Summary
Glutathion S-transferaser (GSTs) er afgiftning enzymer involveret i metabolismen af talrige kemoterapeutiske lægemidler. Overekspression af GST'er er korreleret med kræft kemoterapi resistens. En måde at imødegå denne fænotype er at bruge hæmmere. Denne protokol beskriver en metode, der anvender en spektrofotometrisk analyse til skærmen for potentielle GST-hæmmere.
Abstract
Glutathion S-transferaser (GSTs) er metaboliske enzymer, der er ansvarlige for eliminering af endogene eller udefrakommende elektrofile forbindelser ved glutathion (GSH) bøjning. Desuden er GST'er regulatorer for mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPKs), der er involveret i apoptotiske veje. Overekspression af GST'er er korreleret med nedsat terapeutisk effekt blandt patienter, der gennemgår kemoterapi med elektrofile alkylerende midler. Brug AF GST-hæmmere kan være en potentiel løsning til at vende denne tendens og øge behandlingen potens. At nå dette mål kræver opdagelsen af sådanne forbindelser, med en præcis, hurtig og nem enzymanalyse. En spektrofotometrisk protokol med 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB), da substratet er den mest anvendte metode i litteraturen. Men allerede beskrevne GST hæmningsforsøg giver ikke en protokol, der beskriver hvert trin i en optimal hæmningsanalyse, såsom måling af Michaelis-Menten-konstanten (Km)for CDNB eller indikation af den anvendte enzymkoncentration, afgørende parametre til vurdering af hæmningsdyheden af en testet forbindelse. Derfor beskriver vi med denne protokol hvert trin i en optimeret spektrofotometrisk GST enzymanalyse for at screene biblioteker af potentielle inhibitorer. Vi forklarer beregningen af både den halvmaksimale hæmmende koncentration (IC50) og hæmningskonstanten (Ki)-to egenskaber, der anvendes til at måle styrken af en enzymhæmmer. Den beskrevne metode kan implementeres ved hjælp af en pulje af GST'er udvundet af celler eller rene rekombinant humane GST'er, nemlig GST alpha 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) eller GST pi 1 (GSTP1). Denne protokol kan dog ikke anvendes på GST theta 1 (GSTT1), da CDNB ikke er et substrat for denne isoform. Denne metode blev brugt til at teste hæmningsdybden af curcumin ved hjælp af GST'er fra hestelever. Curcumin er et molekyle udviser anti-cancer egenskaber og viste affinitet mod GST isoformer efter i silico docking forudsigelser. Vi viste, at curcumin er en potent konkurrencedygtig GST-hæmmer, med en IC50 på 31,6 ± 3,6 μM og en K i på 23,2 ± 3,2 μM. Curcumin har potentiale til at blivekombineret med elektrofile kemoterapi medicin for at forbedre sin effektivitet.
Introduction
Cytosolic glutathion S-transferase enzymer (GSTs, EF 2.5.1.18) katalysere bøjning af glutathion (GSH) i forskellige elektrofile forbindelser, såsom kemoterapeutiske stoffer, at afgifte og fjerne dem let fra kroppen1. Syv isoformer af cyklisk GST er blevet identificeret som alfa, mu, pi, sigma, omega, theta, og zeta. GST'er udtrykkes hovedsageligt i leveren, testiklerne, lungerne og mave-tarmkanalen2. GST alpha 1 (GSTA1) isoformen udtrykkes meget i hepatocytter. Kroppen heterogent udtrykker andre undertyper, herunder GST pi 1 (GSTP1) overvejende i hjernen, hjertet og lungerne, og GST mu 1 (GSTM1) i leveren og testiklerne3. Selv om der er høj sekvens homologi mellem GST isoformer, hver udviser substrat specificitet og er involveret i lægemiddelmetabolisme og kræft på forskellige måder, i henhold til dens differentialudtryk4,5.
Elektrofile forbindelser kommer enten ind i kroppen eksogent eller produceres endogent. Pesticider, prostaglandiner, kræftfremkaldende stoffer, og kemoterapeutiske lægemidler er nogle af de potentielle substrater for glutathion konjugation reaktioner6. For eksempel, enhver elektron-mangelfuld reaktiv forbindelse dannet i en celle vil sandsynligvis blive en elektrofil substrat. Alkylerende agenser såsom chlorambucil eller melfalan elimineres som konjugere af GSH katalyseret af GST'er, og forhøjede niveauer af disse enzymer er blevet korreleret med resistens over for disseforbindelser 6,7.
En anden vigtig rolle cykliske GST'er er at regulere aktiviteten af mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK) såsom MAPK8 (også kendt som c-Jun N-terminal kinase, eller JNK1) og MAP3K5 (også kendt som apoptose signalregulerende kinase 1 eller ASK1)8. Nogle isoformer i deres monomeriske kropsbygning vil binde sig til disse proteiner og dermed blokere fosforylering kaskade. Under normale forhold vil GSTP1-isoformen sequester MAPK8 (aktivatoren af c-Jun-proteinet). Ved at kombinere c-Jun med c-Fos protein danner aktivatorprotein 1 (AP-1) transskription faktor, som er ansvarlig for transskribering pro-apoptotiske gener. I stressede celler, komplekset dannet af GSTP1 og MAPK8 dissociates, c-Jun aktiveres, og de gener, der fører til apoptose begynder at blive udtrykt9. Større udtryk for denne GST isoform kan derfor blokere vejen, hvilket fører til øget celle levedygtighed, mere cellulære spredning, og lavere cellulære følsomhed over for kemoterapi. Lignende scenarier kan forekomme med paralogs af GSTP1, for eksempel GSTM1, som interagerer med MAP3K510.
De roller, som GST'er i lægemiddelmetabolisme og i beslaglæggelsen af MAPKs førte til den hypotese, at et større udtryk for GST'er kan være et tegn på en tumorresistens mekanisme til kemoterapeutiskbehandling 6,11. For eksempel, GSTP1 er overudtrykt i mange kræftformer og dens tilstedeværelse er blevet korreleret med en dårlig prognose og en øget forekomst af tilbagefald8. Polymorfi i disse gener har også vist differentieret lægemiddeleksponering og overlevelsesrater for patienter, der præsenterer forskellige sygdomme, hvilket styrker tanken om, at disse enzymer er afgørende for mekanismer af resistens over for lægemidler. For eksempel, personer med GSTM1 null genotype er forbundet med lavere drug clearance og bedre overlevelse12,13. Der er flere potentielle måder at imødegå denne overekspression, såsom brugen af GSH analoger, prodrugs, der aktiveres ved bøjning med GSTs, eller direkte GST hæmmere14,15.
Alle disse metoder er i øjeblikket ved at blive undersøgt, og et par forbindelser er begyndt kliniske forsøg for deres potentielle brug blandt patienter. Men efter vores bedste overbevisning er der ingen forbindelser i brug som GST-hæmmere i kliniske miljøer15. Manglende specificitet for visse isoformer eller nedbrydning af GSH i normale celler, hvilket kan føre til toksicitet forårsaget af akkumulering af reaktive iltarter (ROS) i organsystemer, er blot nogle af de ulemper, der reducerer potentialet i GST-hæmmere14,15. Risikoen for, at disse forbindelser kan udøve andre farmakodynamiske virkninger på kroppen er også begrænse deres brug. Ethacrynic syre, for eksempel, er den mest udbredte undersøgt GST-hæmmer i laboratoriemiljøer, men fordi det primært bruges som et stærkt vanddrivende, denne egenskab begrænser dets anvendelse i kombination med andre lægemidler i kliniske miljøer. Curcumin er en anden naturlig forbindelse med succes screenet som en GST-hæmmer. Dette molekyle er en polyfenol ether udvundet fra Curcuma longa arter af gurkemeje. Det har vist lovende resultater som en mulig behandlingsmulighed mod kræft ved at fremkalde apoptose af forskellige slags tumorcellelinjer16,,17. Forbindelsen kan regulere forskellige cellulære veje, såsom tyrosin kinase18 eller GST vej. Undersøgelser med rene proteiner har vist sin hæmningsdyhed på GSTA1, GSTM1 og GSTP119,20. Der blev dog observeret modstridende resultater i kræftceller, hvor større intracellulær GST-aktivitet blev målt, når celler blev behandlet med curcumin21. Det er derfor vigtigt at undersøge halvmaksimal hæmmende koncentration (IC50) og hæmningskonstant (Ki) afenhver formodede GST-hæmmer ved hjælp af en klart beskrevet protokol med korrekt kontrol, før der planlægges yderligere cellulære eksperimenter.
Screening og test af potentielle nye GST-hæmmere er derfor af betydelig klinisk interesse, og enhver ny forbindelse, der findes, skal være sikker og effektiv til brug i kombination med elektrofile lægemidler. Fokus på isoform-specifikke hæmmere kan muliggøre GST hæmning i tumorvæv udviser specifikke mønstre af GST udtryk, således at udviklingen af en effektiv kombinationsbehandling. Finde inhibitorer med differentierede former for hæmning kan også være af interesse. For eksempel kan en konkurrencedygtig hæmmer, der bruger GSH som et substrat fremkalde sin udtynding. Denne reduktion af GSH-koncentrationen i celler viste sig at fremkalde oxidativt stress hos neuroner, hvilket førte til apoptose. En anden almindelig hæmningsform – ikke-konkurrencebegrænsende hæmning – kan ikke vendes, selvom substratet er til stede i høje koncentrationer.
Enzymatisk aktivitetshastighed repræsenteres af Michaelis-Menten-konstanten (Km) og den maksimale hastighed (Vmax), som kan bestemmes ved at afbilde en Michaelis-Menten-graf med substratkoncentrationen mod reaktionshastigheden23. Km er den koncentration af substrat, der kræves for at besætte halvdelen af de enzymatiske aktive steder, hvilket betyder, at et højt Km repræsenterer mindre affinitet. Vmax repræsenterer den maksimale hastighed af reaktionen, nået, når alle de aktive steder er besat af substratet. Km er lig med halvdelen Vmax. Der er tre mest almindelige hæmningsformer: konkurrencedygtige, konkurrencedygtige og ikke-konkurrencedygtige. I tilfælde af konkurrencemæssig hæmning binder inhibitoren sig til enzymets aktive sted og konkurrerer med underlaget. Derfor ændrer Vmax ikke efter tilsætning af inhibitoren, men Km stiger, da mere substrat er nødvendigt for at imødegå hæmning. Ukonkurrencehæmmende opstår kun, når substratet danner et kompleks med enzymet. I dette tilfælde, da hæmningsniveauet afhænger af substrat- og enzymkoncentrationen, falder Vmax og Km, når inhibitoren tilsættes reaktionen. Den sidste form for hæmning er ikke-konkurrencedygtige og er en blanding af de to andre hæmning mønstre. Inhibitoren kan binde sig til enzymets aktive sted, uanset om enzymet er bundet til dets substrat eller ej. Her Vmax falder efter tilsætning af inhibitor, men Km ændrer ikke24.
En spektrofotometrisk analyse, der målte GST-aktiviteten, blev først udviklet af Habig et al. i 1974 ved hjælp af 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) som substratet for reaktionen22. Bøjning mellem GSH og CDNB danner GS-DNB, som udviser en maksimal lysabsorbance ved bølgelængden på 340 nm, der kan registreres med et spektrofotometer. De fleste af de teknik forklaret nedenfor er afledt af Habig et al., herunder oplysninger om de bedste indstillinger og vigtige optimering punkter for en hæmmende analyse. Teknikken kan anvendes til screening potentielle GST-hæmmere, uanset om valgt ved rationel udvælgelse af lægemidler ved hjælp af beregningsmæssige forudsigelser eller ved litteraturgennemgang. Hvordan man tilpasser protokollen til nyligt syntetiserede GST proteiner eller specifikke isoformer er også drøftet. For eksempel kan test af den hæmmende styrke af GST-isoformer, der udviser en klinisk relevant polymorfi eller enkeltnukleotidpolymorfier (SNPs), være potentielle anvendelser for denne protokol, der er rettet mod patientspecifikke GST'er.
Denne protokol giver en hurtig, gennemførlig og effektiv metode til screening af potentielle GST-hæmmere in vitro før andre funktionelle undersøgelser. De trin, der er nødvendige for at vurdere de hyppigst målte egenskaber ved en enzymatisk hæmmer, er beskrevet: den hæmmende koncentration 50 (IC50), der er koncentrationen af inhibitor, der kræves for at reducere den enzymatiske aktivitet til det halve; og hæmningskonstant (Ki),der repræsenterer ligevægtskonstanten af dissocieringen mellem inhibitoren og enzymet, karakteristisk for affiniteten mellem disse to molekyler. Disse to værdier måles ved ikke-lineær regression og ved hjælp af ligninger, der er specifikke for hver hæmningstilstand. Vi demonstrerer også vurderingen af dette mønster af hæmning, ved hjælp af Michaelis-Menten parceller til at bestemme ændringen af Vmax og Km efter tilsætning af inhibitor23,,25,26.
Protocol
1. Fremstilling af GST enzymopløsning
BEMÆRK: Proceduren for fremstilling af enzymopløsningen afhænger af, om enhederne af enzymatisk aktivitet er kendt før analysen. En enzymatisk enhed er den mængde enzym, der er nødvendig for at syntetisere 1 μmol produkt pr. minut. Enzymatisk aktivitet er repræsenteret i enhed/ml eller μmol/min/ml og afhænger af fortyndingen af den enzymatiske opløsning. Specifik enzymatisk aktivitet er repræsenteret i enhed/mg eller μmol/min/mg og afhænger udelukkende af opløsningens renhed. Begge disse egenskaber bestemmes nedenfor. Hvis enzymatisk enhed i en isoleret GST-isoform er ukendt, skal det anslås at justere enzymatiske koncentrationer for hver reaktion og give reproducerbare resultater.
- Hvis den enzymatiske enhed af GST, der anvendes i analysen, er kendt:
- Forbered en frisk lageropløsning af GST-enzymet ved 0,1 U/ml i vand, og fortsæt derefter med trin 2.
BEMÆRK: Denne opløsning kan opbevares ved -20 °C i undersøgt i flere måneder eller ved -80 °C i længere perioder, men fryse-/optøningscyklussen skal undgås.
- Forbered en frisk lageropløsning af GST-enzymet ved 0,1 U/ml i vand, og fortsæt derefter med trin 2.
- Hvis den enzymatiske enhed af GST, der anvendes i analysen, er ukendt:
- Kvantificer enzymopløsningens proteinkoncentration ved hjælp af en bicinoninsyre (BCA) proteinanalyse eller ethvert andet kit.
- Proteinopløsningen fortyndes til en endelig proteinkoncentration på 0,02 mg/ml.
- Der tilsættes 20 μL enzymopløsning, 20 μL GSH 25 mM (molekylvægt: 307,32 g/mol) og 150 μL af Dulbeccos fosfatbukke (DPBS) til en 96-brøndplade. Til tomen tilsættes 20 μL vand i stedet for enzymopløsningen.
- Der tilsættes 10 μL CDNB 50 mM (molekylvægt: 202,55 g/mol) til hver brønd.
- På en spektrofotometrisk mikropladelæser skal du indstille parametrene for læsning af brøndene til 340 nm. Det anbefales at måle absorbansen hvert minut i 10 minutter.
- Sæt pladen i mikropladelæseren, og start aflæsningen i henhold til indstillingerne i trin 1.2.5.
- Absorbansændringen beregnes pr. minut for enzymatiske prøver og blindprøven.
BEMÆRK: Kontroller, at reaktionen er lineær ved at afbilde absorbans på y-aksen og minutter på x-aksen. Hvis reaktionen ikke er lineær og når et plateau, betyder det, at alt underlaget anvendes, og reaktionen er for hurtig. Således reducere mængden af enzym tilsat til brønden ved at fortynde bestanden opløsning med to. - Blindkorrigere testprøvernes absorbansaflæsninger.
- Med ligning 1, der repræsenterer Beer-Lambert loven, beregne koncentrationen af GS-DNB dannet (i μM) ved reaktionen hvert minut.
Ligning 1:
hvor C er koncentrationen af substratet i μM, A340/min er ændringen i absorbans pr. minut, målt i trin 1.2.7, ε er molarudryddelseskoefficienten for CDNB konjugatet ved 340 nm (0,0096 μM-1*cm-1), og l er længden af lysvejen i brønden (i cm). For en 96-brøndplade fyldt med 200 μL enzymatisk opløsning er banelængden omkring 0,55 cm. Denne værdi kan variere afhængigt af plademodellen og skal verificeres hos producenten. - For at bestemme mængden af produkt til stede i en brønd i μmol / min, gange resultaterne fundet ved hjælp af ligning 1 med mængden af opløsning, 2 x 10-4 L.
- Normalisere aktiviteten pr. mængde protein, der anvendes, ved at dividere resultaterne af trin 1.2.9 med 4 x 10-4 mg. Resultatet er den specifikke enzymatiske aktivitet i enhed/mg eller μmol/min/mg.
BEMÆRK: Hvis fortyndingen blev ændret i trin 1.2.6, justeres proteinets mængde i overensstemmelse hermed på grund af en ikke-lineær reaktion. - For at finde enzymatisk aktivitet justeres resultaterne til proteinkoncentrationen i mg/ml ved at gange den specifikke enzymatiske aktivitet, der blev fundet i trin 1.2.10, med 0,002 mg/ml. Dette vil give enzymatisk aktivitet i enhed/ml eller μmol/min/ml.
BEMÆRK: I modsætning til den enzymatiske aktivitet ændres dette mål ikke afhængigt af fortyndingen af proteinopløsningen. Samme bemærkning som trin 1.2.10, men for proteinkoncentrationen. - Forbered en lageropløsning af GST-enzymet ved 0,1 enhed/ml i vand, og fortsæt derefter med trin 2.
BEMÆRK: Denne opløsning kan opbevares ved -20 °C i undersøgt i flere måneder eller ved -80 °C i længere perioder, men fryse-/optøningscyklussen skal undgås. Kontrol af enzymatisk aktivitet anbefales, hvis forsøgene udføres i en længere periode, da der kan forekomme nedbrydning af proteinopløsningen.
2. Måling af Michaelis-Menten-konstanten i GST-isoformen for CDNB
BEMÆRK: Proceduren forklares for et CDNB-substrat, men kan anvendes på ethvert andet underlag, f.eks. Hver koncentration af CDNB har brug for sin egen blank, da absorbansen ved 340 nm vil stige i henhold til CDNB-koncentrationen.
- Der forbered seks forskellige koncentrationer af CDNB, fra 10 mM til 100 mM, i ethanol 95% (v/v).
- Analyseopløsningen klargøres med 10 μL CDNB, 20 μL GST-enzym, 20 μL GSH 25 mM og 150 μL DPBS. For den tomme, i stedet for CDNB-opløsningen, tilsættes kun 10 μL ethanol 95%.
- Der klargøres en blindprøve for hver CDNB-koncentration med 10 μL CDNB, 20 μL vand, 20 μL GSH 25 mM og 150 μL DPBS.
- Absorbansen registreres ved 340 nm hvert minut i 10 minutter med en mikropladelæser.
- Blind-korrigere absorbans ved at trække resultaterne fra blank fra de korrekte andre prøvebest. I henhold til de målte værdier skal du beregne reaktionshastigheden ved hjælp af Ligning 2.
Ligning 2:
hvor A340/min er den eksperimentelt bestemte ændring i absorbans pr. minut, erV-totalen (samlet volumen) lig med 0,2 ml,V-enzym (enzymvolumen) 0,02 ml, og εGS-DNB er den molære udryddelseskoefficient for GS-DNB-konjugaten ved 340 nm (9,6 mM-1*cm-1). I en 200 μL brønd af en 96-brøndplade er banelængden 0,55 cm (afhængigt af pladetypen), og udryddelseskoefficienten er lig med 5,3 mM-1. Hastigheden kan repræsenteres enten af μmol/ml/min eller mM/min. - Afbilde Michaelis-Menten grafen med hastigheden (på y-aksen) mod substratkoncentrationen (på x-aksen).
- Definer den maksimale hastighed (Vmax)af reaktionen og Michaelis-Menten-konstanten (Km) (dvs. substratekoncentrationen ved halvdelen af Vmax).
BEMÆRK: Ved hjælp af software som GraphPad Prism kan enzymkinetikkurven monteres ved hjælp af en ikke-lineær regression til beregning af parametrene for Michaelis-Menten enzymkinetik, såsom Vmax og Km. - Der klargøres en CDNB-lageropløsning 20 gange denberegnede K m i ethanol 95% (v/v).
3. Absorbans af den potentielle GST-hæmmer
BEMÆRK: Dette trin udføres for at undersøge, om den potentielle GST-hæmmer, der anvendes i reaktionen, frembringer en metabolit, der øger absorbansen ved den bølgelængde, der måles. Hvis det sker, vil mængden af anvendte inhibitor have en indvirkning på resultaterne, og der skal fremstilles en specifik blindprøve for hver koncentration.
- Fortyndes inhibitoren til de ønskede koncentrationer.
BEMÆRK: Forbered tre forskellige fortyndinger, helst de laveste, midterste og højeste koncentrationer testet under hæmningsanalysen. Den maksimale DMSO-koncentration i brønden skal være lig med eller mindre end 1 % (v/v). Vi testede DMSO-koncentrationens effekt på analysen i vores laboratorium, og 1 % har ikke ændret GST-aktivitet væsentligt. - I en 96-brøndplade tilsættes 2 μL af den potentielle GST-hæmmer, 20 μL GSH 25 mM og 168 μL DPBS. Brug en passende kontrol uden inhibitor ved at tilsætte lige store mængder opløsningsmiddel, der anvendes til inhibitorprøverne.
- Inkuber reaktionen i 10 minutter for at begynde den enzymatiske reaktion.
BEMÆRK: Dette trin kan optimeres ved at teste forskellige inkubationstider med de to formål at begynde reaktionen og samtidig undgå total udtynding af underlaget. - Der tilsættes 10 μL CDNB til hver brønd for at opnå en endelig koncentration ved Km, der findes i trin 2.
- Ryst pladen i nogle få sekunder.
- Absorbansen registreres ved 340 nm hvert minut i 10 minutter med en mikropladelæser.
- Beregn ændringen i absorbans pr. minut.
- Kontroller absorbansændringen sammenlignet med både blindprøvereaktionen og den negative kontrolreaktion uden inhibitor.
- Hvis der er en væsentlig ændring, skal der anvendes blindprøve for hver inhibitorkoncentration for at justere resultaterne.
BEMÆRK: Dette resultat indikerer, at reaktionens bestanddele uden GST-enzym reagerer spontant og producerer en metabolit, der øger absorbansen ved 340 nm. For at korrigere for denne yderligere absorbans skal der måles en specifik blindprøve for hver koncentration. - Hvis der ikke er nogen signifikant ændring i absorbansen, anvendes en generel blindprøve, der kun indeholder det opløsningsmiddel, der anvendes til GST-hæmningsfortyndingen, til alle koncentrationer.
- Hvis der er en væsentlig ændring, skal der anvendes blindprøve for hver inhibitorkoncentration for at justere resultaterne.
4. Hæmningsanalyse af GST- og IC50-vurderingen
- Forbered ni koncentrationer af den potentielle GST-hæmmer.
BEMÆRK: Koncentrationerne kan tilpasses efter resultaterne. Målet er at definere bunden og de øverste plateauer i den ikke-lineære regressionskurve. Se diskussionsafsnittet for at få flere oplysninger om dette trin. - Analyseopløsningen klargøres ved at fortynde 20 μL GSH-opløsningen ved 25 mM med 148 μL DPBS. Tilpas volumen i forhold til antallet af brønde, der anvendes i analysen.
- I en klar 96-brøndplade klargør den enzymatiske reaktion i et endeligt volumen på 190 μL. Det anbefales at bruge en multikanalpipette til disse trin.
- For testbesterne tilsættes 20 μL af enzymopløsningen, 2 μL af den potentielle GST-inhibitoropløsning og 168 μL af analyseopløsningen.
- Til kontrolelementet tilsættes 20 μL af enzymopløsningen, 2 μL af fortyndingsmængden, der anvendes til GST-hæmmeren, og 168 μL af analyseopløsningen.
- For de tomme brønde tilsættes 20 μL vand, 2 μL af den potentielle GST-hæmmer og 168 μL af analyseopløsningen.
BEMÆRK: Hvis GST-hæmmeren absorberer bølgelængden på 340 nm, skal der fremstilles en specifik blindprøve for hver koncentrationstestet.
- Der tilsættes 10 μL AF CDNB-opløsningen ved 20x Km til hver brønd, inklusive tom. Det anbefales at bruge en multikanalpipette til dette trin.
- Ryst pladen i nogle få sekunder.
- Absorbansen måles ved 340 nm hvert minut i 10 minutter med en mikropladelæser.
- Blind-korrigere absorbans ved at trække resultaterne fra testen godt emner.
- Normalisere resultaterne ved at dividere de værdier, der opnås ved hjælp af GST-hæmmeropløsningen, med kontrolns absorbans pr. minut uden inhibitor.
- De ikke-lineære regressionsgrafer for inhibitorens logaritmiske koncentration (x-akse) afbildes mod GST-aktiviteten (y-aksen) og bestemmes således for IC50.
BEMÆRK: GraphPad Prism beregner IC50 ud fra de ikke-lineære regressionsområder ved at forudsige den koncentration, der vil vise 50% af den enzymatiske aktivitet i styringen. Forudsigelsen er baseret på bunden og øverste plateauer, samt kurven af hældningen dannet af sigmoid grafen.
5. Vurdering af Kiog hæmningstypen
- Forbered fire forskellige CDNB koncentrationer: tre højere og en svarende til Km tidligere fundet.
- Forbered tre forskellige GST-hæmmerkoncentrationer, lig med eller under den tidligere fundne IC50.
- Udfør hæmningsanalysen som beskrevet i trin 4.2 til 4.7.
- Reaktionerne beregnes ved hjælp af ligning 2.
- Plot Michaelis-Menten grafer for hver hæmmer koncentration og beregne Vmax og Km for hver reaktion.
- Ifølge ændringerne i Vmax og Km ved brug af forskellige koncentrationer, vurdere GST-hæmmerens hæmningsform.
BEMÆRK: Dette trin er forklaret mere detaljeret i resultat- og diskussionsafsnittene. - Baseret på hæmningsmåde, beregne Ki.
BEMÆRK: I GraphPad Prism, vil forskellige ligninger blive brugt til at beregne Ki i henhold til arten af hæmning. De anvendte ligninger er baseret på denobserverede K m og Vmax efter tilsætning af inhibitor og sammenlignet med kontrol's Km og Vmax.
Representative Results
Michaelis-Menten konstant (Km)af CDNB med GST fra hestelever
Curcumin er en sikker naturlig forbindelse selv efter indtagelse ved højere doser27, der viste anticancer egenskaber16. Dette molekyles hæmmende styrke er påvist på humane rekombinant GST'er19,20. Ved at bruge den beskrevne protokol evaluerede vi curcumins effekt på GST-aktivitet ved hjælp af en pulje af GST-isoformer fra hestelever. Ifølge leverandøren er den specifikke aktivitet af denne blanding af proteiner 25 U/mg. En bestandsopløsning på 0,1 U/ml blev fremstillet ved at opløse det frysetørrede pulver i den passende mængde vand. Ethacrynicsyre blev anvendt parallelt som en positiv kontrol, da dette stof er den mest udbredte GST-hæmmer i undersøgelser. Trin til oprettelse af en GST-aktivitetsanalyse og test af inhibitorer er beskrevet i figur 1.
Km skal defineres for hver enzymsubstratreaktion, fordi anvendelse af substratekoncentrationen svarende til Km ikke vil sikre nogen skævhed med hensyn til bestemmelse af hæmningsmåde28. Seks forskellige koncentrationer af CDNB, fra 0,5 mM til 5 mM, blev testet for at måle denne parameter ved hjælp af en fast koncentration på 2,5 mM GSH.
Reaktionens endelige volumen var 200 μL, i en 96-brønd plade. Der blev anvendt en specifik blindprøve for hvert forsøg med samme koncentration af CDNB som testbrønden, fordi der kunne forekomme spontan bøjning af CDNB og GSH og kunne øge absorbansen. Der blev anvendt en endelig enzymkoncentration på 0,01 enhed/ml til alle reaktionerne ved at tilsætte 20 μL af stockopløsningen til analyseblandingen. Absorbans ved 340 nm blev registreret hvert minut i 10 minutter. Reaktionens hastighed (i mM/min) blev beregnet ved hjælp af ligning 2. En Michaelis-Menten graf blev afbildet af substratkoncentrationen (mM) mod hastigheden (μM/min) (figur 2), og Km af reaktionen blev beregnet. Forsøget blev gentaget, indtil mindst tre sæt data viste lignende resultater. Km CDNB med GST fra hestelever blev målt som 0,26 ± 0,08 mM. Der blev anvendt en koncentration på 0,2 mM CDNB for hver hæmmende analyse ved hjælp af dette parti GST'er.
Ingen spontan dannelse af en metabolit, der absorberes ved 340 nm, blev ikke målt under forsøg med curcumin inkuberet alene med GSH og CDNB. Den samme blank blev brugt til hver inhibitor koncentration i hvert eksperiment.
Curcumin's hæmmende styrke på GST'er
Curcumins hæmmende styrke blev forudsagt ved hjælp af en in silico docking simulering med software (f.eks. 29 Den frie bindende energi mellem forskellige GST-isoformer (nemlig GSTA1, GSTM1 og GSTP1) og curcumin blev forudsagt (der blev ikke vist data). Derefter konstanten af hæmning K jegblev beregnet ved hjælp af Ligning 3.
Ligning 3:
hvor ∆G er den frie bindende energi, der findes ved hjælp af silicoanalysen, er R gaskonstanten på 1,987 cal*K-1*mol-1, og T er temperaturen under forsøget, i dette tilfælde i Kelvin (298 K).
Baseret på de frie bindende energiresultater, der returneres af AutoDock Vina, er curcumin en potent GST-hæmmer af human GSTA1, GSTM1 og GSTP1 med Ki-værdier på henholdsvis 78,1 μM, 78,1 μM og 27,4 μM. De første hæmmende analyser blev udført ved hjælp af disse beregningsmæssige Ki skøn, og koncentrationerne blev justeret i henhold til resultaterne, hvis det er nødvendigt.
For det første blev IC50 anslået. Denne egenskab er koncentrationen af inhibitor, der reducerer et enzym reaktionshastighed med 50%. Den er derfor afhængig af enzymkoncentrationen30. Der blev fremstillet ni slutkoncentrationer af inhibitoren, der spænder fra 0,39 μM til 100 μM, hvor hver koncentration var dobbelt så stor som den foregående. Analyseopløsningen bestod af 20 μL GSH 2,5 mM, 20 μL GST fra hestelever ved 0,01 U/ml endelig, 2 μL af curcuminopløsningen og 148 μL PBS. Styringen bestod af den samme opløsning med fortyndingstukken, der blev anvendt til curcumin. Denne blanding blev inkuberet i 15 minutter for at begynde enzymanalysen og for at undgå nedbrydning af curcumin i analyseopløsningen, da dette stof er ustabilt ibufferopløsninger 31. Dernæst blev der tilsat 10 μL CDNB-opløsning ved 4 mM til hver brønd for en endelig koncentration på 0,2 mM CDNB. Absorbans ved 340 nm blev registreret hvert minut i 10 minutter for at beregne ændringer i absorbans pr. minut. For at beregne IC50 blev hver prøve, der blev inkuberet med curcumin, normaliseret til kontrolelementet for at give aktivitetsprocenten. Disse resultater blev analyseret ved hjælp af plotte software ved at beregne den ikke-lineære regression af logaritmisk koncentration af inhibitor versus hæmning. IC50 fundet for curcumin på GST fra hestelever var 31,6 ± 3,6 μM (Figur 3A).
Det samme eksperiment blev udført parallelt med ethacrynicsyre som en positiv kontrol, med koncentrationer fra 0,39 til 100 μM, som med curcumin. IC50 blev fundet 6,6 ± 1,1 μM (Figur 3B).
Det næste skridt var at vurdere curcumin's tilstand af hæmning på disse transferaser. Fire forskellige koncentrationer af curcumin blev testet: 0, 7,5, 15 og 30 μM, sammen med fire forskellige koncentrationer af CDNB: 0,2, 0,4, 1 og 1,5 mM. Protokollen var den samme som for det foregående eksperiment. Hver betingelses hastighed blev beregnet ved hjælp af Ligning 2. Der blev afbildet en kurve for hver inhibitorkoncentration med hastigheden (i μM/min.) mod substratkoncentrationen (mM) (figur 3C). Vmax og Km blev bestemt baseret på hvert plot med GraphPad Prism. Den potentielle inhibitors hæmningsform blev vurderet i henhold til ændringerne i disse to parametre og analysens forskellige tilstand. 24 Da Vmax ikke i væsentlig grad ændrede sig mellem forholdene, men Km steg med de forskellige inhibitorkoncentrationer, er curcumins hæmning af GST'er konkurrencedygtig. Dette hæmningsmønster opstår, når inhibitoren konkurrerer med substratet for enzymets aktive sted. For at måle Ki af en konkurrencedygtig hæmmer, GraphPad bruger Equation 4 og Ligning 5 som beskrevet af Copeland et al.32.
Ligning 4:
Ligning 5:
hvor Km obs er den observerede Michaelis-Menten konstant, Km er Michaelis-Menten konstant af kontrol, [I] er inhibitor koncentration, K ier konstanten af hæmning, Y er den hastighed, og X er substrat koncentration.
Beregningerne er baseret på de samme eksperimenter som vurderingen af hæmningsformen. Ki anslået for curcumin's hæmning af GST fra hestelever var 23,2 ± 3,2 μM.
Figur 1: Rutediagram, der beskriver trinnene i GST enzymatiske og hæmningsanalyser. Nærmere oplysninger om proceduren vises i protokolafsnittet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Michaelis-Menten plot af GST enzymaktivitet. Øget koncentration af substratet CDNB blev anvendt med en fast koncentration af GSH (2,5 mM) til at bestemme GST aktivitet fra en pulje af GST fra hestelever. Km værdien for CDNB blev fastsat som 0,26 ± 0,08 mM i henhold til grafens kurve. Hvert datapunkt på plottet repræsenterer gennemsnitt af fire forskellige eksperimentelle kørsler med SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Effekt af curcumin og ethacrynsyre på GST enzymaktivitet. (A-B) Tilsætning af stigende koncentrationer af enten curcumin (A) eller den positive kontrol ethacrynicsyre (B), samtidig med at de samme GST (0,01 U/ml), GSH (2,5 mM) og CDNB (0,2 mM) endelige koncentrationer blev anvendt til at beregne IC50 af begge forbindelser for GST fra hestelever med en ikke-lineær regression. IC50 blev bestemt som 31,6 ± 3,6 μM for curcumin og 6,6 ± 1,1 μM for ethacrynsyre. c) Michaelis-Menten-grunden med forskellige koncentrationer af curcumin, der er testet i forhold til forskellige koncentrationer af CDNB-substrat, hvilket indikerer en konkurrencemæssig hæmningsform. Uden inhibitor blev Vmax og Km målt som henholdsvis 132,7 ± 4,6 μM og 0,5 ± 0,08 μM. Med 30 μM curcumin var Vmax og Km 130,4 ± 13,1 μM og 1,08 ± 0,39 μM. Datapunkter i alle grafer (A-C) repræsenterer midlerne til tre forskellige eksperimentelle kørsler med SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi leverer en protokol, der beskriver hvert trin i en spektrofotometrisk GST enzymanalyse, til skærm formodede hæmmere (Figur 1, Tabel 1) og kvantificere deres hæmmende styrke. Vi understregede også de mest afgørende kriterier for at overveje for nøjagtige enzymanalyser, der giver reproducerbare resultater. Store fordele ved den beskrevne protokol i forhold til andre kolorimetriske metoder eller massespektrometri er, at denne protokol er hurtig og nem at udføre og give kvantitative målinger af GST aktivitet samt hæmningsydelighed af screenede molekyler.
Vi præsenterer den måde at beregne de to vigtigste Michaelis-Menten parametre for et enzym hæmmer: IC50 og Ki. En potent hæmmer vil udøve den lavest mulige Ki og IC50, hvilket indikerer, at affiniteten mellem inhibitor og enzymet er høj30. Da IC50 er afhængig af enzymkoncentrations- oganalysebetingelserne 33, kan det være vanskeligt at bruge denne værdi til at sammenligne inhibitorer fra forskellige forsøg eller fremstillet ved hjælp af andreanalysebetingelser 34. Ved hjælp af konstantenaf hæmning K i er en bedre indikator for den hæmmende styrken af potentielle forbindelser. K Jeg kan bruges til at sammenligne to hæmmere med forskellige formerfor hæmning, da det udelukkende er afhængig af affiniteten mellem inhibitor og enzymet. Men for at have en klar idé om arten af hæmning man skal bestemme begge inhibitor parametre30. Vi målte curcumins ' IC50 og Ki som 31,6 ± 3,6 μM og 23,2 ± 3,2 μM, hvilket indikerer, at dette stof er en potent GST-hæmmer. Disse resultater bekræftede i silico forudsigelser, at anslået Ki værdier mellem 27,4 til 78,1 μM for forskellige menneskelige GST isoformer og curcumin.
Enzymatisk aktivitet eller reaktionshastighed og mængden af enzym
Som nævnt ovenfor er IC50 afhængig af enzymkoncentrationen, og gennemførelse af et eksperiment med et ukendt niveau af enzymatisk aktivitet kan føre til falske konklusioner33. For at kontrollere for andre faktorer, som kan reducere hæmmende aktivitet, bør man overveje og måle enzymatisk aktivitet for hvert nyt parti af GST'er. For eksempel kan nedbrydning af et enzymatisk parti, forårsaget af for mange fryse-/optøningscyklusser, nedsætte aktiviteten og dermed føre til en lavere IC50, selv om forsøget blev udført under de samme betingelser. Med andre ord, ved hjælp af 0,01 enheder af enzym vil ikke give de samme resultater som ved hjælp af 1 enhed. Brug af for mange enzymer kan føre til en hurtig udtynding af underlaget, og reaktionen vil ikke have en lineær form. Denne parameter kan således føre til unøjagtige resultater, da der ikke vil blive set nogen ændring i absorbans efter en lang inkubationstid.
Km Værdi
For at sikre de bedste betingelser for vurdering af den type hæmning, der udvises af en inhibitor, skal substratekoncentrationen være lig med eller under Michaelis-Menten-konstanten (Km). Km repræsenteres ved den koncentration af substrate , der kræves for at besætte halvdelen af de aktive steder påenzymet 28. For eksempel kan højere substratkoncentration modvirke en konkurrencedygtig hæmmer, og det vil være vanskeligt at vurdere denne form for hæmning i sådanne omgivelser. Et af de afgørende trin i denne metode er således bestemmelsen af enzymets Km for det valgte substrat (her CDNB). I nogle undersøgelser, denne værdi blev ikke bestemt, og dette kan føre til falske konklusioner om det mønster af hæmning forårsaget af inhibitor, og hvis den tilstand af hæmning er forkert, Kjeg vil blive beregnet forkert som ligningen er afhængig af mønsteret af hæmning26,28. Hvis der testes en anden GST-isoform, er en ny vurderingaf K m-værdien obligatorisk, da denne værdi er unik for et par enzym og ligand. Da vi brugte en koncentration af CDNB lidt lavere end Km (0,2 mM), som vi definerede som 0,26 ± 0,08 mM, blev den forventede konkurrenceform for hæmning af curcumin på GST præcist bestemt.
IC50
Opnåelse af en god sigmoidal kurve med til at vurdere IC50 kræver at finde både bunden og øverste plateauer. Det nederste plateau repræsenterer koncentrationerne af en hæmmer, der giver den maksimale hæmmende aktivitet. I nogle tilfælde, en forbindelse kan ikke hæmme enzymet fuldt ud, selv ved høje koncentrationer, på grund af sådanne tekniske problemer som opløselighed. Men værktøjer som GraphPad Prism kan passe bunden plateau ganske præcist. Det øverste plateau består af koncentrationer af inhibitoren, som er utilstrækkelige til at hæmme enzymet, og derfor er aktiviteten maksimal. Begge disse plateauer er afgørende for at bestemme IC50 samt koncentrationer i mellem, for at finde hældningen af kurven-så IC50 kan udledes af formen af sigmoid kurve35. Curcumin er dårligt opløseligt i vand, således den maksimale koncentration, der anvendes i denne analyse er begrænset, for at undgå nedbør i analysen opløsning. Der blev således anvendt mindre koncentrerede opløsninger, som ikke fuldt ud hæmmer GST-aktiviteten. Dette rejste spørgsmål for bestemmelse af bunden plateau. For at imødegå dette problem forudsagde vi bundværdier baseret på den ikke-lineære regressionsgraf, som gav en IC50 på 31,6 ± 3,6 μM for curcumin (Figur 3A). For ethacrynicsyre var det ikke nødvendigt at forudsige værdierne for bundplateauet, da dette stof er opløseligt i analyseopløsningen, og IC50 blev målt til 6,6 ± 1,1 μM.
Denne metode kan anvendes på de mest udtrykte GST isoformer hos mennesker, nemlig GSTA1, GSTM1 eller GSTP1. Denne protokol er dog ikke egnet til at kvantificere aktiviteten af GSTT1-isoformen, da CDNB ikke er et substrat for denne undertype. 36. I mellemtiden kan protokollen ændres en smule for at imødegå dette problem. For eksempel , ved hjælp af 1,2-epoxy-3-(4'-nitrophenoxy) propan (ENPP) som et substrat for GSTT1 og måle mængden af konjugat på 360nm i stedet for 340nm. kr.
Protokoltrin kan være tilpasset og anvendt til at teste GST aktivitet og hæmmer test i cellekultur eksperimenter. Måling af GST-aktiviteten på celler behandlet med og uden GST-hæmmer vil indikere, om dette stof kan anvendes i sådanne eksperimentelle omgivelser. Det er især interessant, når inhibitor er lipofile. For eksempel præsenterede vi, at curcumin er en potent GST-hæmmer ved hjælp af denne protokol. Ikke desto mindre, dens anvendelse til cellulære undersøgelser kan være begrænset, da molekylet er dårligt opløseligt i vand og nedbrydes hurtigt i medium. 31 En anden forbedring af denne protokol er mulig med hensyn til non-isoform specificitet af substratET CDNB. Brug af denne protokol i celleundersøgelser vil kun give oplysninger om den samlede GST-aktivitet, men ikke om aktiviteten af den præcise GST-undertype. Tilsætning af isoformspecifikke substrat og/eller anvendelse af specifik rekombinant GST-isoform vil gøre det muligt at teste isoformspecifikke GST-hæmmere.
Afslutningsvis beskriver vi en komplet procedure til test af GST-hæmmere, der har potentiale til at blive brugt i kombination med elektrofile kemoterapi. Vi understregede de afgørende trin i en GST enzym og hæmning assay, at teste potentielle interessante molekyle og bestemme deres effektivitet som inhibitor med kvantitative værdier, IC50 og Ki. Denne metode kan anvendes på enhver formodede forbindelse og udføres på de mest udtrykte humane GST isoformer (GSTA1, GSTM1 og GSTP1), eller lidt tilpasset til at udføre cellekultur undersøgelser med GST-hæmmere eller måle aktiviteten af andre interessante GST isoform valg.
| Reagenser | Navn | Koncentration i analyseopløsningen | Andre |
| Substrat | CDNB | Målt Km (mM) | Fortyndet i 95% ethanol. Den endelige ethanolkoncentration bør ≤ 5 % (v/v) |
| Bøjning af underlag | Gsh | 2,5 mM | Fortyndet i vand. |
| Koncentrationen skal mætte opløsningen. | |||
| Buffer | Pbs | - | pH = 7,1 |
| Enzym | Pulje af GST-isoformer eller ren isoform | 0,01 enhed/ml, bestemt eksperimentelt. | Fortyndet i vand. |
| GST-hæmmer | Potentiel sammensætning af valg | IC50: 3 koncentrationer, der maksimalt hæmmer, 3, der minimalt hæmmer, og 3 i mellem. | Fortyndet i DMSO og derefter i vand, at have en endelig koncentration af DMSO ≤ 1% (v / v) |
| Ki: 3 koncentrationer omkring IC50. | |||
| Parametre | |||
| Stuetemperatur (25°C) | |||
| pH = 7,1 | |||
| DMSO ≤ 1% (v/v) | |||
| Ethanol ≤ 5% (v/v) | |||
Tabel 1: Resumé af de reagenser og parametre, der skal overvejes under en GST-hæmningsanalyse.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette forskningsarbejde blev støttet af CANSEARCH Foundation. Forfatterne vil gerne anerkende Ms Laurence Lesne og Mr. Yoann Sarmiento for teknisk bistand, især i udførelsen af replikating eksperimenter, mens standardisere assays med inhibitorer. Frugtbare diskussioner og input af Mr. Denis Marino, Dr. Simona Mlakar og Dr. Vid Mlakar er stærkt anerkendt. Vi takker Dr.Patricia Huezo-Diaz Curtis for hendes hjælp med fortællingen om videoen. Vi takker Dr. Muthukumar for hans input på i silico forudsigelser. Vi takker også Mr. Darren Hart for hans hjælp i engelsk sprog bevis læsning af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) | Sigma-Aldrich | 237329 | Substrate used for the GST enzymatic assay |
| Corning UV-Transparent Microplates | Sigma-Aldrich | CLS3635 | Transparent plate to perform the enzymatic assay. When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate. |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 8511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | To prepare the stock of the putative inhibitor |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Buffer for the enzymatic reaction |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 10542382 | To dilute the CDNB |
| Glutathione S-Transferase from equine liver | Sigma-Aldrich | G6511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| L-glutathione reduced (GSH) | Sigma-Aldrich | G4251 | Co-substrate for the GST enzymatic assay |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution |
| Spectramax iD3 | Molecular devices | To do spectrophotometric measurments |
References
- Mannervik, B., Danielson, U. H. Glutathione transferases--structure and catalytic activity. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).
- Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S.
- Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera. Biochemical Journal. 325, Pt 2 481-486 (1997).
- Beckett, G. J., Hayes, J. D.
- Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective. Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).
- Townsend, D. M., Tew, K. D. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance. Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).
- Tew, K. D. Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance. Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).
- Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death. Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).
- Adler, V., et al. Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).
- Cho, S. G., et al. Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).
- Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R.
- Lo, H. W., Ali-Osman, F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).
- Ansari, M., et al. Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients. Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).
- Mahajan, S., Atkins, W. M. The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).
- Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7 (1), 8 (2018).
- Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).
- Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53. Clinical Immunology. 93 (2), Orlando, Fla. 152-161 (1999).
- Golonko, A., Lewandowska, H., Świsłocka, R., Jasińska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment. European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512 (2019).
- Awasthi, S., et al. Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1. Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).
- Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues. Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).
- Dubey, V., Owusu-Apenten, R. Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells. Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).
- Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
- Johnson, K. A., Goody, R. S. The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).
- Ochs, R. S.
- Bisswanger, H.
- Acker, M. G., Auld, D. S. Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications. Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).
- Cheng, A. L., et al. Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).
- Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes. Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).
- Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods. Zenodo. , (2017).
- Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot. Journal of Chemical Education. 80 (2), 214 (2003).
- Wang, Y. J., et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).
- Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods of Biochemical Analysis. 46, 1 (2005).
- Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. Comparability of Mixed IC50 Data - A Statistical Analysis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).
- Brooks, H. B., et al. Basics of Enzymatic Assays for HTS. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).
- Arakawa, S., et al. Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).
- Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human. The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).
