Summary
Denne protokollen beskriver mikroinjeksjonsprosedyrer for Culex quinquefasciatus embryoer som er optimalisert for å fungere med CRISPR / Cas9 genredigeringsverktøy. Denne teknikken kan effektivt generere stedsspesifikke, arvelige, bakteriemutasjoner som kan brukes til å bygge genetiske teknologier i denne undervurderte sykdomsvektoren.
Abstract
Culex quinquefasciatus er en vektor av et mangfoldig utvalg av vektorbårne sykdommer som fugle malaria, West Nile virus (WNV), japansk encefalitt, østlig heste encefalitt, lymfatisk filariasis og Saint Louis encefalitt. Spesielt har fugle malaria spilt en viktig rolle i utryddelsen av mange endemiske øyfuglarter, mens WNV har blitt en viktig vektorbåren sykdom i USA. For å få ytterligere innsikt i C. quinquefasciatus biologi og utvide deres genetiske kontrollverktøykasse, må vi utvikle mer effektive og rimelige metoder for genomteknikk i denne arten. Imidlertid har noen biologiske egenskaper som er unike for Culex mygg, spesielt deres eggflåter, gjort det vanskelig å utføre mikroinjeksjonsprosedyrer som kreves for genomteknikk. For å løse disse utfordringene har vi utviklet en optimalisert embryomikroinjeksjonsprotokoll som fokuserer på å redusere de tekniske hindringene knyttet til de unike egenskapene til Culex mygg. Disse prosedyrene viser optimaliserte metoder for eggsamling, eggflåteseparasjon og andre håndteringsprosedyrer som er avgjørende for vellykket mikroinjeksjon i C. quinquefasciatus. Når de kombineres med CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi, tillater disse prosedyrene oss å oppnå stedsspesifikke, effektive og arvelige bakteriemutasjoner, som kreves for å utføre avansert genomteknikk og utvikle genetiske kontrollteknologier i denne viktige, men for tiden undervurderte, sykdomsvektoren.
Introduction
C. quinquefasciatus, kjent som det sørlige huset mygg, er en kompetent vektor av mange patogener, inkludert West Nile virus (WNV), japansk encefalitt, Saint Louis encefalitt og østlig heste encefalitt. Spesielt siden det først ble oppdaget i New York i 1999, har WNV blitt en stor vektorbåren sykdom i hele det kontinentale USA (USA) med over 50.000 rapporterte menneskelige tilfeller som resulterte i rundt 2.300 dødsfall mellom 1999 og 20181 samt over 4.500 rapporterte hestetilfeller mellom 2008-2019. I tillegg har minst 23 fuglearter funnet i Nord-Amerika blitt påvirket av WNV-infeksjoner med minst 12 arter klassifisert som uopprettelige som følge av WNV3. Virkningen av WNV på menneskelige, heste- og fuglepopulasjoner skyldes den opportunistiske fôringsadferden til vektorene. Vanligvis er fugler de primære vertene for WNV, og mennesker og hester er tilfeldige eller blindveis verter. Noen patogener vektorisert av C. quinquefasciatus smitter bare fugler som fugle malariaparasitten, Plasmodium reliktum. På Hawaii er C. quinquefasciatus en hovedvektor av fugle malaria og har forårsaket utryddelse av mange innfødte fuglearter4,5.
For å kontrollere sykdommer som overføres av C. quinquefasciatus, forskere og vektorkontrollbyråer har brukt ofte etablerte myggpopulasjonskontrollverktøy som insektmiddelapplikasjon6, men disse metodene er kostbare, ikke artsspesifikke, og har begrenset effektivitet da motstanden mot insektmidler er høy i mange C. quinquefasciatuspopulasjoner 6,7,8,9. Andre kontrollteknikker, for eksempel Wolbachia-basertebefolkningskontrollstrategier, er utviklet de siste årene10,11, men treningskostnadene forbundet med Wolbachia-infeksjon begrenser muligheten for denne tilnærmingen for dennevektoren 12. Det er også genetisk baserte kontrollmetoder som er utviklet i andre myggarter som Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 og Anopheles stephensi16, inkludert utviklingen av patogenresistente mygg17,18,19, som også kan utvikles for C. quinquefasciatus hvis de nødvendige genomteknikkene er utviklet for denne arten. Imidlertid skiller C. quinquefasciatus biologi seg sterkt fra andre Aedes og Anopheles myggvektorer som har gjort utviklingen av lignende genetiske teknologier vanskelig i denne vektoren. Med fremveksten av CRISPR-baserte genomteknologier har presis genomteknikk blitt stadig mer triviell, rimelig og tilpasningsdyktig og har følgelig ført til utvikling av nye genetiske verktøy i et bredt spekter av arter.
For å generere mutasjoner med CRISPR-baserte teknologier, blir en blanding av Cas9 protein og syntetisk guide RNA (sgRNA), komplementær til ønsket loci, mikroinjisert i pre-blastoderm stadium embryoer. Siden C. quinquefasciatus kvinner legger eggene sine i grupper festet i en flytende flåtestruktur (figur 1), i motsetning til ovipositing individuelle egg, blir et trekk av Aedes og Anopheles mygg, embryomikroinjeksjoner stadig mer komplisert i denne arten. Culex larver kommer også ut av den fremre siden av hvert egg, som er i kontakt med vannoverflaten (figur 1), så eggorienteringspostmanipulering er viktig i denne arten. Her beskriver vi en detaljert protokoll designet for mikroinjeksjon av Cas9 protein og sgRNA i C. quinquefasciatus embryoer. Denne protokollen er designet for å imøtekomme egenskaper som er unike for Culex biologi for å forbedre embryooverlevelse og genommutasjonsrater gjennom visse trinn som er nøkkelen for rettidig eggsamling og eggoverlevelse.
Protocol
1. C. quinquefasciatus koloni oppdrett
- Sett opp flere kolonier av C. quinquefasciatus voksne i bug dorm bur.
MERK: Koloniene ble levert av Dr. Laura Harrington ved Cornell University20. Detaljerte protokoller for oppdrett av Culex mygg finnes i annen litteratur21.- Opprettholde mygg ved 25 ± 1 °C ved 30 % fuktighet med en 12:12 h dag:natt syklus.
- Gi 20% sukkeroppløsning ad libitum ved å introdusere en sukkeroppløsningsbeholder med en veke i buret eller ved å mette bomullskuler med sukkeroppløsningen og plassere den i buret.
- La mygg parre seg i minst 3 dager før blodfôring (Figur 2A).
2. Innsamling av C. quinquefasciatus pre-blastoderm stadium embryoer
- Etter 3-6 dager etter eclosjon, gi kvinner 1-2 ml av et citrated bovint blodmel gjennom en syntetisk membran og oppvarmet til ca. 40 °C i et blodfôringssystem (Figur 2B). Det finnes også alternative blodfôringsprotokoller som kan brukes til Culex mygg (se for eksempel ref21).
MERK: C. quinquefasciatus er kjent for en preferanse for fugleblod. Noen laboratorier bruker bedøvede levende fugler eller fugleblod til blodmelkilden21,22,23. Kolonier kan imidlertid trenes / velges for å mate på storfeblod eller små gnagere hvis denne funksjonen er valgt for over flere generasjoner.- La kvinner hvile i minst 3 dager etter blodfôring for å gjennomgå oogenese og eggmodning før de induserer oviposisjon for mikroinjeksjonsforsøk.
- På dagen for embryonale mikroinjeksjoner, lag en oviposisjonskopp med organisk infundert oviposisjonsvann. Oviposisjonsvann skal gjøres ved gjæring av kanin avføring (50 g / L), nedbrytende gress (4,5 g / L) eller fiskemat (25 g / L) i vann i løpet av 5 eller flere dager24,25.
- Plasser oviposisjonskoppen i buret og plasser hele buret på et mørkt sted (Figur 2C).
- Etter hver 30 min, sjekk koppen for eggflåter.
- Hvis det finnes eggflåter, samler du flåtene ved å øse dem med pensel og plassere dem på et vått filterpapir (Figur 2D,E).
3. Justering av C. quinquefasciatus pre-blastoderm stadium embryoer
- Skill eggene fra flåtene ved å trykke ned på flåten og erte eggene individuelt ved hjelp av en fin spissmaling og tang (Figur 2E).
- Juster enkeltegg på en tynn stripe med dobbeltsidig klebrig tape plassert over toppen av et glasssklie (Figur 2F).
- Mens du justerer, prøv å peke den fremre siden av hvert egg i samme retning for enklere tilgjengelighet.
MERK: En alternativ eggjusteringsmetode uten dobbeltsidig klebrig tape finnes i en tidligere publisert Nasonia vitripennis embryomikroinjeksjonsprotokoll26. - Dekk egg med halokarbonoljeblandingen.
MERK: Halokarbonblanding kan tilberedes på forhånd ved å forsiktig blande to halokarbonreagenser og vann (9:1:20, halokarbon 700: halokarbon 27 : Ultrapure vann) og deretter inkubere blandingen over natten ved 25οC for å lette vannmetningen til halokarbonoljen.
4. Nålpreparat for mikroinjeksjoner
- Generer aluminosilicate kapillære glassnåler ved hjelp av en glassmikropipettetrekker.
- Plasser et aluminosilicate kapillærglass i en nåletrekker, i henhold til instruksjonene fra nåletrekkerens brukerhåndbok.
MERK: Kvarts og borosilikat kapillær nåler kan også brukes, men for dette eksperimentet er aluminosilicat foretrukket på grunn av sin relative overkommelighet og holdbarhet. - Sett Varme til 516, Hastighet til 100, Forsinkelse til 70, Trekk til 97 og Trykk til 500 på nåletrekkeren.
- Aktiver nåletrekkeren i henhold til pullerens instruksjoner og gjenta etter behov for flere nåler.
MERK: Under injeksjonsprosessen blir nåler ofte tilstoppet eller ved et uhell ødelagt, derfor anbefales det å trekke ekstra nåler til et enkelt eksperiment.
- Plasser et aluminosilicate kapillærglass i en nåletrekker, i henhold til instruksjonene fra nåletrekkerens brukerhåndbok.
- Skråstill nålespissen ved å berøre spissen av den trukket nålen forsiktig på den roterende diamantslipeplaten i rundt 10 s i en 50° vinkel.
MERK: Skråkant av nålen åpner den slik at væsken kan strømme gjennom, samtidig som den skaper en skarpere spiss for enklere penetrasjon i embryoet. Et eksempel på en riktig nål kan ses i en tidligere artikkel26. - Oppbevar trukket og skrå nåler ved å legge dem inn i linjer med modellens leire i en Petri-tallerken.
MERK: For å sikre best mulig kvalitet på nålespissene, bør nålene trekkes og skråstilles så nær injeksjonstidspunktet som mulig.
5. Lasting av injeksjonsblandingen
- Forbered injeksjonsblandingen som består av genommodifiseringsreagenser (f.eks. 200 ng/μL sgRNA og 200 ng/μL Cas9-blanding), eller foretrukne injeksjonsløsninger og hold den på is.
MERK: Denne blandingen kan tilberedes mens du venter på at eggene skal legges. Flere detaljer om Cas9 og sgRNA produksjon og forberedelse for mikroinjeksjon finnes i tidligere publikasjoner27,28,29,30. - Last 2 μL injeksjonsblanding inn i injeksjonsnålen ved hjelp av en mikrolasterspiss.
6. Mikroinjeksjon satt opp
- Plasser den fylte injeksjonsnålen i en mikromanipulator satt opp knyttet til en elektronisk mikroinjektor.
- Plasser glasssklie som inneholder de justerte eggene på scenen til et sammensatt mikroskop.
- Bruk mikromanipulatoren og det sammensatte mikroskopet til å justere nålen for å sikte mot den bakre enden av embryoet i en 25-35° vinkel.
7. Embryomikroinjeksjon (Figur 2G)
- Sett forsiktig nålen inn i embryoet og injiser blandingen med en mengde på ca. 10% av embryovolumet (700-800 pL avhengig av eggets størrelse).
MERK: Ved injeksjon skal egget hovne litt, men hvis for mye væske injiseres, kan egg briste, eller cytoplasmatisk væske kan lekke ut. - Injiser rundt 20 egg om gangen og stopp og utfør embryogjenopprettingsprosedyrer.
MERK: Under injisering er det stor sjanse for at nåler enten tetter eller brekker. Hvis det oppstår en tilstopping, som kan bestemmes av mangel på injeksjonsvæske som strømmer gjennom nålen, kan du prøve å rengjøre nålen med den rene funksjonen på den elektroniske mikroinjektoren eller prøve å omveling nålen. Hvis ingen av trinnet fungerer, bytt raskt til en ny nål samtidig som du sikrer at de tilberedte eggene forblir fuktet.
8. Embryogjenvinning og klekking
- La eggene være uforstyrret i minst 5 min. Innen 20 min etter injeksjon, fjern halokarbonoljen forsiktig ved å pusse lett med en ren pensel (Figur 2H).
- Løft eggene forsiktig med en pensel og legg dem i en kopp dobbeltdestillert vann (Figur 2I). Pass på å holde eggene på overflaten av vannet.
- Kontroller eggene daglig i 7 dager for klekking (Figur 2J).
- Følg normale larvaloppdrettsprosedyrer21.
9. Screening for genommodifisering
- Screen de injiserte myggene for mutantfenotypene ved hjelp av et stereoskop (Figur 2K).
- Kontroller mutasjoner som ikke har en lett gjenkjennelig fenotype, ved PCR-forsterkning, T7 Endonuclease I-analyse og sekvensering ved underkloning av målområdet31.
- Sett opp flere kryss mellom injiserte individer for å oppdage arvelige mutasjoner i bakterien.
Representative Results
I tidligere publiserte eksperimenter ble denne metoden brukt til å generere somatiske og germline mutasjoner av et gen som er kritisk for utviklingen av pigmentering av mørke øyne, hvit (CPIJ005542)30 (Tabell 1). CRISPR/Cas9 genererte somatiske mutasjoner ble scoret ved screening for tap av pigmentering i valpefase øyne av injiserte individer (G0). Somatiske mutasjoner var generelt til stede som mosaikk fenotyper der noen, men ikke alle cellene har mutant fenotype. For eksempel resulterte somatiske mutasjoner av det hvite genet i en blanding av ommatidia med fenotyper som mangler pigmentering og de med en wildtype pigmentert fenotype30. Da det var en bakteriemutasjon av det hvite genet, arvet imidlertid neste generasjon (G1) den fulle hvite øyefenotypen. Germline mutasjonsrater ble bestemt ved å intercrossing mosaikk G0 individer og score for helt hvite øyne avkom (G1). Disse eksperimentene resulterte i en overlevelsesrate på 64% til 82%, samt en 37% til 57% somatisk mutageneserate og en >61% germline mutagenese rate (Tabell 1). Ved å multiplekse sgRNAer for å målrette mot flere loci i samme gen, økte somatiske og bakterieaktige mutageneserater oppover til så mye som 86% (Tabell 1). I tillegg har levedyktige homozygote lagre av de hvite mutantene i mange generasjoner blitt vellykket holdt i laboratoriet.
Figur 1: C. quinquefasciatus eggflåte og enkelt eggmorfologi.
Dorsal (A), lateral (B) og ventral (C) utsikt over C quinquefasciatus egg flåter. C. quinquefasciatus kvinner legger eggene sine med den mer pæreformede fremre siden som berører overflaten av vannet, mens den mer spisse bakre bort fra vannets overflate (D). A- fremre; P- posterior Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tidslinje for å lage C. quinquefasciatus mutanter ved mikroinjeksjon.
Tidslinje over C. quinquefasciatus kolonipreparat og embryosamling for mikroinjeksjon (A-D). Samlet egg blir deretter separert (E) justert i samme retning og dekket med halokarbonolje (F). Eggene injiseres deretter (G) og får hvile i minst 5 minutter før halokarbonoljen (H). Egg overføres deretter til en ren vannkilde (I) for klekking (J) og screenes for mutant fenotyper (K). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Overlevelse | Somatisk mosaikk (G0) | Germline mutagenese (G1) | ||||||
| sgRNA | #injected | ♂ | ♀ | Totalt (%) | ♂ | ♀ | Totalt (%) | G1 mutanter (%) |
| wsgRNA-1 | 50 | 15 | 20 | 35(70) | 7(47) | 13(65) | 20(57) | 128(69) |
| wsgRNA-2 | 50 | 9 | 32 | 41(82) | 3(33) | 12(38) | 15(37) | 51(61) |
| wsgRNA-3 | 50 | 17 | 15 | 32(64) | 7(41) | 8(53) | 15(47) | 157(72) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-2 | 50 | 7 | 16 | 23(46) | 5(71) | 12(75) | 17(74) | 123(79) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-3 | 50 | 13 | 9 | 22(44) | 10(77) | 6(67) | 16(73) | 72(81) |
| wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 17 | 10 | 27(54) | 13(76) | 8(80) | 21(78) | 101(85) |
| wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3 | 50 | 11 | 10 | 21(42) | 9(82) | 9(90) | 18(86) | 149(86) |
Tabell 1: Overlevelses- og mutasjonsrater av embryoer injisert med enkle og multipleksede gRNAer rettet mot hvitt. Tabellen skrives ut på nytt med tillatelse fra30
Discussion
Med nylig innsats for å generere genetisk konstruerte verktøy for myggvektorkontroll, er det behov for å utvikle og optimalisere embryomikroinjeksjonsprotokoller for vanlige myggsykdomsvektorer. Selv om metoder er utviklet for Aedes og Anopheles mygg, har en protokoll designet spesielt for Culex blitt minimalt utforsket. Generelt mygg embryo injeksjon protokoller kan deles inn i 3 generelle trinn: 1) embryo samling og forberedelse, 2) embryo injeksjon, og 3) post-injeksjon utvinning. For å kunne generere mutanter, må alle tre trinnene optimaliseres for målartene. Denne modifiserte protokollen for embryomikroinjeksjon er spesifikk for vellykket genomteknikk av Culex mygg.
Maksimering av embryosamling er en vanlig flaskehals i embryomikroinjeksjonsprotokoller. For å øke antall egg samlet på kort tid, ble mygg begrenset fra et oviposisjonssubstrat i 2-3 dager etter blodmel. Det er viktig å merke seg at C. quinquefasciatus har en tendens til å foretrekke fugleblodkilder i motsetning til pattedyrkilder eller membranfôring med pattedyrblod. Imidlertid har mange forskere problemer med å skaffe seg en pålitelig kilde til levende avians eller fugleblod for blodfôring, slik at laboratoriebestandene kan tilpasses for å mate på mer tilgjengelige blodkilder. Det er også avgjørende å bruke næringsrikt vann til oviposisjonssubstratet, da det gir oviposisjonssignaler for C. quinquefasciatus og de fleste andre Culex-vektorer. Det er mange metoder for å generere næringsrikt vann, som kanskje må optimaliseres mellom laboratorier for å sikre at et passende antall egg er tilgjengelige for mikroinjeksjon. For eksempel, mens denne metoden var den mest vellykkede med kanin avføring gjæret i deionisert vann i 5 eller flere dager, har andre forskere mer suksess med gress eller fiskemat som næringskilde og noen til og med med destillert vann21.
Siden Culex mygg legger grupper av egg i flåter, er det ganske enkelt å samle egg. Egg kan ganske enkelt samles ved å øse hele flåten med en pensel. Eggseparasjon er mer komplisert, men viktig for vellykket injeksjon. Egg kan forsiktig skilles fra flåten ved å påføre forsiktig nedadgående trykk mellom egg med pensel eller tang. Med litt praksis var flere brukere pålitelig i stand til å skille enkeltegg fra eggflåter. Etter å ha separert hvert egg, er eggene justert i samme orientering på dobbeltsidig klebrig tape, som stabiliserer eggene under mikroinjeksjon. Egg injiseres i den koniske bakre enden, og tilsetningen av halokarbonolje holder eggene fuktige under manipulering.
For å begrense embryoskader under mikroinjeksjon, må injeksjonsnåler være av passende styrke og skråstilles i en passende vinkel. Aluminosilicate nåler skråstilt i 10 sekunder i en 50 ° vinkel hadde de beste resultatene, men borosilikat og kvarts nåler kan også fungere, selv om de kan være mindre holdbare og dyrere. I tillegg letter riktig nåleutvikling bedre flyt av Cas9- og sgRNA-blandingene og skaper et skarpere punkt for enklere penetrasjon i embryoet. I mange tilfeller er skråkant også en effektiv måte å raskt fikse tilstoppede nåler i stedet for å bruke tid og krefter på å erstatte tilstoppede nåler.
Etter injeksjon skal eggene forbli uforstyrret i minst 5 minutter med halokarbonoljen fjernet umiddelbart etterpå ved å forsiktig børste den bort med en ren pensel. Etter fjerning av halokarbonoljen kan de injiserte eggene plasseres i vann for å klekkes, som vanligvis oppstår innen 3 dager etter injeksjon. Med praksis og tilstrekkelig antall egg kan denne protokollen oppnå konsistente somatiske og bakteriede mutasjoner i C. quinquefasciatus og er allsidig nok til at den lett kan tilpasses andre Culex mygg.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av UCSD-oppstartsmidler rettet mot O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
| Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
| Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
| Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
| Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
| Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
| Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
| Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
| Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
| TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
| Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |
References
- Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).
- APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).
- Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
- van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
- Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).
- Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).
- Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
- Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
- Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).
- Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
- Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701 (2020).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11 (2007).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
- Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).
- Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).
- Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403 (2011).
- Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).
- Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).
- Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).
- Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
- Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
- Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
- Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
- Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
- New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).
