Summary
글루타티온 S-트랜스퍼라제(GSTs)는 수많은 화학요법 약물의 대사에 관여하는 해독 효소입니다. GSTs의 과발현은 암 화학 요법 저항과 상관관계가 있습니다. 이 표현형에 대응하는 한 가지 방법은 억제제사용이다. 이 프로토콜은 잠재적인 GST 억제제를 검사하기 위해 분광측정 분석법을 사용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
글루타티온 S-트랜스퍼라제(GSTs)는 글루타티온(GSH) 컨쥬게이션에 의한 내인성 또는 외인성 전성 화합물의 제거를 담당하는 대사 효소이다. 또한, GST는 자멸 경로에 관여하는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPKs)의 조절제입니다. GSTs의 과발현은 전기 필성 알킬로팅 에이전트를 가진 화학요법을 겪고 있는 환자 중 감소된 치료 효능과 상관관계가 있습니다. GST 억제제 사용이 경향을 반전 하 고 치료 효능을 증가 하는 잠재적인 솔루션 수 있습니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 정확하고 빠르며 쉬운 효소 분석과 함께 이러한 화합물을 발견해야합니다. 기판으로서 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(CDNB)을 사용하는 분광성 프로토콜은 문헌에서 가장 많이 사용되는 방법이다. 그러나, 이미 기재된 GST 억제 실험은 CDNB에 대한 마이클리스-멘텐 상수(Km)의 측정과 같은m최적 억제 분석의 각 단계를 상세히 설명하는 프로토콜을 제공하지 않으며, 이는 채택된 효소 농도의 표시, 시험된 화합물의 억제 효능을 평가하기 위한 결정적인 파라미터이다. 따라서,이 프로토콜을 사용하여, 우리는 잠재적 인 억제제의 라이브러리를 선별하기 위해 최적화 된 분광성 GST 효소 분석의 각 단계를 설명합니다. 우리는 반 최대 억제 농도 (IC50)와 억제의 상수 (Ki)의계산을 설명합니다 - 효소 억제제의 효능을 측정하는 데 사용되는 두 가지 특성. 설명된 방법은 세포 또는 순수 재조합 인간 GST, 즉 GST 알파 1(GSTA1), GST 뮤 1(GSTM1) 또는 GST 파이 1(GSTP1)에서 추출한 GST의 풀을 사용하여 구현될 수 있다. 그러나 CDNB는 이 동소형에 대한 기판이 아니기 때문에 이 프로토콜은 GST 세타 1(GSTT1)에 적용할 수 없습니다. 이 방법은 말 간에서 GSTs를 사용하여 커큐민의 억제 효능을 테스트하는 데 사용되었다. Curcumin은 항암 특성을 나타내는 분자이며 실리코 도킹 예측 에서 GST 동소포에 대한 친화력을 보였습니다. 우리는 커큐민이 31.6 ± μM의 IC50과 23.2 ± 3.2 μM의 Ki를 가진 강력한 경쟁 GST 억제제임을 입증했습니다.
Introduction
세포성 글루타티온 S-트랜스퍼라제 효소(GSTs, EC 2.5.1.18)는 글루타티온(GSH)의 컨쥬게이션을 화학요법제와 같은 다양한 전기필 화합물로 촉매하여 체내에서 쉽게 해독하고제거한다. 세포성 GST의 7개의 등색소는 알파, 뮤, 파이, 시그마, 오메가, 세타 및 제타로 확인되었습니다. GST는 주로 간, 고환, 폐 및 위장관2에서발현된다. GST 알파 1 (GSTA1) 등소형태는 간세포에서 높게 표현된다. 본체는 뇌, 심장 및 폐에서 주로 GST 파이 1(GSTP1)을 포함한 다른 아류형을 발현하고, GST mu 1(GSTM1)을 간에서 발동하고3. GST 동위상체 사이에 높은 서열 상동성이 있지만, 각각기판 특이성을 나타내며 차동식4,,5에따라 약물 대사와 암에 다른 방식으로 연루된다.
전기성 화합물은 외인성으로 체내에 들어가거나 내인성으로 생성됩니다. 살충제, 프로스타글란딘, 발암물질 및 화학요법 약물은 글루타티온 균주 반응6에대한 잠재적기염의 일부이다. 예를 들어, 세포 내에서 형성된 모든 전자 결핍 반응성 화합물은 전기성 기판이 될 가능성이 높습니다. 클로람부실 또는 멜팔란과 같은 알키라팅 제는 GST에 의해 촉매화된 GSH의 회인으로서 제거되고, 이들 효소의 증가된 수준은 이들화합물6,,7에대한 저항과 상관관계가 있다.
세포성 GSTs의 또 다른 중요한 역할은 MAPK8(c-Jun N-말단 키나아제 또는 JNK1이라고도 함)와 MAP3K5(아포토시스 신호 조절 키나아제 1 또는ASK1)와같은 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)의 활성을 조절하는 것이다. 그들의 단백양식에 있는 몇몇 동소체는 이 단백질에 결합하고 이렇게 인산화 폭포를 차단할 것입니다. 정상 조건에서 GSTP1 이소폼은 MAPK8(c-Jun 단백질의 활성제)을 격리합니다. c-Jun과 c-Fos 단백질을 결합하면 활성제 단백질 1(AP-1) 전사 인자를 형성하며, 이는 프로 세포 유전자를 전사하는 데 책임이 있습니다. 스트레스세포에서, GSTP1 및 MAPK8에 의해 형성된 복합체가 활성화되고, c-Jun이 활성화되고, 세포멸으로9이어지는 유전자가 9발발형되기 시작한다. 이 GST 등도의 더 중대한 발현은 그러므로 증가한 세포 생존가능성, 더 많은 세포 증식 및 화학요법에 더 낮은 세포 감도로 이끌어 내는 통로를 막을 수 있습니다. 유사한 시나리오는 GSTP1의 패러로 인해 발생할 수 있습니다(예: GSTM1)는 MAP3K510과상호 작용합니다.
약물 대사와 MAPKs의 격리에서 GSTs가 맡은 역할은 GSTs의 더 큰 발현이 화학요법 치료에 대한 종양 내성 메커니즘의 징후일 수 있다는 가설을 주도하였다6,,11. 예를 들어, GSTP1은 수많은 암에서 과발현되고 그 존재는 가난한 예후및 재발8의증가된 부각과 상관관계가 있다. 이 유전자에 있는 다형성은 또한 각종 질병을 제시하는 환자를 위한 차분약 노출 및 생존율을 보여주었습니다, 이 효소가 약 저항의 기계장치에 중요하다는 아이디어를 강화하. 예를 들어, GSTM1 null 유전자형을 가진 개인은 더 낮은 약물 정리 및 더 나은 생존12,,13과연관된다. 이러한 과발현에 대응하는 몇 가지 잠재적 수단이 있는데, 예를 들어 GSH 유사체의 사용, GST와의 컨쥬레이션에 의해 활성화되는 프로약물, 또는 직접 GST억제제(14,,15)가있다.
이 모든 방법은 현재 조사 중이며, 몇몇 화합물은 환자 중 그들의 잠재적인 사용에 대한 임상 시험을 시작했습니다. 그러나, 우리의 지식의 최선을 위해, 임상설정에서GST 억제제로 사용 하 여 아무 화합물15 . 실제로, 장기 시스템에서 반응성 산소 종(ROS)의 축적으로 인한 독성으로 이어질 수 있는 정상 세포에서 특정 동소형태 또는 GSH의 고갈에 대한 특이성의 부족은 GST억제제14,,15의잠재력을 감소시키는 단점 중 일부에 불과하다. 이러한 화합물 본문에 다른 약 동 역학 효과 발휘 수 있습니다 위험 또한 그들의 사용을 제한. 예를 들어, 에타크라이닉 산은 실험실 환경에서 가장 널리 연구된 GST 억제제이지만 주로 강력한 이뇨제로 사용되기 때문에 이 특성은 임상 환경에서 다른 약물과 함께 사용을 제한합니다. 커큐민은 GST 억제제로 성공적으로 선별된 또 다른 천연 화합물입니다. 이 분자는 심황의 Curcuma longa 종에서 추출한 폴리페놀 에테르입니다. 16,17의다양한 종류의 종양 세포주멸을 유도함으로써 암에 대한 가능한16치료 옵션으로 유망한 결과를 보이고있다. 화합물다양 한 세포 통로 조절할 수 있습니다., 티로신 키나 아 제 등18 또는 GST 경로. 순수 단백질을 가진 연구는 GSTA1, GSTM1 및 GSTP119,,20에그것의 억제 효능을 보여주었습니다. 그러나, 세포내 GST 활성이커큐민(21)으로치료될 때 더 큰 세포내 GST 활성을 측정한 암세포에서 상반되는 결과가 관찰되었다. 따라서, 어떤 추가 세포 실험을 계획하기 전에 적절한 대조군을 사용하여 명확하게 설명된 프로토콜을 사용하여 임의의 퍼티제 GST 억제제의 반최대 억제 농도(IC50) 및 일정한 억제(Ki)를조사하는 것이 중요하다.
잠재적인 새로운 GST 억제제를 선별하고 테스트하는 것은 상당한 임상 적 관심이며, 발견된 모든 새로운 화합물은 전기 필기약물과 함께 사용하기에 안전하고 효율적이어야 합니다. 동종 포 폼 특이적 억제제에 대한 연구에 초점을 맞추면 GST 발현의 특정 패턴을 나타내는 종양 조직에서 GST 억제를 가능하게 하여 효과적인 조합 요법의 개발을 허용할 수 있습니다. 억제의 차동 모드와 억제제 찾는 또한 관심있을 수 있습니다. 예를 들어, GSH를 기판으로 사용하는 경쟁 억제제는 고갈을 유도할 수 있다. 세포에서 GSH 농도의 이러한 감소는 세포에 산화 스트레스를 유도 하는 것으로 나타났다, 세포 사멸으로 이어지는. 또 다른 일반적인 억제 모드인 비경쟁적 억제는 기판이 고농도로 존재하더라도 되돌릴 수 없습니다.
효소 활성의 속도는 마이클리스-멘텐 상수(Km)와 최대 속도(Vmax)로나타내며, 이는 미하니스-멘텐 그래프를 플로팅하여 결정될 수 있으며,반응(23)의속도에 대한 기판 농도가 있다.m Km은 효소 활성 부위의 절반을 차지하는 데 필요한 기판의 농도로, 이는 높은Km이 선호도가 낮다는 것을 의미합니다. Vmax는 모든 활성 부위가 기판에 의해 점유될 때 도달된 반응의 최대 속도를 나타낸다. Km은 V최대의절반과 같습니다. 억제의 세 가지 가장 일반적인 모드가 있습니다: 경쟁, 비경쟁, 비경쟁. 경쟁 억제의 경우, 억제제는 효소의 활성 부위에 결합하고 기판과 경쟁한다. 따라서,Vmax는 억제제의 첨가 후 변경되지 않지만,Km은 억제제에 대응하기 위해 더 많은 기질이 필요하기 때문에 증가한다. 경쟁적이지 않은 억제는 기판이 효소와 복합체를 형성할 때만 발생합니다. 이 경우, 억제 수준이 기판 및 효소 농도에 따라 달라지므로, Vmax 및Km은 억제제가 반응에 첨가될 때 감소한다. 억제의 마지막 모드는 비 경쟁이며 두 가지 다른 억제 패턴의 혼합이다. 억제제는 효소가 기판에 묶여 있는지 여부에 관계없이 효소의 활성 부위에 결합할 수 있다. 여기서 V맥스는 억제제의 첨가 후 감소하지만,Km은 24를변경하지 않는다.
GST 활성을 측정한 분광측정 분석법은 1974년 Habig 외에 의해 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(CDNB)을반응(22)의기판으로 사용하여 처음 개발되었다. GSH와 CDNB 의 결합은 GS-DNB를 형성하며, 이는 340 nm의 파장에서 최대 광 흡수도를 나타내며 분광계로 기록할 수 있습니다. 아래에 설명된 대부분의 기술은 하빅 외에서 파생되며, 억제 분석에 대한 최상의 설정 및 중요한 최적화 지점에 대한 정보를 포함한다. 이 기술은 전산 예측을 사용하여 합리적인 약물 선택에 의해 선택되든 또는 문헌 검토를 통해 잠재적인 GST 억제제스 선별에 적용될 수 있습니다. 새로 합성된 GST 단백질 또는 특정 동소형에 프로토콜을 조정하는 방법도 논의된다. 예를 들어, 임상적으로 관련된 다형성 또는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)을 나타내는 GST 동소형의 억제 효능을 테스트하는 것은 환자 특정 GST를 대상으로 하는 이 프로토콜에 잠재적인 사용이 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 다른 기능 적 연구 전에 시험관 내에서 잠재적인 GST 억제제의 선별을위한 빠르고 실현 가능하며 효과적인 방법을 제공합니다. 효소 억제제의 가장 일반적으로 측정된 특성을 평가하는 데 필요한 단계는 설명된다: 효소 활성을 반으로 감소시키는 데 필요한 억제제의 농도인 억제농도(50)(IC50); 및 억제제와 효소 사이의 해리의 평형 상수를 나타내는 억제(Ki)의상수, 이들 두 분자 간의 친화의 특징. 이 두 값은 비선형 회귀및 각 억제 모드에 대한 특정 방정식을 사용하여 각각 측정됩니다. 우리는 또한,억제제23,,25,26의추가 후에 Vmax 및 Km의 변경을 결정하기 위하여 Michaelis-Menten 플롯을 사용하여 억제의 이 패턴의 평가를 보여줍니다.
Protocol
1. GST 효소 용액의 준비
참고: 효소 용액을 준비하는 절차는 효소 활성 단위가 분석 전에 알려져 있는지 여부에 따라 달라집니다. 하나의 효소 단위는 분당 제품의 1 μmol을 합성하는 데 필요한 효소의 양입니다. 효소 활성은 단위/mL 또는 μmol/min/mL로 표현되며 효소 용액의 희석에 따라 달라집니다. 특정 효소 활성은 단위/mg 또는 μmol/min/mg으로 표현되며 용액의 순도에만 의존합니다. 이 두 특성은 아래에서 결정됩니다. 격리된 GST 동소폼의 효소 단위가 알려지지 않은 경우 각 반응에 대한 효소 농도를 조정하고 재현 가능한 결과를 제공하는 것으로 추정되어야 합니다.
- 분석서에 사용되는 GST의 효소 단위가 알려진 경우:
- 0.1 U/mL의 GST 효소의 신선한 스톡 솔루션을 물에 준비한 다음 2단계로 진행합니다.
참고: 이 용액은 몇 달 동안 알리쿼트에 -20°C또는 장기간 -80°C에 저장할 수 있지만 동결/해동 주기를 피해야 합니다.
- 0.1 U/mL의 GST 효소의 신선한 스톡 솔루션을 물에 준비한 다음 2단계로 진행합니다.
- 분석서에 사용된 GST의 효소 단위가 알려지지 않은 경우:
- 비신천산(BCA) 단백질 분석기 또는 기타 키트를 사용하여 효소 용액의 단백질 농도를 정량화한다.
- 단백질 용액을 0.02 mg/mL의 최종 단백질 농도로 희석하십시오.
- 효소 용액 20 μL, GSH 25mM의 20 μL(분자량: 307.32 g/mol), 덜벡코의 인산염 완충식식염수(DPBS)의 150 μL을 96웰 플레이트에 추가합니다. 빈칸의 경우 효소 용액 대신 20μL의 물을 추가합니다.
- CDNB 50mMM의 10 μL(분자량: 202.55 g/mol) 기판을 각 웰에 추가합니다.
- 분광성 마이크로 플레이트 판독기에서 340 nm에서 우물을 읽기 위한 매개 변수를 설정합니다. 10 분 동안 매 분마다 흡광도를 측정하는 것이 좋습니다.
- 마이크로 플레이트 판독기에 플레이트를 삽입하고 1.2.5 단계의 설정에 따라 판독을 시작합니다.
- 효소 샘플과 빈에 대한 분당 흡광도의 변화를 계산합니다.
참고: y축의 흡광도와 x축의 분에서 흡광도를 플로팅하여 반응이 선형인지 확인합니다. 반응이 선형이 아니며 고원에 도달하면 모든 기판이 사용되고 반응이 너무 빠르다는 것을 의미합니다. 따라서, 재고 용액을 2로 희석시킴으로써 우물에 첨가된 효소의 양을 줄입니다. - 테스트 샘플의 흡광도 판독값을 비워 수정합니다.
- 맥주-램버트 법칙을 나타내는 방정식 1을 사용하면 매 분마다 반응하여 형성된 GS-DNB(μM)의 농도를 계산합니다.
방정식 1:
여기서 C는 μM에서 기판의 농도이고,340/min은 분당 흡광도의 변화이며, 단계 1.2.7에서 측정된 바와 같이, ε 340nm(0.0096 μM-1*cm-1)에서CDNB 컨쥬게이트의 용해 소멸 계수이며, l은 빛의 경로의 길이(cm)이다. 효소 용액의 200 μL로 채워진 96웰 플레이트의 경우 경로 길이는 약 0.55cm입니다. 이 값은 플레이트 모델에 따라 다를 수 있으며 제조업체에서 확인해야 합니다. - μmol/min에 잘 존재하는 제품의 양을 결정하기 위해, 2 x 10-4 L의 부피에 의해 방정식 1을 사용하여 발견 된 결과를 곱한다.
- 단계 의 결과를 1.2.9 x10-4 mg으로 나누어 사용되는 단백질의 양당 활성을 정규화한다. 결과는 단위/mg 또는 μmol/min/mg에서 특정 효소 활성입니다.
참고: 비선형 반응으로 인해 1.2.6 단계에서 희석이 변경된 경우, 그에 따라 단백질 양을 조절한다. - 효소 활성을 찾으려면, 1.2.10~ 0.002 mg/mL단계에서 발견되는 특정 효소 활성을 곱하여 mg/mL의 단백질 농도로 결과를 조정한다. 이렇게 하면 단위/mL 또는 μmol/min/mL에서 효소 활성이 제공됩니다.
참고: 효소 활성과는 달리, 이 측정은 단백질 용액의 희석에 따라 변경되지 않습니다. 단계 1.2.10과 동일한 참고하지만 단백질 농도에 대한. - 물에 0.1 단위 /mL에서 GST 효소의 재고 용액을 준비하고 2 단계로 진행합니다.
참고: 이 용액은 몇 달 동안 알리쿼트에 -20°C또는 장기간 -80°C에 저장할 수 있지만 동결/해동 주기를 피해야 합니다. 효소 활성의 제어는 단백질 용액의 저하가 발생할 수 있기 때문에 실험이 장기간 진행되는 경우에 권장됩니다.
2. CDNB에 대한 GST 동소형태의 마이클리스-멘텐 상수 측정
참고: 절차는 CDNB 기판에 대해 설명되지만 GSH와 같은 다른 기판에 적용 될 수 있습니다. CDNB 의 각 농도는 CDNB 농도에 따라 340 nm의 흡수성이 증가하기 때문에 자체 공백이 필요합니다.
- 에탄올 95%(v/v)에서 10mMM에서 100mMMMM에 이르는 6개의 CDNB 농도를 준비한다.
- CDNB 10 μL, GST 효소 20μL, GSH 25mM20 μL, 150 μL DPBS로 분석 용액을 준비합니다. 공백의 경우 CDNB 용액 대신 에탄올 이탄올이 10μL만 95%만 추가합니다.
- CDNB 10μL, 물 20μL, GSH 25mM 20 μL, 150 μL DPBS로 각 CDNB 농도에 대해 공백을 준비합니다.
- 마이크로 플레이트 판독기와 함께 분당 340nm에서 10분 동안 흡광도를 기록합니다.
- 올바른 다른 테스트 웰의 빈 에서 결과를 빼서 흡광도를 블랭크 수정합니다. 측정된 값에 따라, 방정식 2를 사용하여 반응의 속도를 계산합니다.
방정식 2:
A340/min이 분당 흡수도의 실험적으로 결정된 변화인 경우, V총(총부피)은 0.2mL, V효소(효소의 부피)는 0.02mL이고,ε GS-DNB 는 340nm(9.6mM-1*cm)에서 GS-DNB 공주게이트의 어금니멸종 계수이다.total -1-1 96웰 플레이트의 200 μL 웰에서 경로 길이는 0.55cm(플레이트 유형에 따라 다름)이고 소멸 계수는5.3mM-1과같습니다. 속도는 μmol/mL/min 또는 mM/min으로 나타낼 수 있습니다. - 미가엘리스-멘텐 그래프를 속도(y축)로 기판 농도(x축)에 대해 플롯합니다.
- 반응의 최대 속도(Vmax)를정의하고 마이클리스-멘텐 상수(Km)(즉, V max의 절반에서 기판 농도)를m정의한다.
참고: GraphPad 프리즘과 같은 소프트웨어를 사용하여 효소 운동 곡선은 Vmax 및Km과같은 Michaelis-Menten 효소 운동 매개 변수의 계산을 위해 비선형 회귀를 사용하여 장착할 수 있습니다. - 에탄올 95%(v/v)에서 계산된Km의 20배로 CDNB 스톡 솔루션을 준비한다.
3. 잠재적인 GST 억제제의 흡수성
참고: 이 단계는 반응에 사용되는 잠재적인 GST 억제제가 측정되는 파장에서 흡수력을 증가시키는 대사산물을 생성하는지 여부를 조사하기 위해 수행됩니다. 이 경우 사용되는 억제제의 양은 결과에 영향을 미치며 특정 공백은 각 농도에 대해 준비되어야합니다.
- 억제제는 필요한 농도로 희석합니다.
참고: 3개의 다른 희석제, 바람직하게는 억제 분석 중에 시험된 가장 낮은, 중간 및 최고 농도를 준비한다. 우물의 최대 DMSO 농도는 1% 미만(v/v)이어야 합니다. 우리는 우리의 실험실에서 분석에 DMSO 농도의 효력을 시험하고, 1%는 GST 활동을 현저하게 바꾸지 않았습니다. - 96웰 플레이트에서 잠재적GST 억제제 2μL, GSH 25mM의 20 μL, DPBS 168 μL을 추가합니다. 억제제 시료에 사용되는 용매의 동일한 볼륨을 추가하여 억제제 없이 적절한 대조군을 사용하십시오.
- 효소 반응을 시작하기 위해 10 분 동안 반응을 배양하십시오.
참고: 이 단계는 기판의 총 고갈을 피하면서 반응을 시작하는 쌍둥이 목표를 가지고 다른 인큐베이션 시간을 테스트하여 최적화 할 수 있습니다. - 각 웰에 10 μL의 CDNB를 추가하여 2단계에서 발견되는 Km에서 최종 농도를 달성합니다.
- 몇 초 동안 접시를 흔들어.
- 마이크로 플레이트 판독기와 함께 분당 340nm에서 10분 동안 흡광도를 기록합니다.
- 분당 흡광도의 변화를 계산합니다.
- 억제제 없이 빈 반응과 음의 대조반응모두에 비해 흡광도의 변화를 검증한다.
- 상당한 변화가 있는 경우 결과를 조정하기 위해 각 억제제 농도에 대해 블랭크를 사용하십시오.
참고: 이 결과는 GST 효소가 없는 반응의 성분이 자발적으로 반응하고 340 nm에서 흡수력을 증가시키는 대사산물을 생성한다는 것을 나타냅니다. 이 추가 흡광도에 대 한 수정, 특정 빈 각 농도 대 한 측정 해야 합니다. - 흡수도에 큰 변화가 없는 경우, 모든 농도에 대해 GST 억제제 희석에 사용되는 용매만 포함하는 일반 블랭크를 사용하십시오.
- 상당한 변화가 있는 경우 결과를 조정하기 위해 각 억제제 농도에 대해 블랭크를 사용하십시오.
4. GST 및 IC50 평가의 억제 분석
- 잠재적인 GST 억제제의 9개의 농도를 준비합니다.
참고: 농도는 결과에 따라 조정할 수 있습니다. 목표는 비선형 회귀 곡선의 바닥 과 상단 고원을 정의하는 것입니다. 이 단계에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. - DPBS의 148 μL으로 25mM에서 GSH 용액의 20 μL을 희석하여 분석 솔루션을 준비합니다. 분석에서 사용되는 우물의 수에 따라 볼륨을 조정합니다.
- 명확한 96웰 플레이트에서 190 μL의 최종 부피에서 효소 반응을 준비합니다. 이러한 단계에 멀티채널 파이펫을 사용하는 것이 좋습니다.
- 시험 우물의 경우 효소 용액의 20 μL, 잠재적인 GST 억제제 용액의 2 μL 및 분석 용액의 168 μL을 추가합니다.
- 대조군을 위해 효소 용액의 20 μL, GST 억제제에 사용되는 희석제의 2μL 및 분석 용액의 168 μL을 추가한다.
- 빈 우물의 경우, 물 20 μL, 잠재적인 GST 억제제의 2 μL 및 분석 용액의 168 μL을 추가합니다.
참고: GST 억제제가 340nm 파장을 흡수하는 경우 테스트된 각 농도에 대해 특정 블랭크를 준비해야 합니다.
- 공백을 포함하여 각 우물에 CDNB 용액의 10 μL을 20x Km에 추가합니다. 이 단계에 멀티채널 파이펫을 사용하는 것이 좋습니다.
- 몇 초 동안 접시를 흔들어.
- 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 분당 340 nm에서 10분 동안 흡광도를 측정합니다.
- 테스트 웰 블랭크에서 결과를 빼서 흡광도를 블랭크로 수정합니다.
- GST 억제제 용액을 사용하여 얻은 값을 억제제 없이 분당 제어의 흡수도에 의해 분할하여 결과를 정규화한다.
- GST 활성(y축)에 대한 억제제의 로개반스믹 농도(x축)의 비선형 회귀 그래프를 플롯하여 IC50을 결정합니다.
참고: 그래프패드 프리즘은 대조군에서 효소 활성의 50%를 표시하는 농도를 예측하여 비선형 회귀 플롯에서 IC50을 계산합니다. 예측은 시그노이드 그래프에 의해 형성된 경사의 곡선뿐만 아니라 바닥 및 상부 고원을 기반으로 합니다.
5. Ki의평가 및 억제의 유형
- 네 개의 다른 CDNB 농도를 준비: 3 높은 하나 Km 이전에 발견.
- 이전에 발견된 IC50과 같거나 아래에 있는 세 가지 다른 GST 억제제 농도를 준비한다.
- 4.2 ~ 4.7 단계에 설명된 바와 같이 억제 분석방법을 수행한다.
- 방정식 2를사용하여 반응속도를 계산합니다.
- 각 억제제 농도에 대해 Michaelis-Menten 그래프를 플롯하고 각 반응의 V최대 및 Km을 계산합니다.
- Vmax 및 Km의 변화에 따라 다른 농도를 사용할 때, 억제의 GST 억제제의 모드를 평가.
참고: 이 단계는 결과 및 토론 섹션에서 보다 자세히 설명되어 있습니다. - 억제 모드에 기초하여, Ki를계산한다.
참고 : 그래프 패드 프리즘에서, 다른 방정식은 억제의 특성에 따라 Ki를 계산하는 데 사용됩니다. 사용되는 방정식은 억제제를 첨가한 후 관찰된Km 및 V최대를 기반으로 하며 대조군의Km 및 V최대값과비교된다.
Representative Results
말 간에서 GST와 CDNB의 마이클리스 -Menten 상수 (Km)
커큐민은 항암성질을보인27에서 섭취후에도 안전한 천연 화합물이다. 이 분자의 억제 효능은 인간 재조합 GSTs19,,20에서입증되었다. 설명된 프로토콜을 사용하여 말 간에서 GST 등색의 풀을 사용하여 GST 활동에 대한 커큐민의 효과를 평가했습니다. 공급 업체에 따르면, 단백질의이 혼합의 특정 활성은 25 U/mg. 0.1 U/mL의 스톡 용액은 적절한 양의 물로 용액을 용해시킴으로써 제조하였다. 에타크라이닉산은 연구에서 가장 널리 사용되는 GST 억제제이기 때문에 양성 조절으로서 병렬로 사용되었다. GST 활동 분석 및 억제제 테스트를 설정하는 단계는 그림 1에설명되어 있습니다.
Km은 Km에 상응하는 기판 농도를 이용하여 억제 모드(28)의 결정에 관하여 편견을 보장하지 않기28때문에 각 효소 기판 반응에 대해 정의되어야 한다.m 0.5mM에서 5mMMM에 이르는 6개의 CDNB 농도는 2.5mM GSH의 고정 농도를 사용하여 이 파라미터를 측정하기 위해 테스트되었다.
반응의 최종 부피는 96웰 플레이트에서 200 μL이었습니다. CDNB와 GSH의 자발적인 활용이 발생할 수 있고 흡광도를 증가시킬 수 있기 때문에 각 실험에 대해 특정 블랭크가 테스트와 동일한 CDNB 농도를 사용하여 잘 사용되었습니다. 0.01 단위/mL의 최종 효소 농도는 모든 반응에 사용되었고, 분석 믹스에 스톡 용액의 20 μL을 첨가하였다. 340 nm의 흡광도는 10 분 동안 매 분마다 기록되었습니다. 반응의 속도(mM/min)는 방정식 2를사용하여 계산하였다. Michaelis-Menten 그래프는 속도(μM/min)(그림2)에대해 기판 농도(mM)를 플롯하고 반응의Km을 계산하였다. 실험은 적어도 3세트의 데이터가 유사한 결과를 보여 주때까지 반복되었다. 말 간에서 GST를 가진 CDNB의 Km는 0.26 ± 0.08 mM로 측정되었다. CDNB의 0.2 mMM의 농도는 GSTs의 이 배치를 사용하여 각 억제 분석에 사용되었다.
340 nm에서 흡수된 대사산물의 자발적인 형성은 GSH 및 CDNB로 단독으로 배양된 커큐민을 사용하여 실험 중에 측정되지 않았다. 동일한 블랭크는 각 실험에서 모든 억제제 농도에 사용되었다.
GST에 대한 커큐민의 억제 효능
커큐민의 억제 효능은 소프트웨어(예: AutoDock Vina 버전 1.1.2)와 함께 실리코 도킹 시뮬레이션을 사용하여 예측되었다. 29 상이한 GST 동소형태(즉 GSTA1, GSTM1 및 GSTP1) 및 커큐민 간의 자유 결합 에너지가 예측되었다(데이터는 표시되지 않음). 이어서, 억제Ki의 상수는 수학식 3을사용하여 계산하였다.
방정식 3:
여기서 ∆G는 실리코 분석에서 발견되는 자유 결합 에너지이며, R은 1.987 cal*K-1*mol -1의가스 상수이며, T는 켈빈(298 K)에서 실험 중 온도이다.-1
AutoDock Vina에 의해 반환되는 자유 결합 에너지 결과에 기초하여, 커큐민은 각각 78.1 μM, 78.1 μM 및 27.4 μM의 Ki 값을 가진 인간 GSTA1, GSTM1 및 GSTP1의 강력한 GST 억제제입니다. 제1 억제소는 이러한 전산 Ki 추정을 이용하여 수행되었고, 필요에 따라 결과에 따라 농도가 조정되었다.
첫째, IC50은 추정되었다. 이 특성은 효소의 반응 속도를 50%까지 감소시키는 억제제의 농도입니다. 따라서 효소농도(30)에의존한다. 억제제의 9개의 최종 농도는 0.39 μM에서 100 μM에 이르는 9개의 최종 농도를 제조했으며, 각 농도는 이전 농도의 두 배에 달한다. 분석용액은 GSH 2.5mM의 20μL, 말간으로부터의 GST 20 μL00, 0.01 U/mL 최종, 커큐민 용액의 2μL, PBS 148 μL로 구성되었다. 컨트롤은 커큐민에 사용되는 희석제와 동일한 솔루션으로 구성되었다. 이 혼합물은 효소 분석법을 시작하고 분석 용액에서 커큐민의 분해를 피하기 위해 15 분 동안 배양되었으며, 이 화합물은완충액(31)에서불안정하기 때문이다. 다음으로, CDNB 용액 10μL을 4mM로 각각 양분에 첨가하여 최종 농도0.2mM CDNB를 받았다. 340 nm의 흡광도는 분당 흡광도의 변화를 계산하기 위해 10 분 동안 매 분마다 기록되었습니다. IC50을 계산하기 위해 커큐민으로 배양된 각 샘플은 활성 비율을 주기 위해 제어로 정규화되었습니다. 이러한 결과는 억제제 대 억제제의 로개반스혈 농도의 비선형 회귀를 계산하여 플롯 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 말 간에서 GST에 커큐민에 대해 발견 된 IC50은 31.6 ± 3.6 μM(그림 3A)이었다.
동일한 실험은 커큐민과 마찬가지로 0.39에서 100 μM에 이르는 농도를 가진 포지티브 컨트롤로서 에타크닉산을 사용하여 병렬로 수행되었다. IC50은 6.6 ± 1.1 μM(도3B)으로나타났다.
다음 단계는 이러한 전달에 대한 커큐민의 억제 모드를 평가하는 것이었습니다. 커큐민의 4개의 다른 농도: 0, 7.5, 15 및 30 μM, CDNB의 4개의 다른 농도와 더불어 시험되었습니다: 0.2, 0.4, 1 및 1.5 mM. 프로토콜은 이전 실험과 동일했습니다. 각 조건의 속도는 방정식 2를사용하여 계산되었습니다. 기판 농도(mM)에 대한 속도(μM/min)를 가진 각 억제제농도(도 3C)에대한 곡선이 플롯되었다. V맥스와 Km은 그래프 패드 프리즘과 각 플롯에 따라 결정되었다. 잠재적 억제제의 억제 모드는 이 두 매개 변수의 변화와 다른 상태의 변화에 따라 평가되었다. 24 Vmax가 조건 간에 크게 변화하지 는 않았지만Km이 다른 억제제 농도로 증가함에 따라, 커큐민의 GST 억제는 경쟁적입니다. 이러한 억제 패턴은 효소의 활성 부위에 대한 기판과 억제제가 경쟁할 때 발생합니다. 경쟁 억제제의 Ki를 측정하기 위해, 그래프 패드는 코플랜드 외32에의해 설명된 대로 방정식 4 및 방정식 5를 사용합니다.
방정식 4:
방정식 5:
여기서Kmobs는 관찰된 Michaelis-Menten 상수이고,Km은 미하요리스-멘텐 상수대조군,[I]는억제제 농도,Ki는 억제의 상수이고, Y는 속도이고, X는 기판 농도이다.
계산은 억제 모드의 평가와 동일한 실험을 기반으로 합니다. 말 간에서 GST의 curcumin의 억제를 위해추정된 Ki는 23.2 ± 3.2 μM이었습니다.
그림 1: GST 효소 및 억제 어약 의 단계를 설명하는 플로크차트. 절차에 대한 세부 정보는 프로토콜 섹션에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 포미-멘텐 플롯의 GST 효소 활성. 기판 CDNB의 농도가 증가하여 GSH(2.5mMM)의 고정 농도를 사용하여 말 간으로부터 GST 풀로부터 GST 활성을 결정하였다. CDNB의Km 값은 그래프의 곡선에 따라 0.26 ± 0.08mMMM로 결정되었다. 플롯의 각 데이터 포인트는 SD와 함께 네 가지 실험 실행의 평균을 나타냅니다.
그림 3: GST 효소 활성에 커큐민 및 에해크라이닉 산의 효과. (A-B) 커큐민(A) 또는 양성A제어 에타크론산(B)의B농도증가의 첨가, 동일한 GST(0.01 U/mL), GSH(2.5mMM) 및 CDNB(0.2 mMMM) 최종 농도는 비선형 회귀와 함께 말간에서 GST에 대한 두 화합물의 IC50을 계산하는 데 사용되었다. IC50은 커큐민용 31.6± 3.6 μM, 에탈크린산용 6.6 ± 1.1 μM으로 결정되었다. (C)마이클리스-메텐 플롯의 다양한 농도의 커큐민, 억제의 경쟁 모드를 나타내는 CDNB 기판의 다양한 농도에 대해 테스트. 억제제가 없는 Vmax와 Km은 각각 132.7± 4.6 μM 및 0.5± 0.08 μM로 측정되었다. 커큐민의 30μM, Vmax 및Km은 130.4± 13.1 μM 및 1.08 ± 0.39 μM. 모든 그래프(A-C)의 데이터 포인트는 SD로 3개의 다른 실험 실행수단을A-C 나타내고 있습니다.
Discussion
우리는 분광성 GST 효소 분석의 각 단계를 설명하는 프로토콜을 제공하고, putative 억제제(도 1, 표 1)를선별하고 억제력을 정량화합니다. 우리는 또한 재현 가능한 결과를 제공하는 정확한 효소 분석에 대해 고려해야 할 가장 중요한 기준을 강조했습니다. 다른 색법 방법 또는 질량 분석법에 대한 설명된 프로토콜의 주요 장점은 이 프로토콜이 빠르고 쉽게 수행되고 GST 활성의 정량적 측정뿐만 아니라 선별된 분자의 억제 효능을 제공한다는 것입니다.
우리는 효소 억제제의 두 가지 가장 중요한 Michaelis-Menten 매개 변수를 계산하는 방법을 제시합니다: IC50 및 Ki. 강력한 억제제는 가능한 가장 낮은 Ki 및 IC50을 발휘하여 억제제와 효소 사이의 친화성이30이높다는 것을 나타냅니다. IC50은 효소 농도 및 분석 조건에의존하므로(33)는,다른 실험에서 억제제또는 다른 분석조건(34)을사용하여 수득하기 어려운 값을 사용하기 어려울 수 있다. 억제 Ki의 상수를i 사용 하 여 잠재적인 화합물의 억제 효능의 더 나은 지표. Ki는 억제제와 효소 사이의 친화성에전적으로 의존하기 때문에 두 개의 억제제와 다른 억제 모드를 비교하는 데 사용할 수 있다. 그러나, 억제제의 성질에 대한 명확한 생각을 갖기 위해서는 억제제의파라미터(30)를모두 결정해야 한다. 커큐민의 IC50과 Ki를 각각 31.6 ±μM 및 23.2 ± 3.2 μM로 측정하여 이 화합물이 강력한 GST 억제제임을 나타냅니다. 이러한 결과는 다른 인간 GST 등산 및 커큐민에 대해 27.4에서 78.1 μM 사이의 Ki 값을 추정한 실리코 예측을 확인했습니다.
효소 활성 또는 반응 속도 및 효소의 양
위에서 언급한 바와 같이, IC50은 효소 농도에 의존하며, 알 수 없는 수준의 효소 활성을 가진 실험을 수행하면 거짓결론(33)으로이어질 수 있다. 억제 활성을 줄일 수 있는 다른 요인을 제어하려면 GST의 각 새로운 배치에 대한 효소 활성을 고려하고 측정해야 합니다. 예를 들어, 너무 많은 동결/해동 사이클로 인한 효소 배치의 열화는 활동을 감소시키고 동일한 조건에서 실험이 실행되더라도 IC50을 낮출 수 있습니다. 즉, 0.01 단위의 효소를 사용하면 1 단위를 사용하는 것과 동일한 결과를 제공하지 않습니다. 너무 많은 효소를 사용하면 기판의 급속한 고갈로 이어질 수 있으며 반응은 선형 모양을 갖지 못할 것입니다. 이 매개 변수는 따라서 정확한 결과로 이어질 수 있습니다., 흡수에 있는 변화는 긴 잠복 시간 후에 볼 것 이다.
Km 값
억제제에 의해 전시되는 억제의 유형을 평가하기 위한 최상의 조건을 보장하기 위하여는, 기질 농도는 Michaelis-Menten 상수 (Km)와동일하거나 그 이하여야 합니다. Km은 효소(28)에활성 부위의 절반을 차지하는 데 필요한 기판의 농도로 표현된다. 예를 들어, 더 높은 기판 농도 경쟁 억제제중화수 및 이러한 유형의 억제를 평가하는 것은 이러한 환경에서 어려울 것이다. 따라서, 이 방법론에서 중요한 단계 중 하나는 선택된 기판에 대한 효소의Km의 결정이다(here CDNB). 일부 연구에서는, 이 값이 결정되지 않았고, 이는 억제제에 의한 억제의 패턴에 대한 잘못된 결론으로 이어질 수 있으며, 억제 모드가 올바르지 않으면, Ki는 방정식이 억제의 패턴에 의존함에 따라 잘못 계산될것이다(26,,28). 다른 GST 등색소를 테스트하는 경우, 이 값은 효소와 리간드 의 쌍에 대한 고유하기 때문에 Km 값의 새로운 평가가 필수적입니다. 0.26± 0.08mMMMM로 정의된 CM(0.2mMM)보다 약간 낮은 CDNB의 농도를 사용함에 따라, GST에 대한 커큐민억제의 예측경쟁 모드가 정확하게 결정되었다.m
IC50
IC50을 추정하는 좋은 시그로이드 곡선을 얻으려면 바닥과 상단 고원 모두를 찾아야합니다. 바닥 고원은 최대 억제 활성을 제공하는 억제제의 농도를 나타낸다. 경우에 따라, 화합물 완전히 효소를 억제 하지 않을 수 있습니다., 고농도에서도, 용해도 같은 기술적 인 문제 때문에. 그러나, 그래프 패드 프리즘 같은 도구는 매우 정확하게 하단 고원에 맞게 할 수 있습니다. 상부 고원은 효소를 억제하기에 충분하지 않은 억제제의 농도로 이루어져 있으며, 따라서 활성은 최대이다. 이 두 고원은 곡선의 경사를 찾기 위해 IC50뿐만 아니라 그 사이의 농도를 결정하는 데 매우 중요합니다-다음 IC50시그로이드 곡선(35)의모양에서 파생 될 수있다. 커큐민은 물에 용해성이 부족하므로 이 분석에서 사용되는 최대 농도는 분석 용액의 강수량을 피하기 위해 제한됩니다. 따라서 GST 활성을 완전히 억제하지 않는 농축 된 솔루션이 덜 사용되었습니다. 이것은 바닥 고원의 결정에 대한 문제를 제기했다. 이 문제에 대처하기 위해, 우리는 커큐민(그림 3A)에대한 31.6 ± 3.6 μM의 IC50을 제공 비선형 회귀 그래프를 기반으로 하단 값을 예측했다. 에타크라이닉산의 경우, 이 화합물이 분석 용액에서 용해되고 IC50이 6.6 ± 1.1 μM로 측정되었기 때문에 바닥 고원에 대한 값을 예측할 필요가 없었다.
이 방법은 인간, 즉 GSTA1, GSTM1 또는 GSTP1에서 가장 발현된 GST 동소체에 적용될 수 있다. 그러나, 이 프로토콜은 CDNB가 이 서브형에 대한 기판이 아니기 때문에 GSTT1 등소형태의 활성을 정량화하는 데 적합하지 않다. 36, 37 한편 이 문제에 대응하기 위해 프로토콜을 약간 수정할 수 있습니다. 예를 들어, GSTT1의 기판으로 1,2-에폭시-3-(4'-니트로페녹시)프로판(ENPP)을 사용하고 340nm 대신 360nm에서 컨쥬게이트의 양을 측정한다. 37
프로토콜의 단계는 세포 배양 실험에서 GST 활성 및 억제제 테스트를 테스트하기 위해 적응되고 적용될 수 있다. GST 억제제없이 처리된 세포에 대한 GST 활성의 측정은 이러한 화합물이 이러한 실험 환경에서 사용될 수 있는지 를 나타냅니다. 억제제가 지피성일 때 특히 흥미롭습니다. 예를 들어, 우리는 curcumin이 프로토콜을 사용 하 여 강력한 GST 억제제 제시. 그럼에도 불구 하 고, 세포 연구에 그것의 응용 프로그램 제한 될 수 있습니다., 분자는 물에 제대로 용해 하 고 매체에서 신속 하 게 저하. 31 기판 CDNB의 비등포특이성에 관한 이 프로토콜의 또 다른 개량성이 가능하다. 세포 연구에서이 프로토콜을 사용하면 전체 GST 활동에 대한 정보만 제공하지만 정확한 GST 하위 유형의 활성은 아닙니다. 동소형태 별 기판을 추가하거나 특정 재조합 GST 동소포를 사용하면 동소형태 특정 GST 억제제를 테스트할 수 있습니다.
결론을 내리기 위해, 우리는 전기 화학 요법과 함께 사용될 가능성이 있는 GST 억제제를 시험하기 위한 완전한 절차를 기술합니다. 우리는 잠재적인 흥미로운 분자를 시험하고 정량적 값, IC50 및 K i를 가진 억제제로서 그들의 효율성을 결정하기 위하여 GST 효소 및 억제 분석의 중요한 단계를강조했습니다. 이 방법은 임의의 퍼티컬 화합물에 적용되고 가장 발현된 인간 GST 등산화(GSTA1, GSTM1 및 GSTP1)에 적용될 수 있거나, GST 억제제를 사용하여 세포 배양 연구를 수행하거나 다른 흥미로운 GST 등색체의 활성을 측정하도록 약간 조정될 수 있다.
| 시약 | 이름 | 분석 용액의 농도 | 다른 |
| 기판 | CDNB | 측정 된Km (mM) | 95% 에탄올로 희석. 최종 에탄올 농도는 5%≤(v/v)여야 합니다. |
| 기판 컨쥬게이팅 | Gsh | 2.5 mM | 물에 희석. |
| 농도는 용액을 포화시켜야 합니다. | |||
| 버퍼 | Pbs | - | pH = 7.1 |
| 효소 | GST 등소 형태 또는 순수 등소 형태의 풀 | 0.01 단위/mL, 실험적으로 결정. | 물에 희석. |
| GST 억제제 | 선택의 잠재적 인 화합물 | IC50: 3 농도는 최대 억제, 3 그 최소 억제, 그리고 3 사이. | DMSO에 희석한 다음 물에 희석하여 DMSO의 최종 농도를 ≤ 1% (v/v) |
| Ki: IC50 주위 3 농도. | |||
| 매개 변수 | |||
| 실온 (25°C) | |||
| pH = 7.1 | |||
| DMSO ≤ 1% (v/v) | |||
| 에탄올 ≤ 5% (v/v) | |||
표 1: GST 억제 분석 중에 고려해야 할 시약 및 매개 변수의 요약입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구 작업은 CANSEARCH 재단에 의해 지원되었다. 저자는 로렌스 레센 씨와 Yoann Sarmiento 씨가 기술 지원을 위해 특히 복제 실험을 수행하면서 억제제로 애체를 표준화하는 것을 인정하고 싶습니다. 데니스 마리노 박사, 시모나 믈라카르 박사, 비드 믈라카르 박사의 유익한 토론과 입력은 대단히 인정받고 있습니다. 패트리샤 Huezo-Diaz 커티스 박사가 비디오 내레이션에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 실리코 예측에 자신의 입력 무투쿠마르 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한이 원고의 영어 증거 읽기에 그의 도움 에 대한 씨 대런 하트 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) | Sigma-Aldrich | 237329 | Substrate used for the GST enzymatic assay |
| Corning UV-Transparent Microplates | Sigma-Aldrich | CLS3635 | Transparent plate to perform the enzymatic assay. When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate. |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 8511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | To prepare the stock of the putative inhibitor |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Buffer for the enzymatic reaction |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 10542382 | To dilute the CDNB |
| Glutathione S-Transferase from equine liver | Sigma-Aldrich | G6511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| L-glutathione reduced (GSH) | Sigma-Aldrich | G4251 | Co-substrate for the GST enzymatic assay |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution |
| Spectramax iD3 | Molecular devices | To do spectrophotometric measurments |
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