Summary
Глутатион S-transferases (GSTs) являются детоксикации ферментов, участвующих в метаболизме многочисленных химиотерапевтических препаратов. Переэкспрессия ГТС коррелирует с устойчивостью к химиотерапии рака. Один из способов борьбы с этим фенотипом заключается в использовании ингибиторов. Этот протокол описывает метод с помощью спектрофотометрического анализа для проверки потенциальных ингибиторов GST.
Abstract
Glutathione S-transferases (GSTs) являются метаболическими ферментами, ответственными за устранение эндогенных или экзогенных электрофильных соединений путем спряжения глутатиона (GSH). Кроме того, ГТС являются регуляторами митоген-активированных белковых киназей (MAPKs), участвующих в апоптотических путях. Переэкспрессия ГТС коррелирует со снижением терапевтической эффективности у пациентов, проходящих химиотерапию электрофилическими алкилатными агентами. Использование ингибиторов GST может быть потенциальным решением, чтобы обратить вспять эту тенденцию и увеличить потенцию лечения. Достижение этой цели требует открытия таких соединений, с точным, быстрым и легким анализом ферментов. Спектрофотометрический протокол с использованием 1-хлоро-2,4-динитробензен (CDNB) в качестве субстрата является наиболее часто используемый метод в литературе. Тем не менее, уже описанные эксперименты по ингибированию GST не обеспечивают протокол, подробно описывающий каждый этап оптимального анализа ингибирования, таких как измерение константы Михаэлиса-Ментена (Km)для CDNB или указание используемой концентрации ферментов, важнейших параметров для оценки потенции ингибирования тестируемого соединения. Таким образом, с помощью этого протокола мы описываем каждый шаг оптимизированного спектрофотометрического анализа ферментов GST для проверки библиотек потенциальных ингибиторов. Мы объясняем расчет как полу максимая ингибирующая концентрация (IC50), так и константа ингибирования (Ki)-две характеристики, используемые для измерения потенции ингибитора фермента. Описанный метод может быть реализован с использованием пула ГТС, извлеченных из клеток или чисто рекомбинантных ГТС человека, а именно GST alpha 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) или GST pi 1 (GSTP1). Однако этот протокол не может быть применен к GST theta 1 (GSTT1), так как CDNB не является субстратом для этой изоформы. Этот метод был использован для проверки потенции ингибирования куркумина с использованием ГТС из конной печени. Куркумин является молекула, экспонирование противоопухоляющих свойств и показал близость к GST изоформ после в силико стыковки прогнозы. Мы продемонстрировали, что куркумин является мощным конкурентоспособным ингибитором GST, с IC50 31,6 ± 3,6 МКМ и Ki 23,2 ± 3,2 МК. Куркумин имеет потенциал для сочетания с электрофильных химиотерапевтических препаратов для повышения его эффективности.
Introduction
Цитосольные ферменты глутатиона S-трансферазы (GSTs, EC 2.5.1.18) катализуют спряжение глутатиона (GSH) в различные электрофильные соединения, такие как химиотерапевтические агенты, для детоксикации илегкого устранения их из организма 1. Семь изоформ цитозолированных GST были определены как альфа, му, пи, сигма, омега, фета и зета. ГТС в основном выражены в печени, яичках, легких и желудочно-кишечном тракте2. GST альфа 1 (GSTA1) изоформа высоко выражена в гепатоцитах. Тело неоднородно выражает другие подтипы, в том числе GST pi 1 (GSTP1) преимущественно в головном мозге, сердце и легких, и GST mu 1 (GSTM1) в печени и яичках3. Хотя существует высокая последовательность гомологии между GST isoforms, каждый экспонатов субстрат специфики и замешан в метаболизме наркотиков и рака по-разному, в соответствии с егодифференциальным выражением 4,5.
Электрофильные соединения либо попадают в организм экзогенно, либо производятся эндогенно. Пестициды, простагландины, канцерогены и химиотерапевтические препараты являются одними из потенциальных субстратов для глутатиона спряженияреакции 6. Например, любое электронно-недостаточное реактивное соединение, образоваваемое внутри клетки, может стать электрофильной субстратом. Алкилатизирующих агентов, таких как хлорамбуцил или мелфалан устраняются как спряжения GSH катализуется GSTs, и повышенный уровень этих ферментов были коррелированы с устойчивостью к этимсоединениям 6,7.
Другой важной ролью цитозолических ГСТ является регулирование активности митоген-активированных белковых киназ (MAPK), таких как MAPK8 (также известный как c-Jun N-терминал киназы, или JNK1) и MAP3K5 (также известный как апоптоз сигнал-регулирующей киназы 1, или ASK1)8. Некоторые изоформы в их мономерной конформации будут связываться с этими белками и, таким образом, блокировать каскад фосфорилирования. При нормальных условиях изоформ GSTP1 будет секвестрировать MAPK8 (активатор белка c-Jun). Сочетание c-Jun с протеином c-Fos образует фактор транскрипции белка активатора 1 (AP-1), который отвечает за транскрибирование проапоптотических генов. В подчеркнутых клетках активируется комплекс, образованный диссоциатами GSTP1 и MAPK8, c-Jun, и гены, ведущие к апоптозу, начинаютвыражались 9. Более широкое выражение этого GST isoform может поэтому блокировать путь, что приводит к повышению жизнеспособности клеток, более клеточного пролиферации, и снижение клеточной чувствительности к химиотерапии. Аналогичные сценарии могут возникнуть с паралогами GSTP1, например, GSTM1, который взаимодействует с MAP3K510.
Роль, которую играют ГСТ в метаболизме наркотиков и в секвестре MAPKs привело к гипотезе, что большее выражение ГСТ может быть признаком механизма опухолевой устойчивости к химиотерапевтическомулечению 6,11. Например, GSTP1 переэкспрессирован в многочисленных раковых заболеваний и его присутствие было коррелировано с плохим прогнозом и увеличение заболеваемости рецидива8. Полиморфизм в этих генах также показал дифференциальное воздействие наркотиков и выживаемость пациентов, представляя различные заболевания, укрепляя идею о том, что эти ферменты имеют решающее значение для механизмов лекарственной устойчивости. Например, лица с генотипом GSTM1 null связаны с более низким клиренсом лекарств илучшей выживаемости 12,,13. Есть несколько потенциальных средств противодействия этой переэкспрессии, таких как использование аналогов GSH, prodrugs, которые активируются путем спряжения с GSTs, или прямые ингибиторы GST14,15.
Все эти методы в настоящее время находятся под следствием, и несколько соединений начали клинические испытания для их потенциального использования среди пациентов. Однако, насколько нам известно, Есть нет соединений в использовании в качестве ингибиторов GST в клинических условиях15. Действительно, отсутствие специфичности для некоторых изоформов или истощение ГСГ в нормальных клетках, что может привести к токсичности, вызванной накоплением реактивных видов кислорода (ROS) в системах органов, являются лишь некоторыми из недостатков, которые уменьшают потенциал ингибиторов GST14,15. Риск того, что эти соединения могут оказывать другие фармакодинамические эффекты на организм, также ограничивает их использование. Этакриновая кислота, например, является наиболее широко изученным ингибитором GST в лабораторных условиях, но поскольку она в основном используется в качестве сильного мочегонное средство, это свойство ограничивает его использование в сочетании с другими препаратами в клинических условиях. Куркумин является еще одним природным соединением успешно скрининг в качестве ингибитора GST. Эта молекула является полифенол эфира извлечены из куркумы лонга видов куркумы. Он показал многообещающие результаты в качестве возможного варианта лечения рака, вызывая апоптоз различных видов опухолевых клетоклиний 16,17. Соединение может регулировать различные клеточные пути, такие как тирозинкиназы18 или GST пути. Исследования с чистыми белками показали его ингибирование потенции на GSTA1, GSTM1 иGSTP1 19,20. Тем не менее, противоречивые результаты наблюдались в раковых клетках, где большая внутриклеточная активность GST измерялась, когда клетки лечилиськуркумином 21. Таким образом, важно исследовать полу максималистную ингибирующую концентрацию (IC50) и константу ингибирования (Ki) любого предположительного ингибитора GST с использованием четко описанного протокола с надлежащим контролем перед планированием дальнейших клеточных экспериментов.
Таким образом, скрининг и тестирование новых ингибиторов GST представляет значительный клинический интерес, и любое новое найденное соединение должно быть безопасным и эффективным для использования в сочетании с электрофилическими препаратами. Сосредоточение внимания на исследованиях изоформных ингибиторов может позволить ингибирование GST в опухолевых тканях, проявив специфические закономерности экспрессии GST, что позволит разработать эффективную комбинированную терапию. Поиск ингибиторов с дифференциальными режимами торможения также может быть интересен. Например, конкурентный ингибитор, который использует GSH в качестве субстрата может вызвать его истощение. Это снижение концентрации ГЛИГ в клетках было показано, чтобы вызвать окислительный стресс в нейронах, что приводит к апоптозу. Другой распространенный способ торможения – неконкурентное торможение – не может быть обращен вспять, даже если субстрат присутствует в высоких концентрациях.
Скорость энзиматической активности представлена константой Михаэлиса-Ментена (Km)и максимальной скоростью (Vmax),которая может быть определена путем построения графика Михаэлиса-Ментена, с концентрацией субстрата против скорости реакции23. Km - это концентрация субстрата, необходимого для занятия половины энзиматических активных участков, что означает, что высокий Km представляет меньшую близость. Vmax представляет максимальную скорость реакции, достигнутую, когда все активные участки заняты субстратом. Kм равен половине Vмакс. Существует три наиболее распространенных способа торможения: конкурентный, неконкурентоспособный и неконкурентоспособный. В случае конкурентного торможения ингибитор связывается с активным участком фермента и конкурирует с субстратом. Следовательно, Vmax не меняется после добавления ингибитора, но Km увеличивается, так как для противодействия ингибированию требуется больше субстрата. Неконкурентное ингибирование происходит только тогда, когда субстрат образует комплекс с ферментом. В этом случае, поскольку уровень ингибирования зависит от концентрации субстрата и фермента, Vmax и Km уменьшаются при добавлении ингибитора в реакцию. Последний способ торможения является неконкурентным и является сочетанием двух других моделей торможения. Ингибитор может связываться с активным местом фермента независимо от того, связан ли фермент с его субстратом или нет. Здесь Vмакс уменьшается после добавления ингибитора, но Km не меняется24.
Спектрофотометрический анализ, который измеряется активность GST был впервые разработан Habig и др. в 1974 году с использованием 1-хлоро-2,4-dinitrobenzene (CDNB) в качестве субстрата для реакции22. Спряжение между GSH и CDNB образует GS-DNB, который обладает максимальным поглощением света на длине волны 340 нм, записываемой с помощью спектрофотометра. Большая часть метода, приведенного ниже, получена из Habig et al., включая информацию о лучших настройках и важных точках оптимизации для ингибирующего анализа. Этот метод может быть применен к скринингу потенциальных ингибиторов GST, независимо от того, выбираются ли они путем рационального отбора лекарств с использованием вычислительных прогнозов или обзора литературы. Обсуждается также вопрос о том, как адаптировать протокол к недавно синтезированным белкам GST или конкретным изоформам. Например, тестирование ингибирующей потенции изоформ GST, экспонирующей клинически значимый полиморфизм или однонуклеотидных полиморфизмов (СНП), может быть потенциальным использованием этого протокола, ориентированного на ГТС, ориентированные на конкретных пациентов.
Этот протокол обеспечивает быстрый, осуществимый и эффективный метод скрининга потенциальных ингибиторов GST in vitro перед любыми другими функциональными исследованиями. Описаны шаги, необходимые для оценки наиболее часто измеряемых характеристик ферментативного ингибитора: ингибирующая концентрация 50 (IC50), то есть концентрация ингибитора, необходимая для снижения ферментативной активности в два раза; и константа ингибирования (Ki), которая представляет собой равновесную константу диссоциации между ингибитором и ферментом, характерную для сродства между этими двумя молекулами. Эти два значения измеряются нелинейной регрессией и с использованием уравнений, характерных для каждого способа торможения, соответственно. Мы также демонстрируем оценку этой модели ингибирования, используя участки Михаэлиса-Ментена для определения изменения Vmax и Km последобавления ингибитора 23,,25,,26.
Protocol
1. Подготовка ферментного раствора GST
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура подготовки ферментного раствора зависит от того, известны ли единицы ферментативной активности до анализа. Одним из ферментативных единиц является количество фермента, необходимого для синтеза 1 ммоль продукта в минуту. Энзиматическая активность представлена в единице/мл или ммоль/мин/мл и зависит от разбавления энзиматического раствора. Специфическая энзиматическая активность представлена в единице/мг или ммоль/мин/мг и зависит исключительно от чистоты раствора. Обе эти характеристики определены ниже. Если энзиматическая единица изолированной формы GST неизвестна, необходимо оценить ее для корректировки энзиматических концентраций для каждой реакции и обеспечения воспроизводимых результатов.
- Если энзиматическая единица GST, используемая в анализе, известна:
- Подготовьте свежий запас раствора фермента GST при 0,1 U/mL в воде, а затем приступить к шагу 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может храниться при -20 градусов по Цельсию в aliquots в течение нескольких месяцев или при -80 градусов по Цельсию в течение более длительных периодов, но замораживания / оттепели цикла следует избегать.
- Подготовьте свежий запас раствора фермента GST при 0,1 U/mL в воде, а затем приступить к шагу 2.
- Если энзиматический блок GST, используемый в анализе, неизвестен:
- Количественная оценка концентрации белка ферментного раствора с использованием анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA) или любого другого комплекта.
- Разбавить белковый раствор до конечной концентрации белка 0,02 мг/мл.
- Добавьте 20 МКЛ ферментного раствора, 20 мкл GSH 25 мМ (молекулярный вес: 307,32 г/мол) и 150 мл фосфатно-буферного солевого раствора Дулбекко (DPBS) к пластине из 96 колодец. Для пустого добавьте 20 йл воды вместо ферментного раствора.
- Добавьте 10 мл субстрата CDNB 50 mM (молекулярный вес: 202,55 г/моль) к каждой хорошо.
- На спектрофотометрическом считыватель микроплета установите параметры для чтения скважин на уровне 340 нм. Рекомендуется измерять абсорбт каждую минуту в течение 10 минут.
- Вставьте пластину в считыватель микроплатформ и начните чтение в соответствии с настройками шага 1.2.5.
- Рассчитайте изменение абсорбанса в минуту для энзиматических образцов и пробела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что реакция линейна, напланив поглощение на оси и минут на оси x. Если реакция не линейна и достигает плато, это означает, что используется весь субстрат и реакция слишком быстрая. Таким образом, уменьшить количество фермента, добавленного в колодец, разбавляя фондовый раствор на два. - Пустая коррекция показаний абсорбанса тестовых образцов.
- С помощью уравнения 1, представляющего закон Пиво-Ламберт, вычисляйте концентрацию GS-DNB, сформированную (в МК) реакцией каждую минуту.
Уравнение 1:
где C является концентрация субстрата в МКМ,340/мин является изменение абсорбации в минуту, как измеряется в шаге 1,2,7, ε является коэффициентом вымирания моляров для КОНъюгировать CDNB на 340 нм (0,0096МКМ -1 см-1), и l является длина пути света в колодец (в см). Для 96-хорошо пластины заполнены 200 йл энзиматический раствор, длина пути составляет около 0,55 см. Это значение может варьироваться в зависимости от модели пластины и должно быть проверено с производителем. - Чтобы определить количество продукта, присутствуют в одной хорошо в ммоль / мин, умножить результаты, найденные с помощью уравнения 1 по объему раствора, 2 х 10-4 л.
- Нормализация активности на количество белка, используемого путем деления результатов шага 1.2.9 на 4 x 10-4 мг. Результатом является специфическая энзиматическая активность в единице/мг или ммоль/мин/мг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если разбавление было изменено в шаге 1.2.6, из-за нелинейной реакции, отрегулируйте количество протеина соответственно. - Чтобы найти энзиматической активности, настроить результаты к концентрации белка в мг / мл путем умножения конкретной энзиматической активности, найденной в шаге 1.2.10 на 0.002 мг/мл. Это даст энзиматической активности в единицу / мл или ммоль / мин / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от энзиматической активности, эта мера не изменится в зависимости от разбавления белкового раствора. То же самое примечание как шаг 1.2.10 но для концентрации протеина. - Подготовье запасного раствора фермента GST на уровне 0,1 единицы/мл в воде, а затем приступайте к шагу 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может храниться при -20 градусов по Цельсию в aliquots в течение нескольких месяцев или при -80 градусов по Цельсию в течение более длительных периодов, но замораживания / оттепели цикла следует избегать. Контроль за энзиматической активностью рекомендуется, если эксперименты проводятся в течение длительного периода времени по мере деградации белкового раствора.
2. Измерение Константы Михаэлиса-Ментена изоформы GST для CDNB
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура объясняется для субстрата CDNB, но может быть применена к любому другому субстрату, например GSH. Каждая концентрация CDNB нуждается в своей собственной пустой, как поглощение на 340 нм будет увеличиваться в соответствии с концентрацией CDNB.
- Подготовь шесть различных концентраций CDNB, от 10 мм до 100 мМ, в этаноле 95% (v/v).
- Подготовь анализ раствора, с 10 йл CDNB, 20 МКЛ фермента GST, 20 йл GSH 25 мМ, и 150 йл DPBS. Для пустого, вместо решения CDNB, добавьте только 10 л этанола 95%.
- Подготовь пробел для каждой концентрации CDNB, с 10 йл CDNB, 20 йл воды, 20 йл GSH 25 мМ, и 150 йл DPBS.
- Запись поглощения на 340 нм каждую минуту в течение 10 минут с микроплютом читателя.
- Пустая коррекция поглощения путем вычитания результатов из пробела из правильной другой испытательной скважины. В соответствии с измеренным значениями вычислите скорость реакции с помощью Equation 2.
Уравнение 2:
где A340/min является экспериментально определяемым изменением абсорбации в минуту,V всего (общий объем) равен 0,2мл, V фермент (объем фермента) составляет 0,02 мл, а εGS-DNB является коэффициентом вымирания молира спряжения GS-DNB на 340 нм (9,6мМ -1 см-1). В 200 мкл хорошо 96-хорошо пластины, длина пути составляет 0,55 см (в зависимости от типа пластины) и коэффициент вымирания составляет 5,3 мМ-1. Скорость может быть представлена либо ммоль/мл/мин, либо мМ/мин. - Участок график Михаэлис-Ментен со скоростью (на оси) против концентрации субстрата (на х-оси).
- Определите максимальную скорость (Vmax)реакции и константу Михаэлиса-Ментена (Km)(т.е. концентрацию субстрата на половине Vmax).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используя программное обеспечение, такое как GraphPad Prism, кривая кинетики фермента может быть установлена с помощью нелинейной регрессии для расчета параметров кинетики фермента Михаэлис-Ментен, таких как Vmax и Km. - Подготовь решение CDNB на складе в 20 раз больше рассчитанного Kм в этаноле 95% (v/v).
3. Поглощение потенциального ингибитора GST
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для изучения того, является ли потенциальный ингибитор GST, используемый в реакции, производит метаболит, который увеличивает абсорбанс на измеренной длине волны. Если это произойдет, количество используемого ингибитора будет иметь влияние на результаты и конкретный пробел должен быть подготовлен для каждой концентрации.
- Разбавить ингибитор до требуемых концентраций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте три различных разбавления, предпочтительно самые низкие, средние и самые высокие концентрации, проверенные во время анализа ингибирования. Максимальная концентрация DMSO в колодец должна быть равна или менее 1% (v/v). Мы проверили влияние концентрации DMSO на анализ в нашей лаборатории, и 1% не существенно изменили активность GST. - В пластине из 96 хорошо добавьте 2 мкл потенциального ингибитора GST, 20 МКЛ GSH 25 мМ и 168 МКЛ DPBS. Используйте соответствующий контроль, без ингибитора, добавляя равные объемы растворителя, используемого для образцов ингибитора.
- Инкубировать реакцию в течение 10 минут, чтобы начать энзиматические реакции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть оптимизирован, путем тестирования различных инкубации раз, с двумя целями начала реакции, избегая при этом полного истощения субстрата. - Добавьте 10 МЛ CDNB к каждой колодец для достижения окончательной концентрации на Km, найденной в шаге 2.
- Встряхните тарелку в течение нескольких секунд.
- Запись поглощения на 340 нм каждую минуту в течение 10 минут с микроплютом читателя.
- Рассчитайте изменение абсорбанса в минуту.
- Проверить изменение абсорбтности по сравнению как с пустой реакцией, так и с отрицательной реакцией контроля без ингибитора.
- Если есть значительные изменения, используйте пустой для каждой концентрации ингибитора для того, чтобы настроить результаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот результат указывает на то, что компоненты реакции, без фермента GST, реагируют спонтанно и производят метаболит, который увеличивает поглощение на 340 нм. Чтобы исправить это дополнительное поглощение, определенный пробел должен быть измерен для каждой концентрации. - Если нет существенных изменений в абсорбции, используйте общий пробел, содержащий только растворитель, используемый для разбавления ингибитора GST, для всех концентраций.
- Если есть значительные изменения, используйте пустой для каждой концентрации ингибитора для того, чтобы настроить результаты.
4. Ингибирование анализа оценки GST и IC50
- Подготовь девять концентраций потенциального ингибитора GST.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации могут быть адаптированы в соответствии с результатами. Цель состоит в том, чтобы определить нижние и верхние плато нелинейной регрессионные кривые. Более подробную информацию об этом шаге можно посмотреть в разделе обсуждения. - Подготовь анализ раствор, разбавляя 20 МКЛ раствора GSH на 25 мМ при 148 МКЛ DPBS. Адаптировать объем в зависимости от количества скважин, используемых в анализе.
- В четкой пластине 96-колодец подготовьтесь к энзиматической реакции в окончательном объеме 190 МКЛ. Для этих шагов рекомендуется использовать многоканальный пипетку.
- Для испытательных скважин добавьте 20 МКЛ ферментного раствора, 2 МКЛ потенциального раствора ингибитора GST и 168 МКЛ раствора анализа.
- Для контроля добавьте 20 МКЛ ферментного раствора, 2 МКЛ разжителя, используемого для ингибитора GST, и 168 МКЛ раствора анализа.
- Для пустых скважин добавьте 20 МКЛ воды, 2 МКЛ потенциального ингибитора GST и 168 МКЛ раствора анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ингибитор GST поглощает длину волны 340 нм, то для каждой испытанной концентрации должен быть подготовлен определенный пробел.
- Добавьте 10 мл раствора CDNB при 20x Kм к каждой колодец, включая пустую. Для этого рекомендуется использовать многоканальный пипетку.
- Встряхните тарелку в течение нескольких секунд.
- Измерьте абсорбанс на 340 нм каждую минуту в течение 10 минут с помощью микропластиного считыватель.
- Пустая коррекция абсорбтирования путем вычитания результатов из теста хорошо пробелы.
- Нормализация результатов путем деления значений, полученных с помощью раствора ингибитора GST путем поглощения контроля в минуту без ингибитора.
- Участок нелинейных графиков регрессии логаритмической концентрации (x-оси) ингибитора против активности GST (у оси), и таким образом определить IC50.
ПРИМЕЧАНИЕ: GraphPad Prism вычисляет IC50 из нелинейных участков регрессии, предсказывая концентрацию, которая покажет 50% энзиматической активности в элементе управления. Прогноз основан на нижнем и верхнем плато, а также кривой склона, образованной сигмоидным графиком.
5. Оценка Kiи тип ингибирования
- Подготовь четыре различных концентрации CDNB: три выше и одна равна Kм ранее найденных.
- Подготовь три различных концентрации ингибитора GST, равные или ниже ранее найденных IC50.
- Выполните анализ ингибирования, описанный в шагах от 4,2 до 4,7.
- Рассчитайте скорость реакций с помощью Equation 2.
- Участок Михаэлис-Ментен графики для каждой концентрации ингибитора и вычислить Vмакс и Kм каждой реакции.
- В соответствии с изменениями vmax и Km при использовании различных концентраций, оцените режим торможения ингибитора GST.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг более подробно описан в разделах результатов и обсуждений. - Основываясь на режиме торможения, вычислить Ki.
ПРИМЕЧАНИЕ: В GraphPad Prism, различные уравнения будут использоваться для расчета Ki в соответствии с характером торможения. Используемые уравнения основаны на наблюдаемых Kм и Vмакс после добавления ингибитора и по сравнению с Kм управления и Vмакс.
Representative Results
Michaelis-Menten константа (Km) CDNB с GST из конской печени
Куркумин является безопасным природным соединением даже после приема пищи в более высокихдозах 27, которые показали противораковые свойства16. Ингибирующая потенция этой молекулы была продемонстрирована на рекомбинантных ГТСчеловека 19,20. Используя описанный протокол, мы оценили влияние куркумина на активность GST с помощью пула изгоформ GST из конной печени. По словам поставщика, специфическая активность этой смеси белков составляет 25 U/mg. Биржевой раствор 0,1 U/mL был подготовлен путем растворения лиофилизированного порошка в соответствующем количестве воды. Этакриновая кислота использовалась параллельно в качестве положительного контроля, так как это соединение является наиболее широко используемым ингибитором GST в исследованиях. Шаги в создании анализа активности GST и тестирования ингибиторов изложены на рисунке 1.
K mдолжен быть определен для каждой ферментной субстратной реакции, потому что использование концентрации субстрата, эквивалентной Km, не обеспечит никакого смещения относительно определения способа ингибирования28. Для измерения этого параметра было проверено шесть различных концентраций CDNB, от 0,5 мМ до 5 мМ, с использованием фиксированной концентрации 2,5 мГГ.
Окончательный объем реакции составил 200 йл, в пластине 96-колодец. Для каждого эксперимента использовался определенный пробел, использующий ту же концентрацию CDNB, что и тест хорошо, потому что спонтанное спряжение CDNB и GSH может произойти и может увеличить абсорбцию. Окончательная концентрация фермента 0,01 единицы/мл была использована для всех реакций, добавив 20 мкл раствора запаса в смесь анализа. Поглощение на 340 нм было записано каждую минуту в течение 10 минут. Скорость (в мМ/мин) реакции была рассчитана с помощью уравнения 2. График Михаэлиса-Ментена был построен концентрации субстрата (мМ) против скорости (МК/мин)(рисунок 2),и был рассчитан K м реакции. Эксперимент повторялся до тех пор, пока по крайней мере три набора данных не показали аналогичных результатов. K mCDNB с GST от лошадиной печени был измерен как 0.26 ± 0.08 mM. Концентрация 0,2 мМ CDNB была использована для каждого ингибирующего анализа с использованием этой партии ГТС.
Никакое спонтанное образование метаболита, который поглощается на 340 нм, не измерялось в ходе экспериментов с использованием куркумина, инкубированного в одиночку с GSH и CDNB. Один и тот же пробел использовался для каждой концентрации ингибитора в каждом эксперименте.
Ингибиторная потенция куркумина на ГТС
Ингибиторная потенция куркумина была предсказана с помощью моделирования стыковки силико с программным обеспечением (например, версия AutoDock Vina 1.1.2). 29 Прогнозировалась свободная связывающая энергия между различными изоформами GST (а именно GSTA1, GSTM1 и GSTP1) и куркумином (данные не показаны). Затем, константа ингибирования K ябыл рассчитан с помощью уравнения 3.
Уравнение 3:
где ∆G является свободной связывающей энергией, найденной с помощью силико-анализа, R является газовой константой 1,987кал-к -1Мол -1, а Т является температурой во время эксперимента, в данном случае в Кельвине (298 K).
Основываясь на свободных связывающих энергетических результатах, возвращенных AutoDock Vina, куркумин является мощным ингибитором GST человека GSTA1, GSTM1 и GSTP1, с значениями Ki 78,1 МКМ, 78,1 МКМ и 27,4 МКМ соответственно. Первые ингибирующие анализы были проведены с использованием этих вычислительных оценок Ki, и концентрации были скорректированы в соответствии с результатами, если это необходимо.
Во-первых, была оценена IC50. Эта характеристика является концентрация ингибитора, который снижает скорость реакции фермента на 50%. Поэтому он зависит от концентрации фермента30. Было подготовлено девять окончательных концентраций ингибитора, варьирующиеся от 0,39 МКМ до 100 МКМ, при этом каждая концентрация в два раза превышает предыдущую. Решение для анализа состояло из 20 МКЛ GSH 2,5 мМ, 20 МКЛ GST из конной печени в финале 0,01 U/mL, 2 МЛ раствора куркумина и 148 МКЛ PBS. Контроль состоял из того же раствора с разминантом, используемым для куркумина. Эта смесь была инкубирована в течение 15 минут, чтобы начать анализ фермента и избежать деградации куркумина в растворе анализа, так как это соединение нестабильно в буферныхрастворах 31. Затем к каждой из них было добавлено 10 МКЛ раствора CDNB на уровне 4 мМ для окончательной концентрации 0,2 мМ CDNB. Поглощение на 340 нм было записано каждую минуту в течение 10 минут, чтобы рассчитать изменения в поглощении в минуту. Для расчета IC50, каждый образец инкубируется куркумин был нормализован на контроль, чтобы дать процент активности. Эти результаты были проанализированы с помощью программного обеспечения построения путем расчета нелинейной регрессии логаритмической концентрации ингибитора по сравнению с ингибированием. IC50, найденный для куркумина на GST из конной печени, составил 31,6 ± 3,6 МКМ(рисунок 3А).
Тот же эксперимент проводился параллельно с использованием этикриновой кислоты в качестве положительного контроля, с концентрациями от 0,39 до 100 МКМ, как с куркумином. Было установлено, что IC50 составляет 6,6 ± 1,1 МКМ(рисунок 3B).
Следующим шагом была оценка режима торможения куркумина на этих трансферазах. Были протестированы четыре различные концентрации куркумина: 0, 7,5, 15 и 30 МКМ, а также четыре различных концентрации CDNB: 0,2, 0,4, 1 и 1,5 мМ. Протокол был таким же, как и в предыдущем эксперименте. Скорость каждого условия была рассчитана с помощью equation 2. Кривая была построена для каждой концентрации ингибитора, со скоростью (в МК/мин) против концентрации субстрата (мМ)(рисунок 3C). V maxи K mопределялись на основе каждого сюжета с помощью GraphPad Prism. Режим ингибирования потенциального ингибитора оценивался в зависимости от изменений в этих двух параметрах и разного состояния анализов. 24 Поскольку Vmax существенно не изменился между условиями, но Km увеличился с различными концентрациями ингибитора, ингибирование куркумина ГТС является конкурентоспособным. Эта модель ингибирования возникает, когда ингибитор конкурирует с субстратом за активное место фермента. Для измерения Ki конкурентного ингибитора, GraphPad использует уравнение 4 и уравнение 5, как описано Copeland et al.32.
Уравнение 4:
Уравнение 5:
где Km obs является наблюдаемой константой Михаэлиса-Ментена, Km являетсяIконстантой Михайлис-Ментена управления, я - концентрацией ингибитора, Ki - константой ингибирования, Y - скоростью, а X - концентрацией субстрата.
Расчеты основаны на тех же экспериментах, что и оценка способа торможения. Kя оценил для ингибирования куркумина GST из конной печени было 23,2 ± 3,2 МКМ.
Рисунок 1: Flowchart описания шагов GST enzymatic и ингибирования анализы. Подробная информация о процедуре представлена в разделе протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Михаэлис-Ментен сюжет активности фермента GST. Повышенная концентрация субстрата CDNB была использована с фиксированной концентрацией GSH (2,5 мМ) для определения активности GST из пула GST из конной печени. ЗначениеK m для CDNB было определено как 0.26 ± 0.08 mM согласно кривой графика. Каждая точка данных на участке представляет среднее из четырех различных экспериментальных запусков с SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Влияние куркумина и этикриновой кислоты на активность ферментов GST. (A-B) Добавление увеличения концентраций куркумина(A) или положительного контроля этакриновой кислоты(B),сохраняя при этом те же GST (0.01 U/mL), GSH (2.5 mM) и CDNB (0.2 mM) окончательные концентрации были использованы для расчета IC50 обоих соединений для GST из лошадиной печени с нелинейной регрессией. IC50 был определен как 31,6 ± 3,6 МКМ для куркумина и 6,6 ± 1,1 МКМ для этикриновой кислоты. (C) Михаэлис-Ментен участок различных концентраций куркумина, испытания против различных концентраций субстрата CDNB, указывающие на конкурентный режим торможения. При отсутствие ингибитора Vmax и Km были измерены как 132,7 ± 4,6 МКМ и 0,5 ± 0,08 МКМ, соответственно. С 30 МКМ куркумина, Vмакс и Kм были 130,4 ± 13,1 МКМ и 1,08 ± 0,39 МКМ. Точки данных во всех графиках (A-C) представляют собой средства трех различных экспериментальных работает с SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Мы предоставляем протокол, описывающий каждый шаг анализа спектрофотометрического фермента GST, для проверки предположительного ингибитора(рисунок 1, Таблица 1) и количественно их ингибирующей потенции. Мы также подчеркнули наиболее важные критерии для рассмотрения точных анализов ферментов, обеспечивающих воспроизводимые результаты. Основные преимущества описанного протокола по сравнению с другими колориметрическими методами или масс-спектрометрией заключается в том, что этот протокол быстр и прост в работе и обеспечивает количественные измерения активности GST, а также потенцию ингибирования экранированных молекул.
Мы представляем способ расчета двух наиболее важных параметров Михаэлиса-Ментена ингибитора фермента: IC50 и Ki. Мощный ингибитор будет оказывать наименьшее возможноЕ Ki и IC50, что указывает на то, что близость между ингибитором и ферментом высока30. Поскольку IC50 зависит от концентрации фермента иусловий анализа 33,может быть трудно использовать это значение для сравнения ингибиторов из различных экспериментов или полученных с использованием других условийанализа 34. Использование постоянной ингибирования Ki является лучшим показателем ингибирующей потенции потенциальных соединений. Ki может быть использован для сравнения двух ингибиторов с различными режимами торможения, так как он опирается исключительно на близость между ингибитором и ферментом. Однако, чтобы иметь четкое представление о характере ингибирования необходимо определить оба параметра ингибитора30. Мы измерили куркумины IC50 и Ki как 31,6 ± 3,6 МКМ и 23,2 ± 3,2 МКМ, соответственно, что указывает на то, что это соединение является мощным ингибитором GST. Эти результаты подтвердили в силико прогнозы, которые оценили значения Ki между 27,4 до 78,1 МКМ для различных человеческих GST изоформ и куркумин.
Ферментативная активность или скорость реакции и количество фермента
Как указывалось выше, IC50 зависит от концентрации фермента, и проведение эксперимента с неизвестным уровнем ферментативной активности может привести к ложным выводам33. Для контроля за другими факторами, которые могли бы снизить ингибирующую активность, следует учитывать и измерять ферментативную активность для каждой новой партии ГТС. Например, деградация энзиматической партии, вызванная слишком большим количеством циклов замораживания/оттепели, может снизить активность и, таким образом, привести к снижению IC50, даже если эксперимент проводился в тех же условиях. Другими словами, использование 0,01 единицы фермента не даст тех же результатов, что и использование 1 единицы. Использование слишком большого количеством ферментов может привести к быстрому истощению субстрата и реакция не будет иметь линейной формы. Таким образом, этот параметр может привести к нетактуатичному результату, поскольку никаких изменений в абсорбции не будет видно после длительного инкубации.
Значение Km
Для обеспечения наилучших условий для оценки типа ингибирования, выставленного ингибитором, концентрация субстрата должна быть равна или ниже константы Михаэлиса-Ментена (Km). Km представлен концентрацией субстрата, необходимого для занятия половины активных участков фермента28. Например, более высокая концентрация субстрата может противодействовать конкурентному ингибитору, и оценить этот тип торможения будет трудно в таких условиях. Таким образом, одним из важнейших шагов в этой методологии является определение фермента Kм для выбранного субстрата (здесь CDNB). В некоторых исследованиях, это значение не было определено, и это может привести к ложным выводам о модели торможения, вызванного ингибитором, и, если режим торможения является неправильным, Kя будет рассчитываться неправильно, как уравнение опирается на модель ингибирования26,28. При тестировании другой изоформ GST новая оценка значения Km является обязательной, так как это значение является уникальным для пары ферментов и лигандов. Поскольку мы использовали концентрацию CDNB немного ниже, чем Km (0,2 мМ), которую мы определили как 0,26 ± 0,08 мМ, точно определен прогнозируемый конкурентный способ ингибирования куркумина на GST.
IC50
Получение хорошей сигмоидной кривой, с которой для оценки IC50 требуется найти как нижнее, так и верхнее плато. Нижнее плато представляет собой концентрацию ингибитора, обеспечивая максимальную ингибирующую активность. В некоторых случаях, соединение не может ингибировать фермент полностью, даже при высоких концентрациях, из-за таких технических проблем, как solubility. Тем не менее, такие инструменты, как GraphPad Prism может соответствовать нижней плато довольно точно. Верхнее плато состоит из концентраций ингибитора, которых недостаточно для ингибирования фермента, и поэтому активность максима. Оба эти плато имеют решающее значение для определения IC50, а также концентрации между ними, для того, чтобы найти склон кривой, то IC50 может быть получен из формы сигмоидной кривой35. Куркумин плохо растворяется в воде, поэтому максимальная концентрация, используемая в этом анализе, ограничена, чтобы избежать осадков в растворе анализа. Таким образом, использовались менее концентрированные решения, которые не в полной мере препятствуют деятельности GST. В связи с этим были подняты вопросы определения нижнего плато. Чтобы противостоять этой проблеме, мы предсказали нижние значения, основанные на графике нелинейной регрессии, который предоставил IC50 31,6 ± 3,6 МКМ для куркумина(рисунок 3A). Для этикриновой кислоты, не было необходимости предсказывать значения для нижнего плато, как это соединение растворяется в анализе решения и IC50 был измерен на 6,6 ± 1,1 МКМ.
Этот метод может быть применен к наиболее выраженным изоформам GST у человека, а именно к GSTA1, GSTM1 или GSTP1. Однако этот протокол не подходит для количественной оценки активности изоформы GSTT1, поскольку CDNB не является подстратом для этого подтипа. 36, 37 Между тем, протокол может быть слегка изменен, чтобы противостоять этой проблеме. Например, использование 1,2-эпоксидной-3-(4'-нитрофеноксии) пропана (ENPP) в качестве субстрата для GSTT1 и измерения количества спряжения на 360nm вместо 340nm. 37 Лет
Шаги протокола могут быть адаптированы и применены для тестирования активности GST и тестирования ингибиторов в экспериментах клеточной культуры. Измерение активности GST на клетках, обработанных ингибитором GST и без него, указывает на то, можно ли использовать это соединение в таких экспериментальных условиях. Особенно интересно, когда ингибитор липофилин. Например, мы представили, что куркумин является мощным ингибитором GST с помощью этого протокола. Тем не менее, его применение к клеточным исследованиям может быть ограничено, так как молекула плохо растворяется в воде и быстро деградирует в среде. 31 Возможно еще одно смеекция этого протокола в отношении неизоформной специфичности субстрата CDNB. Использование этого протокола в клеточных исследованиях даст информацию только об общей активности GST, но не о деятельности точного подтипа GST. Добавление изоформноспецифического субстрата и/или использование специфической рекомбинантной изоформы GST позволит протестировать изоформные специфические ингибиторы GST.
В заключение мы описываем полную процедуру тестирования ингибиторов GST, которые могут быть использованы в сочетании с электрофильной химиотерапией. Мы подчеркнули важнейшие шаги анализа фермента GST и ингибирования, чтобы проверить потенциальную интересную молекулу и определить их эффективность как ингибитор с количественными значениями, IC50 и Ki. Этот метод может быть применен к любому осязаемому соединению и выполнен на наиболее выраженных человеческих GST изоформах (GSTA1, GSTM1 и GSTP1), или слегка адаптирован для выполнения исследований клеточной культуры с ингибиторами GST или измерения активности других интересных GST isoform выбора.
| Реагентов | Имя | Концентрация в решении анализа | Других |
| Субстрат | CDNB | Измеренный Km (mM) | Разбавленный в 95% этанола. Окончательная концентрация этанола должна быть ≤ 5% (v/v) |
| Спряжение субстрата | GSH | 2,5 мм | Разбавленный в воде. |
| Концентрация должна насыщать раствор. | |||
| Буфера | Pbs | - | рН 7,1 |
| Фермента | Бассейн изоформ GST или чистой изоформы | 0,01 единицы/мл, определяется экспериментально. | Разбавленный в воде. |
| Ингибитор GST | Потенциальное соединение выбора | IC50: 3 концентрации, которые максимально ингибируют, 3, которые минимально подавляют, и 3 между ними. | Разбавленный в DMSO, а затем в воде, чтобы иметь окончательную концентрацию DMSO ≤ 1% (v/v) |
| Ki: 3 концентрации вокруг IC50. | |||
| Параметры | |||
| Комнатная температура (25 градусов по Цельсию) | |||
| рН 7,1 | |||
| DMSO ≤ 1% (v/v) | |||
| Этанол ≤ 5% (v/v) | |||
Таблица 1: Резюме реагентов и параметров для рассмотрения во время анализа ингибирования GST.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта исследовательская работа была поддержана Фондом CANSEARCH. Авторы хотели бы поблагодарить г-жу Лоуренс Лесн и г-на Иоанна Сармьенто за техническую помощь, особенно в проведении экспериментов по тиражированию при стандартизации анализов с помощью ингибиторов. Плодотворные дискуссии и вклад г-на Дениса Марино, д-ра Симоны Млакар и д-ра Вид Млакара высоко признаны. Мы благодарим д-ра Патрисию Уэсо-Диаз Кертис за помощь в повествовании видео. Мы благодарим д-ра Мутукумара за его вклад в прогнозы силико. Мы также благодарим г-на Даррена Харта за помощь в чтении этой рукописи на английском языке.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) | Sigma-Aldrich | 237329 | Substrate used for the GST enzymatic assay |
| Corning UV-Transparent Microplates | Sigma-Aldrich | CLS3635 | Transparent plate to perform the enzymatic assay. When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate. |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 8511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | To prepare the stock of the putative inhibitor |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Buffer for the enzymatic reaction |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 10542382 | To dilute the CDNB |
| Glutathione S-Transferase from equine liver | Sigma-Aldrich | G6511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| L-glutathione reduced (GSH) | Sigma-Aldrich | G4251 | Co-substrate for the GST enzymatic assay |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution |
| Spectramax iD3 | Molecular devices | To do spectrophotometric measurments |
References
- Mannervik, B., Danielson, U. H. Glutathione transferases--structure and catalytic activity. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).
- Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S. Human glutathione S-transferases. The International Journal of Biochemistry. 26 (3), 295-308 (1994).
- Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera. Biochemical Journal. 325, Pt 2 481-486 (1997).
- Beckett, G. J., Hayes, J. D. Glutathione S-transferases: biomedical applications. Advances in Clinical Chemistry. 30, 281-380 (1993).
- Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective. Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).
- Townsend, D. M., Tew, K. D. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance. Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).
- Tew, K. D. Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance. Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).
- Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death. Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).
- Adler, V., et al. Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).
- Cho, S. G., et al. Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).
- Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R. Glutathione Transferases. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 45 (1), 51-88 (2005).
- Lo, H. W., Ali-Osman, F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).
- Ansari, M., et al. Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients. Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).
- Mahajan, S., Atkins, W. M. The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).
- Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7 (1), 8 (2018).
- Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).
- Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53. Clinical Immunology. 93 (2), Orlando, Fla. 152-161 (1999).
- Golonko, A., Lewandowska, H., Świsłocka, R., Jasińska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment. European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512 (2019).
- Awasthi, S., et al. Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1. Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).
- Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues. Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).
- Dubey, V., Owusu-Apenten, R. Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells. Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).
- Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
- Johnson, K. A., Goody, R. S. The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).
- Ochs, R. S. Understanding Enzyme Inhibition. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1453 (2000).
- Bisswanger, H. Enzyme assays. Perspectives in Science. 1 (1), 41-55 (2014).
- Acker, M. G., Auld, D. S. Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications. Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).
- Cheng, A. L., et al. Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).
- Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes. Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).
- Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods. Zenodo. , (2017).
- Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot. Journal of Chemical Education. 80 (2), 214 (2003).
- Wang, Y. J., et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).
- Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods of Biochemical Analysis. 46, 1 (2005).
- Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. Comparability of Mixed IC50 Data - A Statistical Analysis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).
- Brooks, H. B., et al. Basics of Enzymatic Assays for HTS. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).
- Arakawa, S., et al. Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).
- Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human. The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).
