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Genetics

एकतरफा मूत्रवर्धक बाधा के साथ माउस किडनी में माइक्रोआरएनए एक्सप्रेशन का मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर मूल्यांकन

Published: August 27, 2020 doi: 10.3791/61383
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 1
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

Summary

हम मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन द्वारा एकतरफा मूत्रगत बाधा (यूयूओ) के साथ चूहों के गुर्दे में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल यूयूओ के साथ चूहों में और अन्य रोग स्थितियों के संदर्भ में गुर्दे माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।

Abstract

माइक्रोआरएनए (एमआईआरएन) एकल फंसे हुए, गैर-कोडिंग आरएनए अणु होते हैं जो आमतौर पर मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) के 3 ' अअनुवादित क्षेत्र (यूटीआर) में आंशिक रूप से पूरक लक्ष्य स्थलों को बाध्यकारी करके पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं, जो एमआरएनए के अनुवाद और स्थिरता को कम करता है । चूहों के विभिन्न अंगों और ऊतकों में मिरना अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच की गई है, लेकिन माउस किडनी में मिरना के शुद्धिकरण और मात्राकरण के लिए मानक तरीके उपलब्ध नहीं हैं। हमने मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा गुर्दे के इंटरस्टिटियल फाइब्रोसिस के साथ माउस किडनी में मिरना अभिव्यक्ति को निकालने और मूल्यांकन करने के लिए एक प्रभावी और विश्वसनीय विधि स्थापित की है। प्रोटोकॉल के लिए पांच चरणों की आवश्यकता थी: (1) नकली और एकतरफा मूत्रवर्धक बाधा (UUO) चूहों का निर्माण; (2) UUO चूहों से गुर्दे के नमूनों की निकासी; (3) गुर्दे के नमूनों से कुल आरएनए, जिसमें मिरना शामिल है, का निष्कर्षण; (4) मिरना से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के साथ पूरक डीएनए (सीडीएनए) संश्लेषण; और (5) सीडीएनए का उपयोग कर क्यूआरटी-पीसीआर। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने सफलतापूर्वक पुष्टि की कि नियंत्रणों की तुलना में, मिरना-3070-3पी की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई थी और मिरना-7218-5पी और मिरना-7219-5p के गुर्दे में काफी कमी आई थी। इस प्रोटोकॉल का उपयोग यूयूओ के साथ चूहों के गुर्दे में मिरना अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

MicroRNAs (miRNAs)-लघु, noncoding RNAs कि गिरावट और दूत आरएनए (mRNA)1 के प्रतिलेखन अवरोध का कारण-विभिन्न mRNAs कि दोनों शरीर विज्ञान और रोग (जैसे, सूजन, फाइब्रोसिस, मेटाबोलिक विकारों, और कैंसर) में महत्वपूर्ण भूमिकाओं है की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है । इसलिए कुछ मिरना 2,3,,4,5विभिन्न प्रकार की बीमारियों के लिए उम्मीदवार उपन्यास बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्य होसकते5हैं । यद्यपि मस्तिष्क, हृदय, फेफड़े, यकृत और गुर्दे सहित माउस अंगों और ऊतकों में मिरना,अभिव्यक्ति प्रोफाइल6, 7, 8,,78,9,10वर्णित किया गया है, गुर्दे के बीच फाइब्रोसिस के साथ माउस किडनी में मिरनास के निष्कर्षण और मूल्यांकन के लिए कोई मानक तरीके नहीं हैं।,

हम मज़बूती से शुद्ध और गुर्दे मध्यवर्ती फाइब्रोसिस के साथ चूहों के गुर्दे में miRNAs की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल डिजाइन किया है। प्रोटोकॉल में पांच मुख्य चरण शामिल हैं, इस प्रकार हैं । (1) 8 सप्ताह पुराने C57BL/6 पुरुष चूहों चूहों के समूहों में विभाजित है कि एक नकली आपरेशन (नियंत्रण) और चूहों कि एकतरफा मूत्र रेखा बाधा (UUO), जो गुर्दे अंतरस्थायी फाइब्रोसिस से जुड़ा हुआ है प्रदान सर्जरी के अधीन है गुजरना । (2) गुर्दे के नमूनों को नकली और UUO चूहों से निकाला जाता है, जो सिलिकॉन होमोजेनाइजर में अलग से समरूप होते हैं, और फिर माइक्रोसेंट्रफ्यूज स्पिन कॉलम11, 12,पर बायोपॉलिमर-श्रेडिंग सिस्टम में स्थानांतरित कर दियाजाताहै। (3) मिरना युक्त कुल आरएनए को किडनी के नमूनों से सिलिका झिल्ली आधारित स्पिन कॉलम12, 13,द्वारा निकालाजाताहै । (4) इस निकाले गए कुल आरएनए का उपयोग करके, पूरक डीएनए (सीडीएनए) को रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज, पॉली (ए) पॉलीमरेज और ओलिगो-डीटी प्राइमर14, 15,के उपयोग के साथ कुल आरएनए से संश्लेषित कियाजाताहै। (5) मिर्ना की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा इंटरकैलिटिंग डाई14, 15,का उपयोग करके कियाजाताहै ।

यह प्रोटोकॉल उन जांचों पर आधारित है जिन्होंने विभिन्न ऊतकों,,11, 12, 13,1314,,,15में मीन्रानों के सार्थक निष्कर्षण और मूल्यांकन प्राप्त किए और प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली बायोपॉलिमर-श्रेडिंग प्रणाली को 200612में ऊतकों से उच्च गुणवत्ता, कुल आरएनए को शुद्ध करने के लिए दिखाया गया था।15 इसके अलावा, पूर्व अध्ययनों ने प्रोटोकॉल के पहलुओं की सटीकता और संवेदनशीलता की पुष्टि की है (यानी, एक्सकैलिंग डाई14,15के साथ क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा मिर्ना अभिव्यक्ति के निर्धारण के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज, पॉली (ए) पॉलीमरेज, और ओलिगो-डीटी प्राइमर के साथ सीडीएनए संश्लेषण।, चूंकि नए प्रोटोकॉल में सादगी, समय की बचत और तकनीकी त्रुटियों में कमी के फायदे हैं, इसलिए प्रोटोकॉल का उपयोग अनुसंधान में किया जा सकता है जिसके लिए माउस किडनी में मिरना प्रोफाइल की सटीक और संवेदनशील पहचान की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल कई रोग स्थितियों की जांच के लिए लागू किया जा सकता है ।

हम अगले UUO, जो गुर्दे इंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस से जुड़ा हुआ है के साथ चूहों में miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल के निर्धारण का वर्णन । मनुष्यों में, गुर्दे की मध्यवर्ती फाइब्रोसिस क्रोनिक किडनी रोग और अंत चरण गुर्दे की बीमारी दोनों की एक आम और महत्वपूर्ण विशेषता है, चाहे उनके एटियोलॉजी16,,17हों। यह गुर्दे की मध्यवर्ती फाइब्रोसिस गुर्दे की विफलता की प्रगति से जुड़ा हुआ है, और यह मध्यवर्ती रिक्त स्थान (जैसे, कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, और α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन)17,,18में बाह्य मैट्रिक्स घटकों की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति की विशेषता है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जिची मेडिकल विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे और प्रयोगशाला जानवरों के लिए जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी गाइड से प्रयोगात्मक पशु दिशानिर्देशों के उपयोग और देखभाल के अनुसार किए गए थे।

1. नकली सर्जरी

  1. निम्नलिखित वस्तुओं को तैयार करें: आइसोफ्लोरेन, कॉर्क शीट, डिपिलेटरी क्रीम, प्रयोगशाला वाइप्स, फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस), 4-0 नायलॉन, चिमटी, सर्जिकल कैंची, कपास झाड़ू, और 8 सप्ताह पुराने C57BL/6 पुरुष चूहों के साथ पेट्री डिश।
  2. 1.5% आइसोफ्लुन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें और 1.5% पर बनाए रखें। फिर, माउस के पेट में डिपिलेटरी क्रीम लगाएं। कुछ मिनटों के बाद, पीबीएस से लथपथ प्रयोगशाला पोंछ के साथ डिपिलेटरी क्रीम को मिटा दें।
  3. माउस के पेट में 70% इथेनॉल इंजेक्ट करें और फिर माउस को रीढ़ की स्थिति में कॉर्क शीट पर रखें।
  4. सर्जिकल कैंची और चिमटी का उपयोग करके, पेट में त्वचा में एक चीरा बनाएं और मूत्राशय से मांसपेशियों और पेरिटोनियल झिल्ली को पसलियों के बाएं निचले किनारे तक काटें।
  5. पीबीएस के साथ दो कपास झाड़ू गीला करें और फिर आंतों को ध्यान से साइड में खींचें। बाएं गुर्दे और मूत्रवर्धक की पहचान करने के लिए गीले झाड़ू रखें।
  6. पेरिटोनियल झिल्ली को बंद करें और फिर चीरा को 4-0 नायलॉन से बंद करें।

2. UUO सर्जरी

  1. निम्नलिखित वस्तुओं को तैयार करें: आइसोफ्लोरेन, कॉर्क शीट, डिपिलेटरी क्रीम, प्रयोगशाला वाइप्स, पीबीएस के साथ पेट्री डिश, 4-0 रेशम, 4-0 नायलॉन, 2.5 एमएल सिरिंज, कपास झाड़ू, चिमटी, सर्जिकल कैंची, और 8 सप्ताह पुराने C57BL/6 पुरुष चूहों।
  2. 1.5% आइसोफ्लुन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें और 1.5% पर बनाए रखें। फिर माउस के पेट में डिपिलेटरी क्रीम लगाएं। कुछ मिनटों के बाद, पीबीएस से लथपथ प्रयोगशाला पोंछ के साथ डिपिलेटरी क्रीम को मिटा दें।
  3. माउस के पेट माउस में 70% इथेनॉल इंजेक्ट करें और फिर माउस को कॉर्क शीट पर रीढ़ की स्थिति में रखें।
  4. सर्जिकल कैंची और चिमटी का उपयोग करके, पेट में त्वचा में एक चीरा बनाएं और मूत्राशय से मांसपेशियों और पेरिटोनियल झिल्ली को पसलियों के बाएं निचले किनारे तक काटें।
  5. माउस के नीचे 2.5 एमएल सिरिंज रखें। दो कपास झाड़ू लें और उन्हें पीबीएस के साथ गीला करें। चिमटी के साथ आंतों को ध्यान से साइड में खींचें, और बाएं मूत्रवर्धक की पहचान करने के लिए गीले झाड़ू को उचित रूप से रखें। चिमटी का उपयोग कर, बाईं किडनी उठा।
  6. 4-0 रेशम का उपयोग करने के लिए दो स्थानों में बाएं मूत्रवर्धक लगभग 1 सेमी के अलावा ligate । दो लिगेशन के केंद्र बिंदु पर मूत्रवर्धक काटें, और फिर पेरिटोनियल झिल्ली और चीरा को बंद करने के लिए 4-0 नायलॉन टांके का उपयोग करें।

3. गुर्दे के नमूनों का संग्रह

  1. निम्नलिखित तैयार करें: 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, आइसोफलुनेन, कॉर्क शीट, 70% इथेनॉल, पीबीएस के साथ पेट्री डिश, चिमटी और सर्जिकल कैंची।
  2. 1.5% आइसोफ्लुन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें और 1.5% पर बनाए रखें। अपने पेट में 70% इथेनॉल इंजेक्ट करें और माउस को रीढ़ की स्थिति में कॉर्क शीट पर रखें।
  3. सर्जिकल कैंची और चिमटी का उपयोग करके, पेट में त्वचा में एक चीरा बनाएं और मूत्राशय से मांसपेशियों और पेरिटोनियल झिल्ली को पसलियों के बाएं निचले किनारे तक काटें।
  4. चिमटी के साथ पेरिटोनियल झिल्ली को उठाएं। सर्जिकल कैंची के साथ, पेरिटोनियल झिल्ली के ऊपरी किनारे पर एक बग़ल में चीरा बनाएं, और पसलियों के सबसे निचले किनारे के साथ चीरा जारी रखें।
  5. इसके बाद, बाईं किडनी की पहचान करें, इसे पीबीएस के साथ तब तक भाटा दें जब तक कि गुर्दे की वाहिकाओं से रक्त धोने के लिए पीला-सफेद न हो जाए, और सर्जिकल कैंची के साथ बाईं गुर्दे की धमनी और नस को काटकर गुर्दे को हटा दें। किडनी को पेट्री डिश में रखें और उसे पीबीएस से ध्यान से धोएं।
  6. सर्जिकल कैंची और चिमटी के साथ 10 मिलीग्राम नमूनों में गुर्दे में कटौती (10 मिलीग्राम अगले कदम के लिए एक उपयुक्त आकार है) । किडनी के प्रत्येक टुकड़े को अपने 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में डालें और ट्यूब की कैप को बंद करें।
  7. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें, और उपयोग से पहले लंबी अवधि के भंडारण के लिए ट्यूबों को −80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

4. गुर्दे के नमूनों से कुल आरएनए की निकासी

  1. निम्नलिखित आइटम तैयार करें: 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, 100% इथेनॉल, क्लोरोफॉर्म, सिलिकॉन होमोजेनाइजर, बर्फ, एक भंवर मिक्सर, 2.0 मिलील संग्रह ट्यूबों में बायोपॉलिमर स्पिन कॉलम11,,12,झिल्ली-लंगरित स्पिन कॉलम 2.0 मिलील संग्रह ट्यूब12,,13,फिनोल/ग्वानिडीन आधारित लाइसिस रिएजेंट, ग्वानिडीन और इथेनॉल युक्त बफर धोने (बफर 1 धोने), बफर युक्त बफर जिसमें इथेनॉल (वॉश बफर 2) और आरएनएस-मुक्त पानी।
  2. सिलिकॉन होमोजेनाइजर में 10 मिलीग्राम किडनी का नमूना डालें। होमोजेनाइजर में फिनॉल/ग्वानिडीन बेस्ड लाइसिस रिएजेंट के 700 माइक्रोन डालें।
  3. होमोजेनाइजर तैयार करें और फिर धीरे-धीरे सैंपल को समरूप बनाने के लिए किडनी सैंपल के खिलाफ होमोजेनाइजर के मूसल को दबा/ट्विस्ट करें। जब तक किडनी का नमूना पूरी तरह से फेनोल/ग्वानिडीन बेस्ड लाइसिस रिएजेंट में घुल न जाए तब तक दबाने/घुमाएं।
  4. नमूने को और समरूप बनाने के लिए, होमोसेक्सुअल lysate (2.0 एमएल संग्रह ट्यूब में) को बायोपॉलिमर स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर समरूप lysate स्पिन, और फिर एक अप्रयुक्त 1.5 मिलीएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के लिए उपजी lysate स्थानांतरित करें।
  6. ट्यूब में lysate को क्लोरोफॉर्म के 140 माइक्रोल के साथ मिलाएं और फिर ट्यूब कैप को कसकर बंद करें। lysate और क्लोरोफॉर्म मिलाने के लिए, ट्यूब को 15 बार उलटा करें।
    नोट: क्लोरोफॉर्म का उपयोग बिना हुड के किया जा सकता है।
  7. आरटी में 2-3 मिनट के लिए प्रत्येक नमूने को इनक्यूबेट करें और फिर प्रत्येक नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर स्पिन करें।
  8. वर्षा को परेशान किए बिना, सुपरनैंट (जो आमतौर पर ~ 300 माइक्रोएल होता है) को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और फिर 100% इथेनॉल की 1.5x इसकी मात्रा (आमतौर पर ~ 450 माइक्रोल) जोड़ें। भंवर 5 एस के लिए मिश्रण।
  9. 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब में झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम पर नमूने के 700 माइक्रोन लोड करें। कॉलम कैप को बंद करें और कॉलम को 15 एस के लिए 15,000 x ग्राम पर स्पिन करें। संग्रह ट्यूब में उपजी lysate दूर फेंक देते हैं।
  10. 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब में झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम में वॉश बफर 1 के 700 माइक्रोन जोड़कर नमूने को अच्छी तरह से धोएं। कॉलम कैप को बंद करें, और कॉलम को 15 एस के लिए 15,000 x ग्राम पर स्पिन करें। संग्रह ट्यूब में उपजी lysate दूर फेंक देते हैं।
  11. ट्रेस लवण को हटाने के लिए 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब में झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम पर वॉश बफर 2 के 500 माइक्रोन लोड करें। कॉलम कैप को बंद करें, और कॉलम को 15 एस के लिए 15,000 x ग्राम पर स्पिन करें। संग्रह ट्यूब में उपजी lysate दूर फेंक देते हैं।
    नोट: एक झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम आरएनए और डीएनए को अलग कर सकते हैं।
  12. चरण 4.11 फिर से करें।
  13. 1 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर फिर से 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब में झिल्ली-एंकर वाले स्पिन कॉलम को स्पिन करें। संग्रह ट्यूब में उपजी lysate दूर फेंक देते हैं।
  14. झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम को एक नए 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें। कॉलम में आरएनएएस-मुक्त पानी के 30 माइक्रोन जोड़कर कुल आरएनए को भंग करें। कॉलम कैप बंद करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट इंतजार करें। फिर, 1 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर कॉलम स्पिन करें।
  15. कुल आरएनए युक्त नमूने की कुल राशि को एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रत्येक ट्यूब को बर्फ पर रखें, और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा कुल आरएनए की एकाग्रता को मापें।
  16. उपयोग से पहले लंबी अवधि के भंडारण के लिए नमूनों के साथ ट्यूबों को −80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

5. कुल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के साथ सीडीएनए का संश्लेषण

नोट: MIQE (मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों के प्रकाशन के लिए न्यूनतम जानकारी) दिशा निर्देशों को बेहतर प्रयोगात्मक प्रथाओं को प्रोत्साहित करने और विश्वसनीय और स्पष्ट परिणाम प्राप्त करने में मदद करने के लिए जारी किए गए थे19। इस प्रोटोकॉल में, सीडीएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज, पॉली (ए) पॉलीमरेज, और ओलिगो-डीटी प्राइमर का उपयोग करके दो-चरण प्रक्रिया में शुद्ध कुल आरएनए के 1.0 माइक्रोग्राम से संश्लेषित किया जाता है।

  1. निम्नलिखित तैयार करें: 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, टोपियां के साथ आठ-अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब, प्रत्येक आठ-स्ट्रिप ट्यूब की टोपी, आसुत पानी, बर्फ, एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस किट (सामग्री की मेजदेखें)14,,पिघला हुआ राज्य में15, एक थर्मल साइकिलर, और एक भंवर मिक्सर।
  2. थर्मल साइकिलर शुरू करें।
  3. एक मास्टर मिक्स समाधान तैयार करें: रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज मिक्स (किट में शामिल) के 2.0 माइक्रोन और 10x न्यूक्लिक एसिड मिश्रण के 2.0 माइक्रोन को 5x हाई-स्पेक बफर के 4.0 माइक्रोन में जोड़ें (प्रति ट्यूब कुल 8.0 माइक्रोन मास्टर मिक्स प्राप्त करने के लिए)।
  4. एक आठ अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब के प्रत्येक ट्यूब में मास्टर मिश्रण समाधान के 8.0 μL रखो।
  5. कुल आरएनए घनत्व को समायोजित करें। RNase मुक्त पानी के 12 μL में गुर्दे के नमूनों से कुल आरएनए के 1.0 μg को अलग करने के लिए, कुल आरएनए की उचित मात्रा को आसुत पानी में स्थानांतरित करें, चरण 4.15 में वर्णित घनत्व डेटा का उपयोग करके।
    नोट: यदि कोई डीएनए संदूषण मौजूद है, दूषित डीएनए QRT-पीसीआर में सह परिलक्षित किया जाएगा ।
  6. प्रत्येक ट्यूब में कुल आरएनए का 12 μL aliquot रखें और ट्यूब की टोपी बंद करें। 15 x के लिए ट्यूब सेंट्रलाइज।
  7. ट्यूब को थर्मल साइकिलर में रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेट करें। इसके बाद, सीडीएनए के संश्लेषण के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए तुरंत नमूने को इनक्यूबेट करें।
  8. जब इनक्यूबेशन पूरा हो जाता है, तो सीडीएनए को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और आसुत पानी के साथ सीडीएनए को दस बार (1:10) पतला करें। भंवर और 5 एस के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  9. अस्थायी रूप से पतला सीडीएनए को बर्फ पर स्टोर करें और उपयोग से पहले दीर्घकालिक भंडारण के लिए नमूनों को −80 डिग्री सेल्सियस पर ले जाएं।

6. क्यूआरटी-मिरना की पीसीआर

नोट: हमने मिरना की क्यूआरटी-पीसीआर को करने के लिए इंटरकैलेटर विधि का उपयोग किया। आरएनए के लिए प्राइमर U6 छोटे परमाणु 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, और miRNA-7219-5p इस्तेमाल किया गया ।

  1. निम्नलिखित तैयार करें: 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, एक भंवर मिक्सर, क्यूआरटी-पीसीआर के लिए 96-वेल रिएक्शन प्लेट, 96-वेल रिएक्शन प्लेट के लिए चिपकने वाली फिल्म, एक चिपकने वाला फिल्म एप्लिकेटर, 96-वेल सेंट्रलाइज रोटर, मिरना-विशिष्ट प्राइमर, एक वास्तविक समय पीसीआर उपकरण, और एक हरे रंग की डाई-आधारित पीसीआर किट (सामग्री की मेजदेखें)14,,15 जिसमें 2x पीसीआर मास्टर मिक्स और 10x यूनिवर्सल प्राइमर शामिल हैं।
  2. उन्हें 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मिलाने के बाद, निम्नलिखित आइटम भंवर: आसुत पानी के 6.25 माइक्रोन, प्रत्येक 5 μM miRNA प्राइमर के 1.25 माइक्रोन नाभिक मुक्त पानी में भंग, 2.5 μL के 2× पीसीआर मास्टर मिश्रण, और 10x सार्वभौमिक प्राइमर के 2.5 माइक्रोन।
  3. चरण 5 में वर्णित सीडीएनए संश्लेषण तैयार करें, और इसे पिघला दें। भंवर और अपकेंद्रित्र 5 एस के लिए सीडीएनए।
  4. 96-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में रीएजेंट (चरण 6.2 में वर्णित के रूप में बनाया गया) का 22.5 μL aliquot रखो।
  5. प्लेट के प्रत्येक कुएं में सीडीएनए का 2.5 माइक्रोन एलिकोट रखें।
  6. चिपकने वाली फिल्म एप्लिकेटर का उपयोग करके, चिपकने वाली फिल्म को 96-वेल प्लेट पर कसकर सुरक्षित करें। प्रत्येक कुएं के तल पर प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित करने के लिए 30 एस के लिए 1,000 x ग्राम पर 96-अच्छी तरह से अपकेंद्रित्र रोटर के साथ प्लेट को अपकेंद्रित्र करें।

7. पीसीआर साइकिलिंग

  1. वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली शुरू करें, और चरण 6.6 में वर्णित प्लेट को रखें। वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली में। प्रयोग गुणों को आगे सेट करें; प्रयोग के नाम की पहचान करें। निम्नलिखित का चयन करें: "96-वेल (0.2 एमएल)" सिस्टम के प्रयोग प्रकार के रूप में, "तुलनात्मक सीटी (ΤCT) क्वांटिटेशन विधि के रूप में, "SYBR ग्रीन रिएजेंट्स" लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने के लिए रिएजेंट के रूप में, और सिस्टम के रन के रूप में "मानक"।
  2. नमूना और लक्ष्य miRNA के लिए एक नाम असाइन करें, और फिर नमूना करने के लिए एक नाम आवंटित और प्रत्येक अच्छी तरह से miRNA लक्ष्य । परिणामों की पुष्टि के लिए उपयुक्त डेटा प्राप्त करने के लिए नमूनों को डुप्लिकेट में सौंपा जाना चाहिए । एक संदर्भ नमूना और एक अंतर्जात नियंत्रण का चयन करें, और निष्क्रिय संदर्भ के रूप में उपयोग किए जाने वाले डाई के लिए "कोई नहीं" चुनें। अभिकर्षकों के क्रॉस-संदूषण को खत्म करने के लिए मिरना अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस और गैर-टेम्पलेट नियंत्रण सेट करना सुनिश्चित करें।
  3. सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया मात्रा सेटिंग "20 माइक्रोन" है और पीसीआर साइकिलिंग की स्थिति 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट की गई है, इसके बाद 15 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 40 चक्रों की डेनैचेशन, 30 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 30 एस के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार किया जाता है।
  4. क्यूआरटी-पीसीआर प्रक्रिया पूरी होने के बाद क्यूआरटी-पीसीआर डेटा का विश्लेषण करने के लिए सिस्टम के सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का इस्तेमाल करें। सुनिश्चित करें कि सॉफ्टवेयर प्रोग्राम द्वारा स्वचालित रूप से चुनी गई सीमा रेखा प्रत्येक अच्छी तरह से उपयुक्त है।
  5. प्रत्येक नमूने में विश्लेषण किए गए अंतर्जात नियंत्रण और लक्ष्य मिरना के दहलीज चक्र (सीटी) मूल्य की जांच करें। सीटी मूल्य प्रवर्धन वक्र और दहलीज लाइन के चौराहे से निर्धारित होता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने लक्ष्य मिरना अभिव्यक्ति स्तर के लिए एक अंतर्जात नियंत्रण के रूप में RNU6-2 का उपयोग किया, और हमने प्रत्येक लक्ष्य मिरना20के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए एक एक्सटीटीटी विधि का उपयोग किया।

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Representative Results

एक UUO माउस मॉडल बाएं मूत्रवर्धक बंधन द्वारा बनाया गया था के रूप में8 सप्ताह पुराने पुरुष चूहों में 21 वर्णित 20-25 ग्राम वजनी । यूटर्स को 4-0 रेशम टांके के साथ डबल लिगेशन द्वारा पूरी तरह से बाधित किया गया था। एक एनाल्जेसिक (मेलोक्सिकम 5 मिलीग्राम/किलो, चमड़े के नीचे इंजेक्शन) सर्जरी से पहले और सर्जरी के बाद 2 दिनों पर भी दैनिक प्रशासित किया गया था । सर्जरी के बाद 8 दिनों में, गुर्दे एकत्र किए गए, पीबीएस के साथ धोया गया, विच्छेदित किया गया, और आगे के विश्लेषण के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया गया। नकली संचालित चूहों नियंत्रण के रूप में सेवा की । अगर बायीं किडनी में हाइड्रोनेफ्रोसिस हो तो डबल लिगामेंट सफल होता है। इस UUO मॉडल का उपयोग कर प्राप्त miRNA qRT-पीसीआर डेटा के आधार पर, miRNA-3070-3p के स्तर में काफी वृद्धि हुई थी और miRNA-7218-5p और miRNA-7219-5p के स्तर को नियंत्रण(चित्रा 1)की तुलना में UUO चूहों के गुर्दे में काफी कमी आई थी ।

Figure 1
चित्रा 1: UUO चूहों के गुर्दे में अलग ढंग से miRNAs व्यक्त किया। qRT-miRNA के पीसीआर विश्लेषण-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, और miRNA-7219-5p अभिव्यक्ति में नकली चूहों (n =8) और UUO चूहों (n = 8) । मान का मतलब मानक त्रुटि (त्रुटि सलाखों) ± है। टी परीक्षण समूहों के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया । पी-वैल्यू और लेफ्टिनेंट के साथ टी-टेस्ट को महत्वपूर्ण माना गया । मिरना: माइक्रोआरएनए, एन.एस.: महत्वपूर्ण नहीं, क्यूआरटी-पीसीआर: मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन, यूयूओ: एकतरफा मूत्रवर्धक बाधा। * पी एंड एलटी;0.05। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

क्यूआरटी-पीसीआर के साथ उपरोक्त वर्णित प्रोटोकॉल ने लक्षित मीनरएनए के अभिव्यक्ति स्तर को सफलतापूर्वक निर्धारित किया। सार्थक क्यूआरटी-पीसीआर डेटा प्राप्त करने की मांग करते समय निकाले गए एमआईआरएन का मूल्यांकन महत्वपूर्ण है, और क्यूआरटी-पीसीआर करने से पहले एमआईआरएन की गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए, 280 एनएम पर अवशोषण के अनुपात को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से जांचा जाना चाहिए। यदि अपेक्षित लंबाई और पिघलने वाले तापमान का एक भी पीसीआर प्रवर्धन या क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा मोनोमॉडल पिघलने वाले वक्र प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं, तो प्रतिक्रिया प्लेट के प्रत्येक कुएं में डीएनए संदूषण या प्राइमर डिमर हो सकता है।

मियार्ना के अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन क्यूआरटी-पीसीआर के अलावा कई तरीकों से किया जा सकता है, जिसमें माइक्रोएरी, उत्तरी ब्लॉटिंग और राइबोन्यूकेज प्रोटेक्शन परख के तरीके शामिल हैं । हालांकि, क्यूआरटी-पीसीआर एक सरल, अत्यधिक प्रजनन योग्य प्रक्रिया है जो सटीक और संवेदनशील दोनों है, और उत्तरी ब्लॉटिंग और रिबोन्यूक्लिज सुरक्षा परख की तुलना में क्यूआरटी-पीसीआर के लिए छोटे नमूना वॉल्यूम का उपयोग किया जा सकताहै। इसके अलावा, चूंकि माइक्रोएरे दसियों हजार मिरना की अभिव्यक्ति के एक साथ माप को सक्षम करते हैं, इसलिए वे उम्मीदवार मिरना मार्कर की पहचान कर सकते हैं। माइक्रोएरे डेटा ने क्यूआरटी-पीसीआर23द्वारा प्राप्त आंकड़ों के साथ समग्र उच्च संबंध दिखाया है, लेकिन असमान अध्ययनों में प्राप्त माइक्रोरैके डेटा की तुलना करने के लिए इष्टतम पद्धति पर सर्वसम्मति24तक नहीं पहुंच पाई है ।

नए प्रोटोकॉल में निम्नलिखित सीमाएं हैं । इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता को यकृत और फेफड़े जैसे अन्य अंगों में मान्य नहीं किया गया है; और प्रोटोकॉल का परीक्षण अन्य प्रयोगशाला जानवरों (जैसे, चूहों, कुत्तों और सूअरों) में नहीं किया गया है। कई समूहों ने बताया कि इस प्रोटोकॉल (क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा मीननाओं के शुद्धिकरण,और पता लगाने के लिए) ने ऊतकों12, 14,,15से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के शुद्धिकरण को सक्षम किया।15 इस विधि में मिरना अभिव्यक्ति12 , 14,14का पता लगाने के लिए उच्च सटीकता और संवेदनशीलता है । वर्तमान रिपोर्ट दर्शाती है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग माउस गुर्दे में मिरना अभिव्यक्ति का सफलतापूर्वक पता लगाने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार प्रोटोकॉल का उपयोग रोग राज्यों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ चूहों के गुर्दे में मिरना अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की सादगी के कारण, कई नमूनों को एक साथ संसाधित किया जा सकता है, और प्रोटोकॉल का उपयोग करना इसलिए गुर्दे की विभिन्न रोग स्थितियों में कई मीनरना की अभिव्यक्ति के विश्लेषण में योगदान दे सकता है।

प्रोटोकॉल के कुछ पहलुओं के बारे में पता है और ध्यान में रखना है । सबसे पहले, शुद्ध RNAs कमरे के तापमान पर गिरावट को रोकने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए । गुर्दे के नमूनों को तब तक समरूप किया जाना चाहिए जब तक कि नमूनों को लाइसिस रिएजेंट में पूरी तरह से पिघल न जाए। चूंकि माउस गुर्दे में पर्याप्त कनेक्टिव ऊतक होते हैं जो लाइसिस रीएजेंट में भंग नहीं होते हैं, इसलिए आगे समरूपता के लिए एक कॉलम श्रेडर आवश्यक है। दूसरा, उचित अंतर्जात नियंत्रण मिरना (जिनकी अभिव्यक्ति नमूनों के बीच स्थिर है) को क्यूआरटी-पीसीआर प्रायोगिक सेटअप में सत्यापित किया जाना चाहिए क्योंकि इस प्रोटोकॉल के तहत विभिन्न पदार्थों पर आक्रमण अंतर्जात नियंत्रण मिरना के अभिव्यक्ति स्तर को बदल सकता है, संभवतः परिणामों से समझौता कर सकता है।

अंत में, हमने यूयूओ के साथ माउस किडनी में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्तियों का पता लगाने, शुद्धिकरण और मूल्यांकन के लिए क्यूआरटी-पीसीआर प्रोटोकॉल का विवरण प्रस्तुत किया है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि के एक मसौदे के संपादन के लिए एडंज समूह (https://en-author-services.edanzgroup.com/) से पीएचडी मिशेल गुडी को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Qiagen 79216 Wash buffer 2
Qiagen 1067933 Wash buffer 1
Tokyo Laboratory Animals Science Not assigned
Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
Thermo Fisher Scientific 4311971 Adhesive film for 96-well reaction plate
Qiagen MS00001701 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'
Qiagen MS00065141 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3'
Qiagen MS00068067 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'
Qiagen MS00068081 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'
Qiagen 217004 Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube
Qiagen 218161 Reverse transcriptase kit
Qiagen 218073 Green dye-based PCR kit
Qiagen 79654 Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube
Qiagen 79306 Phenol/guanidine-based lysis reagent
Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument
Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument software
Qiagen 129112
Qiagen MS00033740 Not disclosed
Takara Bio 9790B Silicon homogenizer
ASKUL GA04SW
AS ONE ER1004NA45-KF2,62 -9968-32

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References

  1. Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
  2. Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
  3. Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
  4. Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
  5. Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. Pathogenesis of liver cirrhosis. World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).
  6. Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
  7. Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
  8. Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
  9. Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
  10. Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
  11. Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
  12. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  13. Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
  14. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  15. Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
  16. Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
  17. Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
  18. Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  20. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
  21. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  22. Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
  23. Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
  24. Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).

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