Summary
Un método se describe para crear organoids usando los xenografts paciente-derivados (PDX) para la investigación in vitro, dando por resultado pares hechos juego de modelos in vivo/ines vitro. Los tumores de PDX fueron cosechados/procesados en pedazos pequeños mecánicamente o enzimático, seguidos por el Clevers' método para crecer los organoids del tumor que fueron pasados, cryopreserved y caracterizados contra el PDX original.
Abstract
Los xenoinjertos de tumores derivados de pacientes (PDXs) se consideran los modelos preclínicos más predictivos, en gran parte se cree que son impulsados por células madre cancerosas (CSC) para la evaluación convencional de medicamentos contra el cáncer. Una gran biblioteca de PDXs refleja la diversidad de las poblaciones de pacientes y, por lo tanto, permite ensayos preclínicos basados en la población ("Ensayos clínicos con ratones tipo Fase II"); sin embargo, PDX tiene limitaciones prácticas de bajo rendimiento, altos costos y larga duración. Los organoides tumorales, también siendo modelos impulsados por CSC derivados por pacientes, pueden considerarse como el equivalente in vitro de PDX, superando ciertas limitaciones de PDX para tratar con grandes bibliotecas de organoides o compuestos. Este estudio describe un método para crear los organoids PDX-derivados (PDXO), así dando por resultado los modelos apareados para la investigación in vitro e in vivo de la farmacología. los tumores Subcutáneo-trasplantados PDX-CR2110 fueron recogidos de ratones del tumor-cojinete cuando los tumores alcanzaron 200-800 milímetros3,por un procedimiento aprobado de la autopsia, seguido por el retiro de los tejidos adyacentes del no-tumor y la disociación en pequeños fragmentos del tumor. Los pequeños fragmentos de tumor se lavaron y pasaron a través de un colador celular de 100 μm para eliminar los desechos. Los racimos celulares fueron recogidos y suspendidos en la solución del extracto de la membrana del sótano (BME) y plateados en una placa de 6 pozos como gotita sólida con los medios líquidos circundantes para el crecimiento en una incubadora del CO2. El crecimiento organoide fue supervisado dos veces semanalmente bajo microscopia ligera y registrado por la fotografía, seguida por el cambio medio líquido 2 o 3 veces por semana. Los organoides crecidos fueron pasados más a fondo (7 días más adelante) en un ratio 1:2 interrumpiendo los organoids encajados BME usando el esquileo mecánico, ayudado por la adición de tripsina y la adición de 10 μM Y-27632. Los organoides fueron criopreservados en crio-tubos para almacenamiento a largo plazo, después de la liberación de BME por centrifugación, y también muestreados (por ejemplo, ADN, ARN y bloque FFPE) para su posterior caracterización.
Introduction
Los cánceres son una colección de diversos trastornos genéticos e inmunológicos. El desarrollo exitoso de tratamientos efectivos depende en gran medida de los modelos experimentales que predicen eficazmente los resultados clínicos. Las bibliotecas grandes de xenoinjertos paciente-derivados bien-caracterizados (PDX) se han visto durante mucho tiempo como el sistema in vivo traslacional de la opción para probar chemo- y/o terapias apuntadas debido a su capacidad de recapitular características del tumor paciente, heterogeneidad y respuesta de la droga paciente1,así permitiendo que la fase II-como los ensayos clínicos del ratón mejore éxito clínico2,3. Los PDX se consideran generalmente como enfermedades de células madre cancerosas, con estabilidad genética, en contraste con los xenoinjertos derivados de la línea celular2. En las últimas décadas, se han creado grandes colecciones de PDXs en todo el mundo, convirtiéndose en el caballo de batalla del desarrollo de medicamentos contra el cáncer en la actualidad. Aunque son ampliamente utilizados y con un gran valor de traslación, estos modelos animales son intrínsecamente costosos, consumen mucho tiempo y bajo rendimiento, por lo tanto, inadecuados para el cribado a gran escala. Los PDX también son indeseables para las pruebas de inmunooncología (IO) debido a una naturaleza inmunocomprocomprotege4. Por lo tanto, no es práctico aprovechar al máximo la gran biblioteca disponible de PDXs.
Descubrimientos recientes, iniciados por el laboratorio5de Hans Clevers, han llevado al establecimiento de cultivos in vitro de organoides generados a partir de células madre adultas en la mayoría de los órganos humanos de origen epitelial5. Estos protocolos se han perfeccionado aún más para permitir el crecimiento de organoides a partir de supuestos CSCs en carcinomas humanos de diversas indicaciones6,7. Estos organoides derivados de pacientes (DOP) son genómicamente estables8,9 y se ha demostrado que son altamente predictivos de los resultados del tratamiento clínico10,11,12. Además, la naturaleza in vitro de las DOP permite el cribado de alto rendimiento (HTS)13,lo que potencialmente ofrece una ventaja sobre los modelos in vivo y aprovecha las grandes bibliotecas organoides como sustituto de la población de pacientes. Las DOP están preparadas para convertirse en una importante plataforma de descubrimiento y traslación, superando las muchas limitaciones de las PDX descritas anteriormente.
Tanto la DOP como la PDX son modelos derivados de pacientes e impulsados por CSC, con la capacidad de evaluar la terapéutica en el contexto de un tratamiento personalizado o un formato de ensayo clínico. Las grandes bibliotecas existentes de PDXs, como la colección patentada de >3000 PDXs14,15,16,17,son por lo tanto adecuadas para la rápida generación de bibliotecas de organoides tumorales (organoides derivados de PDX, o PDXO), lo que resulta en una biblioteca emparejada de modelos pdx y pdxo emparejados. Este informe describe el procedimiento para crear y para caracterizar el cáncer colorrectal PDXO-CR2110 en lo referente a su modeloparental 16de PDX-CR2110.
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Protocol
Todos los protocolos y enmiendas o procedimientos relacionados con el cuidado y uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Crown Bioscience (IACUC) antes de realizar los estudios. El cuidado y uso de los animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices internacionales de la AAALAC (Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio) según lo informado en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Consejo Nacional de Investigación (2011). Todos los procedimientos experimentales en animales se llevaron a cabo en condiciones estériles en instalaciones libres de patógenos específicos y se llevaron a cabo en estricta conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de diferentes instituciones gubernamentales (por ejemplo, los Institutos Nacionales de Salud). Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la institución de la instalación (por ejemplo, el Comité institucional de la IACUC).
1. Preparación para el trasplante de tumores
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Alojamiento de animales
- Casa Balb / c ratones desnudos (n = 5) en jaulas ventiladas individuales, a 20-26 ° C, 30-70% de humedad, y un ciclo de iluminación de 12 h luz / 12-h oscuro, con ropa de cama de mazorca de maíz cambiada semanalmente, y la irradiación esterilizada alimentos gránulos secos más agua potable estéril ad libitum.
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Preparación de fragmentos tumorales de donantes
- Vigile de cerca a los ratones donantes que contienen tumores para el peso corporal (BW, vía la balanza de pesaje), y el volumen del tumor (TV, por la medida de la pinza).
- Cuando la TV alcanza los 800-1000 mm3,eutanasia a los animales que contienen tumores en una capucha de riesgo biológico.
- Coloque los ratones en una cámara de eutanasia con una tapa que entregue gas CO2 a la cámara. Descargue gas en la cámara a una velocidad de flujo que produzca una rápida inconsciencia con una angustia mínima para el animal. El caudal óptimo para el CO2 es de alrededor de 2-2,5 Lpm.
- Asegurar la eutanasia observando que los animales no recuperan la conciencia.
- Después de la muerte clínica aparente, mantenga el flujo de gas durante >1 minuto para minimizar la posibilidad de que un animal pueda recuperarse.
- Esterilizar la piel alrededor del tumor usando hisopos de yodoforo. Recoger los tumores mediante la extracción de tejidos adyacentes no tumorales y la colocación en una placa de Petri que contiene 20 mL de PBS, pre-refrigerado (4 °C) antes de la eutanasia.
- Lave los tumores con PBS en otra placa de Petri para eliminar los componentes sanguíneos seguidos de cortar por la mitad y eliminar cualquier piel, vasos sanguíneos, calcificación y/o necrosis adicionales.
- Coloque solo piezas tumorales intactas en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con 20 mL de PBS, antes de transportarlos a una sala de animales separada para su trasplante.
2. Crecimiento tumoral subcutáneo
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Inoculación subcutánea del pedazo del tumor en ratones immunocompromised
- Corte el tumor pdx en pedazos de 2 milímetros con un bisturí, y coloque cada uno en los trocars para la implantación subcutánea (SC).
- Anestesiar a los animales receptores con isoflurano al 5% (mantenido por un cono nasal al 1%). Los animales se relajan, perdiendo su reflejo corrector y eventualmente quedando inmóviles, hasta no responder al dolor. Fije los ratones anestesiados en un tablero de experimento en la posición lateral correcta y esterilice con hisopos de yodoforo, particularmente las áreas que rodean el sitio de inoculación del tumor.
- En la piel del flanco izquierdo justo craneal a la cadera, hacer una incisión de 0,5 cm con un bisturí y crear un túnel debajo de la piel hacia el miembro anterior, 2-3 cm, utilizando pórceps contundentes.
- Transferir asépticamente un cubo de fragmento de tumor por sitio de inoculación desde el medio y colocar profundamente dentro del túnel subcutáneo. Confirme visualmente la posición del fragmento antes del cierre de la herida con los clips de la herida.
- Monitorear a los ratones implantados en el tumor (5) hasta que se vuelvan conscientes para mantener la reclinación esternal, y luego devolverlos a su jaula solo después de su recuperación completa de la anestesia.
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Monitoreo de la salud de ratones con tumores
- Compruebe el consumo de agua y alimentos diariamente y registre el peso corporal semanalmente.
- Revise los ratones durante el monitoreo de rutina. Registre cualquier efecto sobre la movilidad, la respiración, el aseo y la apariencia general, el consumo de alimentos y agua, la ganancia / pérdida de BW, la ascitis, etc.
- Mida la TV dos veces por semana usando pinzas y exprese en mm3 por: TV = 0.5 a × b2,donde a y b son la longitud y la anchura del tumor, respectivamente.
- Sacrificar animales para recoger muestras cuando aparezca alguno de los siguientes signos: pérdida de BW >20%; movilidad deteriorada (no capaz de comer o beber); incapaz de moverse normalmente debido a ascitis significativa o abdomen agrandado; esfuerzo en la respiración; muerte.
3. Necropsia y cosecha tumoral
- Cuando el volumen tumoral alcanzó los 200-800 mm3,eutanasia a los ratones según los protocolos aprobados (véase el paso 1.2.2).
- Recoja los tejidos del tumor quitando los tejidos no-tumorales adyacentes, seguido colocando el tejido en un tubo plástico de 50 mL con AD+++ (en el hielo) antes de la disociación.
4. Preparación para el cultivo organoide derivado de PDX
NOTA: Todos los siguientes pasos se realizaron dentro de un gabinete de bioseguridad por las pautas estándar de cultivo de tejidos. Mantenga las existencias precalentadas de placas de 96, 24 y 6 pozos en una incubadora de 37 °C antes de su uso.
- Preparaciones de reactivos
- Prepare la solución del extracto de la membrana del sótano (BME) (factor de crecimiento reducido, Fenol Rojo-libre). Mantenga 10 mL de BME en un refrigerador de 4 °C durante la noche. Una vez descongelado, gire la botella de BME para asegurar la dispersión.
- Prepare el medio base/tampón de lavado AD+++. Añadir 5 mL de L-glutamina de 200 mM, HEPES de 1 M y Pluma/Estreptococo al medio AVANZADO DMEM/F12 pipeteando con una pipeta de 5 mL.
- Preparar el medio organoide del colon descrito por Sato et al.18 mediante la suplementación de medios base con N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Nicotinamida (10 mM), SD202190 (10 nM), R-espondina (500 ng/mL), L-glutamina (2 mM), HEPES (10 μM), penicilina-estreptomicina (1x) e Y-27623 (10 μM)19.
- Preparar AD+++Medio de digestión: 10 mL de 1x medio de cultivo organoide con 500 μL de colagenasa tipo II (20 mg/mL) y 10 μL de RhoKI Y-27632 (10 mM).
- Disociacióntumoral 20
- Transfiera el tumor en un tubo plástico de 50 mL a una placa de Petri de 10 cm. Tome una fotografía macroscópica junto a una regla y registre una descripción de sus condiciones (es decir, tamaño, tejidos grasos, vascularización, necrosis, etc.).
- Elimine el exceso de AD+++ por aspiración y corte el tejido tumoral en trozos pequeños con tijeras seguidas de transferencia de 1-2 piezas en un microtubo de 2 mL para la congelación instantánea en hielo seco. Conservar a -80 °C para perfiles genómicos. Picar las piezas restantes en piezas más finas por tijeras antes de transferir a un tubo de plástico de 50 mL utilizando AD +++.
- Lavar el tejido picado 2-3 veces por 35 mL de AD+++, seguido de la adición de 10 mL de medio de digestión (ver paso 4.1.4) y la colocación en una coctelera orbital a 4 x g durante 1 h a 37 °C.
- Homogeneizar el tejido digerido pipeteando hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta de plástico estéril de 5 mL, seguida de la adición de 20 mL de AD+++ y la filtración por colador celular de 100 μm.
- Lavar el paso a través dos veces con AD +++ (girar a 450 x g durante 5 min), seguido de resuspensión en BME (añadir 4x volumen de BME a la pastilla para la suspensión) y mantener en el hielo19.
- Preparación del cultivo organoide
- Agregue la suspensión de celda BME en la placa de 6 pozos en múltiples gotas hasta un total de 200 μL por pozo.
- Transfiera la placa a una incubadora de 37 °C. Después de 30 min, las gotas de gel se solidifican.
- Añadir 2 mL de medio organoide a cada pozo, con las gotas representativas registradas por fotografía microscópica antes de transferir a una incubadora (37 °C y 5% deCO2).
- Mantener los cultivos organoides con cambio medio cada 3-4 días, y el paso en una proporción de 1:2 cada 7 días o dependiendo de su crecimiento y densidad.
5. Histopatología y análisis de secuenciación de próxima generación (NGS)
- histopatología
- Recoger organoides del pozo con el medio existente utilizando una pipeta P1000, seguida de centrifugación (espín a 450 x g durante 5 min), lavado con PBS y fijación en formalina al 10% durante 1 h.
- Coloque los organoides fijos en gelatina al 100% en la parte inferior del tubo cónico de 50 mL, seguido de procesamiento e incrustación de tejidos de rutina.
- Realice la coloración de hematoxilina-eosina (H&E) utilizando protocolos estándar en secciones de parafina de 4 mm.
- RNAseq y secuenciación completa del exoma
- Recoger organoides del pozo con el medio de cultivo existente utilizando una pipeta P1000, seguido de centrifugación utilizando una microcentrífuga a la velocidad máxima (12.000 x g)durante 5 min a 4 °C.
- Recoja el pellet eliminando el sobrenadante medio para asegurarse de que no haya BME visible presente, seguido de congelación instantánea en un microtubo (hielo seco) y luego transferirlo a un congelador de -80 °C.
- Extraiga el ARN o la DNA usando el procedimiento estándar de fabricantes y realice el análisis de NGS para RNAseq y la secuenciación entera del exoma (WES).
6. EnsayoIC 50 20
- Siembra organoide en placa de 384 pozos para ensayo IC50
- Disociar organoides en gotas de BME de cada pozo (digerir BME) mediante la adición de 20 μL de solución de dispase 100x a cada pozo (placa de 6 pozos), que contenía 2 mL de medio organoide, seguido de 10 min de incubación a 37 °C.
- Pipette digirió organoides de todos los pozos a través de un filtro de 70 μm en un tubo de plástico de 50 mL para recoger los organoides.
- Contar los organoides bajo microscopía para la determinación de la concentración organoide. Suspenda los organoides utilizando el medio de cultivo, antes de añadir BME para alcanzar la concentración final del 5% (v/v) sobre hielo.
- Agregue 50 μL de la suspensión organoide en cada placa de 384 pozos con el dispensador de líquido, de acuerdo con el mapa de la placa con una densidad de siembra de 200 PDXOs CR2110 por pozo en el medio de cultivo organoide correspondiente.
- Tratamiento con cisplatino e irinotecán
- Use cisplatino (con la concentración más alta de 100 μM) e "irinotecán" (con la concentración más alta de 10 μM). Añadir SN-38 (un metabolito de irinotecán, a diferencia del irinotecán que se suele utilizar para estudios in vivo) a cada pozo según el esquema de dilución del fármaco durante 9 dosis, en dilución en serie por dispener digital.
- Cree el mapa de placas utilizando la herramienta de software del dispensador digital. Incluir un vehículo de control negativo con 100% de viabilidad y control postivo de starurosporina de 5 μM, que mostró 0% de viabilidad.
- Vuelva a colocar las placas de 384 pozos tratadas con fármacos en la incubadora de 37 °C.
- Determinación de la viabilidad de las células organoides después del tratamiento farmacológico
- Al final de los 5 días de tratamiento farmacológico, determine la viabilidad de las células organoides utilizando reactivos de viabilidad de células luminiscentes según el procedimiento recomendado por el fabricante. Agregue el reactivo luminiscente en cada pozo con el disipador líquido y mezcle durante 5 minutos en una coctelera de placas, seguida de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Grabe la señal luminiscente en un lector de placas multi-pozo de luminiscencia.
- Calcule las viabilidades normalizadas de cada pozo utilizando las lecturas en bruto del lector de placas y cree una curva dosis-respuesta y valores de IC50 por ajuste de curva no lineal.
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Representative Results
Morfología de PDXOs, típica de organoides bajo microcopia ligera, y consistente con PDX parental por tinción H&E
Bajo microscopía de luz, PDXO-CR2110 demuestra una morfología quística típica(Figura 1A),como se describió anteriormente para organoides derivados de pacientes (DOP), evidencia que apoya la similitud entre PDXO y DOP bajo las mismas condiciones de cultivo.
El examen histopatológico por tinción H&E revela que las estructuras tisulares y los tipos celulares de PDXO-CR2110(Figura 1B)son reflejos del PDX-CR2110 original(Figura 1C),apoyando que el PDX y el PDXO fueron desarrollados a partir del mismo origen: CR2110. Esta observación proporciona evidencia de la histopatología para apoyar la semejanza de PDXO a su PDX parental.
La expresión del transcriptoma y la secuenciación completa del exoma demuestran una alta correlación entre PDXO-CR2110 y el PDX-CR2110 parental
Los tumores PDX-CR2110 se han perfilado previamente genomically usando la secuencia del transcriptome (RNAseq, mRNA)16 y el exome entero (WES, DNA) secuenciado. Ahora hemos perfilado de manera similar el PDXO-CR2110 correspondiente. Las comparaciones de perfiles genómicos de los correspondientes PDX y PDXO emparejados(Figura 2)demuestran una alta correlación del 94,92% en la expresión del transcriptoma (ARNm) (epigenética) y una alta concordancia del 97,67% de las mutaciones del ADN (WES) (genéticas), lo que sugiere una similitud genómica global entre este par de modelos.
Similitudes observadas para las propiedades farmacológicas entre PDXO-CR2110 in vitro e in vivo PDX-CR2110
Se realizaron ensayos de sensibilidad al fármaco en PDXO-CR2110 en placas de 384 pozos, con resultados que se muestran en la Figura 3A. PDXO-CR2110 fue sensible al irinotecán y resistente al cisplatino, consistente con los resultados del tratamiento con PDX(Figura 3B)donde el TGI (inhibición del crecimiento tumoral) a niveles de dosis de 100 mg/kg, i.p., Q3Dx3 para irinotecán y 5 mg/kg, i.p., Q4Dx4 para cisplatino es de 84,63% y 6,61% respectivamente. Esta consistencia farmacológica observada apoya la equivalencia potencialmente biológica de ambos modelos, y se puede utilizar para estudios complementarios de la farmacología in vitro e in vivo.
Figura 1: Morfología de PDXO-CR2110. (A)Morfología de la microscopía bajoluminosa (tipo quístico). b,c) Histopatología de PDXO-CR2110 y PDX-CR2110, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Perfiles genómicos de PDXO-CR2110 frente a PDX-CR2110, WES y RNAseq. Panel superior: correlación global de la expresión de ARNm entre PDX-CR2110 y PDXO-CR2110 por RNAseq. Panel inferior: tabla de correlaciones tanto de expresión de ARNm por RNAseq como de concordancia de mutaciones en el ADN por WES: PDX- vs PDXO-CR2110. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Propiedades farmacológicas tanto de PDXO-CR2110 in vitro como de SC PDX-CR2110 in vivo. (A) PDXO-CR2110 dosis-respuesta in vitro a los compuestos de ensayo. (B)Inhibición del crecimiento tumoral inducida por los mismos compuestos de prueba en CR2110 in vivo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
Los datos preliminares para PDX-/PDXO-CR2110 en este informe apoyan la equivalencia biológica entre PDX y su derivado, PDXO, con respecto a la genómica, la histopatología y la farmacología, puesto que ambos modelos representan las formas de la enfermedad derivadas del CSC original del paciente. Ambos modelos son modelos de enfermedad derivados del paciente, potencialmente predictivos de la respuesta clínica de los pacientes10,11,12,21. El par emparejado de modelos in vitro e in vivo puede complementarse entre sí para la detección in vitro y la validación in vivo, mejorando la tasa de éxito del descubrimiento de fármacos y reduciendo potencialmente las tasas de deserción en el desarrollo clínico. Vale la pena señalar que PDXO ahora puede permitir que HTS aproveche las grandes bibliotecas organoides derivadas de pacientes disponibles, donde los PDX fallan debido a los altos costos in vivo y los plazos más largos. No hace falta decir que una biblioteca PDX-PDXO emparejada probablemente se convertiría en la plataforma de elección para apoyar el descubrimiento de fármacos y la investigación traslacional en un futuro próximo.
La conversión de la biblioteca existente de modelos PDX anotados podría ser un enfoque rápido y productivo para construir una biblioteca organoide práctica mediante el empleo de un proceso industrial. Este informe convirtió un PDX en PDXO para explorar la viabilidad de tal proceso, y el método utilizado podría ser una base para apoyar el proceso a gran escala para construir una extensa biblioteca pdxo. Prácticamente, los métodos para crear PDXO son generalmente similares al método ampliamente descrito para la generación de dop18,con la excepción de la fuente del tejido del paciente que son los ratones.
Hay pasos críticos para asegurarse de que pdxos se crean con éxito: 1) los tumores pdx frescos se fragmentan en pedazos pequeños; 2) las condiciones de cultivo descritas para el cultivo organoide según lo descrito por Clevers y sus colegas se implementan fielmente18,22,pero se pueden ajustar para diferentes organoides; 3) diferentes organoides tienen diferentes tasas de crecimiento, lo que afecta la duración del cultivo organoide y la salud, así como la duración del tratamiento farmacológico; 4) un ensayo eficaz para determinar el contenido de ratón frente al contenido humano es absolutamente crítico para garantizar que los cultivos sean en gran parte organoides humanos, ya que algunos cultivos pueden tener inevitablemente contaminación persistente de tejido de ratón / célula (en el caso reportado aquí, hay una contaminación mínima de tejido de ratón, datos no mostrados). La contaminación de ratones podría ser una de las limitaciones importantes en la creación de biobancos PDXO si no se utilizan métodos efectivos de detección y eliminación.
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Disclosures
Todos los autores son los actuales empleados a tiempo completo de Crown Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Dra. Jody Barbeau, Federica Parisi y Rajendra Kumari por la lectura crítica y la edición del manuscrito. Los autores también quieren agradecer al equipo de Oncología in vitro e in vivo de Crown Bioscience por sus grandes esfuerzos técnicos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
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