Summary
Vi beskriver ett protokoll för laser microdissektion av undersegment av den mänskliga njuren, inklusive glomerulus, proximala tubule, tjock stigande lem, samla kanalen och interstitium. RNA isoleras sedan från de erhållna facken och RNA-sekvensering utförs för att bestämma förändringar i den transkriptomiska signaturen inom varje delsegment.
Abstract
Genuttryck analys av mänskliga njurvävnad är ett viktigt verktyg för att förstå homeostas och sjukdom patofysiologi. Att öka upplösningen och djupet av denna teknik och utvidga den till cellnivån i vävnaden behövs. Även om användningen av enstaka nukleära och encelliga RNA-sekvensering har blivit utbredd, upprätthåller uttryckssignaturer av celler som erhållits från vävnadsdisociation inte rumsligt sammanhang. Laser microdissection (LMD) baserat på specifika fluorescerande markörer skulle tillåta isolering av specifika strukturer och cellgrupper av intresse med känd lokalisering, vilket möjliggör förvärv av rumsligt förankrade transkriptomic signaturer i njurvävnad. Vi har optimerat en LMD-metodik, styrd av en snabb fluorescensbaserad fläck, för att isolera fem distinkta fack i den mänskliga njuren och genomföra efterföljande RNA-sekvensering från värdefulla mänskliga njurvävnadsprover. Vi presenterar också kvalitetskontrollparametrar för att göra det möjligt att bedöma om de insamlade exemplaren är adekvata. Arbetsflödet som beskrivs i detta manuskript visar genomförbarheten av denna metod för att isolera subsegmentala transkriptionsbaserade signaturer med högt förtroende. Det metodologiska tillvägagångssätt som presenteras här kan också tillämpas på andra vävnadstyper med ersättning av relevanta antikroppsmarkörer.
Introduction
Tekniska framsteg när det gäller att studera vävnadsprover har förbättrat förståelsen för hälsotillstånd och sjukdom i olika organ. Sådana framsteg har understrukit att patologi kan börja i begränsade regioner eller i specifika celltyper, men har ändå viktiga konsekvenser för hela organet. Därför är det i den nuvarande eran av personlig medicin viktigt att förstå biologin på både cell- och regional nivå och inte bara globalt1. Detta gäller särskilt i njuren, som består av olika specialiserade celler och strukturer som differentiellt initierar och/ eller svarar på patologisk stress. Patogenesen vid olika typer av mänsklig njursjukdom är fortfarande inte väl förstådd. Att generera en metodik för att studera förändringar i genuttryck i specifika rörformiga segment, strukturer eller områden av interstitium i den mänskliga njuren kommer att förbättra förmågan att avslöja regionspecifika förändringar som kan informera om patogenesen vid sjukdom.
Mänskliga njurbiopsiprover är en begränsad och värdefull resurs. Därför bör teknik som förhör transkriptomik i njurvävnad optimeras för att spara vävnad. De tillgängliga metoderna för att studera transkriptomik på cell- och regional nivå inkluderar RNA-sekvensering med en cell (scRNaseq), RNaseq (snRNaseq), rumslig hybridisering på plats och lasermikrodissektion (LMD). Den senare är väl lämpad för exakt isolering av regioner eller strukturer av intresse inom vävnadssektioner, för nedströms RNA-sekvensering ochanalys 2,3,4,5. LMD kan antas för att förlita sig på identifiering av specifika celltyper eller strukturer baserade på validerade markörer med fluorescensbaserad avbildning under dissekering.
De unika egenskaperna hos lasermikrodissekretionsassisterad regional transkriptomik omfattar: 1) bevarandet av cellernas och struktureras rumsliga sammanhang, som kompletterar encellsteknik där celler identifieras med uttryck snarare än histologiskt; 2) Tekniken informerar och informeras av annan bildteknik eftersom en antikroppsmarkör definierar uttryckssignaturer. 3) Förmågan att identifiera strukturer även när markörer förändras i sjukdom; 4) påvisande av lågt uttryckta transkriptioner i cirka 20 000 gener; och 5) anmärkningsvärd vävnadsekonomi. Tekniken är skalbar för en njurbiopsi med mindre än 100 μm tjocklek av en kärna som är nödvändig för tillräckligt RNA-förvärv och möjliggör användning av arkiverad frusen vävnad, som är allmänt tillgängliga i stora databaser eller akademiskacentra 6.
I det efterföljande arbetet beskriver vi den regionala och bulk transcriptomics tekniken i detalj, optimerad med en ny snabb fluorescens färgning protokoll för användning med mänskliga njurvävnad. Den här metoden förbättrar klassiska LMD-utforskningar eftersom den tillhandahåller separata uttrycksdata för delsegmenten interstitium och nephron i motsats till aggregerade tubulointerstitiella uttryck. Här ingår de kvalitetssäkrings- och kontrollåtgärder som vidtagits för att säkerställa stringens och reproducerbarhet. Protokollet möjliggör visualisering av celler och regioner av intresse, vilket resulterar i tillfredsställande förvärv av RNA från dessa isolerade områden för att tillåta nedströms RNA-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien godkändes för användning av Institutional Review Board (IRB) vid Indiana University.
OBS: Använd detta protokoll med njurnefrektomivävnad (upp till 2 cm i både X- och Y-måtten) som bevarats i den optimala skärtemperaturen (OCT) och lagrats vid -80 °C. Utför allt arbete på ett sätt som begränsar RNA-kontaminering, använd rena engångshandskar och en ansiktsmask. Se till att alla ytor är rena. Utrustningen för vilken detta protokoll optimerades är ett lasermikrodissektionssystem med pulsad UV-laser.
1. Kryosectioning
- Exponera 1,2 μm LMD PPS-membran (poly(p-fenylensulfid) glider till UV-ljus (i en vävnadskultur laminär flödeshuv) i 30 minuter, omedelbart före kryosectioning. Förvara diabilderna i rumstemperatur för optimal vävnads vidhäftning.
- Kyl kryostaten till -20 °C. Rengör arbetsytorna och montera ett nytt skärblad.
- Placera en liten skjutbox (rengjord med RNase ytdekontamineringslösning) inuti kryostatkammaren för att lagra diabilder med nyskuren vävnad.
- Fäst provet i OCT på en vävnadshållare och låt det jämvikta i några minuter för att nå kammartemperaturen och stärka vidhäftningen mellan OCT-blocket och hållaren. Hjälp processen med att använda en värmeavskiljare.
- Skär provet till en tjocklek av 12 μm och fäst det på den specialiserade LMD-bilden med hjälp av glidadaptern. Varje bild innehåller ett nephrectomy avsnitt per bild eller upp till två njurbiopsi avsnitt per bild. Förvara diabilderna vid -80 °C med torkmedelspatron och inuti en tätt sluten plastpåse för att förhindra att överskott av fukt ackumuleras inuti skjutboxen.
- Märk varje bild med ett prov-ID, datum och bildnummer.
- Använd bilderna med prover inom 10 dagar från det ursprungliga datumet för kryosectioning.
2. Mikrodissekering av laser
- Omedelbart före färgningen, förbered antikroppsblandningen (Ab-Mix) i 10% BSA i RNase-fri PBS genom att lägga till följande: 4 μL FITC-Phalloidin, 1,5 μL DAPI, 2 μL Tamm-Horsfall Protein (THP) antikropp direkt konjugerad med Alexa Fluor 546, 3,3 μL RNase-hämmare och 89,2 μL 10 % BSA i PBS (för att nå en volym på 100 μL).
OBS: Alternativa antikroppar kan användas i stället för THP-antikroppen. Till exempel kan 2 μL megalin/LRP2-antikroppar, direkt konjugerade med Alexa Fluor 568, användas för att märka den proximala tubuleen. Ab-Mix innehåller antingen LRP2- eller THP-antikroppar (för att visualisera antingen proximala tubuler respektive tjocka stigande lemmar). Andra antikroppar kan valideras enligt användarens behov. - Tvätta rutschkanan i iskall (-20 °C) 100% aceton i 1 min och flytta den till fuktighetskammaren.
- Tvätta bildens överst med RNase-fri PBS i 30 s. Upprepa.
- Tvätta bildens överst med 10% BSA i RNase-fri PBS i 30 s. Upprepa.
- Applicera Ab-Mix i 5 min.
- Tvätta bildens överst med 10% BSA i RNase-fri PBS i 30 s. Upprepa.
- Lufttorka rutschkanan i 5 minuter och ladda den på lasermikrodissektionskärplattformen.
- Installera uppsamlingsrören (autoklaverade 0,5 ml mikrocentrifugrör) som är lämpliga för PCR-arbete och som innehåller 50 μL extraktionsbuffert från RNA-isoleringssatsen.
- Fortsätt med LMD. Slutför varje LMD-session inom högst 2 timmar.
- Samla in för- och post-LMD immunofluorescensbilder, med hjälp av mikroskopkameran för att validera dissekeringen för variabilitet mellan operatörer samt arkiveringsändamål, utbildning och kvalitetsbedömning av det utförda protokollet. För att erhålla 0,5 – 1 ng RNA krävs minst 500 000 μm2-yta. Detta kräver ofta användning av upp till 8 x12 μm tjocka sektioner för att erhålla en tillräcklig mängd material för alla undersegment av intresse.
- Identifiera regioner av intresse genom färgning, morfologi och plats och punktskatter dem med laserkraft större än 40.
OBS: Här är dissekeringskriterierna. Den proximala tubule definieras av FITC-Phalloidin och LRP2 märkning. Den tjocka stigande delen definieras av THP-märkning. Insamlingskanalen definieras av nukleär morfologi (DAPI) och frånvaro av annan färgning. Glomerulus definieras av FITC-Phalloidin och morfologi. Interstitium definieras som området mellan färgade tubules.
- Få en masssignatur för tvärsnittsuttryck genom att fästa två 12 μm-sektioner på en LMD-bild och dissekera hela sektionerna i extraheringsbufferten.
- När LMD-processen är klar stänger du de uppsamlingsande mikrocentrifugrören och snärtar den kraftigt för att säkerställa att innehållet flyttas från locket till botten av röret
- Centrifugera rören med 3 000 x g i 30 s.
- Inkubera rören i 42 °C vattenbad i 30 min.
- Centrifugera rören med 3 000 x g i 2 minuter.
- Överför supernatanten till ett nytt 0,5 ml-rör och förvara det i -80 °C.
3. RNA-isolering
Obs: För detta RNA isolering protokoll, vi har anpassat ett protokoll från en kommersiell RNA isolering kit. Tillverkarens protokoll har ändrats för att uppfylla de kvalitetskontrollkrav som fastställts för projektet.
- Tillsätt 250 μL konditionerad buffert (CB) till varje RNA-reningskolonn (PC) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera alla datorer i 1 min vid 16 000 x g.
- Tillsätt 50 μL 70 % etanol (som ingår i satsen) i rören med vävnadsprover. Blanda proverna väl genom att leda upp och ner. Virvla inte. Centrifugera inte.
- Överför blandningen till konditionerade datorer och centrifugera i 2 min vid 100 x g (för att binda RNA), följ snabbt med centrifugering i 30 s vid 16 000 x g (för att ta bort flödet igenom). Upprepa detta steg om mer än 1 rör med vävnadsprover finns tillgängliga för ett givet delsegment.
- Tillsätt 100 μL tvättbuffert 1 (WB1) i datorerna och centrifug i 1 minut vid 8 000 x g.
- Förbered 40 μL DNase per varje prov (Tillsätt 5 μL DNase till 35 μL RDD-buffert). Tillsätt sedan 40 μL av blandningen direkt på datorns membran och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 40 μL WB1 på pc-membranet och centrifug i 15 s vid 8 000 x g.
- Tillsätt 100 μL tvättbuffert 2 (WB2) på pc-membranet och centrifug i 1 min vid 8 000 x g.
- Tillsätt 100 μL WB2 på pc-membranet, centrifugera i 2 min vid 16 000 x g, följ omedelbart med centrifugering i 1 min vid 16 000 x g.
- Överför datorn till ett nytt 0,5 ml-rör.
- Tillsätt 12 μL elueringsbuffert (EB) på membranet och inkubera i 7 minuter vid rumstemperatur. Således är den slutliga volymen av alla poolade dissekerade vävnadsprover 12 μL per delsegment.
- Centrifugera proverna i 1 min vid 1 000 x g och sedan i 2 min vid 16 000 x g.
- Överför 2 μL till ett nytt rör för Bioanalyzer-analys (för att förhindra frysningshändelser).
- Förvara alla rör i -80 °C tills de är klara för vidare bearbetning.
4. RNA-sekvensering
- Utvärdera varje prov, avsett för sekvensering, för kvalitet med hjälp av en kommersiell Bioanalyzer och ett chip som är dedikerat till att mäta små mängder RNA.
- Följande QC-parametrar (Quality Control) före biblioteksförberedelser och sekvensering krävs: Mängd RNA som är större än 4 ng för bulk och större än 0,5 – 1 ng för varje delsegment; Procenten av transkriptioner längre än 200 nukleotider (DV200) måste vara större än 25% för LMD-prover (optimala > 75%).
- Utför biblioteksförberedelser med ett kommersiellt cDNA-biblioteksförberedande kit avsett för små mängder försämrat RNA. För det kommersiella kit som anges i tillägget föreslår vi att du använder alternativ 2, som kräver minst DV200 på 25% och ingen fragmentering. Vissa sekvenseringstekniker kan kräva högre minimitrösklar för DV200, till exempel 30 %7.
- Lägg till cDNA-kort och index.
- Rena RNAseq-biblioteken med hjälp av magnetisk pärlteknik.
- Utarmas ribosomal cDNA med hjälp av ett kommersiellt rRNA-borttagningskit före RNAseq biblioteksförstärkningssteg.
- Rena det sista RNAseq-biblioteket med hjälp av magnetisk pärlteknik vid en 2 ng/μL cDNA-bibliotekskoncentration.
- Utför RNA-sekvensering på 75 bp parat ände på ett kommersiellt sekvenseringssystem med 30 miljoner läsningar/prov för bulk och 100 miljoner läsningar/prov för subsegmentala sektioner.
- Använd ett referens-RNA (25 μg) med varje sekvenseringskörning för att möjliggöra kontroll av batcheffekten. Den ursprungliga koncentrationen av vårt referens-RNA är 1 μg/μL, medan den slutliga koncentrationen som används vid sekvensering är 25 ng/μL. Kör referens-RNA som ett separat prov under biblioteksberedningen och kör med alla LMD-prover varje gång.
- Utför dataanalys med hjälp av FastQC-applikationen för att bedöma kvaliteten på sekvensering, intergena och mitokondriella läsningar och för att bestämma läsningar som tillskrivs en gen.
- Använd Integrative Genomics Viewer (IGV) för justering och edgeR/rbamtools för transkriptionsuttrycksmått.
- Ta bort prover med mindre än 100 000 läsningar. Kvantil normaliserar de råa avläsningarna i data uppsättningen efter att ha filtrerat ut lågt uttryckta gener vid ett användardefinierat tröskelvärde.
- Kvantifiera uttrycket som ett förhållande mellan undersegmentet av intresse och genomsnittet för alla andra delsegment och log2-transformering. Relativa uttryck för samma gen kan jämföras mellan delsegment och prover. Det är dock inte idealiskt att jämföra relativa uttryck mellan två olika gener på grund av potentiella skillnader i nedbrytning mellan gener och RNA-arter.
- Utför en anrikningsanalys för att jämföra genuttryck för en uppsättning tillverkare som är specifika för varje nefronundersegment, medan referens-RNA-prover jämförs mellan partier. En batcheffekt inom 1 standardavvikelse för medelvärdesuttryck med R-värde > 0,9 anses godtagbar. Ytterligare normalisering krävs för en högre batcheffektpoäng. Alla körningar som avviker från den accepterade batcheffekten kan flaggas. Q30 bör vara större än >90% för varje sekvenseringskörning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prover
Vi presenterar data från nio referens nephrectomies (3 exemplar erhålls vid Indiana University och 6 exemplar erhålls genom Kidney Precision Medicine Project), med hjälp av rapid fluorescence färgning protokoll för att isolera njure nephron segment och interstitiella områden. De avsnitt som används i denna process erhölls från avlidna njure givare eller opåverkade tumör nephrectomies. Dessa prover hade inte patologiska tecken på sjukdom som visualiserats i H&E-fläcken som tagits från angränsande avsnitt (figur 1A).
Kvalitetskontroll för lasermikrodissektion
Identifiering av rörformiga delsegment i njuren uppnås genom antikroppsfärgning av unika rörformiga markörer, liksom morfologi och strukturella landmärken. Figur 1B-C illustrerar färgning och mikrodissektion av rörformiga delsegment från en representativ nefrectomy. Detta uppnås genom färgning med DAPI (atomkärnor), FITC-Phalloidin (F-aktin) och en ytterligare antikropp vid behov. Den fluorescensfärgning som användes gjorde det möjligt att visualisera njurundersegment med hög grad av förtroende, ytterligare styrd av morfologiska egenskaper samt rumslig positionering av de bildade strukturerna (Figur 2). Till exempel avslöjas glomeruli av falloidin och DAPI färgning med mycket särskiljande morfologi. På samma sätt visualiseras insamling av kanaler med hjälp av nukleär morfologi och frånvaron av andra fläckar. Megalin/LRP2-antikroppen (direkt konjugerad till Alexa Fluor 568) används här för att identifiera proximala tubuler. Den tjocka stigande delen visualiseras med hjälp av en Tamm-Horsfall protein (THP) antikroppar (direkt konjugerade till Alexa Fluor 546). Interstitiumet är däremot struket längs tubulernas yttre membran och innehåller stromala och immunceller samt små kapillärer.
För att få tillräckligt med RNA på 0,5 – 1 ng per delsegment försöker vi dissekera ett minimiområde på 500 000 μm2. Detta kräver i allmänhet fem till åtta 12 μm tjocka sektioner (1 sektion per bild) för att erhålla tillräckligt med material för alla delsegment. Dissekeringen av en bild slutförs på mindre än 2 timmar för att bevara RNA-kvaliteten vilket gör att man kan skära ~ 4 segment per bild. Införskaffad vävnad från samma delsegment slås samman från flera diabilder för nedströmssekvensering. En immunofluorescensbild före och efter LMD erhålls för att validera samlingen av undersegment av intresse med hjälp av en bifogad kamera. Figur 3 avgränsar framgångsgraden för dissekeringsområdet och minsta RNA-ingång. Framgångsgraden för att uppfylla minsta områdesindata var >90 % i den här representativa datauppsättningen. Om källvävnaden har en liten mängd CD eller interstitium finns det en möjlighet att dissekeringsområdet kommer att vara under 500 000 μm2 för dessa segment efter att ha använt 8 bilder. Ytterligare bilder kan klippas beroende på användarens behov. Men som ses i figur 3, om området är nära 500 000 μm2, har det önskade antalet upptäckta gener en hög framgångsgrad (100%) och den totala läsräkningsframgångsgraden är 98,6% (1 prov föll under QC-måttet). Således fanns det tillräckligt med vävnad för att uppnå tillräcklig gen och läsa räkningar utan att använda ytterligare vävnad.
Kvalitetskontroll för sekvensering av indata
Den valda kommersiella biblioteksberednings- och sekvenseringsplattformen möjliggör reproducerbara mätningar av transkriptionsuttryck, även med låga mängder mycket försämrat RNA. Den minsta RNA-ingången är 500 pg och den minsta DV200 (andelen läsningar längre än 200 nukleotider i längd) är över 25%. Det finns inget minimum av RIN. Sekvensering med 100 miljoner läsningar per prov försöker vi mätta de tillgängliga läsningarna för att upptäcka lågt uttryckta transkriptioner. De totala läsningarna kan justeras efter användarens behov.
Det är enkelt att få tillräckligt med RNA från två 12 μm bulk tvärsnitt avsnitt, så vi försöker få en högre minsta totala mRNA mängd på 4 ng för bulk sekvensering. Som avgränsas i protokollet kräver varje delsegment 0,5-1 ng totalt RNA. Den optimala RNA-koncentrationen är över 50 pg/μL efter isolering. RNA-mängder som är lägre än detta kan leda till minskad gendetektering och observerade läsantal. Majoriteten av proverna ger >20 000 upptäckta gener och >1 miljoner läsningar. En DV200 som är större än 25% för alla exemplar krävs av tillverkaren (>75% anses optimal). Även om RIN mäts, minskar processen för lasermikrodissektion RIN och RNA-sekvenseringsplattformarna har optimerats för fragmenterat RNA. RNA-kvantitet och kvalitet bedöms av en bioanalyzer före sekvensering. Den snabba fläcken minskar den tid vävnaden utsätts för rumstemperatur och vattenförhållanden, vilket minimerar försämringen av RNA i möjligaste mån. Kvalitetskontrollmåttet DV200 för sekvensering av indata finns också i figur 3.
Kvalitetskontroll för sekvensering av utdata
Databehandling nedströms använder kvantil normalisering för att möjliggöra jämförelser mellan prover i olika partier. Ett minsta antal gendetektioner på 10 000 och ett minsta läsantal på 1 miljon används som trösklar för att inkludera prover i kvantil normalisering. Prover med lägre gendetektering eller läsantal är uteslutna från kvantil normalisering och efterföljande jämförande analyser. Endast 1 av 98 dissekerade delsegmentprover uppfyllde inte dessa tröskelvärden (figur 3). Q30 (andelen läsningar som kartlagts med 99,9 % konfidens) har varit större än 93 % för varje sekvenseringsexperiment(figur 4).
Vi sekvens en mänsklig referens RNA (25 ng) med varje sekvensering kör för att tillåta korrigering för sats effekt om en sådan korrigering önskas eller krävs. Den uppmätta satseffekten bör ligga inom 1 standardavvikelse från medelvärdet med ett R-värde > 0,9. Om batcheffekten är högre krävs ytterligare normalisering för den sekvenseringskörningen. Här har batcheffekten legat under 3 % i de fyra sekvenseringsexperiment som beskrivs i figur 4. Således adresseras batcheffekten vanligtvis med kvantil normalisering för alla sekvenserings körningar, agnostiska till referens-RNA. Ingen korrigering baserad på referens-RNA har genomförts ännu, men denna information är tillgänglig och kan användas beroende på målen för en viss analys.
Rigor och reproducerbarhet
Det är viktigt att visa stringens vid identifiering av celltyper och strukturer. Efter lasermikrodissektion testar vi för berikning av kända markörer i glomeruli, PT, TAL, CD och interstitium jämfört med de andra facken(tabell 1). En anrikningsanalys används för att jämföra genuttryck för förutbestämda förväntade markörer. Genuttryck förmedlas somlog 2-förhållanden för uttrycket av undersegmentet av intresse jämfört med medelvärdet för de andra delsegmenten. Detta uttrycksmått valdes för mänskliga prover eftersom det minskar variabiliteten mellan individer, vilket underlättar jämförelser mellan cell- och facktyper mellan exemplar. Men de råa läsningarna och kvantilnormaliserade läsningarna kan också jämföras i alternativa analyser. Figure 5 illustrerar exempel på immunohistokemisk färgning av dessa 5 utvalda kända markörer, som presenteras i humanproteinatlasen.
Således presenterar vi orthogonal data källor som ger förtroende för rätt delsegment samlas in: 1) avbildning som inkluderar antikropp fläck och morfologi i segmentet/facket och 2) uttrycket utdata som visar kända markörer uttrycks i motsvarande delsegment.
Den regionala transkriptomiska analysen av gener uttryckta i varje delsegment möjliggör ny och underskattad marköridentifiering. Figur 6 illustrerar ett exempel på en markör för varje delsegment som identifierats genom LMD-regional transkriptomik som också gav en specifik immunohistokemisk färgning av motsvarande nephron-delsegment.
För att visa reproducerbarhet och förstå effekten av operatörens variabilitet genomförde vi ett experiment på ett tumör nefrectomy prov. Detta exemplar hade glomeruli, PT och TAL re-dissekerade för att öka förtroendet för RNA sekvensering resultat och nu fungerar som en användbar teknisk replikat. Månader ifrån varandra genomgick detta prov en andra instans av kryosectioning, antikropp färgning, LMD dissekering, RNA extraktion, bibliotek prep och RNA sekvensering (Figur 7) av glomeruli, PT och TAL fack. De två versionerna (v1 och v2) jämfördes. De glomerulära, PT och TAL-facken var mycket korrelerade med r2-värden > 0,95, liknande den minimala batcheffekten av vårt referens-RNA.
Figur 1: Representativa bilder av njurvävnaden.
A)H&E-fläck av en mänsklig referens njurvävnad. B)Immunofluorescerande bild av human referens njurvävnad med färgade tjocka stigande lem segment före LMD och (C) omedelbart efter dissekering av enstaka tjocka stigande lem struktur. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder av referens njursubsegment, visualiserade vid 20x med hjälp av en specifik immunofluorescerande färgning strategi.
a)En Glomerulus,B)Proximal Tubule,C)Tjock stigande lem,d)Uppsamlingskanal,e)Interstitium. (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001 av ANOVA). Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mätvärden för kvalitetskontroll i segmenterad transkriptomik.
a)Mer än 90 % av pilotproverna uppfyllde tröskelvärdet för dissekeringsområdets insats på 500 000 μm2. (B) Alla prover utom ett uppfyllde den önskade RNA-ingången på minst 500 pg. (C) 100% av pilotproverna uppfyllde tillverkarens lägsta DV200-tröskel på 25% och (D) 100% av proverna uppfyllde vårt minimitröskel på 10 000 upptäckta gener. E)Alla prover utom ett nådde ett minsta totala läsantal på 1 miljon. Som förväntat korrelerar lägre dissektionsområden med minskade RNA-koncentrationer, lägre genantal och lägre läsantal. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Sekvensering av kvalitetskontroll.
(A) Sekvenseringskörningar som använder ett referens-RNA (inte kvantilnormaliserat) jämförs med medelvärdet uttryck för alla körningar. Det finns en stark korrelation med minsta batcheffekt (alla R >0,969). (B) Större än 93% av våra läsningar i alla körningar kartlades med högt förtroende (Q30 eller 99,9%). Observera att Q30-värden tillhandahålls per körfält med flera körfält per körning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Exempel på immunohistokemisk färgning för att identifiera de valda kända markörerna.
Bilder avbildas för( A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD(D) SLC4A9 (E) COL6A2. Immunohistokemiska bilder erhålls från Human Protein Atlas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Exempel på immunohistokemisk färgning för att illustrera uttryck för icke-traditionella markörgener i relevanta delsegment.
Avbildade transkriptioner med motsvarande immunohistokemi inkluderar (A) SHANK3 i glomerulus, (B) ACSM2B i proximal tubule, (C) RAP1GAP i den tjocka stigande delen och (D) L1CAM i uppsamlingskanalen. Immunohistokemiska bilder erhålls från Human Protein Atlas. (*= p < 0.0001 av ANOVA) Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Korrelation mellan två distinkta dissektioner med separat sekvensering av samma prov.
En hög grad av korrelation observerades mellan olika dissekeringar i (A) glomerulus, (B) proximal tubule och ( C )tjockstigande slinga av Henle. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Markör | Segment | Vik förändring | p-Värde |
| NPHS1 (NH1) | Glomerulus (på andra) | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 (LRP2) | Proximal Tubule | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD (på andra) | Tjock stigande lem | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 (olika) | Samla in kanal | 4.09 | 0.000133 |
| KOL6A2 | Interstitium | 7.19 | 1.47E-06 |
Tabell 1: Representativa genomsnittsvärden för varje undersegment av intresse bland tre nephrectomyprover, jämfört med de återstående delsegmenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD-baserad transkriptomik är en användbar teknik som förankrar genuttryck till specifika områden i vävnaden. Grunden för denna teknik och dess potentiella tillämpning i njuren har beskrivits tidigare8. Optimering, modernisering och effektivisering av fluorescensbaserad dissekering som specifikt syftar till hög noggrannhet dissekering för nedströms RNA-sekvensering är dock mindre allestädes närvarande. Eftersom denna metod är rumsligt grundad i vävnaden, har den potential att avslöja nya eller underskattade markörer i vävnadsstrukturer, särskilt i sjukdomsstater. Faktum är att många vanliga markörer för celler kan förändras med sjukdom, vilket endast förlitar sig på cellen RNA-uttrycksmarkörer för identitetsbedömning utan det rumsliga sammanhanget kan vara utmanande i sjukdoms tillstånd. Därför är det rumsligt förankrade LMD-tillvägagångssättet sannolikt att komplettera och tillhandahålla en mark-sanningsplattform för många andra transkriptomiska tekniker som encellig och enda kärn-RNA-sekvensering, som definierar celler genom att främst genom deras genuttrycksprofil9. Dessutom ger genuttryckets djup som tillhandahålls av LMD (upp till 20 000 gener per prov) en annan fördel och viktig plats för att korslänka data från flera källor och redogöra för förändringar i genuttryck som kanske inte är uppenbara utan ett visst djup. Övervägandet av vävnadsekonomin är ett annat positivt inslag i denna teknik, där en tjocklek på mindre än 100 μm totalt från ett fruset block kan vara tillräckligt för en hel LMD-datauppsättning. Detta gör det möjligt att använda överbliven vävnad för andra analytiska ändamål.
LMD har begränsningar. En förväntad begränsning av laser microdissection transcriptomic data förvärv är dess lägre genomströmning natur. Framtida automatisering kan visa sig viktigt för att förbättraskalbarheten 10,11. Två ytterligare begränsningar av LMD-transkriptomik inkluderar beroendet av expertis och vävnadskvalitetens inverkan på dataresultaten. Oavsiktlig insamling av celler och material utanför intressesegmentet är en känd begränsning eftersom berikade cellfack samlas in, inte en enda cell. LMD förlitar sig på en användares färdigheter i att förstå vävnadsstrukturen och kräver därför en viss domänexpertis. Således måste individer utbildas för att identifiera relevanta regioner i njuren med och utan antikroppsfärgning. Slutligen kan effekten av vävnadskvaliteten påverka datakvaliteten nedströms. LMD-protokollet leder till vävnadsnedbrytning, så kvaliteten på utgångsmaterialet är viktig. Detta protokoll optimerades dock på arkiverade tarmbiopsier med flera prover av endast måttlig kvalitet. De data som ingår visar att den valda transkriptionsplattformen är robust.
Observera att isoleringssatsen som används och nedströmsmetoden för RNA-sekvensering måste skräddarsys specifikt för den förväntade graden av RNA-nedbrytning. Färgningsprotokollet som beskrivs här antogs eftersom det hade den mest gynnsamma effekten på att minimera en sådan effekt. I detta protokoll var vävnad inbäddad i OCT för att underlätta framtida jämförelser mellan andra transkriptomiska tekniker. Formalin fast vävnad kan dock vara ett alternativ.
De data som presenteras i detta manuskript avslöjar fördelarna med regional transkriptomik, inklusive optimering, kvalitetskontrollmått och teknikresultat. Fastställandet av rigorösa kriterier för förhandsanalys och analytisk kvalitetskontroll, och även fastställandet av solida bevis på stringens och reproducerbarhet är avgörande för alla metoder. Framtida tillämpningar av regional transkriptomik kan i stort sett grupperas i biologiska tillämpningar, tekniska framsteg och analytiska framsteg. Framtida biologiska tillämpningar kan syfta till förhör av vävnad från oskadda, skadade och regenererande tubules, liksom tubules i närheten av inflammation. Dessa fack kan identifieras i samma biopsi både genom traditionella morfologiska markörer samt antikroppsfläckar för "väg" specifika markörer. De två antikroppsmarkörerna som validerats för användning i denna teknik, megalin och uromodulin, uttrycks starkt i proximala tubule respektive tjock stigande lem. Det är dock möjligt att dessa markörer kan minskas i allvarligt sjuka vävnader. I dessa situationer kan ytterligare antikroppsvalidering av kursspecifika markörer eller nya markörer som inte ändrar deras uttrycksnivå lösa problemet.
LMD är sannolikt en lämplig metod att använda vid transkription av andra organ. Urval och optimering av antikroppar som fungerar för snabb färgning kommer att vara absolut nödvändigt. En antikropp som fungerar i ett regelbundet färgningsprotokoll kanske inte nödvändigtvis fungerar för det snabba färgningsprotokollet, vilket sannolikt kräver antikroppar med hög affinitet. En primär konjugerad antikropp minimerar de steg som behövs och kan ge fördelar. Konjugation av en antikropp mot fluorforer kan dock ändra bindningen, och pilotexperiment måste utföras innan dessa reagenser införlivas i protokollet.
Sammanfattningsvis beskriver vi en pipeline för fluorescensbaserad laser microdissection att isolera specifika områden och strukturer i den mänskliga njuren för att möjliggöra en transkriptomic analys. Detta tillvägagångssätt erbjuder viktiga fördelar och kan utvidgas till andra vävnader för att ge en vävnadsbaserad molekylär förhör. Regional transkriptomik kompletterar andra transkriptomiska tekniker genom att tillhandahålla ett histopatologiskt ankare för att förstå uttryck, hjälpa till med tolkningen av biologin och signaturen av hälsa och sjukdom. Denna teknik passar naturligt inom visionen för att bygga en transkriptomisk atlas över njuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Allmänt: Författarna vill tacka utredarna av Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) för deras älskvärda stöd och råd.
Finansiering: Stöd för detta arbete tillhandahölls av NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Forskning som rapporterades i detta manuskript stöddes av National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), under tilldelningsnummer U2CDK114886.
Tillgång till data och material: Data arkiveras i Gene Expression Omnibus (GEO # väntar)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
