Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تقنيات التلقيح الدقيق الجنيني لتولد موتاسيس محدد الموقع الفعال في Culex quinquefasciatus

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/61375
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3
1Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2Department of Entomology and Plant Patholog, Auburn University, 3Tata Institute for Genetics and Society, University of California, San Diego

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراءات التلقيح المجهري لأجنة Culex quinquefasciatus التي تم تحسينها للعمل مع أدوات تحرير الجينات CRISPR/Cas9. يمكن لهذه التقنية أن تولد بكفاءة طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للوراثة يمكن استخدامها لبناء تقنيات جينية في ناقلات الأمراض هذه غير الم مدروسة.

Abstract

Culex quinquefasciatus هو ناقل لمجموعة متنوعة من الأمراض المنقولة بالنواقل مثل ملاريا الطيور وفيروس غرب النيل (WNV) والتهاب الدماغ الياباني والتهاب الدماغ الشرقي والشعيرات اللمفاوية والتهاب الدماغ سانت لويس. وتجدر الإشارة إلى أن ملاريا الطيور لعبت دورا رئيسيا في انقراض العديد من أنواع الطيور الجزرية المستوطنة، في حين أصبح فيروس نقص الطيور من الأمراض الهامة المنقولة بالنواقل في الولايات المتحدة. للحصول على مزيد من البصيرة في بيولوجيا C. quinquefasciatus وتوسيع مجموعة أدوات التحكم الجيني الخاصة بهم ، نحتاج إلى تطوير طرق أكثر كفاءة وبأسعار معقولة لهندسة الجينوم في هذا النوع. ومع ذلك ، فإن بعض الصفات البيولوجية الفريدة من نوعها للبعوض Culex ، ولا سيما طوافات البيض الخاصة بهم ، جعلت من الصعب إجراء إجراءات التلقيح الدقيق المطلوبة لهندسة الجينوم. ولمعالجة هذه التحديات، قمنا بتطوير بروتوكول محسن للجينات الدقيقة يركز على تخفيف العقبات التقنية المرتبطة بالخصائص الفريدة للبعوض Culex. توضح هذه الإجراءات الطرق المثلى لجمع البيض وفصل طوافة البيض وإجراءات المناولة الأخرى الضرورية للتكميل المجهري الناجح في C. quinquefasciatus. وعندما تقترن هذه الإجراءات بتكنولوجيا تحرير الجينوم CRISPR/Cas9، فإنها تسمح لنا بتحقيق طفرات جرثومية محددة الموقع وفعالة وقابلة للوراثة، وهي طفرات مطلوبة لإجراء هندسة الجينوم المتقدمة وتطوير تكنولوجيات التحكم الجيني في هذا ناقلات الأمراض الهامة، ولكن غير المفحودة حاليا.

Introduction

C. quinquefasciatus، المعروف باسم البعوض المنزل الجنوبي ، هو ناقل المختصة من مسببات الأمراض العديدة بما في ذلك فيروس غرب النيل (WNV) ، والتهاب الدماغ الياباني ، والتهاب الدماغ سانت لويس ، والتهاب الدماغ الخيول الشرقية. على وجه الخصوص، منذ اكتشافه لأول مرة في نيويورك في عام 1999 ، أصبح WNV مرضا رئيسيا ينتقل عن طريق النواقل في جميع أنحاء الولايات المتحدة القارية (الولايات المتحدة) مع أكثر من 50،000 حالة بشرية تم الإبلاغ عنها مما أدى إلى حوالي 2300 حالة وفاة بين عامي 1999 و 20181 بالإضافة إلى أكثر من 4500 حالة إعتدال تم الإبلاغ عنها بين عامي 2008-20192. وبالإضافة إلى ذلك، تأثر ما لا يقل عن 23 نوعا من الطيور الموجودة في أمريكا الشمالية بعدوى WNV مع ما لا يقل عن 12 نوعا مصنفة على أنها غير قابلة للاسترداد نتيجة لWNV3. ويرجع تأثير WNV على البشر والخيول وتجمعات الطيور إلى سلوك التغذية الانتهازية لناقلاتها. عادة ، الطيور هي المضيف الرئيسي لWNV ، والبشر والخيول هي المضيفين العرضية أو مسدودة. بعض مسببات الأمراض المتجهة بواسطة C. quinquefasciatus تصيب الطيور فقط مثل طفيلي ملاريا الطيور ، بقايا البلازموديوم. في هاواي، C. quinquefasciatus هو ناقل رئيسي للملاريا الطيور وتسبب في انقراض العديد من أنواع الطيور المحلية4،5.

لمكافحة الأمراض التي تنتقل عن طريق C. quinquefasciatus، استخدم الباحثون ووكالات مكافحة ناقلات الأمراض أدوات مكافحة البعوض المنشأة بشكل شائع مثل تطبيق المبيدات الحشرية6، ومع ذلك ، فإن هذه الطرق مكلفة ، وليست خاصة بالأنواع ، ولها فعالية محدودة حيث أن مقاومة المبيدات الحشرية عالية في العديد من مجموعات C. quinquefasciatus 6و7و8و9. تقنيات مكافحة أخرى، مثل استراتيجيات السيطرة على السكان المستندة إلى وولباشياوقد وضعت في السنوات الأخيرة10،11، ولكن تكاليف اللياقة البدنية المرتبطة عدوى وولباشيا تحد من جدوى هذا النهج لهذا المتجه12. وهناك أيضا أساليب المكافحة الجينية التي تم تطويرها في أنواع البعوض الأخرى مثل Aedes aegypti13،14، Anopheles gambiae15 و Anopheles stephensi16، بما في ذلك تطوير البعوض المقاوم للأمراض17،18،19، والتي يمكن تطويرها أيضا ل C. quinquefasciatus إذا كانت أدوات هندسة الجينوم المطلوبة هي وضعت لهذا النوع. ومع ذلك ، فإن بيولوجيا C. quinquefasciatus تختلف اختلافا كبيرا عن ناقلات البعوض الأخرى Aedes و Anopheles مما جعل تطوير تقنيات جينية مماثلة أمرا صعبا في هذا الناقل. مع ظهور تقنيات هندسة الجينوم المستندة إلى CRISPR ، أصبحت هندسة الجينوم الدقيقة تافهة بشكل متزايد وبأسعار معقولة وقابلة للتكيف ، وبالتالي أدت إلى تطوير أدوات جينية جديدة في مجموعة واسعة من الأنواع.

لتوليد الطفرات مع التكنولوجيات القائمة على CRISPR، يتم تقسيم خليط من البروتين Cas9 والجيش الملكي النيبالي دليل الاصطناعية (sgRNA)، مكملة لloci المطلوب، في الأجنة مرحلة ما قبل blastoderm. منذ C. quinquefasciatus الإناث وضع بيضها في مجموعات تعلق في هيكل طوف العائمة (الشكل 1)، بدلا من البيض الفردية ovipositing، سمة من سمات البعوض Aedes و Anopheles، والاحتراقات الدقيقة الجنين معقدة على نحو متزايد في هذا النوع. تظهر يرقات Culex أيضا من الجانب الأمامي لكل بيضة ، والتي هي على اتصال مع سطح الماء (الشكل 1) ، لذلك فإن معالجة اتجاه البيض مهمة في هذا النوع. هنا نصف بروتوكول مفصل مصممة للميكرونجيكشن من البروتين Cas9 وsgRNA في أجنة C. quinquefasciatus. وقد تم تصميم هذا البروتوكول لاستيعاب الصفات الفريدة لبيولوجيا Culex من أجل تحسين بقاء الجنين ومعدلات طفرة الجينوم من خلال خطوات معينة هي المفتاح لجمع البيض في الوقت المناسب وبقاء البيض.

Protocol

1. C. تربية مستعمرة كوينكويفاستيتوس

  1. إعداد مستعمرات متعددة من البالغين C. quinquefasciatus في أقفاص النوم علة.
    ملاحظة: تم توفير المستعمرات من قبل الدكتور لورا هارينغتون في جامعة كورنيل20. ويمكن الاطلاع على بروتوكولات مفصلة لتربية البعوض Culex في الأدب الأخرى21.
    1. الحفاظ على البعوض في 25 ± 1 درجة مئوية في الرطوبة 30٪ مع 12:12 ساعة في اليوم: دورة ليلية.
    2. توفير 20٪ من محلول السكر الإعلانية libitum عن طريق إدخال حاوية محلول السكر مع فتيلة في القفص أو عن طريق تشبع كرات القطن مع محلول السكر ووضعه داخل القفص.
  2. السماح للبعوض بالتزاوج لمدة 3 أيام على الأقل قبل تغذية الدم (الشكل 2A).

2. مجموعة من الأجنة مرحلة ما قبل blastoderm C. quinquefasciatus

  1. بعد 3-6 أيام بعد انهيار الجلد، وتوفير الإناث مع 1-2 مل من وجبة الدم البقري citrated من خلال غشاء الاصطناعية وتسخينها إلى ما يقرب من 40 درجة مئوية في نظام تغذية الدم (الشكل 2B). وهناك أيضا بروتوكولات بديلة لتغذية الدم يمكن استخدامها للبعوض Culex (على سبيل المثال، انظر المرجع21).
    ملاحظة: C. ومن المعروف quinquefasciatus لتفضيل لدم الطيور. تستخدم بعض المختبرات الطيور الحية المخدرة أو دم الطيور لمصدر وجبة الدم21،22،23. ومع ذلك ، يمكن تدريب / اختيار المستعمرات لتتغذى على الدم البقري أو القوارض الصغيرة إذا تم اختيار هذه الميزة لأكثر من أجيال متعددة.
    1. السماح للإناث بالراحة لمدة لا تقل عن 3 أيام بعد تغذية الدم للخضوع لتولد البويضة ونضوجها قبل تحفيز oviposition لتجارب التحويض الدقيق.
  2. في يوم الاحتياجات الدقيقة الجنينية ، قم بإنشاء كوب oviposition مع ماء oviposition المشبع عضويا. وينبغي أن يتم الماء Oviposition عن طريق تخمير براز الأرانب (50 غرام / لتر)، العشب المتحلل (4.5 غرام / لتر)، أو أغذية السمك (25 غرام / لتر) في الماء على مدى 5 أيام أو أكثر24،25.
  3. وضع كأس oviposition في القفص ووضع القفص بأكمله في مكان مظلم (الشكل 2C).
  4. بعد كل 30 دقيقة، تحقق من الكأس بحثا عن طوافات البيض.
    1. إذا كانت طوافات البيض موجودة، وجمع الطوافات عن طريق مغرفة لهم مع فرشاة الطلاء ووضعها على ورقة تصفية الرطب(الشكل 2D، E).

3. محاذاة C. كوينكويفاسيتوس قبل blastoderm مرحلة الأجنة

  1. فصل البيض من الطوافات عن طريق الضغط على الطوافة وإغاظة البيض بشكل فردي باستخدام فرشاة الطلاء تلميح غرامة والملقط(الشكل 2E).
  2. محاذاة البيض الفردية على شريط رقيقة من الشريط لزجة على الوجهين وضعت عبر الجزء العلوي من شريحة زجاجية (الشكل 2F).
  3. أثناء المحاذاة، حاول توجيه الجانب الأمامي من كل بيضة في نفس الاتجاه لتسهيل الوصول.
    ملاحظة: يمكن العثور على طريقة بديلة لمحاذاة البويضات بدون شريط لاصق مزدوج الجانب في بروتوكول26لشفط الأجنة في Nasonia vitripennis المنشور سابقا.
  4. غطي البيض بمزيج زيت الهالوكربون.
    ملاحظة: يمكن تحضير مزيج الهالوكربون في وقت مبكر عن طريق خلط اثنين من الكواشف الهالوكربونية والماء برفق (9:1:20، الهالوكربون 700: الهالوكربون 27: المياه فائقة البور) ومن ثم احتضان الخليط بين عشية وضحاها في 25οC لتسهيل تشبع الماء من زيت الهالوكربون.

4. إعداد إبرة للميكروبيكشنس

  1. توليد الإبر الزجاجية الشعرية الألومينوسيليكات باستخدام سحب micropipette الزجاج.
    1. ضع زجاج شعري ألومينوسيليكات في سحب إبرة، وفقا لتعليمات من دليل المستخدم إبرة سحب.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام إبر الكوارتز والبوروسيليكاتي الشعرية ، ولكن لهذه التجربة ، يفضل الألومينوسيليكات بسبب قدرتها النسبية على تحمل التكاليف ومتانتها.
    2. تعيين الحرارة إلى 516، السرعة إلى 100، تأخير إلى 70، سحب إلى 97، والضغط إلى 500 على سحب إبرة.
    3. تنشيط سحب الإبرة، وفقا لتعليمات سحب وكرر حسب الحاجة لإبر إضافية.
      ملاحظة: أثناء عملية الحقن، غالبا ما تصبح الإبر مسدودة أو مكسورة بطريق الخطأ، لذلك يوصى بشدة بسحب إبر إضافية لتجربة واحدة.
  2. شطب طرف الإبرة عن طريق لمس بلطف غيض من الإبرة سحبت على لوحة جلخ الماس الدورية لحوالي 10 ق بزاوية 50 درجة.
    ملاحظة: يغلف الإبرة يفتح للسماح للسائل بالتدفق من خلال في حين خلق أيضا تلميح أكثر وضوحا لتسهيل اختراق الجنين. ويمكن رؤية مثال على إبرة السليم في المادةالسابقة 26.
  3. مخزن سحبت و مشطوف الإبر عن طريق تضمينها في خطوط الطين العارضة في طبق بيتري.
    ملاحظة: لضمان أفضل نوعية للحصول على نصائح إبرة، الإبر ينبغي سحبها حديثا ومغلفة أقرب وقت ممكن من الحقن.

5. تحميل خليط الحقن

  1. إعداد خليط الحقن الذي يتكون من كاشفات تعديل الجينوم (على سبيل المثال، 200 نانوغرام/μL sgRNA و 200 نانوغرام/μL Cas9 خليط)، أو حلول الحقن المفضلة وإبقائه على الجليد.
    ملاحظة: يمكن إعداد هذا المزيج في انتظار وضع البيض. مزيد من التفاصيل عن Cas9 و SGRNA الإنتاج والتحضير للmicroinjection يمكن العثور عليها في المنشورات السابقة27،28،29،30.
  2. تحميل 2 ميكرولتر من خليط الحقن في إبرة الحقن باستخدام طرف microloader.

6. إنشاء الميكرويكشن

  1. ضع إبرة الحقن المملوءة في جهاز مايكرومانيبواتور تم إعداده مرتبطا بمضخة دقيقة إلكترونية.
  2. ضع الشريحة الزجاجية التي تحتوي على البيض المنحاز على خشبة مسرح المجهر المركب.
  3. باستخدام المجهر المجهري والمجهر المركب، قم بمحاذاة الإبرة لتصويب النهاية الخلفية للجنين بزاوية 25-35 درجة.

7. جنين الميكرويكشن (الشكل 2G)

  1. أدخل الإبرة بعناية في الجنين وحقن الخليط بكمية حوالي 10٪ من حجم الجنين (700-800 pL اعتمادا على حجم البويضات).
    ملاحظة: عند الحقن، يجب أن تنتفخ البويضة قليلا، ومع ذلك، إذا تم حقن الكثير من السوائل، قد ينفجر البيض، أو قد يتسرب السائل السيتوبلازمي.
  2. حقن حوالي 20 بويضة في وقت واحد ثم وقف وإجراء إجراءات استعادة الجنين.
    ملاحظة: أثناء الحقن، هناك فرصة كبيرة للإبر إما تسد أو كسر. إذا حدث تسد، والذي يمكن تحديده من خلال عدم وجود سائل الحقن المتدفقة من خلال الإبرة، حاول إما تنظيف الإبرة مع وظيفة نظيفة على الحقن المجهري الإلكترونية أو محاولة إعادة شطب الإبرة. إذا لم تنجح أي من الخطوتين، فاتغير بسرعة إلى إبرة جديدة مع ضمان بقاء البيض المعد رطبا.

8. استعادة الجنين والفقس

  1. اترك البيض دون إزعاج لمدة 5 دقائق على الأقل. في غضون 20 دقيقة بعد الحقن، وإزالة بعناية زيت الهالوكربون بالفرشاة طفيفة مع فرشاة طلاء نظيفة(الشكل 2H).
  2. رفع البيض بلطف باستخدام فرشاة الطلاء ووضعها في كوب من الماء المقطر المزدوج(الشكل 2I). الحرص على إبقاء البيض على سطح الماء.
  3. فحص البيض يوميا لمدة 7 أيام للفقس (الشكل 2J).
  4. اتبع إجراءات تربية اليرقات العادية21.

9. فحص لتعديل الجينوم

  1. فحص البعوض المحقون للأنماط الظاهرية المتحولة باستخدام مجسمة(الشكل 2K).
    1. تحقق من الطفرات التي ليس لديها النمط الظاهري يمكن التعرف عليها بسهولة، عن طريق تضخيم PCR، T7 إندونوكليز I المقايسة، والتسلسل عن طريق subcloning من المنطقة المستهدفة31.
  2. إعداد الصلبان إضافية بين الأفراد عن طريق الحقن للكشف عن الطفرات الوراثية داخل الجرثومة.

Representative Results

في التجارب المنشورة سابقا تم استخدام هذه الطريقة لتوليد بنجاح الطفرات الجسدية والجرثومية لجين حاسم لتطوير تصبغ العين الداكنة، أبيض (CPIJ005542)30 (الجدول 1). CRISPR/Cas9 ولدت الطفرات الجسدية وسجل عن طريق فحص لفقدان التصبغ في عيون المرحلة الجرو من الأفراد عن طريق الحقن (G0). كانت الطفرات الجسدية موجودة بشكل عام كأنماط فسيفساء حيث بعض الخلايا وليس كلها لديها النمط الظاهري المتحول. على سبيل المثال ، أدت الطفرات الجسدية للجين الأبيض إلى مزيج من ommatidia مع الأنماط الظاهرية التي تفتقر إلى التصبغ وتلك التي لديها النمط الظاهري المصطبغ البري30. عندما كان هناك طفرة الجرثومية من الجين الأبيض، ومع ذلك، الجيل القادم (G1)ورثت النمط الظاهري عين بيضاء كاملة. تم تحديد معدلات طفرة Germline من قبل الأفراد الفسيفساء G0 المتشابكة وتسجيل لذرية العينين البيضاء تماما (G1). وأسفرت هذه التجارب عن معدل بقاء الجنين على قيد الحياة بنسبة تتراوح بين 64 و82 في المائة، فضلا عن معدل 37 في المائة إلى 57 في المائة من الطفرات الجسدية ومعدل تولد الطفرات الجرثومية >61 في المائة (الجدول 1). عن طريق sgRNAs متعددة لاستهداف loci متعددة في نفس الجين، ارتفعت معدلات تولد الطفرات الجسدية والجرثومية صعودا إلى ما يصل إلى 86٪(الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، لأجيال عديدة ، تم الاحتفاظ بمخزونات متجانسة قابلة للحياة من المسوخ البيضاء بنجاح في المختبر.

Figure 1
الشكل 1: C. طوف البيض quinquefasciatus ومورفولوجيا بيضة واحدة.
دورسال (أ), الجانبي (ب), والبطين (C) وجهات النظر من الطوافات البيض C quinquefasciatus. C. الإناث quinquefasciatus وضع بيضها مع الجانب الأمامي أكثر لمبة لمس سطح الماء في حين أن الخلفي أكثر وأشار بعيدا عن سطح الماء (D). أ- الأمامية؛ P- الخلفية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الجدول الزمني لإنشاء المسوخ C. quinquefasciatus عن طريق الميكرويكشن.
الجدول الزمني لإعداد مستعمرة C. quinquefasciatus وجمع الأجنة للميكروينيكشن(A-D). ثم يتم فصل البيض المجمع(E)محاذاة في نفس الاتجاه ومغطاة بزيت الهالوكربون(F). ثم يتم حقن البيض(G)ويسمح للراحة لمدة لا تقل عن 5 دقائق قبل إزالة زيت الهالوكربون (H). ثم يتم نقل البيض إلى مصدر مياه نظيفة (I) للفقس (J) ويتم فحصه للأنماط الظاهرية المتحولة (K). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بقاء الفسيفساء الجسدية (G0) تولد الجراثيم (G1)
SgRNA #injected ♂ ♀ المجموع (٪) ♂ ♀ المجموع (٪) G1 المسوخ (٪)
wsgRNA-1 50 15 20 35(70) 7(47) 13(65) 20(57) 128(69)
wsgRNA-2 50 9 32 41(82) 3(33) 12(38) 15(37) 51(61)
wsgRNA-3 50 17 15 32(64) 7(41) 8(53) 15(47) 157(72)
wsgRNA-1/wsgRNA-2 50 7 16 23(46) 5(71) 12(75) 17(74) 123(79)
wsgRNA-1/wsgRNA-3 50 13 9 22(44) 10(77) 6(67) 16(73) 72(81)
wsgRNA-2/wsgRNA-3 50 17 10 27(54) 13(76) 8(80) 21(78) 101(85)
wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3 50 11 10 21(42) 9(82) 9(90) 18(86) 149(86)

الجدول 1: معدلات بقاء وطفرات الأجنة المحقونة بالرنانات الوراثية الأحادية والمتعددة المضاعفات التي تستهدف البيض. تتم إعادة طباعة الجدول بإذن من30

Discussion

ومع الجهود المبذولة مؤخرا لتوليد أدوات مصممة وراثيا لمكافحة ناقلات البعوض، هناك حاجة إلى وضع بروتوكولات للتجميل الدقيق للأجنة وتحسينها لناقلات أمراض البعوض الشائعة. على الرغم من أنه تم تطوير طرق للبعوض Aedes و Anopheles ، فقد تم استكشاف بروتوكول مصمم خصيصا ل Culex الحد الأدنى. بشكل عام يمكن تقسيم بروتوكولات حقن الأجنة البعوض إلى 3 خطوات عامة: 1) جمع الجنين وإعداده، 2) حقن الأجنة، و 3) استعادة ما بعد الحقن. من أجل توليد المسوخ بنجاح ، يجب تحسين جميع الخطوات الثلاث للأنواع المستهدفة. هذا البروتوكول المعدل للهندسة الدقيقة للأجنة خاص بهندسة الجينوم الناجحة للبعوض Culex.

تعظيم جمع الأجنة هو عنق الزجاجة المشتركة في بروتوكولات التلقيح الدقيق الجنين. من أجل زيادة عدد البيض الذي يتم جمعه في فترة قصيرة من الزمن ، تم تقييد البعوض من ركيزة oviposition لمدة 2-3 أيام بعد وجبة الدم. من المهم ملاحظة أن C. quinquefasciatus تميل إلى تفضيل مصادر دم الطيور بدلا من مصادر الثدييات أو تغذية الأغشية بدم الثدييات. ومع ذلك، يواجه العديد من الباحثين صعوبة في الحصول على مصدر موثوق به من الطيور الحية أو دم الطيور لتغذية الدم، لذلك يمكن تكييف المخزونات المختبرية لتتغذى على مصادر الدم الأكثر سهولة. ومن الأهمية بمكان أيضا استخدام المياه الغنية بالمغذيات للركيزة oviposition كما أنه يوفر العظة oviposition لC. quinquefasciatus ومعظم ناقلات Culex الأخرى. هناك العديد من الطرق لتوليد المياه الغنية بالمغذيات، والتي قد تحتاج إلى تحسين بين المختبرات لضمان وجود عدد مناسب من البيض المتاحة للميكروبيكشن. على سبيل المثال، في حين أن هذه الطريقة كانت الأكثر نجاحا مع براز الأرانب المخمرة في الماء deionized لمدة 5 أيام أو أكثر، والباحثين الآخرين لديهم المزيد من النجاح مع العشب أو الأسماك الغذاء كمصدر للمغذيات وبعض حتى مع الماء المقطر21.

نظرا لأن بعوض Culex يضع مجموعات من البيض في الطوافات ، فإن جمع البيض بسيط إلى حد ما. يمكن ببساطة جمع البيض عن طريق مغرفة الطوافة بأكملها مع فرشاة الطلاء. فصل البيض هو أكثر تعقيدا، ولكن من الضروري لحقن ناجحة. يمكن فصل البيض بعناية عن الطوافة عن طريق تطبيق ضغط نزولي لطيف بين البيض مع فرشاة الطلاء أو ملقط. مع بعض الممارسة ، تمكن العديد من المستخدمين بشكل موثوق من فصل بيض واحد عن طوافات البيض. بعد فصل كل بيضة ، يتم محاذاة البيض في نفس الاتجاه على شريط لاصق على الوجهين ، مما يحقق الاستقرار في البيض أثناء التلقيح الدقيق. يتم حقن البيض في النهاية الخلفية مدبب وإضافة زيت الهالوكربون يحافظ على رطوبة البيض أثناء التلاعب.

للحد من تلف الجنين أثناء الحقن المجهري، يجب أن تكون إبر الحقن ذات قوة مناسبة ومغلفة بزاوية مناسبة. الإبر الألومينوسيليكات مشطوف لمدة 10 ثوان في زاوية 50 درجة كان أفضل النتائج، ولكن البوروسيليكات والإبر الكوارتز قد تعمل أيضا، على الرغم من أنها قد تكون أقل دواما وأكثر تكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يسهل تغليف الإبر المناسب تدفقا أفضل لخلائط Cas9 و sgRNA ويخلق نقطة أكثر وضوحا لتسهيل الاختراق إلى الجنين. في كثير من الحالات، شطب هو أيضا وسيلة فعالة لإصلاح الإبر المسدودة بسرعة بدلا من قضاء الوقت والجهد لاستبدال الإبر المسدودة.

بعد الحقن، يجب أن يبقى البيض دون إزعاج لمدة 5 دقائق على الأقل مع إزالة زيت الهالوكربون بعد ذلك مباشرة عن طريق تنظيفه بلطف باستخدام فرشاة طلاء نظيفة. بعد إزالة زيت الهالوكربون ، يمكن وضع البيض المحقون في الماء للفقس ، والذي يحدث عادة في غضون 3 أيام بعد الحقن. مع الممارسة وأعداد كافية من البيض ، يمكن لهذا البروتوكول تحقيق طفرات جسدية وجراثيم متسقة في C. quinquefasciatus ومتعدد الاستخدامات بما يكفي بحيث يجب أن يكون قابلا للتكيف بسهولة مع بعوض Culex الآخر.

Disclosures

اي

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بدء UCSD الموجهة إلى O.S.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
9 oz clear plastic pet cup Karat C-KC9 Insect Rearing and Egg Collection
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) Sutter Instruments BF100-58-10 Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate
Blood Colorado Serum Company 31025 The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.
Bugdorm Bugdorm 4F2222 Insect Rearing Cage
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01 Microinjection
Compound Microscope Olympus BX41 Microinjection, for embryo injection
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) Sutter Instruments 104E Microinjection, to be used with beveler
DNase/RNase-Free distilled Water Invitrogen 10977-015 Microinjection
Double-sided Tape Scotch B084NVQGXD Microinjection, embryo alignment
Femtojet 4x or 4i programmable microinjector Eppendorf Microinjection
Femtotips Microloader tips Fisher Scientific E5242956003 Microinjection
Filter Paper Whatman 1001-090 Microinjection, embryo collection
Fine-tip paintbrush ZEM 2595 Microinjection, embryo alignment
Halocarbon oil 27 Sigma-Aldrich H8773 Microinjection, embryo alignment
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 Microinjection, embryo alignment
Hemotek Hemotek PS5 Line Maintenance
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV10 Microinjection, needle beveling
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000 or P-2000 Microinjection, needle pulling
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-A3 Microinjection, embryo alignment
Non-Drying Modeling Clay Jovi B0025Z71IM Microinjection, needle storage
Stereo Microscope Olympus SZ51 Microinjection, for embryo alignment
Sugar Domino 20% sugar solution for adult sugar source.
T7 Endonuclease I NEB M0302 Preparation of microinjection materials
TOPO TA Cloning Kit ThermoFischer Scientific K451020 Preparation of microinjection materials
Ultra-fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-121 Microinjection, embryo alignment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).
  2. APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).
  3. Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
  4. van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
  5. Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).
  6. Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).
  7. Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
  8. Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
  9. Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17 (2015).
  10. Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).
  11. Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).
  12. Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
  13. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701 (2020).
  14. Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11 (2007).
  15. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  16. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
  17. Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  18. Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).
  19. Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).
  20. Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403 (2011).
  21. Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).
  22. Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).
  23. Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).
  24. Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
  25. Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
  26. Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).
  27. Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
  28. Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
  29. Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
  30. Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
  31. New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).

Tags

علم الوراثة، العدد 159، Culex quinquefasciatus، CRISPR / Cas9 تحرير الجينوم، محاذاة الأجنة، microinjection الجنين، تعديل الجينوم، تكوين الجراثيم
تقنيات التلقيح الدقيق الجنيني لتولد موتاسيس محدد الموقع الفعال في <em>Culex quinquefasciatus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu,… More

Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus. J. Vis. Exp. (159), e61375, doi:10.3791/61375 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter