Summary
Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.
Abstract
İnsan böbrek dokusunun gen ekspresyon analizi homeostaz ve hastalık patofizyolojisini anlamak için önemli bir araçtır. Bu teknolojinin çözünürlüğünün ve derinliğinin arttırılması ve doku içindeki hücre seviyesine kadar genişletilmesi gerekir. Tek nükleer ve tek hücreli RNA diziliminin kullanımı yaygınlaşmış olsa da doku ayrışmasından elde edilen hücrelerin ifade imzaları mekansal bağlamı korumamaktadır. Belirli floresan belirteçlere dayanan lazer mikrodiseksiyon (LMD), bilinen lokalizasyon ile belirli yapıların ve hücre gruplarının izolasyonuna izin verecek ve böylece böbrek dokusunda mekansal bağlantılı transkriptomik imzaların elde edilmesini sağlayacaktır. hızlı floresan bazlı bir leke tarafından yönlendirilen bir LMD metodolojisini, insan böbreği içindeki beş ayrı bölmeyi izole etmek ve değerli insan böbrek dokusu örneklerinden sonraki RNA dizilimini yapmak için optimize ettik. Ayrıca, toplanan numunelerin yeterliliğinin değerlendirilmesini sağlamak için kalite kontrol parametreleri sunuyoruz. Bu yazıda özetlenen iş akışı, alt segmental transkriptomik imzaları yüksek güvenle izole etmek için bu yaklaşımın fizibilitesini göstermektedir. Burada sunulan metodolojik yaklaşım, ilgili antikor belirteçlerinin ikame edilmesi ile diğer doku tiplerine de uygulanabilir.
Introduction
Doku örneklerinin incelenmesindeki teknolojik gelişmeler, çeşitli organlardaki sağlık ve hastalık durumunun anlaşılmasını geliştirlemiştir. Bu tür gelişmeler, patolojinin sınırlı bölgelerde veya belirli hücre tiplerinde başlayabileceğinin altını çizmiştir, ancak tüm organ üzerinde önemli etkileri vardır. Bu nedenle, kişiselleştirilmiş tıbbın mevcut çağında, biyolojiyi sadece küresel olarak değil, hem hücre hem de bölgesel düzeyde anlamak önemlidir1. Bu, özellikle patolojik stresi farklı olarak başlatan ve / veya yanıt veren çeşitli özel hücre ve yapılardan oluşan böbrekte geçerlidir. Çeşitli insan böbrek hastalığı türlerinin patogenezi hala iyi anlaşılamamıştır. İnsan böbreğindeki interstiyumun belirli tübüler segmentlerinde, yapılarında veya alanlarında gen ifadesindeki değişiklikleri incelemek için bir metodoloji oluşturmak, hastalığın patogenezini bilgilendirebilecek bölgeye özgü değişiklikleri ortaya çıkarma yeteneğini artıracaktır.
İnsan böbrek biyopsisi örnekleri sınırlı ve değerli bir kaynaktır. Bu nedenle, böbrek dokusundaki transkriptomiyi sorgulayan teknolojiler dokuyu ekononize etmek için optimize edilmelidir. Hücre ve bölgesel düzeyde transkriptomikleri incelemek için mevcut yöntemler arasında tek hücreli RNA dizilimi (scRNaseq), tek nükleer RNaseq (snRNaseq), in situ mekansal hibridizasyon ve lazer mikrodiseksiyon (LMD) sayilebilir. İkincisi, aşağı akış RNA dizilimi ve analizi 2 ,3,4,5için doku bölümlerindeki bölgelerin veya ilgi çekici yapıların hassas izolasyonu için çok uygundur. LMD, diseksiyon sırasında floresan bazlı görüntüleme kullanılarak doğrulanmış belirteçlere dayalı belirli hücre tiplerinin veya yapılarının tanımlanmasına dayanarak benimsenebilir.
Lazer mikroseksiyon destekli bölgesel transkriptominin benzersiz özellikleri şunlardır: 1) hücrelerin histolojik olarak değil ifade ile tanımlandığı tek hücre teknolojilerini tamamlayan hücre ve yapıların mekansal bağlamının korunması; 2) bir antikor işaretçisi ifade imzalarını tanımladığı için teknoloji diğer görüntüleme teknolojilerini bilgilendirir ve bilgilendirir; 3) hastalıkta belirteçler değiştiğinde bile yapıları tanımlama yeteneği; 4) yaklaşık 20.000 gende düşük eksprese transkriptlerin tespiti; ve 5) olağanüstü doku ekonomisi. Teknoloji, yeterli RNA alımı için gerekli olan bir çekirdeğin 100 μm kalınlığından daha az olan bir böbrek biyopsisi için ölçeklenebilir ve büyük depolarda veya akademik merkezlerde yaygın olarak bulunan arşivlenmiş donmuş dokunun kullanılmasını sağlar6.
Devam eden çalışmada, insan böbrek dokusu ile kullanılmak üzere yeni bir hızlı floresan boyama protokolü ile optimize edilmiş bölgesel ve toplu transkriptomik teknolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu yaklaşım klasik LMD keşifleri üzerinde geliştirir, çünkü toplama tubulointerstitial ifadenin aksine interstiyum ve nefron alt segmentleri için ayrı ifade verileri sağlar. Titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlamak için uygulanan kalite güvence ve kontrol önlemleri dahildir. Protokol, hücrelerin ve ilgi alanlarının görselleştirilmesini sağlar ve bu da aşağı akış RNA dizilimine izin vermek için bu yalıtılmış alanlardan RNA'nın tatmin edici bir şekilde alınmasına neden olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma Indiana Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından kullanılmak üzere onaylandı.
NOT: Bu protokolü, Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiminde korunmuş ve -80 °C'de depolanan böbrek nefrektomi dokusuyla (hem X hem de Y boyutlarında 2 cm'ye kadar) kullanın. Tüm çalışmaları RNA kontaminasyonini sınırlayan bir şekilde gerçekleştirin, temiz tek kullanımlık eldivenler ve yüz maskesi kullanın. Tüm yüzeylerin temizliğini sağlayın. Bu protokolün optimize edildiği ekipman, darbeli UV lazer içeren bir lazer mikrodiseksiyon sistemidir.
1. Kriyoseksiyon
- Kriyoseksiyondan hemen önce 30 dakika boyunca 1,2 μm LMD PPS-membran (poli (p-fenilen sülfit) slaytlarını UV ışığına (doku kültürü laminer akış davlumbazında) maruz bırakın. Optimum doku yapışağı için slaytları oda sıcaklığında saklayın.
- Kriyostatı -20 °C'ye soğutun. Çalışma yüzeylerini temizleyin ve yeni bir kesme bıçağı takın.
- Slaytları taze kesilmiş dokuyla saklamak için kriyostat odasının içine küçük bir slayt kutusu (RNase yüzey dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenir) yerleştirin.
- OCT'deki numuneyi bir doku tutucuya yapıştırın ve oda sıcaklığına ulaşmak ve OCT bloğu ile tutucu arasındaki yapışma kuvvetini güçlendirmek için birkaç dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Bir ısı çıkarıcı kullanarak işleme yardımcı olmak.
- Numuneyi 12 μm kalınlıkta kesin ve slayt adaptörünü kullanarak özel LMD slaydına yapıştırın. Her slaytta slayt başına bir nefrektomi bölümü veya slayt başına en fazla iki böbrek biyopsisi bölümü vardır. Slayt kutusunun içinde fazla nemin birikmesini önlemek için slaytları -80 °C'de kurutucu bir kartuşla ve sıkıca kapalı bir plastik torbanın içinde saklayın.
- Her slaydı örnek kimliği, tarih ve slayt numarasıyla etiketleyin.
- İlk kriyoseksiyon tarihinden itibaren 10 gün içinde örnekleri içeren slaytları kullanın.
2. Lazer mikro disseksiyon
- Boyamadan hemen önce, antikor karışımını (Ab-Mix) RNase içermeyen PBS'de% 10 BSA'da aşağıdakileri ekleyerek hazırlayın: 4 μL FITC-Phalloidin, 1,5 μL DAPI, 2 μL Tamm-Horsfall Protein (THP) antikor doğrudan Alexa Fluor 546, 3,3 μL RNase Inhibitörü ve PBS'de % 10 BSA'nın 89,2 μL'si (100 μL hacme ulaşmak için).
NOT: THP antikorunun yerine alternatif antikorlar kullanılabilir. Örneğin, doğrudan Alexa Fluor 568'e konjuge edilen 2 μL megalin/LRP2 antikoru proksimal tübül etiketlemek için kullanılabilir. Ab-Mix LRP2 veya THP antikoru içerir (sırasıyla proksimal tübülleri veya kalın yükselen uzuvları görselleştirmek için). Diğer antikorlar kullanıcı ihtiyaçlarına göre doğrulanabilir. - Kaydırağı buz gibi (-20 °C) %100 asetonda 1 dakika yıkayın ve nem odasına taşıyın.
- Slastanın üst kısmını RNase içermeyen PBS ile 30 sn boyunca yıkayın.
- Slaydın üst kısmını RNase içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 sn boyunca yıkayın.
- Ab-Mix'i 5 dakika uygulayın.
- Slaydın üst kısmını RNase içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 sn boyunca yıkayın.
- Kaydırağı 5 dakika boyunca havayla kurulayın ve lazer mikroseksiyon kesme platformuna yükleyin.
- RNA izolasyon kitinden 50 μL Ekstraksiyon Tamponu içeren PCR çalışması için uygun toplama tüplerini (otomatik olarak kapatılmış 0,5 mL mikrosantrifüj tüpler) takın.
- LMD ile devam edin. Her LMD oturumunu en fazla 2 saat içinde tamamlayın.
- Operatörler arası değişkenliğin yanı sıra arşivleme amaçları, gerçekleştirilen protokolün eğitimi ve kalite değerlendirmesi için diseksiyonu doğrulamak için mikroskop kamerayı kullanarak LMD öncesi ve sonrası immünofluoresans görüntülerini toplayın. 0,5 – 1 ng RNA elde etmek için en az 500.000 μm2 alan gereklidir. Bu genellikle tüm alt ilgi segmentleri için yeterli miktarda malzeme elde etmek için 8 x12 μm kalınlıkta bölümlerin kullanılmasını gerektirir.
- Boyama, morfoloji ve konum olarak ilgi çekici bölgeleri belirleyin ve 40'tan büyük lazer gücü kullanarak bunları çıkarın.
NOT: İşte diseksiyon kriterleri. Proksimal tübül FITC-Phalloidin ve LRP2 etiketlemesi ile tanımlanır. Kalın yükselen uzuv THP etiketleme ile tanımlanır. Toplama kanalı nükleer morfoloji (DAPI) ve diğer lekelerin olmaması ile tanımlanır. Glomerulus FITC-Phalloidin ve morfoloji ile tanımlanır. Intersitium lekeli tübüller arasındaki alan olarak tanımlanır.
- LMD slaydına iki adet 12 μm bölüm yapıştırarak ve tüm bölümleri ayıklama arabelleğine keserek toplu kesitsel ifade imzası elde edin.
- LMD işlemi tamamlandıktan sonra, toplama mikrosantrifüj tüplerini kapatın ve içeriğin kapaktan tüpün altına taşındığından emin olmak için kuvvetlice kaydırın
- Tüpleri 30 s için 3.000 x g'da santrifüj edin.
- Tüpleri 42 °C su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Tüpleri 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj edin.
- Süpernatant'ı yeni bir 0,5 mL tüpe aktarın ve -80 °C'de saklayın.
3. RNA izolasyonu
NOT: Bu RNA yalıtım protokolü için, ticari bir RNA yalıtım kitinden bir protokol uyarladık. Üreticinin protokolü, proje için belirlenen kalite kontrol gereksinimlerini karşılayacak şekilde değiştirilmiştir.
- Her RNA arıtma sütununa (PC) 250 μL Şartlandırılmış Tampon (CB) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Tüm bilgisayarları 16.000 x g'da 1 dakika boyunca santrifüj edin.
- Doku örnekleri ile tüplere %70 etanol (Kit'te bulunur) 50 μL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak numuneleri iyice karıştırın. Girdap yapmayın. Santrifüj yapmayın.
- Karışımı 100 x g'da 2 dakika boyunca şartlandırılmış pc'lere ve santrifüje aktarın (RNA'yı bağlamak için), 16.000 x g'da 30 s santrifüjleme ile hızla takip edin (akışı kaldırmak için). Herhangi bir alt segment için doku örnekleri içeren 1'den fazla tüp varsa bu adımı tekrarlayın.
- Pc'lere 100 μL Yıkama Tamponu 1 (WB1) ekleyin ve 8.000 x g'da1 dakika santrifüj ekleyin.
- Her numune başına 40 μL DNase hazırlayın (35 μL RDD arabelleğe 5 μL DNase ekleyin). Daha sonra doğrudan PC'nin zarı üzerine 40 μL karışım ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- PC'nin zarına 40 μL WB1 ekleyin ve 8.000 x g'da15 s için santrifüj ekleyin.
- PC'nin zarına 100 μL Yıkama Tamponu 2 (WB2) ekleyin ve 8.000 x g'da1 dakika santrifüj ekleyin.
- PC'nin zarına 100 μL WB2 ekleyin, 16.000 x g'da2 dakika santrifüj , hemen ardından 16.000 x g'da1 dakika santrifüjleme.
- Bilgisayarı yeni bir 0,5 mL tüpe aktarın.
- Membrana 12 μL Elution Buffer (EB) ekleyin ve oda sıcaklığında 7 dakika kuluçkaya yatırın. Böylece, havuza alınan tüm diseksiyonlu doku örneklerinin son hacmi alt segment başına 12 μL'dir.
- Numuneleri 1.000 x g'da 1 dakika ve ardından 16.000 x g'da 2 dakika santrifüj.
- Biyoanalyzer analizi için 2 μL'yi taze bir tüpe aktarın (donma-çözülme olaylarını önlemek için).
- Tüm tüpleri daha fazla işleme hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
4. RNA dizilimi
- Ticari bir Biyoanalyzer ve küçük miktarlarda RNA ölçmeye adanmış bir çip kullanarak kalite için sıralamaya yönelik her numuneyi değerlendirin.
- Kütüphane hazırlığı ve dizilemesi öncesinde aşağıdaki kalite kontrol (QC) parametreleri gereklidir: Toplu olarak 4 ng'den ve her alt segment için 0,5 – 1 ng'den büyük RNA miktarı; 200 nükleotitten (DV200) uzun transkriptlerin yüzdesinin LMD örnekleri için %25'ten büyük olması gerekir (optimal > %75).
- Küçük miktarlarda bozulmuş RNA için tasarlanmış ticari bir cDNA kütüphane hazırlama kiti ile kütüphane hazırlığı gerçekleştirin. Ekte listelenen ticari kit için, minimum DV200% 25 ve parçalanma gerektirmeyen Seçenek 2'yi kullanmanızı öneririz. Bazı sıralama teknolojileri% 307gibi daha yüksek minimum DV200 eşikleri gerektirebilir.
- cDNA bağdaştırıcıları ve dizinleri ekleyin.
- Manyetik boncuk teknolojisini kullanarak RNAseq kitaplıklarını arındırın.
- RNAseq kitaplık amplifikasyon adımından önce ticari bir rRNA kaldırma kiti kullanarak ribozomal cDNA'yı tükenmesi.
- 2 ng/μL cDNA kütüphane konsantrasyonundaki manyetik boncuk teknolojisini kullanarak son RNAseq kütüphanesini arındırın.
- Toplu olarak 30 milyon okuma/örnek ve alt segmental bölümler için 100 milyon okuma/örnek ile ticari bir sıralama sisteminde 75 bp eşleştirilmiş uç RNA dizilimini gerçekleştirin.
- Toplu iş efektinin kontrolüne izin vermek için her sıralama çalıştırmasıyla bir Referans RNA (25 μg) kullanın. Referans RNA'mızın ilk konsantrasyonu 1 μg/μL iken, sıralamada kullanılan son konsantrasyon 25 ng/μL'dir.
- Sıralama, interjenik ve mitokondriyal okumaların kalitesini değerlendirmek ve bir gene atfedilen okumaları belirlemek için FastQC uygulamasını kullanarak veri analizi yapın.
- Hizalama için Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici (IGV) ve transkript ifade ölçümleri için edgeR/rbamtools kullanın.
- 100.000'den az okuma ile örnekleri kaldırın. Quantile, kullanıcı tanımlı bir eşikte düşük ifade edilen genleri filtreledikten sonra veri kümesindeki ham okumaları normalleştirir.
- İfadeyi, ilgili alt segmentin diğer tüm alt segmentlerin ortalamasına bir oranı olarak ölçün ve log2 dönüşümü yapın. Aynı genin bağıl ekspresy edilmesi alt segmentler ve örnekler arasında karşılaştırılabilir; bununla birlikte, genler ve RNA türleri arasındaki potansiyel bozulma farklılıkları nedeniyle iki farklı gen arasındaki bağıl ifadeyi karşılaştırmak ideal değildir.
- Referans RNA örnekleri partiler arasında karşılaştırılırken, her nefron alt segmentine özgü bir dizi üretici için gen ekspresyonını karşılaştırmak için bir zenginleştirme analizi gerçekleştirin. R değeri > 0.9 olan ortalama ifadenin 1 standart sapması içindeki bir toplu iş efekti kabul edilebilir olarak kabul edilir. Daha yüksek bir toplu iş efekti puanı için ek normalleştirme gereklidir. Kabul edilen toplu iş efektinden sapan herhangi bir çalıştırma işaretlenebilir. Q30, her sıralama çalıştırması için >%90'dan büyük olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Örnekleri
Böbrek nefron segmentlerini ve interstisyel alanları izole etmek için hızlı floresan boyama protokolünü kullanarak dokuz referans nefrektomiden (Indiana Üniversitesi'nde elde edilen 3 örnek ve Böbrek Hassas Tıp Projesi ile elde edilen 6 örnek) verileri sunuyoruz. Bu süreçte kullanılan bölümler vefat eden böbrek donörlerinden veya etkilenmemiş tümör neforektomilerinden elde edildi. Bu örneklerde bitişik bölümlerden alınan H&E lekesinde görselleştirildiği gibi patolojik hastalık bulgusu yoktu(Şekil 1A).
Lazer Mikroseksiyon Kalite Kontrolü
Böbrekteki tübüler alt segmentlerin tanımlanması, benzersiz tübüler belirteçlerin antikor boyanmalarının yanı sıra morfoloji ve yapısal yer işaretleri ile gerçekleştirilir. Şekil 1B-C, tübüler alt segmentlerin temsili bir nefrektomiden boyanması ve mikro diseksiyonu göstermektedir. Bu, DAPI (çekirdek), FITC-Phalloidin (F-actin) ve gerektiğinde ek bir antikor ile lekelenerek gerçekleştirilir. Kullanılan floresan boyama, renal alt segmentlerin yüksek derecede güvenle görselleştirilmesini mümkün kıldı, morfolojik özelliklerin yanı sıra görüntülenen yapıların mekansal konumlandırılması ile daha da yönlendirildi (Şekil 2). Örneğin, glomeruli çok ayırt edici morfoloji ile phalloidin ve DAPI lekeleme ile ortaya çıkarılır. Benzer şekilde, toplama kanalları nükleer morfoloji ve diğer lekelerin yokluğu kullanılarak görselleştirilir. Megalin/LRP2 antikoru (doğrudan Alexa Fluor 568'e konjuge edilir) burada proksimal tübülleri tanımlamak için kullanılır. Kalın yükselen uzuv, Tamm-Horsfall protein (THP) antikor (doğrudan Alexa Fluor 546'ya eşleştirilmiş) kullanılarak görselleştirilir. Buna karşılık, intersityum tübüllerin dış zarı boyunca eksilir ve stromal ve bağışıklık hücrelerinin yanı sıra küçük kılcal damarları içerir.
Alt segment başına 0,5 – 1 ng yeterli RNA elde etmek için, minimum 500.000 μm2alanı parçalamaya çalışıyoruz. Bu genellikle tüm alt segmentler için yeterli malzeme elde etmek için beş ila sekiz 12 μm kalınlığında bölüm (slayt başına 1 bölüm) gerektirir. Herhangi bir slaydın diseksiyonu, slayt başına ~4 segment kesmeye izin veren RNA kalitesini korumak için 2 saatten daha kısa bir sürede tamamlanır. Aynı alt segmentten alınan doku, aşağı akış dizilimi için birden fazla slayttan birikmiş. LMD öncesi ve sonrası immünoresans görüntüsü, bağlı bir kamera kullanılarak ilgi çekici alt segmentlerin toplanmasını doğrulamak için elde edilir. Şekil 3 diseksiyon alanının başarı oranlarını ve minimum RNA girişini tanımlamaz. Bu temsili veri kümesinde en düşük alan girişini karşılama başarı oranı >90% idi. Kaynak dokuda az miktarda CD veya intersitium varsa, diseksiyon alanının 8 slayt kullandıktan sonra bu segmentler için 500.000μm 2'nin altında olma olasılığı vardır. Kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak ek slaytlar kesilebilir; bununla birlikte, Şekil 3'tegörüldüğü gibi , alan 500.000 μm2'yeyakınsa, tespit edilen istenen gen sayısı yüksek bir başarı oranına sahiptir (%100) ve toplam okuma sayısı başarı oranı% 98.6'dır (1 örnek QC ölçümünün altına düştü). Böylece, ek doku kullanmadan yeterli gen ve okuma sayısına ulaşmak için yeterli doku vardı.
Giriş Kalite Kontrolünü Sıralama
Seçilen ticari kütüphane hazırlama ve sıralama platformu, düşük miktarlarda yüksek oranda bozulmuş RNA ile bile transkript ifadesinin tekrarlanabilir ölçümlerine izin verir. Minimum RNA girişi 500 pg ve minimum DV200 (uzunluğu 200 nükleotitten uzun okuma oranı) % 25'in üzerindedir. Minimum RIN yoktur. Örnek başına 100 milyon okuma ile sıralama, düşük ifade edilen transkriptleri tespit etmek için mevcut okumaları doyurmaya çalışıyoruz. Toplam okuma, kullanıcının ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir.
İki 12 μm dökme kesit bölümünden yeterli RNA elde etmek kolaydır, bu nedenle toplu sıralama için 4 ng'lik daha yüksek bir minimum toplam mRNA miktarı elde etmeye çalışıyoruz. Protokolde belirtildiği gibi, her alt segment toplam RNA'da 0,5-1 ng gerektirir. İzolasyondan sonra optimum RNA konsantrasyonu 50 pg/μL'nin üzerindedir. Bundan daha düşük RNA miktarları gen tespit ve okuma sayılarının azalmasına neden olabilir. Örneklerin çoğunluğu tespit edilen 20.000 gen ve >1 milyon okuma verir. Tüm numuneler için %25'ten büyük bir DV200 üretici tarafından gereklidir (>%75 en uygun olarak kabul edilir). RIN ölçülse de lazer mikrodiseksiyon süreci RIN'i azaltır ve RNA dizileme platformları parçalanmış RNA için optimize edilmiştir. RNA miktarı ve kalitesi, sıralamadan önce bir biyoanalyzer tarafından değerlendirilir. Hızlı leke, dokunun oda sıcaklığına ve sulu koşullara maruz kalma süresini azaltır, böylece mümkün olduğu ölçüde RNA'nın bozulmasını en aza indirir. Sıralama girişi için DV200 kalite kontrol ölçümü şekil 3'te de bulunur.
Çıktı Kalite Kontrolünü Sıralama
Aşağı akış veri işleme, farklı toplu işlerdeki örnekler arasında karşılaştırmaya izin vermek için nicel normalleştirme kullanır. Minimum gen algılama sayısı 10.000 ve en az 1 milyon okuma sayısı, örnekleri nicel normalleştirmeye dahil etmek için eşik olarak kullanılır. Daha düşük gen algılama veya okuma sayısına sahip numuneler nicel normalleştirme ve sonraki karşılaştırmalı analizlerin dışında tutulur. 98 parçalanmış alt segmental numuneden sadece 1'i bu eşikleri karşılayamadı (Şekil 3). Q30 (%99,9 güvenle eşlenen okumaların oranı) her sıralama deneyi için %93'ten fazla olmuştur (Şekil 4).
Bu düzeltme isteniyorsa veya gerekliyse toplu iş efekti için düzeltmeye izin vermek için her sıralama çalıştırmasında bir insan referans RNA'sını (25 ng) sıralıyoruz. Ölçülen toplu iş efekti, R değeri > 0,9 olan ortalama ifadenin 1 standart sapması içinde olmalıdır. Toplu iş efekti daha yüksekse, bu sıralama çalıştırması için ek normalleştirme gerekir. Burada, Şekil 4'tegösterilen dört sıralama deneyinde parti etkisi% 3'ün altında olmuştur. Bu nedenle, toplu iş efekti genellikle başvuru RNA'sına göre agnostik olan tüm sıralama çalıştırmaları için nicel normalleştirme ile ele alınmaktadır. Referans RNA'sına dayalı bir düzeltme henüz uygulanmadı, ancak bu bilgiler kullanılabilir ve belirli bir analizin hedeflerine bağlı olarak kullanılabilir.
Titizlik ve Tekrarlanabilirlik
Hücre tiplerini ve yapılarını belirlemede titizlik göstermek önemlidir. Lazer mikrodiseksiyondan sonra, diğer bölmelere kıyasla glomeruli, PT, TAL, CD ve interstiyumda bilinen belirteçlerin zenginleştirilmesini test ediyoruz (Tablo 1). Önceden belirlenmiş beklenen belirteçler için gen ekspresyonlarını karşılaştırmak için bir zenginleştirme analizi kullanılır. Gen ekspresyosu, diğer alt segmentlerin ortalamasına göre ilgi alt segmentinin ekspresyonununkütüğü 2 oranları olarak iletilir. Bu ifade ölçümü, numuneler arasında hücre ve bölme tipleri arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırarak, bireyler arası değişkenliği azalttığı için insan örnekleri için seçilmiştir. Bununla birlikte, ham okumalar ve nicel normalleştirilmiş okumalar alternatif analizlerde de karşılaştırılabilir. Figure 5, İnsan Protein Atlası'nda gösterildiği gibi, seçilen bu 5 bilinen belirtecin immünohistokimyasal lekeleme örneklerini göstermektedir.
Bu nedenle, toplanan doğru alt segmente güven veren ortogonal veri kaynakları sunuyoruz: 1) segmentin/bölmenin antikor lekesini ve morfolojisini içeren görüntüleme ve 2) bilinen belirteçleri gösteren ifade çıktısı ilgili alt segmentte ifade edilir.
Her alt segmentte ifade edilen genlerin bölgesel transkriptomik analizi, yeni ve az takdir edilen belirteç tanımlamasına olanak tanır. Şekil 6, LMD bölgesel transkriptomikleri aracılığıyla tanımlanan ve ilgili nefron alt segmentinin spesifik bir immünohistokimyasal lekelenerek tanımlanan her alt segment için bir işaretleyici örneği göstermektedir.
Tekrarlanabilirliği göstermek ve operatör değişkenliğinin etkisini anlamak için tümör nefrektomi örneği üzerinde bir deney yaptık. Bu örnek, RNA dizileme sonuçlarının güvenini artırmak için glomeruli, PT ve TAL'ı yeniden parçaladı ve şimdi yararlı bir teknik çoğaltma görevi görür. Aylar arayla, bu örnek kriyoseksiyon, antikor boyama, LMD diseksiyonu, RNA ekstraksiyonu, kütüphane hazırlığı ve glomeruli, PT ve TAL bölmelerinin RNA diziliminin (Şekil 7) ikinci bir örneğinden geçti. İki sürüm (v1 ve v2) karşılaştırıldı. Glomerüler, PT ve TAL bölmeleri, referans RNA'mızın minimum parti etkisine benzer şekilde r2 değerleri >0.95 ile yüksek oranda ilişkiliydi.
Şekil 1: Renal dokunun temsili görüntüleri.
(A) İnsan referans böbrek dokusunun H&E lekesi. (B) LMD'den önce lekeli kalın yükselen uzuv segmentlerine sahip insan referans böbrek dokusunun immünoresan görüntüsü ve (C) tek kalın yükselen uzuv yapısının diseksiyonunun hemen ardından. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Belirli bir immünoresan boyama yaklaşımı kullanılarak 20x'te görselleştirilen referans renal alt segmentlerin temsili görüntüleri.
(A) a Glomerulus, (B) Proksimal Tübül, (C) Kalın yükselen uzuv, (D) Toplama kanalı, (E) Interstiyum. (*= p < 0.05, **= p < 0.01, ***= p < 0.001 ANOVA tarafından). Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Segmental transkriptomide kalite kontrol ölçümleri.
(A) Pilot örneklerin % 90'ından fazlası 500.000 μm2diseksiyon alanı giriş eşiğini karşıladı. (B) Biri hariç tüm numuneler en az 500 pg istenen RNA girişini karşıladı. (C) Pilot örneklerin% 100'ü üreticinin minimum DV200 eşiğini karşıladı% 25 ve (D) örneklerin% 100'ü tespit edilen minimum 10.000 gen eşiğimizi karşıladı. (E) Biri hariç tüm numuneler minimum toplam okuma sayısı 1 milyona ulaştı. Beklendiği gibi, daha düşük diseksiyon alanları azaltılmış RNA konsantrasyonları, daha düşük gen sayıları ve daha düşük okuma sayıları ile ilişkilidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sıralama Kalite Kontrolü.
(A) Bir başvuru RNA'sını kullanan sıralama çalıştırmaları (normalleştirilmiş nicel değil) tüm çalıştırmaların ortalama ifadesiyle karşılaştırılır. Minimum toplu iş etkisiyle güçlü bir korelasyon vardır (tüm R >0.969). (B) Tüm çalıştırmalardaki okumalarımızın% 93'ünden fazlası yüksek güvenle (Q30 veya% 99.9) eşleştirildi. Q30 değerlerinin, koşu başına birden fazla şeritle şerit bazında sağlandığını unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Seçilen bilinen belirteçleri tanımlamak için immünohistokimyasal lekeleme örnekleri.
Görüntüler (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2 için tasvir edilir. İmmünohistokimya görüntüleri İnsan Protein Atlası'ndan elde edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İlgili alt segmentlerde geleneksel olmayan belirteç genlerinin ekspresyonunun gösterilmesini göstermek için immünohistokimyasal boyama örnekleri.
İlgili immünofistokimya ile tasvir edilen transkriptler arasında glomerulusta (A) SHANK3, proksimal tübülde ACSM2B, (C) kalın yükselen uzuvda RAP1GAP ve (D) toplama kanalında L1CAM bulunur. İmmünohistokimya görüntüleri İnsan Protein Atlası'ndan elde edilir. (*= p < ANOVA tarafından 0.0001) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Aynı numunenin ayrı dizilimi ile iki farklı diseksiyon arasındaki korelasyon.
(A) glomerulus, (B) proksimal tübül ve (C) kalın yükselen Henle döngüsündeki farklı diseksiyonlar arasında yüksek derecede korelasyon gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Işaretleyici | Segment | Katlama Değişimi | p-Değer |
| NPHS1 | Glomerulus | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | Proksimal Tübül | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | Kalın Yükselen Uzuv | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | Toplama Kanalı | 4.09 | 0.000133 |
| COL6A2 | Interstitium | 7.19 | 1.47E-06 |
Tablo 1: Üç nefrektomi örneği arasında ilgi çekici her alt segment için, kalan alt segmentlere kıyasla temsili ortalama değerler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD tabanlı transkriptomik, gen ekspresyonını doku içindeki belirli alanlara tutturan yararlı bir teknolojidir. Bu teknolojinin temeli ve böbrekteki potansiyel uygulaması daha önce tanımlanmıştır8. Bununla birlikte, özellikle aşağı akış RNA dizilimi için yüksek doğruluk diseksiyonunu amaçlayan floresan bazlı diseksiyonun optimizasyonu, modernizasyonu ve düzene sokulması daha az yaygındır. Bu metodoloji doku içinde mekansal olarak topraklandığı için, doku yapılarında, özellikle hastalık durumlarında yeni veya az takdir edilen belirteçleri ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir. Aslında, hücrelerin birçok yaygın belirteci hastalıkla değişebilir, bu nedenle mekansal bağlam olmadan kimlik yargılaması için yalnızca hücre RNA ifade işaretçilerine güvenmek hastalık durumlarında zor olabilir. Bu nedenle, mekansal bağlantılı LMD yaklaşımının, hücreleri ağırlıklı olarak gen ekspresyon profilleri9ile tanımlayan tek hücre ve tek nükleer RNA dizilimi gibi diğer birçok transkriptomik teknolojiyi tamamlaması ve sağlaması muhtemeldir. Ayrıca, LMD tarafından sağlanan gen ekspresyonunun derinliği (örnek başına 20.000 gen) birden fazla kaynaktan gelen verileri çapraz bağlamak ve gen ifadesinde belirli bir derinlik olmadan belirgin olmayabilecek değişiklikleri hesaba katmak için başka bir avantaj ve önemli bir mekan sağlar. Doku ekonomisinin göz önünde bulundurulması, donmuş bir bloktan toplam 100 μm'den daha az bir kalınlığın tüm LMD veri kümesi için yeterli olabileceği bu teknolojinin bir başka olumlu özelliğidir. Bu, arta kalan dokunun diğer analitik amaçlar için kullanılmasını sağlar.
LMD'nin sınırlamaları vardır. Lazer mikroseksiyon transkriptomik veri alımının beklenen bir sınırlaması, daha düşük aktarım hızı doğasıdır. Gelecekteki otomasyon ölçeklenebilirliği artırmada önemli olabilir10,11. LMD transkriptomisinin iki ek sınırlaması, uzmanlığa bağımlılığı ve doku kalitesinin veri sonuçları üzerindeki etkisini içerir. Tek bir hücre değil, zenginleştirilmiş hücre bölmeleri toplandığı için, ilgi segmenti dışındaki hücrelerin ve malzemelerin yanlışlıkla toplanması bilinen bir sınırlamadır. LMD, bir kullanıcının doku yapısını anlamadaki yeterliliğine dayanır ve bu nedenle belirli bir alan uzmanlığı gerektirir. Bu nedenle, bireyler antikor lekesi olan ve olmayan böbrekteki ilgili bölgeleri belirlemek için eğitilmelidir. Son olarak, doku kalitesinin etkisi aşağı akış veri kalitesini etkileyebilir. LMD protokolü doku bozulmasına yol açar, bu nedenle başlangıç malzemesinin kalitesi önemlidir. Bununla birlikte, bu protokol sadece orta kalitede birkaç örnekle arşivlenmiş biyopsilerde optimize edilmiştir. Dahil edilen veriler, seçilen transkriptomik platformun sağlam olduğunu göstermektedir.
Not olarak, kullanılan izolasyon kiti ve RNA diziliminin aşağı akış metodolojisi, beklenen RNA bozulması derecesi için özel olarak uyarlanmalıdır. Burada açıklanan boyama protokolü, bu etkiyi en aza indirmede en olumlu etkiye sahip olduğu için benimsenmiştir. Bu protokolde doku, diğer transkriptomik teknolojiler arasında gelecekteki karşılaştırmaları kolaylaştırmak için OCT'ye gömülmüştü. Ancak formalin sabit dokusu alternatif olabilir.
Bu yazıda sunulan veriler, optimizasyon, kalite kontrol ölçümleri ve teknoloji sonuçları da dahil olmak üzere bölgesel transkriptominin faydalarını ortaya koymaktadır. Titiz ön analitik ve analitik kalite kontrol kriterlerinin oluşturulması ve ayrıca katılık ve tekrarlanabilirlik kanıtlarının oluşturulması her metodoloji için gereklidir. Bölgesel transkriptominin gelecekteki uygulamaları biyolojik uygulamalar, teknik gelişmeler ve analitik ilerlemeler olarak geniş ölçüde gruplandırılabilir. Gelecekteki biyolojik uygulamalar, yaralanmamış, yaralanmış ve yenileyici tübüllerin yanı sıra iltihaplanmaya yakın tübüllerden doku sorgulamayı hedef alabilir. Bu bölmeler aynı biyopside hem geleneksel morfolojik belirteçlerle hem de "yolak" spesifik belirteçler için antikor lekeleriyle tanımlanabilir. Bu teknolojide kullanılmak üzere doğrulanan iki antikor belirteci, megalin ve uromodulin, sırasıyla proksimal tübül ve kalın yükselen uzuvda yüksek oranda ifade edilir. Ancak ağır hastalıklı dokularda bu belirteçlerin azalması mümkündür. Bu gibi durumlarda, yola özgü belirteçlerin veya ifade düzeylerini değiştirmeyen yeni belirteçlerin ek antikor doğrulaması bu sorunun üstesinden gelebilir.
LMD'nin diğer organların transkriptomik sorgulamasında kullanılması uygun bir yöntem olması muhtemeldir. Hızlı boyama için çalışan antikorların seçimi ve optimizasyonu zorunlu olacaktır. Düzenli bir boyama protokolünde çalışan bir antikor, muhtemelen yüksek benzeşim antikorları gerektiren hızlı boyama protokolü için çalışmayabilir. Birincil konjuge antikor, gereken adımları en aza indirir ve avantajlar sunabilir. Bununla birlikte, floroforlara karşı bir antikorun konjugasyonu bağlamayı değiştirebilir ve bu reaktiflerin protokole dahil edilmesi için pilot deneylerin yapılması gerekir.
Sonuç olarak, transkriptomik bir analiz sağlamak için insan böbreğindeki belirli alanları ve yapıları izole etmek için floresan bazlı lazer mikrodisksiyonu için bir boru hattı tarif ediyoruz. Bu yaklaşım önemli avantajlar sunar ve doku bazlı moleküler sorgulama sağlamak için diğer dokulara da genişletilebilir. Bölgesel transkriptomik, ifadeyi anlamak için histopatolojik bir çapa sağlayarak, biyolojinin yorumlanmasına ve sağlık ve hastalığın imzasına yardımcı olarak diğer transkriptomik teknolojileri tamamlar. Bu teknoloji, böbreğin transkriptomik atlasını inşa etmek için doğal olarak vizyona uyar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Genel: Yazarlar, Böbrek Hassas Tıp Projesi (www.kpmp.org) araştırmacılarına nazik destekleri ve tavsiyeleri için teşekkür eder.
Finansman: Bu çalışma için destek NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Bu yazıda bildirilen araştırmalar, U2CDK114886 ödül numarası altında Ulusal Diyabet ve Sindirim Enstitüsü (NIDDK) Böbrek Hassas Tıp Projesi (KPMP), (www.kpmp.org) tarafından desteklenmiştir.
Veri ve malzeme kullanılabilirliği: Veriler Omnibus Gen İfadesi'nde arşivlenmiştir (GEO # beklemede)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
