Summary
Descrevemos um protocolo para microdisseção a laser de subsegmentos do rim humano, incluindo o glomerulus, túbulo proximal, membro ascendente espesso, coletor de duto e interstício. O RNA é então isolado dos compartimentos obtidos e o sequenciamento de RNA é realizado para determinar alterações na assinatura transcriômica dentro de cada subsegmento.
Abstract
A análise da expressão genética do tecido renal humano é uma ferramenta importante para entender a homeostase e a fisiopatologia da doença. Aumentar a resolução e a profundidade dessa tecnologia e estendê-la ao nível das células dentro do tecido é necessário. Embora o uso de sequenciamento de RNA uni nuclear e unicelular tenha se espalhado, as assinaturas de expressão das células obtidas a partir da dissociação tecidual não mantêm o contexto espacial. A microdisseção a laser (LMD) baseada em marcadores fluorescentes específicos permitiria o isolamento de estruturas específicas e grupos celulares de interesse com localização conhecida, permitindo assim a aquisição de assinaturas transcriômicas ancoradas espacialmente no tecido renal. Otimizamos uma metodologia de LMD, guiada por uma mancha rápida baseada em fluorescência, para isolar cinco compartimentos distintos dentro do rim humano e realizar sequenciamento subsequente de RNA de valiosos espécimes de tecido renal humano. Também apresentamos parâmetros de controle de qualidade para permitir a avaliação da adequação das amostras coletadas. O fluxo de trabalho descrito neste manuscrito mostra a viabilidade dessa abordagem para isolar assinaturas transcriômicas subsu segmentares com alta confiança. A abordagem metodológica aqui apresentada também pode ser aplicada a outros tipos de tecidos com substituição de marcadores de anticorpos relevantes.
Introduction
Os avanços tecnológicos no estudo dos espécimes teciduais melhoraram a compreensão do estado de saúde e da doença em diversos órgãos. Tais avanços têm sublinhado que a patologia pode começar em regiões limitadas ou em tipos celulares específicos, mas têm implicações importantes em todo o órgão. Portanto, na atual era da medicina personalizada, é importante compreender a biologia tanto no nível celular quanto regional e não apenas globalmente1. Isso é particularmente verdadeiro no rim, que é composto por várias células e estruturas especializadas que iniciam diferencialmente e/ou respondem ao estresse patológico. A patogênese de vários tipos de doença renal humana ainda não é bem compreendida. Gerar uma metodologia para estudar mudanças na expressão genética em segmentos tubulares específicos, estruturas ou áreas do interstício no rim humano aumentará a capacidade de descobrir alterações específicas da região que poderiam informar sobre a patogênese da doença.
Biópsia de rim humano é um recurso limitado e precioso. Portanto, as tecnologias que interrogam a transcrição no tecido renal devem ser otimizadas para economizar tecido. Os métodos disponíveis para estudar transcrição em nível celular e regional incluem sequenciamento de RNA de célula única (scRNaseq), RNaseq nuclear único (snRNaseq), hibridização espacial in situ e microdissecção a laser (LMD). Este último é adequado para o isolamento preciso de regiões ou estruturas de interesse dentro de seções teciduais, para sequenciamento e análise de RNA a jusante2,3,4,5. A LMD pode ser adotada para contar com a identificação de tipos ou estruturas celulares específicas baseadas em marcadores validados usando imagens baseadas em fluorescência durante a dissecção.
As características únicas da microdisseção a laser assistida transcrição regional incluem: 1) a preservação do contexto espacial das células e estruturas, que complementa tecnologias celulares únicas onde as células são identificadas pela expressão e não histologicamente; 2) a tecnologia informa e é informada por outras tecnologias de imagem porque um marcador de anticorpos define assinaturas de expressão; 3) a capacidade de identificar estruturas mesmo quando os marcadores mudam na doença; 4) detecção de transcrições humildemente expressas em aproximadamente 20.000 genes; e 5) notável economia tecidual. A tecnologia é escalável para uma biópsia renal com menos de 100 μm de espessura de um núcleo necessário para aquisição suficiente de RNA e permite o uso de tecido congelado arquivado, que são comumente disponíveis em grandes repositórios ou centros acadêmicos6.
No trabalho seguinte, descrevemos em detalhes a tecnologia de transcrição regional e em massa, otimizada com um novo protocolo de coloração rápida de fluorescência para uso com tecido renal humano. Essa abordagem melhora em explorações clássicas de LMD porque fornece dados de expressão separados para os subsegmentos interstitium e nefron em oposição à expressão tubulointerstícia agregada. Incluem-se as medidas de garantia e controle de qualidade implementadas para garantir rigor e reprodutibilidade. O protocolo permite a visualização de células e regiões de interesse, resultando na aquisição satisfatória de RNA dessas áreas isoladas para permitir o sequenciamento de RNA a jusante.
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Protocol
O estudo foi aprovado para uso pelo Institutional Review Board (IRB) da Universidade de Indiana.
NOTA: Use este protocolo com tecido de nefrectomia renal (até 2 cm nas dimensões X e Y) preservado no composto de Temperatura de Corte Ideal (OCT) e armazenado a -80 °C. Realize todo o trabalho de forma que limite a contaminação do RNA, use luvas descartáveis limpas e uma máscara facial. Certifique-se da limpeza de todas as superfícies. O equipamento para o qual este protocolo foi otimizado é um sistema de microdissecção a laser com laser UV pulsado.
1. Criosectioning
- Exponha slides de 1,2 μm LMD PPS-membrana (poli(p-fenileu sulfeto) à luz UV (em uma capa de fluxo laminar da cultura tecidual) por 30 minutos, imediatamente antes da criosecção. Armazene os slides à temperatura ambiente para a adesão ideal do tecido.
- Esfrie o criostat para -20 °C. Limpe as superfícies de trabalho e instale uma nova lâmina de corte.
- Coloque uma pequena caixa de slides (limpa com solução de descontaminação da superfície RNase) dentro da câmara criostat para armazenar lâminas com tecido recém-cortado.
- Adere a amostra em OUTUBRO a um suporte de tecido e deixe-o equilibrar por alguns minutos para atingir a temperatura da câmara e fortalecer a adesão entre o bloco DECs e o suporte. Ajude o processo usando um extrator de calor.
- Corte o espécime a uma espessura de 12 μm e afixe-o no slide LMD especializado, usando o adaptador de slides. Cada slide contém uma seção de nefrectomia por slide ou até duas seções de biópsia renal por slide. Armazene os slides a -80 °C com um cartucho dessecante e dentro de um saco plástico bem fechado para evitar que o excesso de umidade se acumule dentro da caixa de slides.
- Rotule cada slide com um ID de espécime, data e número de slides.
- Use os slides com espécimes dentro de 10 dias a partir da data inicial de criosectioning.
2. Microdisseção a laser
- Imediatamente antes da coloração, prepare o Mix de Anticorpos (Ab-Mix) em 10% BSA no PBS livre de RNase adicionando o seguinte: 4 μL de FITC-Phalloidin, 1,5 μL de DAPI, 2 μL de anticorpo Tamm-Horsfall Protein (THP) diretamente conjugado ao Alexa Fluor 546, 3,3 μL de Inibidor de RNase e 89,2 μL de 10% BSA em PBS (para atingir um volume de 100 μL).
NOTA: Podem ser utilizados anticorpos alternativos no lugar do anticorpo THP. Por exemplo, 2 μL de anticorpo megalin/LRP2, diretamente conjugado ao Alexa Fluor 568, pode ser usado para rotular o túbulo proximal. O Ab-Mix contém anticorpoS LRP2 ou THP (para visualizar túbulos proximais ou membros ascendentes espessos, respectivamente). Outros anticorpos podem ser validados de acordo com as necessidades do usuário. - Lave o slide no frio gelado (-20 °C) 100% acetona por 1 min e mova-o para a câmara de umidade.
- Lave a parte superior do slide com PBS sem RNase por 30 s. Repita.
- Lave a parte superior do slide com 10% de BSA no PBS livre de RNase por 30 s. Repita.
- Aplique o Ab-Mix por 5 minutos.
- Lave a parte superior do slide com 10% de BSA no PBS livre de RNase por 30 s. Repita.
- Seque o escorregador por 5 minutos e carregue-o na plataforma de corte de microdisseção a laser.
- Instale os tubos de coleta (tubos de microcentrifuuge de 0,5 mL) apropriados para o trabalho de PCR, contendo 50 μL de Buffer de Extração do kit de isolamento RNA.
- Prossiga com LMD. Complete cada sessão de LMD dentro de no máximo 2 horas.
- Coletar imagens de imunofluorescência pré e pós-LMD, utilizando a câmera do microscópio para validar a dissecção para variabilidade entre operadores, bem como fins de arquivamento, treinamento e avaliação de qualidade do protocolo realizado. Para obter 0,5 – 1 ng de RNA, é necessário um mínimo de 500.000 μm2 de área. Isso muitas vezes requer o uso de seções de até 8 x12 μm de espessura para obter uma quantidade suficiente de material para todos os subsegmentos de interesse.
- Identifique regiões de interesse por coloração, morfologia e localização e extirpa-as usando energia laser maior que 40.
NOTA: Aqui estão os critérios de dissecção. O túbulo proximal é definido pela rotulagem FITC-Phalloidin e LRP2. O membro ascendente espesso é definido pela rotulagem THP. O ducto coletor é definido pela morfologia nuclear (DAPI) e ausência de outras manchas. O glomerulus é definido por FITC-Phalloidin e morfologia. O interstício é definido como a área entre túbulos manchados.
- Obtenha uma assinatura de expressão transversal em massa, afixando duas seções de 12 μm em um slide LMD e dissecando as seções inteiras em buffer de extração.
- Após a conclusão do processo LMD, feche os tubos de microcentrifuuagem de coleta e pise vigorosamente para garantir que o conteúdo tenha se movido da tampa para a parte inferior do tubo
- Centrifugar os tubos a 3.000 x g para 30 s.
- Incubar os tubos em banho de água de 42 °C por 30 min.
- Centrifugar os tubos a 3.000 x g por 2 min.
- Transfira o supernatante para um novo tubo de 0,5 mL e armazene-o em -80 °C.
3. Isolamento do RNA
NOTA: Para este protocolo de isolamento de RNA, adaptamos um protocolo de um kit comercial de isolamento de RNA. O protocolo do fabricante foi modificado para atender aos requisitos de controle de qualidade estabelecidos para o projeto.
- Adicione 250 μL de Buffer Condicionado (CB) a cada coluna de purificação de RNA (PC) e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifugar todos os PCs por 1 min a 16.000 x g.
- Adicione 50 μL de 70% de etanol (fornecido no Kit) nos tubos com amostras de tecido. Misture bem as amostras por pipetting para cima e para baixo. Não vórtice. Não centrifugar.
- Transfira a mistura em PCs condicionados e centrífuga por 2 min a 100 x g (para ligar o RNA), siga rapidamente com centrifugação para 30 s a 16.000 x g (para remover o fluxo). Repita esta etapa se mais de 1 tubo com amostras de tecido estiverem disponíveis para qualquer subsegmento.
- Adicione 100 μL de Wash Buffer 1 (WB1) nos PCs e centrífuga por 1 minuto a 8.000 x g.
- Prepare 40 μL de DNase por cada amostra (Adicione 5 μL de DNase a 35 μL de buffer RDD). Em seguida, adicione 40 μL da mistura diretamente na membrana do PC e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
- Adicione 40 μL de WB1 na membrana do PC e centrífuga por 15 s a 8.000 x g.
- Adicione 100 μL de Wash Buffer 2 (WB2) na membrana do PC e centrífuga por 1 min a 8.000 x g.
- Adicione 100 μL de WB2 na membrana do PC, centrífuga por 2 min a 16.000 x g,siga imediatamente por centrifugação por 1 min a 16.000 x g.
- Transfira o PC para um novo tubo de 0,5 mL.
- Adicione 12 μL de Amortecedor de Elução (EB) na membrana e incubar por 7 minutos à temperatura ambiente. Assim, o volume final de todas as amostras de tecido dissecado agrupadas é de 12 μL por subsegmento.
- Centrifugar as amostras por 1 min a 1.000 x g e depois por 2 min a 16.000 x g.
- Transfira 2 μL para um tubo fresco para análise bioanalílise (para evitar eventos de congelamento).
- Armazene todos os tubos em -80 °C até ficar pronto para posterior processamento.
4. Sequenciamento de RNA
- Avalie cada amostra, destinada ao sequenciamento, para qualidade utilizando um Bioanalyzer comercial e um chip dedicado à medição de pequenas quantidades de RNA.
- Seguindo os parâmetros de controle de qualidade (QC) antes da preparação da biblioteca e sequenciamento: Quantidade de RNA maior que 4 ng para a granel e superior a 0,5 – 1 ng para cada subsegmento; O percentual de transcrições com mais de 200 nucleotídeos (DV200) é necessário para ser superior a 25% para amostras de LMD (ótimo > 75%).
- Realize a preparação da biblioteca com um kit comercial de preparação da biblioteca cDNA destinado a pequenas quantidades de RNA degradado. Para o kit comercial listado no suplemento, sugerimos o uso da Opção 2, que requer um DV200 mínimo de 25% e nenhuma fragmentação. Algumas tecnologias de sequenciamento podem exigir limites mínimos de DV200 mais elevados, como 30%7.
- Adicione adaptadores e índices cDNA.
- Purifique as bibliotecas RNAseq usando tecnologia de contas magnéticas.
- Despoque o cDNA ribossômico usando um kit comercial de remoção de rRNA antes da etapa de amplificação da biblioteca RNAseq.
- Purifique a biblioteca rnaseq final usando tecnologia de contas magnéticas em uma concentração de biblioteca cDNA de 2ng/μL.
- Realize o sequenciamento de RNA de 75 bp emparelhado em um sistema de sequenciamento comercial com 30 milhões de leituras/amostra para massa e 100 milhões de leituras/amostra para seções subsu segmentares.
- Use um RNA de referência (25 μg) a cada execução de sequenciamento para permitir o controle do efeito em lote. A concentração inicial do nosso RNA de referência é de 1 μg/μL, enquanto a concentração final utilizada no sequenciamento é de 25 ng/μL. Execute o RNA de referência como uma amostra separada durante a preparação da biblioteca e execute com todos os espécimes de LMD cada vez.
- Realize a análise de dados utilizando a aplicação FastQC para avaliar a qualidade do sequenciamento, leituras intergênicas e mitocondriais e determinar leituras atribuídas a um gene.
- Use O Visualizador de Genômica Integrativa (IGV) para alinhamento e edgeR/rbamtools para medidas de expressão de transcrição.
- Remova amostras com menos de 100.000 leituras. Quantile normalize as leituras brutas no conjunto de dados após filtrar genes humildemente expressos em um limiar definido pelo usuário.
- Quantifique a expressão como uma razão do subsegmento de interesse para a média de todos os outros subsegmentos e log2-transform. A expressão relativa do mesmo gene pode ser comparada entre subsegmentos e amostras; no entanto, não é ideal comparar a expressão relativa entre dois genes diferentes devido a potenciais diferenças na degradação entre genes e espécies de RNA.
- Realize uma análise de enriquecimento para comparar a expressão genética de um conjunto de fabricantes específicos para cada subsegmento de nephron, enquanto as amostras de RNA de referência são comparadas entre lotes. Um efeito em lote dentro de 1 desvio padrão de expressão média com valor de R > 0,9 é considerado aceitável. É necessária uma normalização adicional para uma pontuação de efeito em lote mais alta. Qualquer execução que se desvie do efeito de lote aceito pode ser sinalizada. O Q30 deve ser maior que >90% para cada sequência de sequenciamento.
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Representative Results
Amostras
Apresentamos dados de nove nefrectomias de referência (3 espécimes obtidos na Universidade de Indiana e 6 espécimes obtidos através do Kidney Precision Medicine Project), utilizando o protocolo de coloração de fluorescência rápida para isolar segmentos de nefradeira renal e áreas intersticiais. As seções utilizadas neste processo foram obtidas de doadores renais falecidos ou nefrectomias tumorais não afetadas. Estas amostras não apresentaram evidência patológica da doença como visualizada na mancha de H&E colhida de seções contíguas(Figura 1A).
Controle de qualidade da microdisseção a laser
A identificação de subsegmentos tubulares no rim é realizada através da coloração de anticorpos de marcadores tubulares únicos, bem como morfologia e marcos estruturais. A Figura 1B-C ilustra a coloração e microdisseção de subsegmentos tubulares a partir de uma nefrectomia representativa. Isso é feito por coloração com DAPI (núcleos), FITC-Phalloidin (F-actin), e um anticorpo adicional conforme necessário. A coloração de fluorescência utilizada possibilitou visualizar subsegmentos renais com alto grau de confiança, ainda mais guiados por características morfológicas, bem como posicionamento espacial das estruturas imagens(Figura 2). Por exemplo, glomeruli são revelados pela mancha de fhalloidina e DAPI com morfologia muito distinta. Da mesma forma, os dutos de coleta são visualizados usando morfologia nuclear e a ausência de outras manchas. O anticorpo megalin/LRP2 (diretamente conjugado com Alexa Fluor 568) é usado aqui para identificar túbulos proximais. O membro ascendente espesso é visualizado usando um anticorpo de proteína Tamm-Horsfall (THP) (diretamente conjugado a Alexa Fluor 546). Em contraste, o interstício é extirpado ao longo da membrana externa dos túbulos e inclui células estrômicas e imunes, bem como pequenos capilares.
Para obter RNA suficiente de 0,5 – 1 ng por subsegmento, buscamos dissecar uma área mínima de 500.000 μm2. Isso geralmente requer de cinco a oito seções de 12 μm de espessura (1 seção por slide) para obter material suficiente para todos os subsegmentos. A dissecção de qualquer slide é concluída em menos de 2 horas para preservar a qualidade do RNA, que permite cortar ~4 segmentos por slide. O tecido adquirido do mesmo subsegmento é agrupado de vários slides para sequenciamento a jusante. Uma imagem de imunofluorescência pré e pós-LMD é obtida para validar a coleta de subsegmentos de interesse usando uma câmera anexada. A Figura 3 delineia as taxas de sucesso da área de dissecção e da entrada mínima de RNA. A taxa de sucesso do cumprimento da entrada de área mínima foi de >90% neste conjunto de dados representativo. Se o tecido de origem tiver uma pequena quantidade do CD ou interstício, existe a possibilidade de a área de dissecção estar abaixo de 500.000 μm2 para esses segmentos depois de utilizar 8 slides. Slides adicionais podem ser cortados dependendo das necessidades do usuário; no entanto, como visto na Figura 3, se a área estiver perto de 500.000 μm2, os genes desejados detectados contam tem uma alta taxa de sucesso (100%) e a taxa total de sucesso da contagem de leitura é de 98,6% (1 espécime ficou abaixo da métrica QC). Assim, havia tecido suficiente para alcançar contagens genéticas e leituras suficientes sem utilizar tecido adicional.
Controle de qualidade de entrada de sequenciamento
A plataforma de preparação e sequenciamento da biblioteca comercial selecionada permite medições reprodutíveis de expressão de transcrição, mesmo com baixas quantidades de RNA altamente degradado. A entrada mínima de RNA é de 500 pg e a DV200 mínima (proporção de leituras com mais de 200 nucleotídeos de comprimento) é superior a 25%. Não há rin mínimo. Sequenciamento com 100 milhões de leituras por amostra, buscamos saturar as leituras disponíveis a fim de detectar transcrições humildemente expressas. O total de leituras pode ser ajustado de acordo com as necessidades do usuário.
É simples obter RNA suficiente de duas seções transversais a granel de 12 μm a granel, por isso buscamos obter uma quantidade mínima mínima de mRNA maior de 4 ng para sequenciamento a granel. Conforme delineado no protocolo, cada subsegmento requer 0,5-1 ng no RNA total. A concentração de RNA ideal é acima de 50 pg/μL após o isolamento. Quantidades de RNA menores do que isso podem levar à redução da detecção genética e à contagem de leitura observada. A maioria das amostras produz >20.000 genes detectados e >1 milhão de leituras. Um DV200 superior a 25% para todas as amostras é exigido pelo fabricante (>75% é considerado ótimo). Embora o RIN seja medido, o processo de microdissecção a laser reduz o RIN e as plataformas de sequenciamento de RNA foram otimizadas para RNA fragmentado. A quantidade e a qualidade do RNA são avaliadas por um bioanalzer antes do sequenciamento. A mancha rápida diminui a quantidade de tempo que o tecido é exposto à temperatura ambiente e às condições aquosas, minimizando, assim, na medida do possível, a degradação do RNA. A métrica de controle de qualidade DV200 para entrada de sequenciamento também é encontrada na Figura 3.
Controle de qualidade de saída de sequenciamento
O processamento de dados a jusante usa normalização quântica para permitir a comparação entre amostras em diferentes lotes. Uma contagem mínima de detecção genética de 10.000 e uma contagem mínima de leitura de 1 milhão são empregadas como limiares para incluir amostras na normalização quântica. Amostras com menor detecção ou leitura de genes são excluídas da normalização quântica e das análises comparativas subsequentes. Apenas 1 das 98 amostras subsu segmentadas dissecadas não conseguiu atingir esses limites(Figura 3). O Q30 (proporção de leituras mapeadas com 99,9% de confiança) foi superior a 93% para cada experimento de sequenciamento(Figura 4).
Nós sequenciamos um RNA de referência humana (25 ng) com cada execução de sequenciamento para permitir a correção para efeito em lote se tal correção for desejada ou necessária. O efeito de lote medido deve estar dentro de 1 desvio padrão de expressão média com um valor de R > 0,9. Se o efeito do lote for maior, é necessária uma normalização adicional para essa execução de sequenciamento. Aqui, o efeito em lote foi inferior a 3% nos quatro experimentos de sequenciamento retratados na Figura 4. Assim, o efeito em lote é tipicamente abordado com normalização quântica para todas as corridas de sequenciamento, agnóstico ao RNA de referência. Nenhuma correção baseada no RNA de referência foi implementada ainda, mas essas informações estão disponíveis e podem ser usadas dependendo dos objetivos de uma análise específica.
Rigor e Reprodutibilidade
É importante demonstrar rigor na identificação de tipos e estruturas celulares. Após microdisseção a laser, testamos o enriquecimento de marcadores conhecidos nos glomeruli, PT, TAL, CD e interstício em comparação com os outros compartimentos(Tabela 1). Uma análise de enriquecimento é usada para comparar a expressão genética para marcadores esperados pré-determinados. A expressão genética é transmitida como proporções de log2 da expressão do subsegmento de interesse em comparação com a média dos outros subsegmentos. Esta métrica de expressão foi escolhida para amostras humanas, pois reduz a variabilidade entre indivíduos, facilitando comparações entre tipos de células e compartimentos entre os espécimes. No entanto, as leituras brutas e as leituras quantificadas também podem ser comparadas em análises alternativas. Figure 5 ilustra exemplos de coloração imunohistoquímica desses 5 marcadores conhecidos selecionados, conforme apresentado no Atlas de Proteína Humana.
Assim, apresentamos fontes de dados ortogonais que dão confiança ao subsegmento correto que está sendo coletado: 1) a imagem que inclui a mancha de anticorpo e morfologia do segmento/compartimento, e 2) a saída de expressão mostrando marcadores conhecidos são expressas no subsegmento correspondente.
A análise transcriômica regional dos genes expressos em cada subsegmento permite a identificação de marcadores novos e subestimados. A Figura 6 ilustra um exemplo de um marcador para cada subsegmento identificado por transcrição regional de LMD que também produziu uma coloração imunohistoquímica específica do subsegmento de nefrão correspondente.
Para demonstrar a reprodutibilidade e entender o efeito da variabilidade do operador, realizamos um experimento em uma amostra de nefréctomia tumoral. Este espécime teve o glomeruli, PT e TAL re-dissecados para aumentar a confiança dos resultados de sequenciamento de RNA e agora serve como uma réplica técnica útil. Meses de diferença, esta amostra foi submetida a uma segunda instância de criosectioning, manchas de anticorpos, dissecção de LMD, extração de RNA, preparação da biblioteca e sequenciamento de RNA(Figura 7) dos compartimentos glomeruli, PT e TAL. As duas versões (v1 e v2) foram comparadas. Os compartimentos glomerular, PT e TAL foram altamente correlacionados com os valores r2 >0,95, semelhante ao efeito mínimo de lote do nosso RNA de referência.
Figura 1: Imagens representativas do tecido renal.
(A) Mancha de H&E de um tecido renal de referência humana. (B) Imagem imunofluorescente do tecido renal de referência humana com segmentos de membros ascendentes espessos manchados antes da LMD e (C) imediatamente após a dissecção da estrutura de membros ascendentes de espessura única. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de subsegmentos renais de referência, visualizadas em 20x utilizando uma abordagem específica de coloração imunofluorescente.
(A)a Glomerulus, (B) Proximal Tubule,(C) Membro ascendente grosso, (D) Coletor de duto,(E) Interstício. (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001 por ANOVA). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Métricas de controle de qualidade em transcrição segmental.
(A) Maiores que 90% das amostras piloto atingiram o limiar de entrada da área de dissecção de 500.000 μm2. (B) Todas as amostras, exceto uma, atenderam à entrada de RNA desejada de pelo menos 500 pg. (C)100% das amostras piloto atingiram o limiar mínimo de DV200 do fabricante de 25% e (D)100% das amostras atingiram nosso limiar mínimo de 10.000 genes detectados. (E) Todas as amostras, exceto uma, atingiram uma contagem mínima de leitura total de 1 milhão. Como esperado, áreas de dissecção mais baixas se correlacionam com concentrações reduzidas de RNA, menores contagens genéticas e menores contagens de leitura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Sequenciamento controle de qualidade.
(A) As corridas de sequenciamento que empregam um RNA de referência (não quantile normalizado) são comparadas à expressão média de todas as corridas. Há forte correlação com efeito de lote mínimo (todos R >0,969). (B) Mais de 93% de nossas leituras em todas as corridas foram mapeadas com alta confiança (Q30 ou 99,9%). Observe que os valores do Q30 são fornecidos por faixa com várias faixas por corrida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplos de coloração imunohistoquímica para identificar os marcadores conhecidos selecionados.
As imagens são retratadas para (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD(D) SLC4A9(E) COL6A2. Imagens imunohistoquímicas são obtidas do Atlas de Proteína Humana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exemplos de coloração imunohistoquímica para ilustrar a expressão de genes marcadores não tradicionais em subsegmentos relevantes.
Transcrições retratadas com imunohistoquímica correspondente incluem (A) SHANK3 em glomerulus, (B) ACSM2B em túbulo proximal, (C) RAP1GAP no membro ascendente espesso, e(D) L1CAM no duto coletor. Imagens imunohistoquímicas são obtidas do Atlas de Proteína Humana. (*= p < 0,0001 por ANOVA) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Correlação entre duas dissecções distintas com sequenciamento separado da mesma amostra.
Observou-se alto grau de correlação entre diferentes dissecções no glomerulus (A)(B) proximal, e (C) laço ascendente espesso de Henle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Marcador | Segmento | Mudança de dobra | p-Valor |
| NPHS1 | Glomérulo | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | Túbulo Proximal | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | Membro Ascendente Espesso | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | Coletor de Dutos | 4.09 | 0.000133 |
| COL6A2 | Interstício | 7.19 | 1.47E-06 |
Tabela 1: Valores médios representativos para cada subsegmento de interesse entre três amostras de nefrectomia, em comparação com os subsegmentos restantes.
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Discussion
A transcriptômica baseada em LMD é uma tecnologia útil que ancora a expressão genética em áreas específicas dentro do tecido. A base dessa tecnologia e sua potencial aplicação no rim foram descritas anteriormente8. No entanto, a otimização, modernização e simplificação da dissecção baseada em fluorescência especificamente destinada à dissecção de alta precisão para sequenciamento de RNA a jusante é menos onipresente. Como essa metodologia é espacialmente fundamentada dentro do tecido, tem o potencial de revelar marcadores novos ou subestimados em estruturas teciduais, especialmente em estados de doenças. De fato, muitos marcadores comuns das células podem mudar com a doença, portanto, depender apenas dos marcadores de expressão de RNA celular para julgamento de identidade sem o contexto espacial pode ser desafiador nos estados da doença. Portanto, a abordagem LMD ancorada espacialmente provavelmente complementará e fornecerá uma plataforma de verdade terrestre para muitas outras tecnologias transcriômicas, como sequenciamento de RNA unicelular e único nuclear, que definem as células predominantemente pelo seu perfil de expressão genética9. Além disso, a profundidade da expressão genética fornecida pelo LMD (até 20.000 genes por amostra) fornece outra vantagem e local importante para cruzar dados de múltiplas fontes e contabilizar mudanças na expressão genética que podem não ser aparentes sem uma certa profundidade. A consideração da economia tecidual é outra característica positiva desta tecnologia, pela qual uma espessura de menos de 100 μm total de um bloco congelado poderia ser suficiente para um conjunto de dados LMD inteiro. Isso permite que o tecido remanescente seja usado para outros fins analíticos.
O LMD tem limitações. Uma limitação antecipada da aquisição de dados transcriômicos de microdisseção a laser é sua natureza de menor rendimento. A automação futura pode ser importante para melhorar a escalabilidade10,11. Duas limitações adicionais da transcriptômica LMD incluem a dependência da perícia e o impacto da qualidade do tecido nos resultados dos dados. A coleta inadvertida de células e materiais fora do segmento de interesse é uma limitação conhecida porque compartimentos enriquecidos de células são coletados, não uma única célula. O LMD se baseia na proficiência do usuário na compreensão da estrutura tecidual e, portanto, requer uma certa experiência de domínio. Assim, os indivíduos devem ser treinados para identificar regiões relevantes no rim com e sem manchas de anticorpos. Finalmente, o efeito da qualidade do tecido pode afetar a qualidade dos dados a jusante. O protocolo LMD leva à degradação tecidual, por isso a qualidade do material inicial é importante. No entanto, este protocolo foi otimizado em biópsias arquivadas com várias amostras de qualidade apenas moderada. Os dados incluídos mostram que a plataforma transcriptômica selecionada é robusta.
Note-se que o kit de isolamento utilizado e a metodologia a jusante do sequenciamento de RNA devem ser adaptados especificamente para o grau esperado de degradação do RNA. O protocolo de coloração aqui descrito foi adotado porque teve o efeito mais favorável na minimização desse efeito. Neste protocolo, o tecido foi incorporado em OUTUBRO, a fim de facilitar comparações futuras em outras tecnologias transcriômicas. No entanto, o tecido fixo formalin pode ser uma alternativa.
Os dados apresentados neste manuscrito revelam os benefícios da transcrição regional, incluindo a otimização, métricas de controle de qualidade e resultados tecnológicos. O estabelecimento de rigorosos critérios de controle de qualidade pré-analíticos e analíticos, e também o estabelecimento de evidências sólidas de rigor e reprodutibilidade é essencial para qualquer metodologia. As aplicações futuras de transcrição regional podem ser amplamente agrupadas em aplicações biológicas, avanços técnicos e progressos analíticos. Futuras aplicações biológicas podem ser destinadas ao interrogatório de tecidos de túbulos ilesos, feridos e regeneradores, bem como túbulos próximos à inflamação. Esses compartimentos podem ser identificados na mesma biópsia tanto por marcadores morfológicos tradicionais quanto por manchas de anticorpos para marcadores específicos "pathway". Os dois marcadores de anticorpos validados para uso nesta tecnologia, megalin e uromodulina, são altamente expressos no túbulo proximal e membro ascendente espesso, respectivamente. No entanto, é possível que esses marcadores possam ser reduzidos em tecido severamente doente. Nessas situações, a validação adicional de anticorpos de marcadores específicos da via ou marcadores novos que não alteram seu nível de expressão pode superar essa questão.
É provável que a LMD seja um método apropriado para usar no interrogatório transcriômico de outros órgãos. A seleção e otimização de anticorpos que trabalham para coloração rápida serão imprescindíveis. Um anticorpo que funciona em um protocolo regular de coloração pode não necessariamente funcionar para o protocolo de coloração rápida, que provavelmente requer anticorpos de alta afinidade. Um anticorpo conjugado primário minimizará as etapas necessárias e poderá oferecer vantagens. No entanto, a conjugação de um anticorpo para fluoroforos pode alterar a ligação, e experimentos piloto precisam ser realizados antes da incorporação desses reagentes no protocolo.
Em conclusão, descrevemos um pipeline para microdisseção a laser baseada em fluorescência para isolar áreas e estruturas específicas no rim humano para permitir uma análise transcriômica. Esta abordagem oferece vantagens importantes e pode ser estendida a outros tecidos para fornecer um interrogatório molecular baseado em tecido. A transcrição regional complementa outras tecnologias transcriômicas, fornecendo uma âncora histopatológica para compreender a expressão, auxiliando na interpretação da biologia e na assinatura da saúde e da doença. Esta tecnologia se encaixa naturalmente na visão para a construção de um atlas transcriômico do rim.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Geral: Os autores gostariam de agradecer aos pesquisadores do Projeto de Medicina de Precisão Renal (www.kpmp.org) pelo apoio e aconselhamento graciosos.
Financiamento: O suporte para este trabalho foi fornecido pelo NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo Projeto de Medicina de Precisão Renal (KPMP) do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK), (www.kpmp.org), sob o número de premiação U2CDK114886.
Disponibilidade de dados e materiais: Os dados são arquivados no Omnibus de Expressão Genética (GEO # pendente)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
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