2 एमएम की एकाग्रता का उपयोग किया गया था।

जीएसएच और सीडीएनबी के साथ अकेले इनक्यूबेटेड करक्यूमिन का उपयोग करके प्रयोगों के दौरान 340 एनएम पर अवशोषित मेटाबोलाइट का कोई सहज गठन नहीं मापा गया था। प्रत्येक प्रयोग में हर अवरोधक एकाग्रता के लिए एक ही खाली का उपयोग किया गया था।

जीटीएस पर करक्यूमिन की निरोधात्मक शक्ति
करक्यूमिन की निरोधात्मक शक्ति सॉफ्टवेयर (उदाहरण के लिए, ऑटोडॉक विना संस्करण 1.1.2) के साथ सिलिको डॉकिंग सिमुलेशन में एक का उपयोग करके भविष्यवाणी की गई थी। 29 विभिन्न जीएसटी आइसोफॉर्म (अर्थात् जीएसटीए1, जीएसटीएम1 और जीएसटीपी1) और करक्यूमिन के बीच मुफ्त बाध्यकारी ऊर्जा की भविष्यवाणी की गई थी (डेटा नहीं दिखाया गया) । फिर, अवरोध कश्मीर के निरंतरमैं समीकरण 3का उपयोग कर गणना की गई थी ।

समीकरण 3:
Equation 3
जहां ∆जी सिलिको विश्लेषण में उपयोग करके पाई जाने वाली मुफ्त बाध्यकारी ऊर्जा है, आर 1.987 कैलोरी * कश्मीर-1* मोल-1की गैस स्थिर है, और टी प्रयोग के दौरान तापमान है, केल्विन (2 9 8 K) में इस मामले में।

ऑटोडॉक विना द्वारा लौटाए गए मुफ्त बाध्यकारी ऊर्जापरिणामों के आधार पर, करक्यूमिन मानव जीएसटीए1, जीएसटीएम 1 और जीएसटीपी1 का एक शक्तिशाली जीएसटी अवरोधक है, जिसमें क्रमशः 78.1 माइक्रोनएम, 78.1 माइक्रोनएम और 27.4 माइक्रोन के मूल्य हैं। पहले निरोधात्मक परख इन कम्प्यूटेशनल कश्मीरमैं अनुमानों का उपयोग कर आयोजित किया गया, और सांद्रता परिणामों के अनुसार समायोजित किया गया, यदि आवश्यक हो ।

सबसे पहले, IC50 का अनुमान लगाया गया था। यह विशेषता अवरोधक की एकाग्रता है जो एंजाइम की प्रतिक्रिया दर को 50% तक कम कर देती है। इसलिए यह एंजाइम एकाग्रता30पर निर्भर है । अवरोधक के नौ अंतिम सांद्रता तैयार किए गए थे, जो 0.39 माइक्रोन से लेकर 100 माइक्रोन तक थे, जिसमें प्रत्येक एकाग्रता पिछले एक से दोगुनी थी। परख समाधान जीबीएस 2.5 एमएम के 20 माइक्रोन, 0.01 यू/एमएल फाइनल में घोड़े के जिगर से जीएसटी के 20 माइक्रोन, करक्यूमिन समाधान के 2 माइक्रोन और पीबीएस के 148 माइक्रोन से बना था। नियंत्रण करक्यूमिन के लिए उपयोग किए जाने वाले मंद के साथ एक ही समाधान से बना था। इस मिश्रण को एंजाइम परख शुरू करने और परख समाधान में करक्यूमिन के क्षरण से बचने के लिए 15 मिनट तक इनक्यूबेटेड किया गया था, क्योंकि यह यौगिक बफर समाधान31में अस्थिर है। इसके बाद, 0.2 m M CDNB की अंतिम एकाग्रता के लिए, प्रत्येक कुएं में 4 mM पर सीडीएनबी समाधान के 10 μL जोड़ा गया था। प्रति मिनट अवशोषण में परिवर्तन की गणना करने के लिए, 10 मिनट के लिए हर मिनट 340 एनएम पर अवशोषण दर्ज किया गया था। IC50 की गणना करने के लिए, करक्यूमिन के साथ इनक्यूबेटेड प्रत्येक नमूने को नियंत्रण में सामान्यीकृत किया गया था, ताकि गतिविधि का प्रतिशत दिया जा सके। इन परिणामों को अवरोधक बनाम अवरोधक के लॉगरिथम एकाग्रता के गैर-रैखिक प्रतिगमन की गणना करके प्लॉटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। घोड़े के जिगर से जीएसटी पर करक्यूमिन के लिए पाया IC50 ३१.६ ± ३.६ μM(चित्रा 3A)था ।

एक ही प्रयोग समानांतर में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एथ्रिनिक एसिड का उपयोग कर के रूप में आयोजित किया गया था, 0.39 से 100 माइक्रोन, करक्यूमिन के साथ के रूप में सांद्रता के साथ। IC50 6.6 ± 1.1 μM(चित्रा 3B) पायागया था।

अगला कदम इन हस्तांतरणों पर अवरोध के करक्यूमिन के मोड का आकलन करना था। करक्यूमिन की चार अलग-अलग सांद्रता का परीक्षण किया गया: 0, 7.5, 15, और 30 माइक्रोन, सीडीएनबी की चार अलग-अलग सांद्रता के साथ: 0.2, 0.4, 1, और 1.5 एम. प्रोटोकॉल पिछले प्रयोग के लिए के रूप में ही था। प्रत्येक स्थिति के वेग समीकरण 2का उपयोग कर गणना की गई थी । प्रत्येक अवरोधक एकाग्रता के लिए एक वक्र की साजिश रची गई थी, वेग के साथ (μM/मिनट में) सब्सट्रेट एकाग्रता (mM)(चित्रा 3C) केखिलाफ । वीमैक्स और केएम ग्राफपैड चश्मे के साथ प्रत्येक भूखंड के आधार पर निर्धारित किए गए थे। इन दो मापदंडों में परिवर्तन और परख की अलग-अलग स्थिति के अनुसार अवरोध के संभावित अवरोधक के मोड का आकलन किया गया था। 24 चूंकि वीमैक्स की स्थितियों के बीच काफी बदलाव नहीं आया लेकिन केएम विभिन्न अवरोधक सांद्रता के साथ बढ़ गया, जीटीएस के करक्यूमिन का अवरोध प्रतिस्पर्धी है। अवरोध का यह पैटर्न तब होता है जब अवरोधक एंजाइम की सक्रिय साइट के लिए सब्सट्रेट के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। प्रतिस्पर्धी अवरोधक के K i कोमापने के लिए, ग्राफपैड समीकरण 4 और समीकरण 5 का उपयोग करता है जैसा कि कोपलैंड एट अल32द्वारा वर्णित है।
समीकरण 4:
Equation 4
समीकरण 5:
Equation 5
जहां कश्मीरएम ऑब्स मनाया माइकलिस-Menten स्थिर है, कश्मीरएम माइकलिस-मेंटेन नियंत्रण के स्थिर है,[मैं]अवरोधक एकाग्रता है, कश्मीरमैं अवरोध का निरंतर है, वाई वेग है, और एक्स सब्सट्रेट एकाग्रता है ।

गणना निषेध के तरीके के आकलन के रूप में एक ही प्रयोगों पर आधारित हैं । केआई ने घोड़े के लिवर से जीएसटी के करक्यूमिन के अवरोध का अनुमान 23.2 ± 3.2 माइक्रोन किया था।

Figure 1
चित्र 1: फ्लर्चर्ट जीएसटी एंजाइमेटिक और अवरोध परख के चरणों का वर्णन करता है। प्रक्रिया के बारे में विवरण प्रोटोकॉल अनुभाग में प्रस्तुत कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जीएसटी एंजाइम गतिविधि की माइकलिस-मेंटेन प्लॉट। सब्सट्रेट सीडीएनबी की बढ़ी हुई एकाग्रता का उपयोग जीएसएच (2.5 एमएम) की एक निश्चित एकाग्रता के साथ किया गया था ताकि इक्विन लिवर से जीएसटी गतिविधि का निर्धारण किया जा सके। ग्राफ के वक्र के अनुसार सीडीएनबी के लिए Km मूल्य 0.26 ± 0.08 m M M के रूप में निर्धारित किया गया था। प्लॉट पर प्रत्येक डेटा पॉइंट एसडी के साथ चार अलग-अलग प्रयोगात्मक रन के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: जीएसटी एंजाइम गतिविधि पर करक्यूमिन और एथेक्रिनिक एसिड का प्रभाव। (ए-बी) एक ही जीएसटी (0.01 यू/एमएल), जीएसएच (2.5 m) और सीडीएनबी (0.2 m M) को गैर-रैरेखीय पुनः प्राप्त करने के साथ ईक्विन लिवर से जीएसटी के लिए दोनों यौगिकों की गणना करने के लिए समान जीएसटी (0.01 यू/एमएल) और सीडीएनबी (0.2 m M) अंतिम सांद्रता रखते हुए या तो करक्यूमिन(ए)या सकारात्मक नियंत्रण एथक्रिनिक एसिड(बी)की बढ़ती सांद्रता को शामिल किया गया था। IC50 को करक्यूमिन के लिए 31.6 ± 3.6 माइक्रोन और 6.6 ± 1.1 माइक्रोन के लिए एथाक्रिनिक एसिड के लिए निर्धारित किया गया था। (ग)करक्यूमिन की विभिन्न सांद्रता की माइकलिस-मेंटेन प्लॉट, सीडीएनबी सब्सट्रेट की अलग-अलग सांद्रता के खिलाफ परीक्षण किया गया जो अवरोध की प्रतिस्पर्धी विधा का संकेत देता है। कोई अवरोधक के साथ, वीमैक्स और कश्मीरएम क्रमशः 132.7 ± 4.6 माइक्रोनएम और 0.5 ± 0.08 माइक्रोन के रूप में मापा गया। करक्यूमिन के 30 माइक्रोन, वीमैक्स और केएम 130.4 ± 13.1 माइक्रोन और 1.08 ± 0.39 माइक्रोनएम थे। सभी रेखांकनों(ए-सी)में डेटा अंक एसडी के साथ तीन अलग-अलग प्रायोगिक रन के साधनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक जीएसटी एंजाइम परख के प्रत्येक चरण का वर्णन करते हैं, ख्यात अवरोधकों(चित्र 1, तालिका 1)को स्क्रीन करने और उनकी निरोधात्मक शक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए। हमने प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करने वाले सटीक एंजाइम परख के लिए विचार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण मानदंडों पर भी जोर दिया। अन्य रंग-द्रव विधियों या मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर वर्णित प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदे यह है कि यह प्रोटोकॉल जीएसटी गतिविधि के मात्रात्मक माप के साथ-साथ जांच किए गए अणुओं की निषेध शक्ति को करने और प्रदान करने में त्वरित और आसान है।

हम एक एंजाइम अवरोधक के दो सबसे महत्वपूर्ण माइकल्स-मेंटेन मापदंडों की गणना करने का तरीका पेश करते हैं: IC50 और KI। एक शक्तिशाली अवरोधक सबसे कम संभव कश्मीरमैं और IC50 लागू करेगा, यह दर्शाता है कि अवरोधक और एंजाइम के बीच आत्मीयता उच्च30है । चूंकि IC50 एंजाइम एकाग्रता और परख की स्थितियों पर निर्भर है,इसलिए विभिन्न प्रयोगों से अवरोधकों की तुलना करने या अन्य परख शर्तों का उपयोग करके प्राप्त करने के लिए इस मूल्य का उपयोग करना कठिन हो सकता है34. अवरोध कश्मीर के निरंतर का उपयोग करनामैं संभावित यौगिकों की निरोधात्मक शक्ति का एक बेहतर संकेतक है। कश्मीरमुझे अवरोध के विभिन्न तरीकों के साथ दो अवरोधकों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि यह पूरी तरह से अवरोधक और एंजाइम के बीच आत्मीयता पर निर्भर करता है। हालांकि, अवरोध की प्रकृति का एक स्पष्ट विचार है एक अवरोधक के मापदंडों के दोनों निर्धारित करना चाहिए30। हमने करक्यूमिन्स के आईसी50 और केआई को क्रमशः 31.6 ± 3.6 माइक्रोनएम और 23.2 ± 3.2 माइक्रोनएम मापा, यह दर्शाता है कि यह यौगिक एक शक्तिशाली जीएसटी अवरोधक है। इन परिणामों ने सिलिको भविष्यवाणियों में पुष्टि की, जिसने अनुमानलगाया कि विभिन्न मानव जीएसटी आइसोफॉर्म और करक्यूमिन के लिए 27.4 से 78.1 माइक्रोन के बीच के आई मूल्य हैं।

एंजाइमेटिक गतिविधि या प्रतिक्रिया की दर और एंजाइम की मात्रा
जैसा कि ऊपर कहा गया है, IC50 एंजाइम एकाग्रता पर निर्भर है, और एंजाइमेटिक गतिविधि के अज्ञात स्तर के साथ एक प्रयोग करने से झूठे निष्कर्ष33हो सकते हैं। अन्य कारकों के लिए नियंत्रित करने के लिए, जो निरोधात्मक गतिविधि को कम कर सकता है, किसी को जीएसटीएस के प्रत्येक नए बैच के लिए एंजाइमेटिक गतिविधि पर विचार करना चाहिए और मापना चाहिए। उदाहरण के लिए, एक एंजाइमेटिक बैच का क्षरण, बहुत अधिक फ्रीज/गल चक्र के कारण, गतिविधि में कमी आ सकती है और इस प्रकार एक कम IC50 के लिए नेतृत्व भले ही प्रयोग एक ही शर्तों के तहत चलाया गया था । दूसरे शब्दों में, एंजाइम की 0.01 इकाइयों का उपयोग करके 1 इकाई का उपयोग करने के समान परिणाम नहीं देंगे। बहुत सारे एंजाइमों का उपयोग करने से सब्सट्रेट की तेजी से कमी हो सकती है और प्रतिक्रिया में रैखिक आकार नहीं होगा। इस प्रकार यह पैरामीटर सटीक परिणाम का कारण बन सकता है, क्योंकि लंबे इनक्यूबेशन समय के बाद अवशोषण में कोई परिवर्तन नहीं देखा जाएगा।

कश्मीरएम वैल्यू
एक अवरोधक द्वारा प्रदर्शित अवरोध के प्रकार का आकलन करने के लिए सबसे अच्छी स्थिति सुनिश्चित करने के लिए, सब्सट्रेट एकाग्रता माइकलिस-मेंटेन स्थिर (KM)के बराबर या नीचे होनी चाहिए। केएम का प्रतिनिधित्व एंजाइम28पर आधी सक्रिय साइटों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट की एकाग्रता द्वारा किया जाता है । उदाहरण के लिए, उच्च सब्सट्रेट एकाग्रता एक प्रतिस्पर्धी अवरोधक का प्रतिकार कर सकती है और इस प्रकार के अवरोध का आकलन करना ऐसी सेटिंग में मुश्किल होगा। इस प्रकार, इस पद्धति में महत्वपूर्ण चरणों में से एक चयनित सब्सट्रेट (यहां सीडीएनबी) के लिए एंजाइम के केएम का निर्धारण है। कुछ अध्ययनों में, यह मूल्य निर्धारित नहीं किया गया था और इससे अवरोधक के कारण अवरोध के पैटर्न के बारे में झूठे निष्कर्ष निकल सकते हैं, और, यदि अवरोध का तरीका गलत है, तो कश्मीर की गणना गलततरीके से की जाएगी क्योंकि समीकरण अवरोध26,,28की तर्ज पर निर्भर करता है। यदि एक अलग जीएसटी आइसोफॉर्म का परीक्षण किया जाता है, तोकेएम मूल्य का एक नया आकलन अनिवार्य है, क्योंकि यह मूल्य एंजाइम और लिगामेंट की एक जोड़ी के लिए अद्वितीय है। जैसा कि हमनेकेएम (0.2 m M) की तुलना में सीडीएनबी की एकाग्रता का उपयोग किया, जिसे हमने 0.26 ± 0.08 m M M के रूप में परिभाषित किया, जीएसटी पर करक्यूमिन के अवरोध की भविष्यवाणी की गई प्रतिस्पर्धी मोड सटीक रूप से निर्धारित की गई थी।

आईसी50
एक अच्छा सिग्मोइडल वक्र प्राप्त करना जिसके साथ IC50 का अनुमान लगाने के लिए नीचे और शीर्ष दोनों पठारों को खोजने की आवश्यकता होती है। नीचे का पठार एक अवरोधक की सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है जो अधिकतम निरोधात्मक गतिविधि प्रदान करता है। कुछ मामलों में, एक यौगिक एंजाइम को पूरी तरह से बाधित नहीं कर सकता है, यहां तक कि उच्च सांद्रता पर, क्योंकि घुलनशीलता जैसे तकनीकी मुद्दों के कारण। हालांकि, ग्राफपैड चश्मे जैसे उपकरण नीचे के पठार को काफी सटीक रूप से फिट कर सकते हैं। शीर्ष पठार अवरोधक की सांद्रता से बना है, जो एंजाइम को बाधित करने के लिए अपर्याप्त हैं, और इसलिए गतिविधि अधिकतम है। ये दोनों पठार आईसी50 के साथ-साथ बीच में सांद्रता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, ताकि वक्र की ढलान को खोजने के लिए-फिर IC50 को सिग्मॉयड वक्र35के आकार से प्राप्त किया जा सकता है। करक्यूमिन पानी में खराब घुलनशील है, इस प्रकार इस परख में उपयोग की जाने वाली अधिकतम एकाग्रता सीमित है, परख समाधान में वर्षा से बचने के लिए। इस प्रकार, कम केंद्रित समाधान, जो पूरी तरह से जीएसटी गतिविधि को बाधित नहीं करते हैं, का उपयोग किया गया था। यह नीचे पठार के निर्धारण के लिए मुद्दे उठाए । इस समस्या का मुकाबला करने के लिए, हमने गैर-रैखिक प्रतिगमन ग्राफ के आधार पर नीचे मूल्यों की भविष्यवाणी की, जिसने करक्यूमिन(चित्रा3 ए) के लिए 31.6 ± 3.6 माइक्रोन का IC50 प्रदान किया। एथ्रिनिक एसिड के लिए, नीचे के पठार के लिए मूल्यों की भविष्यवाणी करने की कोई आवश्यकता नहीं थी क्योंकि यह यौगिक परख समाधान में घुलनशील है और IC50 को 6.6 ± 1.1 माइक्रोनएम मापा गया था।

इस विधि को मानव में सबसे अधिक व्यक्त किए गए जीएसटी आइसोफॉर्म, अर्थात् जीएसटी1, जीएसटीएम1 या जीएसटीपी1 पर लागू किया जा सकता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल जीएसटीटी1 आइसोफॉर्म की गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुकूल नहीं है, क्योंकि सीडीएनबी इस उपप्रकार के लिए सब्सट्रेट नहीं है। 36, 37 इस बीच, प्रोटोकॉल थोड़ा इस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, जीएसटीटी1 के लिए सब्सट्रेट के रूप में 1,2-एपॉक्सी-3-(4'-नाइट्रोफेनॉक्सी) प्रोपेन (एनपीपी) का उपयोग करना और 340एनएम के बजाय 360 एनएम पर संजूगेट की मात्रा को मापना। 37

सेल संस्कृति प्रयोगों में जीएसटी गतिविधि और अवरोधक परीक्षण का परीक्षण करने के लिए प्रोटोकॉल के कदम अनुकूलित और लागू किए जा सकते हैं। जीएसटी अवरोधक के साथ और बिना इलाज की जाने वाली कोशिकाओं पर जीएसटी गतिविधि का मापन यह इंगित करेगा कि इस यौगिक का उपयोग ऐसी प्रायोगिक सेटिंग में किया जा सकता है या नहीं। यह विशेष रूप से दिलचस्प है जब अवरोधक लिपोफिलिक है। उदाहरण के लिए, हमने प्रस्तुत किया कि करक्यूमिन इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक शक्तिशाली जीएसटी अवरोधक है। फिर भी, सेलुलर अध्ययनों के लिए इसका आवेदन सीमित हो सकता है, क्योंकि अणु पानी में खराब घुलनशील होता है और मध्यम में जल्दी से कम हो जाता है। 31 सब्सट्रेट सीडीएनबी की गैर-आइसोफॉर्म विशिष्टता के संबंध में इस प्रोटोकॉल का एक और सुधार संभव है। सेल स्टडीज में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करने से सिर्फ ओवरऑल जीएसटी एक्टिविटी के बारे में जानकारी मिलेगी, लेकिन सटीक जीएसटी सबटाइप की एक्टिविटी पर नहीं। आइसोफॉर्म-स्पेसिफिक सब्सट्रेट और/या विशिष्ट रिकॉम्बिनेंट जीएसटी आइसोफॉर्म का उपयोग करना आइसोफॉर्म विशिष्ट जीएसटी अवरोधकों का परीक्षण करने की अनुमति देगा।

अपनी बात समाप्त करने के लिए, हम जीएसटी अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए एक पूरी प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग इलेक्ट्रोफिलिक कीमोथेरेपी के संयोजन में करने की क्षमता है। हमने संभावित दिलचस्प अणु का परीक्षण करने और मात्रात्मक मूल्यों, IC50 और KIके साथ अवरोधक के रूप में उनकी दक्षता निर्धारित करने के लिए जीएसटी एंजाइम और अवरोध परख के महत्वपूर्ण कदमों पर जोर दिया। इस विधि को किसी भी ख्यात यौगिक पर लागू किया जा सकता है और सबसे अधिक व्यक्त मानव जीएसटी आइसोफॉर्म (जीएसटीए 1, जीएसटीएम 1 और जीएसटीपी 1) पर किया जा सकता है, या जीएसटी अवरोधकों के साथ सेल संस्कृति अध्ययन करने या पसंद के अन्य दिलचस्प जीएसटी आइसोफॉर्म की गतिविधि को मापने के लिए थोड़ा अनुकूलित किया जा सकता है।

अभिकर्मकों नाम परख समाधान में एकाग्रता अन्य
सब्सट्रेट सीडीएनबी मापा कश्मीरएम (mM) 95% इथेनॉल में पतला। अंतिम इथेनॉल एकाग्रता 5% ≤ होनी चाहिए (v/v)
कंजूगेटिंग सब्सट्रेट जीएसएच 2.5 mM पानी में पतला।
एकाग्रता को समाधान को तर करना चाहिए।
बफ़र पीबीएस - पीएच = 7.1
एंजाइम जीएसटी आइसोफॉर्म या प्योर आइसोफॉर्म का पूल 0.01 इकाई/एमएल, प्रायोगिक रूप से निर्धारित। पानी में पतला।
जीएसटी अवरोधक पसंद का संभावित यौगिक IC50: 3 सांद्रता जो अधिकतम रूप से रोकती है, 3 जो न्यूनतम रूप से रोकती है, और 3 बीच में। DMSO में पतला और फिर पानी में, DMSO की एक अंतिम एकाग्रता ≤ 1% (v/v)
कश्मीरमैं:IC50 के आसपास 3 सांद्रता ।
पैरामीटर
कमरे का तापमान (25 डिग्री सेल्सियस)
पीएच = 7.1
DMSO ≤ 1% (v/v)
इथेनॉल ≤ 5% (v/v)

तालिका 1: जीएसटी अवरोध परख के दौरान विचार करने के लिए अभिकर् ती और मापदंडों का सारांश।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध कार्य को कैनसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक तकनीकी सहायता के लिए सुश्री लारेंस लेस्ने और श्री योएन सरमिएंटो को स्वीकार करना चाहते हैं, विशेष रूप से नकल प्रयोगों के संचालन में, जबकि अवरोधकों के साथ परख का मानकीकरण करते हैं। श्री डेनिस मैरिनो, डॉ सिमोना म्लाकर और डॉ वड म्लाकर द्वारा सार्थक चर्चाओं और जानकारियों को बहुत स्वीकार किया जाता है । हम वीडियो के कथन के साथ उसकी मदद के लिए डॉ पेट्रीसिया Huezo-Diaz कर्टिस का शुक्रिया अदा करते हैं । हम डॉ मुथुकुमार को सिलिको भविष्यवाणियों में उनके इनपुट के लिए धन्यवाद देते हैं । हम इस पांडुलिपि के अंग्रेजी भाषा प्रूफ रीडिंग में उनकी मदद के लिए श्री डैरेन हार्ट को भी धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) Sigma-Aldrich 237329 Substrate used for the GST enzymatic assay
Corning UV-Transparent Microplates Sigma-Aldrich CLS3635 Transparent plate to perform the enzymatic assay.
When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate.
Curcumin Sigma-Aldrich 8511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 To prepare the stock of the putative inhibitor
DPBS Sigma-Aldrich D8537 Buffer for the enzymatic reaction
Ethanol 95% Fisher scientific 10542382 To dilute the CDNB
Glutathione S-Transferase from equine liver Sigma-Aldrich G6511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
L-glutathione reduced (GSH) Sigma-Aldrich G4251 Co-substrate for the GST enzymatic assay
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225 To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution
Spectramax iD3 Molecular devices To do spectrophotometric measurments

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बायोकेमिस्ट्री अंक 164 ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेस जीएसटी अवरोधक एंजाइम परख अवरोध परख IC50 KI
साइटोसोलिक ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरास के संभावित अवरोधकों के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक स्क्रीनिंग
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Robin, S. K. D., Ansari, M.,… More

Robin, S. K. D., Ansari, M., Uppugunduri, C. R. S. Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases. J. Vis. Exp. (164), e61347, doi:10.3791/61347 (2020).

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