Anvendelse af Laser Microdissection at afdække regionale Transcriptomics i Human Nyre Tissue
Summary
Vi beskriver en protokol for laser mikrodissementering af undersegmenter af den menneskelige nyre, herunder glomerulus, proksimal tubule, tykt stigende lem, opsamlingskanal og interstitium. RNA’et isoleres derefter fra de opnåede rum, og der udføres RNA-sekventering for at bestemme ændringer i transskriptionssignaturen inden for hvert undersegment.
Abstract
Genekspressionsanalyse af humant nyrevæv er et vigtigt redskab til at forstå homøostase og sygdomspatofysiologi. Det er nødvendigt at øge opløsningen og dybden af denne teknologi og udvide den til niveauet af celler i vævet. Selv om brugen af enkelt nuklear og enkelt celle RNA sekventering er blevet udbredt, udtrykket underskrifter af celler opnået fra væv dissociation ikke opretholde rumlige sammenhæng. Lasermikrobiagesektion (LMD) baseret på specifikke fluorescerende markører ville gøre det muligt at isolere specifikke strukturer og cellegrupper af interesse med kendt lokalisering, hvilket ville gøre det muligt at erhverve rumligt forankrede transskriptionssignaturer i nyrevæv. Vi har optimeret en LMD-metode, styret af en hurtig fluorescensbaseret plet, til at isolere fem forskellige rum i den menneskelige nyre og udføre efterfølgende RNA-sekventering fra værdifulde humane nyrevævsprøver. Vi præsenterer også kvalitetskontrolparametre, der gør det muligt at vurdere tilstrækkeligheden af de indsamlede prøver. Den arbejdsgang, der er skitseret i dette manuskript, viser gennemførligheden af denne tilgang til at isolere subsegmentale transskriptionssignaturer med høj tillid. Den metodologiske fremgangsmåde, der præsenteres her, kan også anvendes på andre vævstyper med substitution af relevante antistofmarkører.
Introduction
Teknologiske fremskridt i studiet af vævsprøver har forbedret forståelsen af sundhedstilstanden og sygdommen i forskellige organer. Sådanne fremskridt har understreget, at patologi kan starte i begrænsede regioner eller i specifikke celletyper, men har vigtige konsekvenser for hele organet. Derfor er det i den nuværende æra af personlig medicin vigtigt at forstå biologien på både celle- og regionalt niveau og ikke kun globalt1. Dette gælder især i nyrerne, som består af forskellige specialiserede celler og strukturer, der differentieret indleder og / eller reagerer på patologisk stress. Patogenese af forskellige typer af menneskelig nyresygdom er stadig ikke godt forstået. Generering af en metode til undersøgelse af ændringer i genekspression i specifikke rørformede segmenter, strukturer eller områder af interstitium i den menneskelige nyre vil forbedre evnen til at afdække regionen specifikke ændringer, der kan informere om sygdomspatogenese.
Human nyre biopsi prøver er en begrænset og kostbar ressource. Derfor bør teknologier, der afhører transcriptomics i nyrevæv, optimeres til at spare væv. De tilgængelige metoder til at studere transcriptomics på celle- og regionalt plan omfatter enkeltcellet RNA-sekventering (scRNaseq), enkelt nuklear RNaseq (snRNaseq), in situ rumlig hybridisering og lasermikrodissement (LMD). Sidstnævnte er velegnet til præcis isolering af regioner eller strukturer af interesse inden for vævssektioner , til downstream-RNA-sekventering og analyse2,3,4,5. LMD kan anvendes til at basere sig på identifikation af specifikke celletyper eller strukturer baseret på validerede markører ved hjælp af fluorescensbaseret billeddannelse under dissektion.
De unikke træk ved lasermikrodissection assisteret regional transskription omfatter: 1) bevarelse af den rumlige kontekst af celler og strukturer, som supplerer enkeltcelleteknologier, hvor celler identificeres ved udtryk snarere end histologisk; 2) teknologien informerer og informeres af andre billeddannelsesteknologier, fordi en antistofmarkør definerer udtrykssignaturer 3) evnen til at identificere strukturer, selv når markører ændrer sig i sygdom; 4) påvisning af lavt udtrykte udskrifter i ca. 20.000 gener; og 5) bemærkelsesværdig vævsøkonomi. Teknologien er skalerbar for en nyrebiopsi med mindre end 100 μm tykkelse af en kerne, der er nødvendig for tilstrækkelig RNA-erhvervelse og muliggør brug af arkiveret frosset væv, som er almindeligt tilgængelige i store depoter eller akademiske centre6.
I det efterfølgende arbejde beskriver vi den regionale og bulk transcriptomics teknologi i detaljer, optimeret med en ny hurtig fluorescens farvning protokol til brug med humant nyrevæv. Denne tilgang forbedrer klassiske LMD-udforskninger, fordi den giver separate udtryksdata for interstitium- og nephron-undersegmenterne i modsætning til det samlede tubulointerstitial-udtryk. Herunder hører de kvalitetssikrings- og kontrolforanstaltninger, der er gennemført for at sikre stringens og reproducerbarhed. Protokollen muliggør visualisering af celler og interesseregioner, hvilket resulterer i tilfredsstillende erhvervelse af RNA fra disse isolerede områder for at muliggøre downstream RNA-sekventering.
Protocol
Representative Results
Discussion
LMD-baserede transskriptionsprodukter er en nyttig teknologi, der forankrer genekspression til specifikke områder i vævet. Grundlaget for denne teknologi og dens potentielle anvendelse i nyrerne er blevet beskrevet tidligere8. Optimering, modernisering og strømlining af fluorescensbaseret dissektion, der specifikt er rettet mod høj nøjagtighedsdissektion for downstream-RNA-sekventering, er imidlertid mindre allestedsnærværende. Fordi denne metode er rumligt funderet i vævet, det har potent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Generelt: Forfatterne vil gerne takke efterforskerne af Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) for deres elskværdige støtte og rådgivning.
Finansiering: Støtten til dette arbejde blev ydet af NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Forskning rapporteret i dette manuskript blev støttet af National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), under prisnummer U2CDK114886.
Data- og materialetilgængelighed: Data arkiveres i Gene Expression Omnibus (GEO # verserende)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett’s esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- . Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016)
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
