मानव गुर्दे के ऊतकों में क्षेत्रीय ट्रांसक्रिप्टोमिक्स को उजागर करने के लिए लेजर माइक्रोडिसेक्शन का आवेदन
Summary
हम मानव गुर्दे के उप-खंडों के लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें ग्लोमेरुलस, समीपस्थ ट्यूबल, मोटी आरोही अंग, डक्ट और इंटरस्टिटियम इकट्ठा करना शामिल है। आरएनए को प्राप्त डिब्बों से अलग किया जाता है और प्रत्येक उप-खंड के भीतर ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए आरएनए अनुक्रमण किया जाता है।
Abstract
मानव गुर्दे के ऊतकों का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण होमोस्टेसिस और रोग रोगविज्ञान को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। संकल्प और इस तकनीक की गहराई बढ़ाने और ऊतक के भीतर कोशिकाओं के स्तर तक विस्तार की जरूरत है । हालांकि एकल परमाणु और एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण का उपयोग व्यापक हो गया है, ऊतक वियोजन से प्राप्त कोशिकाओं की अभिव्यक्ति हस्ताक्षर स्थानिक संदर्भ को बनाए नहीं रखते हैं। विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर के आधार पर लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) ज्ञात स्थानीयकरण के साथ विशिष्ट संरचनाओं और ब्याज के सेल समूहों के अलगाव की अनुमति देगा, जिससे गुर्दे के ऊतकों में स्थानिक रूप से लंगर डाले गए ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षरों के अधिग्रहण को सक्षम किया जा सकेगा। हमने मानव गुर्दे के भीतर पांच अलग-अलग डिब्बों को अलग करने और मूल्यवान मानव गुर्दे के ऊतक नमूनों से बाद में आरएनए अनुक्रमण का संचालन करने के लिए तेजी से फ्लोरेसेंस-आधारित दाग द्वारा निर्देशित एक एलएमडी पद्धति को अनुकूलित किया है। हम एकत्र नमूनों की पर्याप्तता के आकलन को सक्षम करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण मापदंड भी प्रस्तुत करते हैं। इस पांडुलिपि में उल्लिखित कार्यप्रवाह उच्च आत्मविश्वास के साथ उप-खंडीय प्रतिलिपि हस्ताक्षरों को अलग करने के लिए इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को दर्शाता है। यहां प्रस्तुत पद्धतिगत दृष्टिकोण को प्रासंगिक एंटीबॉडी मार्कर के प्रतिस्थापन के साथ अन्य ऊतक प्रकारों पर भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
ऊतक नमूनों का अध्ययन करने में तकनीकी प्रगति ने विभिन्न अंगों में स्वास्थ्य और रोग की स्थिति की समझ में सुधार किया है। इस तरह के अग्रिमों ने रेखांकित किया है कि विकृति सीमित क्षेत्रों में या विशिष्ट कोशिका प्रकारों में शुरू हो सकती है, फिर भी पूरे अंग पर महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। इसलिए, व्यक्तिगत चिकित्सा के वर्तमान युग में, कोशिका और क्षेत्रीय दोनों स्तरों पर जीव विज्ञान को समझना महत्वपूर्ण है और न केवल विश्व स्तर पर1। यह गुर्दे में विशेष रूप से सच है, जो विभिन्न विशेष कोशिकाओं और संरचनाओं से बना है जो अलग-अलग रूप से शुरू करते हैं और/या पैथोलॉजिकल तनाव का जवाब देते हैं । विभिन्न प्रकार की मानव गुर्दे की बीमारी के रोगजनन अभी भी अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है। मानव गुर्दे में विशिष्ट ट्यूबलर खंडों, संरचनाओं या इंटरस्टिटियम के क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक पद्धति पैदा करने से क्षेत्र विशिष्ट परिवर्तनों को उजागर करने की क्षमता में वृद्धि होगी जो रोग के रोगजनकों पर सूचित कर सकते हैं ।
मानव गुर्दे बायोप्सी नमूने एक सीमित और कीमती संसाधन हैं। इसलिए, गुर्दे के ऊतकों में ट्रांसक्रिप्टोमिक्स से पूछताछ करने वाली प्रौद्योगिकियों को ऊतक को अर्थव्यवस्था बनाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। सेल और क्षेत्रीय स्तर पर ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध तरीकों में एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (scRNaseq), एकल परमाणु RNaseq (snRNaseq), सीटू स्थानिक संकरण में, और लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) शामिल हैं। उत्तरार्द्ध ऊतक वर्गों के भीतर क्षेत्रों या रुचि की संरचनाओं के सटीक अलगाव के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण और विश्लेषण2,3,4,5के लिए। विच्छेदन के दौरान फ्लोरेसेंस-आधारित इमेजिंग का उपयोग करके मान्य मार्कर के आधार पर विशिष्ट सेल प्रकार या संरचनाओं की पहचान पर भरोसा करने के लिए एलएमडी अपनाया जा सकता है।
लेजर माइक्रोडिसेक्शन असिस्टेड रीजनल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की अनूठी विशेषताओं में शामिल हैं: 1) कोशिकाओं और संरचनाओं के स्थानिक संदर्भ का संरक्षण, जो एकल कोशिका प्रौद्योगिकियों का पूरक है जहां कोशिकाओं को हिस्टोलॉजिकल रूप से अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना जाता है; 2) प्रौद्योगिकी अन्य इमेजिंग प्रौद्योगिकियों द्वारा सूचित और सूचित की जाती है क्योंकि एक एंटीबॉडी मार्कर अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों को परिभाषित करता है; 3) रोग में मार्कर बदलने पर भी संरचनाओं की पहचान करने की क्षमता; 4) लगभग 20,000 जीन में नीच व्यक्त टेप का पता लगाना; और 5) उल्लेखनीय ऊतक अर्थव्यवस्था। यह तकनीक पर्याप्त आरएनए अधिग्रहण के लिए आवश्यक कोर की 100 माइक्रोन मोटाई से कम के साथ गुर्दे की बायोप्सी के लिए स्केलेबल है और संग्रहीत जमे हुए ऊतकों के उपयोग को सक्षम बनाती है, जो आमतौर पर बड़े भंडार या अकादमिक केंद्रों में उपलब्ध हैं6।
आगामी काम में, हम विस्तार से क्षेत्रीय और थोक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स तकनीक का वर्णन करते हैं, जो मानव गुर्दे के ऊतकों के साथ उपयोग के लिए एक उपन्यास रैपिड फ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल के साथ अनुकूलित होता है। यह दृष्टिकोण क्लासिक एलएमडी अन्वेषणों पर सुधार करता है क्योंकि यह कुल तुबुलोइंटिशियल अभिव्यक्ति के विपरीत इंटरस्टिटियम और नेफ्रॉन उप-खंडों के लिए अलग अभिव्यक्ति डेटा प्रदान करता है। कठोरता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए लागू गुणवत्ता आश्वासन और नियंत्रण उपाय शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं और रुचि के क्षेत्रों के दृश्य को सक्षम बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप इन अलग-थलग क्षेत्रों से आरएनए का संतोषजनक अधिग्रहण होता है ताकि डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण की अनुमति दी जा सके ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एलएमडी आधारित ट्रांसक्रिप्टोमिक्स एक उपयोगी तकनीक है जो ऊतक के भीतर विशिष्ट क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति को एंकर करती है। इस तकनीक का आधार और गुर्दे में इसके संभावित अनुप्रयोग को पहले8बताय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सामान्य: लेखक किडनी प्रिसिजन मेडिसिन प्रोजेक्ट (www.kpmp.org) के जांचकर्ताओं को उनके अनुग्रह समर्थन और सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।
फंडिंग: इस काम के लिए समर्थन NIH/NIDK K08DK107864 (M.T.E.) द्वारा प्रदान किया गया था; NIH/NIDDK UG3DK1114923 (T.M.E., P.C.d.); R01dK099345 (T.A.S.) । इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या U2CDK114886 के तहत राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों (NIDDK) किडनी प्रेसिजन मेडिसिन परियोजना (KPMP), (www.kpmp.org) द्वारा समर्थित किया गया था ।
डेटा और सामग्री की उपलब्धता: डेटा जीन अभिव्यक्ति सर्वग्राही में संग्रहीत है (जियो # लंबित)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
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