Tillämpning av lasermikrodissektion för att upptäcka regional transkriptomik i mänsklig njurvävnad
Summary
Vi beskriver ett protokoll för laser microdissektion av undersegment av den mänskliga njuren, inklusive glomerulus, proximala tubule, tjock stigande lem, samla kanalen och interstitium. RNA isoleras sedan från de erhållna facken och RNA-sekvensering utförs för att bestämma förändringar i den transkriptomiska signaturen inom varje delsegment.
Abstract
Genuttryck analys av mänskliga njurvävnad är ett viktigt verktyg för att förstå homeostas och sjukdom patofysiologi. Att öka upplösningen och djupet av denna teknik och utvidga den till cellnivån i vävnaden behövs. Även om användningen av enstaka nukleära och encelliga RNA-sekvensering har blivit utbredd, upprätthåller uttryckssignaturer av celler som erhållits från vävnadsdisociation inte rumsligt sammanhang. Laser microdissection (LMD) baserat på specifika fluorescerande markörer skulle tillåta isolering av specifika strukturer och cellgrupper av intresse med känd lokalisering, vilket möjliggör förvärv av rumsligt förankrade transkriptomic signaturer i njurvävnad. Vi har optimerat en LMD-metodik, styrd av en snabb fluorescensbaserad fläck, för att isolera fem distinkta fack i den mänskliga njuren och genomföra efterföljande RNA-sekvensering från värdefulla mänskliga njurvävnadsprover. Vi presenterar också kvalitetskontrollparametrar för att göra det möjligt att bedöma om de insamlade exemplaren är adekvata. Arbetsflödet som beskrivs i detta manuskript visar genomförbarheten av denna metod för att isolera subsegmentala transkriptionsbaserade signaturer med högt förtroende. Det metodologiska tillvägagångssätt som presenteras här kan också tillämpas på andra vävnadstyper med ersättning av relevanta antikroppsmarkörer.
Introduction
Tekniska framsteg när det gäller att studera vävnadsprover har förbättrat förståelsen för hälsotillstånd och sjukdom i olika organ. Sådana framsteg har understrukit att patologi kan börja i begränsade regioner eller i specifika celltyper, men har ändå viktiga konsekvenser för hela organet. Därför är det i den nuvarande eran av personlig medicin viktigt att förstå biologin på både cell- och regional nivå och inte bara globalt1. Detta gäller särskilt i njuren, som består av olika specialiserade celler och strukturer som differentiellt initierar och/ eller svarar på patologisk stress. Patogenesen vid olika typer av mänsklig njursjukdom är fortfarande inte väl förstådd. Att generera en metodik för att studera förändringar i genuttryck i specifika rörformiga segment, strukturer eller områden av interstitium i den mänskliga njuren kommer att förbättra förmågan att avslöja regionspecifika förändringar som kan informera om patogenesen vid sjukdom.
Mänskliga njurbiopsiprover är en begränsad och värdefull resurs. Därför bör teknik som förhör transkriptomik i njurvävnad optimeras för att spara vävnad. De tillgängliga metoderna för att studera transkriptomik på cell- och regional nivå inkluderar RNA-sekvensering med en cell (scRNaseq), RNaseq (snRNaseq), rumslig hybridisering på plats och lasermikrodissektion (LMD). Den senare är väl lämpad för exakt isolering av regioner eller strukturer av intresse inom vävnadssektioner, för nedströms RNA-sekvensering ochanalys 2,3,4,5. LMD kan antas för att förlita sig på identifiering av specifika celltyper eller strukturer baserade på validerade markörer med fluorescensbaserad avbildning under dissekering.
De unika egenskaperna hos lasermikrodissekretionsassisterad regional transkriptomik omfattar: 1) bevarandet av cellernas och struktureras rumsliga sammanhang, som kompletterar encellsteknik där celler identifieras med uttryck snarare än histologiskt; 2) Tekniken informerar och informeras av annan bildteknik eftersom en antikroppsmarkör definierar uttryckssignaturer. 3) Förmågan att identifiera strukturer även när markörer förändras i sjukdom; 4) påvisande av lågt uttryckta transkriptioner i cirka 20 000 gener; och 5) anmärkningsvärd vävnadsekonomi. Tekniken är skalbar för en njurbiopsi med mindre än 100 μm tjocklek av en kärna som är nödvändig för tillräckligt RNA-förvärv och möjliggör användning av arkiverad frusen vävnad, som är allmänt tillgängliga i stora databaser eller akademiskacentra 6.
I det efterföljande arbetet beskriver vi den regionala och bulk transcriptomics tekniken i detalj, optimerad med en ny snabb fluorescens färgning protokoll för användning med mänskliga njurvävnad. Den här metoden förbättrar klassiska LMD-utforskningar eftersom den tillhandahåller separata uttrycksdata för delsegmenten interstitium och nephron i motsats till aggregerade tubulointerstitiella uttryck. Här ingår de kvalitetssäkrings- och kontrollåtgärder som vidtagits för att säkerställa stringens och reproducerbarhet. Protokollet möjliggör visualisering av celler och regioner av intresse, vilket resulterar i tillfredsställande förvärv av RNA från dessa isolerade områden för att tillåta nedströms RNA-sekvensering.
Protocol
Representative Results
Discussion
LMD-baserad transkriptomik är en användbar teknik som förankrar genuttryck till specifika områden i vävnaden. Grunden för denna teknik och dess potentiella tillämpning i njuren har beskrivits tidigare8. Optimering, modernisering och effektivisering av fluorescensbaserad dissekering som specifikt syftar till hög noggrannhet dissekering för nedströms RNA-sekvensering är dock mindre allestädes närvarande. Eftersom denna metod är rumsligt grundad i vävnaden, har den potential att avslö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Allmänt: Författarna vill tacka utredarna av Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) för deras älskvärda stöd och råd.
Finansiering: Stöd för detta arbete tillhandahölls av NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Forskning som rapporterades i detta manuskript stöddes av National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), under tilldelningsnummer U2CDK114886.
Tillgång till data och material: Data arkiveras i Gene Expression Omnibus (GEO # väntar)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett’s esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- . Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016)
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
