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Neuroscience

इस्केमिया में न्यूरॉन-ग्लिया इंटरैक्शन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक सेल संस्कृति मॉडल

Published: November 14, 2020 doi: 10.3791/61388
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम विशिष्ट संस्कृति मीडिया का उपयोग करके एक सरल दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं जो उच्च उपज और प्रजनन क्षमता के साथ, भ्रूण कॉर्टेक्स से न्यूरॉन-और एस्ट्रोसाइट-समृद्ध संस्कृतियों, या न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों की स्थापना की अनुमति देता है।

Abstract

इस्कीमिक स्ट्रोक एक नैदानिक स्थिति है जो मस्तिष्क के ऊतकों के हाइपोपरफ्यूजन की विशेषता है, जिससे ऑक्सीजन और ग्लूकोज का अभाव होता है, और परिणामस्वरूप न्यूरोनल हानि होती है। कई सबूत ों से पता चलता है कि ग्लियल और न्यूरोनल कोशिकाओं के बीच बातचीत एक इस्कीमिक घटना के बाद लाभकारी प्रभाव डालती है। इसलिए, संभावित सुरक्षात्मक तंत्रों का पता लगाने के लिए, ऐसे मॉडल विकसित करना महत्वपूर्ण है जो इस्कीमिक वातावरण में न्यूरॉन-ग्लिया इंटरैक्शन का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। इसके साथ हम चूहे भ्रूण प्रांतस्था से एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण पेश करते हैं, और विशिष्ट संस्कृति मीडिया का उपयोग करके, उच्च उपज और प्रजनन क्षमता के साथ न्यूरॉन-या एस्ट्रोसाइट-समृद्ध संस्कृतियों या न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों की स्थापना की अनुमति देता है।

एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के बीच क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए, हम एक सह-संस्कृति प्रणाली पर आधारित दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं जिसमें कवरस्लिप में सुसंस्कृत न्यूरॉन्स को मल्टीवेल प्लेटों में चढ़ाया जाने वाले एस्ट्रोसाइट्स के मोनोलेयर के संपर्क में रखा जाता है। दो संस्कृतियों को छोटे पैराफिन क्षेत्रों द्वारा अलग रखा जाता है। यह दृष्टिकोण स्वतंत्र हेरफेर और प्रत्येक सेल प्रकार के लिए विशिष्ट उपचार के आवेदन की अनुमति देता है, जो कई अध्ययनों में एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है।

इस्कीमिक स्ट्रोक के दौरान जो कुछ होता है, उसे अनुकरण करने के लिए, संस्कृतियों को ऑक्सीजन और ग्लूकोज अभाव प्रोटोकॉल के अधीन किया जाता है। यह प्रोटोकॉल इस्कीमिक स्ट्रोक में न्यूरॉन-ग्लिया इंटरैक्शन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

विश्व स्वास्थ्य संगठन के आंकड़ों के मुताबिक, इस्कीमिक स्ट्रोक1से हर साल करीब ५,५००,००० लोगों की मौत हो जाती है । यह स्थिति एक निश्चित मस्तिष्क क्षेत्र में रक्त प्रवाह में रुकावट की विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति में प्रतिवर्ती या अपरिवर्तनीय हानि होती है, जो ऊतक कार्य को बदल देती है और माइटोकॉन्ड्रियल रोग, कैल्शियम डिस्रेगुलेशन, ग्लूटामेटोक्सिसिटी, सूजन और सेल हानि2, 3कीओर लेजातीहै।

संवहनी कोशिकाओं के अलावा, न्यूरोनल और ग्लियल कोशिकाएं इस्कीमिक स्ट्रोक4के रोगविज्ञान में शामिल हैं। विशेष रूप से, एस्ट्रोसाइट्स न्यूरॉन्स के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं और हाल ही में इस्कीमिक घाव5के जवाब में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाए गए थे। इस प्रकार की ग्लियल सेल संरचनात्मक समर्थन, ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ रक्षा, न्यूरोट्रांसमीटर का संश्लेषण, सेल-सेल संचार का स्थिरीकरण, अन्य6के बीच कार्य करता है। न्यूरॉन्स के साथ, एस्ट्रोसाइट्स सिनैप्टिक ट्रांसमिशन में सीधी भूमिका निभाते हैं, जो एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट, गामा-अमीनोबुटिरिक एसिड और ग्लूटामेट 7 जैसे अणुओं की रिहाई को विनियमित करतेहैं। इस्केमिया द्वारा प्रेरित चोट का एक हिस्सा ग्लूटामेट की अत्यधिक रिहाई और सिनैप्टिक फांक पर इसके संचय के कारण होता है, जिससे एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट रिसेप्टर्स का अतिसक्रियण होता है, जो डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड को सक्रिय करता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततः एक्सटोटोक्सीसिटी8होता है। चूंकि एस्ट्रोसाइट्स सिनैप्टिक फांक से ग्लूटामेट को हटाने और इसे ग्लूटामीन में बदलने में सक्षम हैं, इसलिए वे एक्सेक्टॉक्सिटी के खिलाफ बचाव में महत्वपूर्ण हैं, जिससे इस्केमिया पर न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव पड़ता है। ये कोशिकाएं इस्केमिया प्रेरित न्यूरोइंफ्लेमेशन में भी भूमिका निभाती हैं। इस्कीमिक अपमान के बाद, सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स मॉर्फोलॉजिक परिवर्तनों (हाइपरट्रॉफी) से गुजरते हैं, पैदा होते हैं, और ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) अभिव्यक्ति में वृद्धि दिखाते हैं। वे प्रतिक्रियाशील (एस्ट्रोग्लियोसिस) बन सकते हैं, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α, इंटरल्यूकिन-1α और इंटरल्यूकिन-1, और नाइट्रिक ऑक्साइड और सुपरऑक्साइड सहित मुक्त कणों का उत्पादन जैसे प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स जारी कर सकते हैं, जो बदले में न्यूरोनल डेथ9,,10को प्रेरित कर सकते हैं। इसके विपरीत, प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव भी निभा सकते हैं, क्योंकि वे एंटी-भड़काऊ साइटोकिन्स जारी करते हैं, जैसे विकास कारक-β को बदलना, जो स्ट्रोक11के बाद अपवित है। इसके अलावा, वे एक ग्लियल निशान उत्पन्न कर सकते हैं, जो अक्षीय अंकुरण को बाधित करके ऊतक उत्थान को सीमित कर सकता है; हालांकि, इस glial निशान व्यवहार्य ऊतक से चोट साइट अलग कर सकते हैं, इस प्रकार अनियंत्रित ऊतक क्षति12,,13की एक व्यापक लहर को रोकने .

इस प्रकार, यह मॉडल है कि एक इस्कीमिक चोट के तहत न्यूरॉन-ग्लिया बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति के लिए चिकित्सीय रणनीतियों है कि सीमा या इस्कीमिक चोट के प्रभाव रिवर्स खोजने के लिए स्थापित करने के लिए आवश्यक है । इस्कीमिक चोट का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य मॉडलों की तुलना में, अर्थात् वीवो मॉडल में14,,15,,16,ऑर्गेनोटीपिक संस्कृतियों17,,18,,19 और तीव्र मस्तिष्क स्लाइस20,21,,22,प्राथमिक कोशिका संस्कृतियां कम जटिल हैं, जो आईएसकेमिक स्ट्रोक के रोगविज्ञान में प्रत्येक कोशिका प्रकार के व्यक्तिगत योगदान का अध्ययन संभव बनाती हैं और प्रत्येक कोशिका का जवाब कैसे संभव होता है।, आमतौर पर, न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृतियों और एस्ट्रोसाइट-समृद्ध संस्कृतियों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, न्यूरॉन्स और प्रसवोत्तर मूल की ग्लियल कोशिकाओं का उपयोग23,24,या प्रसवोत्तर ग्लियल कोशिकाओं और भ्रूणीय न्यूरॉन्स25, 26,26का उपयोग किया जाता है।, यहां एक ही ऊतक से न्यूरॉन-या एस्ट्रोसाइट-समृद्ध संस्कृतियों और न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण का प्रस्ताव किया गया है। ये प्राथमिक कोशिकाएं चूहे भ्रूणीय प्रांतस्था से प्राप्त होती हैं, जो अक्सर स्ट्रोक27,,28से प्रभावित क्षेत्र है। इसके अलावा, ऊतक का वियोजन केवल एक यांत्रिक प्रक्रिया द्वारा किया जाता है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल विकास के एक ही चरण में कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है, एक तेज और सस्ती तरीके से, और उच्च प्रदर्शन और प्रजनन क्षमता के साथ।

एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के बीच क्रॉसटॉक को सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके खोजा जा सकता है जिसमें कवरस्लिप में सुसंस्कृत न्यूरॉन्स को मल्टीवेल प्लेटों में वरीयता प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स के मोनोलेयर के संपर्क में रखा जाता है। दो सेल संस्कृतियों के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए छोटे पैराफिन क्षेत्रों का उपयोग किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण प्रत्येक कोशिका प्रकार के स्वतंत्र हेरफेर की अनुमति देता है इससे पहले कि वे संपर्क में लाया जाता है । उदाहरण के लिए, एस्ट्रोसाइट्स में एक विशिष्ट जीन को मौन करना और यह देखना संभव है कि यह इस्कीमिक-प्रेरित क्षति के खिलाफ न्यूरोनल भेद्यता या सुरक्षा को कैसे प्रभावित कर सकता है। विट्रो में इस्कीमिक जैसी स्थितियों को प्रेरित करने के लिए एक स्थापित विधि ऑक्सीजन और ग्लूकोज वंचन (ओजीडी)3है, जिसमें ग्लूकोज की चूक से जुड़े एनोक्सिक वातावरण (95% एन2और 5% सीओ2) द्वारा नियमित वातावरण (95% हवा और 5% सीओ2)को प्रतिस्थापित करना शामिल है।

वर्णित विधि एक सरल, तेज, प्रजनन योग्य और सस्ती तरीके से इस्कीमिक स्ट्रोक के संदर्भ में न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।

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Protocol

इस्तेमाल किए गए सभी जानवरों को सीआईसीएस-यूबीआई स्वास्थ्य विज्ञान अनुसंधान केंद्र में पशु अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय नैतिक आवश्यकताओं के अनुसार और यूरोपीय कन्वेंशन के साथ प्रायोगिक और अन्य वैज्ञानिक प्रयोजनों (निर्देश 2010/63/EU) के लिए उपयोग किए जाने वाले कशेरुकी जानवरों की सुरक्षा के लिए पैदा किया गया था ।

1. चूहा भ्रूण प्रांतस्था प्राथमिक कोशिका संस्कृति

  1. संस्कृति माध्यम तैयारी
    1. निम्नलिखित सप्लीमेंट जोड़कर न्यूरोबेसल मीडियम (एनबीएम) तैयार करें: 2% B27, 0.5 mm ग्लूटामीन, 25μM ग्लूटामेट और 120 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामिसिन। समरूप, पीएच को 7.2 में समायोजित करें और 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके, वैक्यूम फिल्ट्रेशन चरण के साथ माध्यम को स्टरलाइज करें। न्यूरॉन-ग्लिया सेल संस्कृति के लिए, गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एचआई-एफबीएस) के 10% के साथ एनबीएम सेल कल्चर माध्यम को पूरक करें।
    2. निम्नलिखित सप्लीमेंट्स के साथ मिनिमम एसेंशियल मीडियम ईगल (एमईएम) मीडियम तैयार करें- सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट 2.2 जी/एल, इंसुलिन से गोजातीय अग्न्याशय 5 मिलीग्राम/एल, डी-ग्लूकोज अनहाइड्रस 3.4 ग्राम/एल, पेनिसिलिन (12 यू/एमएल) /स्ट्रेप्टोमामाइसिन (12 g/mL) और 10% एचआई-एफबी। समरूप, पीएच को 7.2 में समायोजित करें और एक निस्पंदन चरण के साथ माध्यम को स्टरलाइज करें।
  2. सामग्री और उपकरणों की तैयारी
    1. एक 1 एमएल प्लास्टिक माइक्रोपिपेट टिप के टर्मिनल भाग को एक तरफ से पंचर करें, एक विशिष्ट व्यास के साथ सुई का उपयोग करके (एस के लिए 0.5 मिमी; एम के लिए 0.6 मिमी; एल के लिए 0.8 मिमी) और लौ का उपयोग करके टिप के उद्घाटन को सील करें।
    2. सभी कांच के बर्तनों को स्टरलाइज करें। विच्छेदन के दौरान 70% इथेनॉल में डूबे उपकरण (जैसे, कैंची, चिमटी, स्केलपेल) का उपयोग किया जाता है। लेमिनार फ्लो चैंबर में प्रवेश करने से पहले सामग्रियों को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
    3. पानी स्नान तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और प्रक्रिया शुरू करने से पहले कोशिका संस्कृति माध्यम को पानी के स्नान में रखें।
      नोट: इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के रूप के लिए, पॉली-डी-लिसाइन कोटिंग को कवरस्लिप युक्त मल्टीवेल प्लेटों में किया जाना चाहिए।
  3. चूहा भ्रूण कॉर्टेक्स संस्कृति
    1. गर्भ के 15-16 दिनों के साथ एक मादा Wistar चूहे से चूहे के भ्रूण को हटा दें (संभोग का अंत, जो 24 घंटे तक होना चाहिए, भ्रूण विकास का 1दिन माना जाता है)। इस उद्देश्य के लिए, केटामाइन (८७.५ मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (12 मिलीग्राम/किलो) के साथ मादा को एनेस्थेटाइज करें और भ्रूण को हटा दें । फिर मानक प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा मादा चूहे को इच्छामृत्यु दें।
    2. भ्रूण को 50 एमएल बाँझ ट्यूब में रखें, फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) जोड़ें जब तक कि यह भ्रूण को कवर न कर ले जाए और जल्दी से उन्हें संस्कृति कक्ष में ले जाए।
    3. अभी भी जर्दी थैली के अंदर, एक पेट्री डिश में भ्रूण रखें जिसमें 25 एमएल ठंडे पीबीएस होते हैं। कैंची और चिमटी की मदद से जर्दी की थैली को तोड़कर भ्रूण को हटा दें और उसे ठंडे पीबीएस युक्त दूसरे पेट्री डिश में ट्रांसफर कर दें। पेट्री डिश में पीबीएस पूरे भ्रूण को ढकने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
      नोट: भ्रूण को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए जर्दी थैली खोलते समय सावधान रहें। 1.3.3 और 1.3.4 में हमने पीबीएस को कम तापमान पर रखने के लिए शोषक कागज से ढके बर्फ पैक के शीर्ष पर रखे 90 मिमी व्यास पेट्री व्यंजनों का उपयोग किया।
    4. भ्रूण के विच्छेदन के लिए, इसे एक और पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 30 एमएल ठंडा पीबीएस होता है। भ्रूण को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और चिमटी का उपयोग करके इसे स्थिर करें। प्रारंभिक चीरा कॉर्टेक्स के समानांतर बनाएं, नेत्र गुहा से थूथन के अंत तक जा रहे हैं और सावधान रहें कि जानवर को काटना न हो।
    5. कॉर्टिकल मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान न पहुंचाने के लिए चिमटी का उपयोग करके खोपड़ी और मेनिंग्स को सावधानी से हटा दें। कॉर्टेक्स को अलग करने के लिए अगला चीरा लगा लें। एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पीबीएस के 5 एमएल युक्त 15 एमएल ट्यूब में कॉर्टिकल ऊतक को स्थानांतरित करें।
    6. 1.2.1 में तैयार 1 एमएल प्लास्टिक युक्तियों का उपयोग करके कॉर्टिकल मस्तिष्क ऊतक के यांत्रिक पाचन करें। एक नियमित पिपेट के साथ 10 बार ट्रिट करें और उत्तरोत्तर छोटे छेद (एल, एम और एस) के साथ पिपेट का उपयोग करके प्रक्रिया को दोहराएं, जब तक कि हिस्सा अलग न हो जाए।
    7. यांत्रिक पाचन के बाद, 3 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर निलंबन को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को त्यागें और तलछट को उपयुक्त सेल संस्कृति माध्यम के साथ फिर से खर्च करें जो पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म था।
    8. न्यूबॉर चैंबर का उपयोग करके सेल सस्पेंशन (सेल घनत्व) में मौजूद कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें, उचित कमजोर पड़ने और कोशिकाओं को प्लेट करें। प्रारंभिक कोशिका घनत्व को पिछले अध्ययन5के आधार पर परिभाषित किया गया था ।
      1. एक न्यूरॉन समृद्ध संस्कृति के लिए, प्रारंभिक सेल घनत्व के रूप में 0.21 x10 6 कोशिकाओं/सेमी2 का उपयोग करें और एचआई-एफबीएस के बिना NBM संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखने ।
      2. न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों के लिए प्रारंभिक कोशिका घनत्व के रूप में 0.14 x10 6 कोशिकाओं/सेमी2 का उपयोग करें और 10% HI-FBS के साथ पूरक NBM संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखने ।
      3. एक एस्ट्रोसाइट-समृद्ध संस्कृति के लिए, प्रारंभिक कोशिका घनत्व के रूप में 0.26 x10 6 कोशिकाओं/सेमी2 का उपयोग करें और पहले के अनुसार पूरक एमईएम में कोशिकाओं को बनाए रखें।
      4. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 95% O2 और 5%सीओ2 पर सेट इनक्यूबेटर में रखें।
        नोट: लंबे समय तक संस्कृति अवधि के लिए, सेल विकास को दबाने के लिए 68 माइक्रोन यूरिडीन के साथ 27 माइक्रोन 5-फ्लोरो-2'-डिऑक्सीरिडीन जैसे एंटी-माइटोटिक को जोड़ा जाना चाहिए।

2. सह-संस्कृति प्रणाली

  1. सामग्री की तैयारी
    1. पैराफिन को लगभग 7 मिनट के लिए हीटिंग ब्लॉक में 150 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। प्रक्रिया खत्म होने तक 150 डिग्री सेल्सियस पर रखें। फिर, 1 मिमी व्यास बाँझ ग्लास पाश्चर पिपेट की मदद से, निष्फल और पीडीएल-लेपित कवरस्लिप पर एक छोटी बूंद जोड़ें। पैराफिन क्षेत्र अनियमित हैं, लेकिन उनके पास लगभग 2 मिमी व्यास है। क्षेत्रों में दोनों संस्कृतियों को लगभग 1.25 मिमी से अलग करने की अनुमति होगी।
    2. चूंकि पैराफिन बाँझ नहीं है, इसलिए मल्टीवेल को पैराफिन क्षेत्रों के साथ 15 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण के तहत रखें।
    3. सह-संस्कृति स्थापित करने के लिए, 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में पहले डूबे चिमटी का उपयोग करके पैराफिन क्षेत्रों के साथ कवरस्लिप को स्थानांतरित करें।
  2. सह-संस्कृति
    1. जब दोनों संस्कृतियां उपयोग करने के लिए तैयार हैं (यानी, चरण 1.3.8 में उल्लिखित शर्तों के तहत संस्कृति में 7 दिनों के बाद), एस्ट्रोसाइट्स वाले कुओं में पैराफिन क्षेत्रों के साथ कवरस्लिप में वरीयता प्राप्त न्यूरॉन्स को स्थानांतरित करें।
    2. 24 घंटे पहले दो संस्कृतियों के संपर्क में लाया जाता है, प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर, एचआई-एफबीएस के साथ, NBM पूरक, या नहीं करने के लिए न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की संस्कृति माध्यम बदल जाते हैं ।
    3. दोनों सेल प्रकारों को संपर्क में रखने के बाद, विभिन्न उत्तेजनाओं और प्रक्रियाओं को शुरू करने से पहले 8-12 घंटे का इंतजार करें।
      नोट: सह संस्कृति प्रणाली का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1में दिखाया गया है ।

3. ऑक्सीजन और ग्लूकोज अभाव

  1. संस्कृति माध्यम तैयारी
    1. ओजीडी प्रयोगों के लिए हैंक के बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (एचबीबीएस) का इस्तेमाल करें । निम्नलिखित अभिकर्मकों के साथ एचबीएस माध्यम तैयार करें: 1.26 m M CaCl2,5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4,0.49 mMg MgCl2,139.9 mM NaCl, 4.17 m M NaHCO3,3.38 mNa2HPO4. होममोजेनाइज करें और पीएच को 7.2 पर समायोजित करें। फिल्ट्रेशन द्वारा माध्यम को स्टरलाइज करें।
      नोट: यदि उचित हो, तो 5.56 m m ग्लूकोज जोड़कर ग्लूकोज (एचबीएसएसएलयू+) के साथ एचबीबीएस समाधान को पूरक करें। ओजीडी को प्रस्तुत संस्कृतियों के लिए ग्लूकोज (एचबीएसएसग्लू-) के साथ एचबीएस माध्यम का पूरक नहीं है।
  2. ओजीडी प्रक्रिया
    1. कोशिकाओं को सीडिंग करने के 7 दिन बाद कल्चर मीडियम को हटा दें और दो बार एचबीएसएसग्लू से धोएं- धोने के बाद एचबीएसएसग्लू-सेल कल्चर मीडियम डालें और मल्टीवेल को हाइपोक्सिया चैंबर में रखें ।
    2. हाइपोक्सिया कक्ष को सील करें और कक्ष के अंदर मौजूद ऑक्सीजन को हटाने के लिए20एल/मिनट के प्रवाह के साथ4 मिनट के लिए 95% एन 2 /5% सीओ 2 युक्त गैस मिश्रण जोड़ें। इसके बाद, प्रवाह को रोकें और इच्छित इस्केमिया की सीमा के आधार पर 4 घंटे या 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में हाइपोक्सिया कक्ष रखें।
    3. ओजीडी की अवधि के बाद, शेष प्रक्रियाओं के लिए उपयुक्त संस्कृति माध्यम के साथ एचबीएसएसग्लू-माध्यम को प्रतिस्थापित करें।
      नोट: OGD प्रयोग का उद्देश्य इन विट्रो स्थितियों का अनुकरण करना है जो कोशिकाओं को इस्कीमिक घटना के दौरान पीड़ित होती हैं, इसलिए यह प्रमाणित करना महत्वपूर्ण है कि पहले इस्तेमाल किए गए सभी मीडिया को हटा दिया जाता है।

4. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री परख

नोट: इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री परख के रूप में पहले5वर्णित प्रदर्शन करते हैं ।

  1. संक्षेप में, विभिन्न कॉर्टिकल संस्कृतियों की विशेषता के लिए, खरगोश विरोधी GFAP (1:2000) और माउस एंटी-माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2; 1:500) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें; और फिर निम्नलिखित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 1 एच: एंटी-खरगोश एलेक्सा फ्लोर 546 और एंटी-माउस को 1:1000 कमजोर पड़ने पर एलेक्सा फ्लोर 488 के लिए संयुग्मित किया गया।
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2 μM Hoechst 33342 के साथ इनक्यूबेशन द्वारा सेल नाभिक लेबल।
  3. माउंट फ्लोरेसेंस बढ़ते माध्यम में कवरलिप और 63x आवर्धन के साथ एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर छवियों को प्राप्त करते हैं।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. कोशिकाओं की कुल संख्या के प्रतिशत के रूप में या नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में डेटा व्यक्त करें और ट्रिपलिकेट में किए गए कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब (एसईएम) के मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया गया।
  2. बिनायर किए गए छात्र के टी परीक्षण का उपयोग करके सॉफ्टवेयर (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, सैन डिएगो, सीए) के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण करें। परिणाम महत्वपूर्ण माना जाता था जब पी एंड एलटी के मूल्य; 0.05।

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Representative Results

संस्कृतियों की विशेषता के लिए, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री उन कोशिकाओं की संख्या का आकलन करने के लिए जो GFAP या MAP2 व्यक्त करते थे, जो एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स(चित्रा 2)के व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले मार्कर थे, प्रत्येक प्रकार की कॉर्टिकल संस्कृति में किए जाते थे। इस विश्लेषण से पता चला है कि एस्ट्रोसाइट-समृद्ध संस्कृतियों ने GFAP(चित्रा 2A)को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का 97% प्रस्तुत किया। न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृति के बारे में 78% कोशिकाओं ने MAP2 व्यक्त किया, 4% कोशिकाओं ने GFAP व्यक्त किया, और 18% कोशिकाएं GFAP और MAP2-नकारात्मक(चित्रा 2B)दोनों थीं। न्यूरॉन-ग्लिया कॉर्टिकल संस्कृति के संबंध में, 49% कोशिकाएं MAP2-सकारात्मक थीं, 31% GFAP-सकारात्मक थे और 20% दोनों मार्कर(चित्रा 2C)के लिए नकारात्मक थे।

कॉर्टिकल संस्कृति की स्थापना के सात दिन बाद, न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृति और न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृति को 4 घंटे या 6 घंटे के लिए ओजीडी प्रक्रिया के अधीन किया गया था। इस प्रक्रिया के बाद, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा MAP2 और GFAP-सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या का आकलन किया गया था। न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृति में, ओजीडी के क्रमशः 4 एच और 6 एचकेबाद मानचित्र 2-सकारात्मक कोशिकाओं का नुकसान 30% और 60% था, जबकि जीएफएपी-पॉजिटिव कोशिकाओं का नुकसान क्रमशः 4 घंटे और 6 एच के बाद 17% था(चित्रा 3C)। न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृति के बारे में, ओजीडी के क्रमशः 4 घंटे और 6 एच(चित्रा 3 ए)के बाद MAP2-सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या में 41% और 64% की कमी आई थी। इसके अलावा, न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृति में, न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृति(चित्रा 3 ए)की तुलना में ओजीडी के 4 एच द्वारा प्रेरित चोट विस्तार में मामूली वृद्धि हुई थी।

Figure 1
चित्रा 1: सह-संस्कृति प्रणाली का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।
(क)एस्ट्रोसाइट्स को पीडीएल-कोटेड कवरस्लिप युक्त मल्टीवेल में वरीयता दी गई थी और न्यूरॉन्स को 3 पैराफिन क्षेत्रों वाले पीडीएल-कोटेड कवरस्लिप के साथ एक मल्टीवेल में वरीयता दी गई थी । (ख)जब दोनों संस्कृतियां उपयोग करने के लिए तैयार थीं, तो गोले के साथ कवरस्लिप में न्यूरॉन्स को एस्ट्रोसाइट्स युक्त कुओं में स्थानांतरित कर दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: न्यूरॉन-ग्लिया कॉर्टिकल संस्कृति, न्यूरॉन-समृद्ध कॉर्टिकल संस्कृति और एस्ट्रोसाइट-समृद्ध कॉर्टिकल संस्कृति का लक्षण वर्णन।
न्यूरॉन्स का प्रतिशत (MAP2-सकारात्मक कोशिकाओं), एस्ट्रोसाइट्स (GFAP-सकारात्मक कोशिकाओं) का प्रतिशत, और डबल नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत (MAP2-नकारात्मक/GFAP-नकारात्मक कोशिकाओं) 7वें पर में संस्कृति में दिन(ए)एस्ट्रोसाइट-समृद्ध संस्कृति(बी)न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृति और(सी)न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृति और प्रतिनिधि छवियों में MAP2 (ग्रीन) और GFAP (लाल) के लिए इम्यूनोस्टेटिंग दिखा। कोशिकाओं की कुल संख्या का आकलन गैर-पाइकोनॉटिक आकृति विज्ञान (नीला) के साथ Hoechst ३३३४२-लेबल नाभिक की मात्रा निर्धारित करके किया गया था । एस्ट्रोसाइट-समृद्ध कॉर्टिकल संस्कृति में न्यूरॉन्स की कम संख्या के कारण, प्रतिनिधि छवि MAP2-सकारात्मक धुंधला नहीं दिखाती है। डेटा को ट्रिपलीकेट में किए गए 3 स्वतंत्र प्रयोगों(ए)और 6 स्वतंत्र प्रयोगों(बी, सी)के मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। छवियों को 63x उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ओजीडी अवधि के बाद न्यूरोनल हानि का आकलन।
(ए, बी) न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृति और न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृति और(सी)संख्या एस्ट्रोसाइट्स/फील्ड (GFAP-सकारात्मक कोशिकाओं) और MAP2 (ग्रीन) और GFAP (लाल) की प्रतिनिधि छवि में न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृति में न्यूरॉन/फील्ड (MAP2-positive कोशिकाओं) की संख्या । कोशिकाओं की कुल संख्या का आकलन गैर-पाइकोनॉटिक आकृति विज्ञान (नीला) के साथ Hoechst ३३३४२-लेबल नाभिक की मात्रा निर्धारित करके किया गया था । न्यूरॉन-ग्लिया और न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृतियों को 4 घंटे और 6 घंटे की अवधि के लिए ऑक्सीजन और ग्लूकोज अभाव (ओजीडी) में प्रस्तुत किया गया था। डेटा को ट्रिपलीकेट में किए गए कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कोशिकाओं की कुल संख्या का आकलन Hoechst ३३३४२-लेबल नाभिक की मात्रा निर्धारित करके किया गया था । **p & 0.01, ***p< 0.001 और ****p< 0.0001 की तुलना में ओजीडी 0 एच (अनपेयर्ड स्टूडेंट का टी टेस्ट) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित विधि में चूहे भ्रूणीय कॉर्टिकल ऊतक से एस्ट्रोसाइट और न्यूरॉन अलगाव होते हैं, जिससे न्यूरॉन-या एस्ट्रोसाइट-समृद्ध संस्कृतियों या न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों की स्थापना की अनुमति होती है। यह हमारे समूह5के पिछले अध्ययन से अनुकूलित किया गया था, जहां कॉर्टिकल न्यूरॉन-ग्लिया और न्यूरॉन-समृद्ध भ्रूण संस्कृतियों अलगाव का वर्णन किया गया था और दो संस्कृतियों की विशेषता थी। इन संस्कृतियों का उपयोग करते हुए, रोक एट अल ने पाया कि एस्ट्रोसाइट्स इस्कीमिक क्षति का जवाब देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और पता चलता है कि एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के बीच संचार न्यूरोप्रोटेक्शन5के लिए आवश्यक है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, न्यूरॉन-ग्लिया और न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृतियों की तैयारी के अलावा, हम एस्ट्रोसाइट्स-समृद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने में भी सक्षम हैं, जो हमें न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स पर इस्कीमिक वातावरण के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है अलग या एक साथ।

इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री डेटा के विश्लेषण से पता चला है कि न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृति में 18% कोशिकाएं और न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों में 20% MAP2 और GFAP दोनों के लिए नकारात्मक थे। इन कोशिकाओं ने नाभिक को गैर-पाइकोनॉटिक आकृति विज्ञान के साथ प्रस्तुत किया। यह देखते हुए कि संस्कृतियों भ्रूण ऊतक से तैयार किए गए थे, कोशिकाओं का हिस्सा अभी तक न्यूरोनल मार्कर व्यक्त नहीं कर सकता है, आगे परिपक्वता की जरूरत है । यह पिछले अध्ययनों के अनुरूप है जो यह दर्शाता है कि MAP2 अभिव्यक्ति न्यूरोनल परिपक्वता के साथ बढ़ जाती है और संस्कृति में समय के साथ और विच्छेदन29,,30के समय भ्रूण की उम्र के साथ MAP2-सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई। हमने पहले यह प्रदर्शित किया है कि न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृति में माइक्रोग्लियल मार्कर आयनित कैल्शियम-बाइंडिंग एडाप्टर अणु 15के लिए केवल 0.7% कोशिकाएं सकारात्मक थीं। यद्यपि न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों में उपयोग किए जाने वाले संस्कृति माध्यम में ग्लियल सेल विकास के लिए आवश्यक पोषण सहायता होती है, लेकिन 15-16 दिनों के साथ भ्रूण के प्रांतस्था में माइक्रोग्लिया की मात्रा कम हो जाती है और जैसे-जैसे संस्कृति का समय कम होता है, इस सेल प्रकार का विकास सीमित होता है। एक ही न्यूरॉन समृद्ध संस्कृतियों पर लागू होता है, लेकिन इस मामले में ग्लियल कोशिकाओं की वृद्धि संस्कृति माध्यम में एचआई-एफबीएस की अनुपस्थिति के कारण और भी सीमित है।

विभिन्न प्रकार की संस्कृतियों को एक ही तैयारी से प्राप्त करने की अनुमति देने के अलावा, यहां वर्णित प्रोटोकॉल के अन्य फायदे हैं। एकल कोशिका निलंबन केवल यांत्रिक पाचन द्वारा प्राप्त किया जाता है, अन्य तरीकों के विपरीत,जो एंजाइमेटिक और यांत्रिक पाचन24, 25,31,,,2532दोनों का उपयोग करते हैं; इसलिए, यह तेज और सस्ता है। एक अन्य लाभ यह है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से कोशिकाओं को तैयार करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे हिप्पोकैम्पस या मिडब्रेन, मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों को प्रभावित करने वाली विकृतियों के अध्ययन की अनुमति देता है। इसके अलावा, वर्णित वैकल्पिक प्रक्रिया, जो सह-संस्कृतियों की स्थापना की अनुमति देती है, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री जैसे तरीकों का उपयोग करके सह-संस्कृति में मौजूद विशिष्ट सेल प्रकारों में होने वाले जैव रासायनिक और रूपात्मक परिवर्तनों के विश्लेषण की अनुमति देती है। सह - संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक आम मॉडल ट्रांसवेल सिस्टम24,25,33,,34है।, पैराफिन क्षेत्रों जैसे छोटे स्पेसर्स का उपयोग करके सह-संस्कृति प्रणाली के साथ जो कुछ होता है, उसके विपरीत, ट्रांसवेल सह-संस्कृति मॉडल सह-संस्कृति में मौजूद दोनों कोशिकाओं प्रकारों पर इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री करने की अनुमति नहीं देते हैं। इसके अलावा, पैराफिन क्षेत्रों जैसे स्पेसर्स का उपयोग करने वाली सह-संस्कृतियां सरल और कम लागत हैं।

ओजीडी के लिए न्यूरॉन-समृद्ध या न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों को अधीन करना इस्केमिया के लिए एक आम इन विट्रो मॉडल है, फिर भी अन्य इन विट्रो विधियों का उपयोग किया गया है, अर्थात् रासायनिक और एंजाइमेटिक तरीकों या ग्लूटामेट3, 35,35द्वारा एक्सिटोक्सिटी का शामिल होना। अन्य तरीकों की तुलना में, ओजीडी इस्कीमिक स्ट्रोक के दौरान होने वाले दो चरणों के अनुकरण की अनुमति देता है, अर्थात् ऑक्सीजन और ग्लूकोज का अभाव और रिफ्यूजन, जो एक लाभ है क्योंकि यह वीवो मेंक्या होता है। इसके अलावा, हालांकि रासायनिक और एंजाइमेटिक तरीके इसकी त्वरित प्रतिक्रिया और आवेदन में आसानी के कारण उपयोगी हो सकते हैं, लेकिन वीवो पैथोलॉजिकल राज्य में प्रासंगिकता के साथ चिंता का विषय है, क्योंकि रासायनिक हाइपोक्सिया एनोक्सिया की तुलना में अधिक मुक्त कट्टरपंथी पीढ़ी की ओर जाता है, जो वीवो35में मनाया जाता है। ओजीडी प्रोटोकॉल के बारे में, हमने देखा कि इससे न्यूरोनल हानि होती है और प्रयोगात्मक आवश्यकताओं तक पहुंचने के लिए ओजीडी अवधि की अवधि में फेरबदल करके घाव के विस्तार को समायोजित किया जा सकता है। न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृतियों और न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों में ओजीडी अवधि के बाद न्यूरोनल हानि में देखे गए मतभेद एस्ट्रोसाइट्स द्वारा निभाई गई सुरक्षात्मक भूमिका के कारण हो सकते हैं, जिससे न्यूरोनल मृत्यु को क्षीण किया जा सकता है।

जैसा कि उम्मीद थी, न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों में एस्ट्रोसाइट्स को ओजीडी क्षति न्यूरॉन्स की तुलना में 4 घंटे और 6 घंटे दोनों में कम थी। ओजीडी के लिए एस्ट्रोसाइट्स के उच्च प्रतिरोध को कई पहलुओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। वे इस्केमिया के दौरान न्यूरॉन्स की तुलना में एटीपी स्तर को बनाए रखने में सक्षम हैं, और गंभीर आयनिक डिस्रेगुलेशन अधिक धीरे-धीरे36को प्राप्त करता है: सबसे पहले क्योंकि न्यूरॉन्स में आयनिक चैनलों का घनत्व अधिक होता है और इसके परिणामस्वरूप आयनिक ढाल बनाए रखने के लिए अधिक ऊर्जा की मांग होती है; और दूसरे क्योंकि मस्तिष्क में ग्लाइकोजन स्टोर्स के अधिकांश एस्ट्रोसाइट्स36में पाया जाता है . इसके अतिरिक्त, एस्ट्रोसाइट्स न्यूरॉन्स की तुलना में आयनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के निचले स्तर को व्यक्त करते हैं और इसमें बेहतर आयनिक बफरिंग और एंटीऑक्सीडेंट क्षमता36होती है। ये विशेषताएं संभवतः एस्ट्रोसाइट्स36पर न्यूरॉन्स के प्रसिद्ध चयनात्मक नुकसान को रेखांकित करती हैं।

यहां प्रस्तावित प्रोटोकॉल की सीमाओं के संबंध में, सबसे महत्वपूर्ण यह है कि यह एक इन विट्रो मॉडल पर आधारित है जिसमें वीवो सिस्टम में होने वाली बातचीत की जटिलता का अभाव है, जो वीवो स्थिति में अनुवादके मुद्दों का कारण बन सकता है। हालांकि, यह सेल संस्कृतियों से जुड़े लाभों को प्रस्तुत करता है, अर्थात् सादगी, हेरफेर में आसानी, इस बारे में बुनियादी विस्तृत जानकारी प्रदान करने की क्षमता कि एक विशिष्ट कोशिका आबादी एक निश्चित अपमान का जवाब कैसे देती है3। रोग के इन विट्रो मॉडल कम समय लेने वाले और वीवो मॉडल की तुलना में बनाए रखने के लिए कम खर्चीले होते हैं। अधिक विशेष रूप से, इस्कीमिक स्ट्रोक के मॉडलिंग के लिए, एक इन विट्रो मॉडल में ग्लूकोज और ऑक्सीजन के स्तर को नियंत्रित करने में आसान होने का लाभ भी होता है जब वीवो विकल्प34में तुलना की जाती है। इसके अलावा, हम सह-संस्कृतियों के उपयोग का भी प्रस्ताव करते हैं, जो उच्च स्तर की जटिलता दे सकता है, जिससे ऊतक में मौजूद विभिन्न सेल प्रकारों के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति मिल सकती है।

कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें प्रोटोकॉल निष्पादित करते समय और ध्यान देने की आवश्यकता होती है। एस्ट्रोसाइट्स की पोषण आवश्यकता के कारण, न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एनबीएम को एचआई-एफबीएस-युक्त विकास कारकों, अमीनो एसिड और फैटी एसिड के 10% के साथ पूरक किया जाना चाहिए। यह पूरकता है जो न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृति को न्यूरॉन-समृद्ध संस्कृति से अलग करती है। एक एस्ट्रोसाइट-समृद्ध संस्कृति को तैयार करने के लिए न्यूरोनल विकास के लिए आवश्यक पूरक से रहित एक माध्यम, जैसे B27, का उपयोग किया जाना चाहिए। वर्तमान प्रोटोकॉल में एस्ट्रोसाइट समृद्ध संस्कृति के लिए चुनाव का माध्यम एमईएम था। यह भी बहुत महत्वपूर्ण है कि विभिन्न सेल प्रकारों की जरूरतों को सुनिश्चित किया जाता है जब उन्हें संपर्क में लाया जाता है। इस उद्देश्य के लिए, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स दोनों के साथ संगत संस्कृति माध्यम, अर्थात् बी 27 और एचआई-एफबीएस के साथ पूरक एनबीएम का उपयोग किया जा सकता है। ओजीडी प्रोटोकॉल के बारे में, मुख्य महत्वपूर्ण कदम ओजीडी अवधि शुरू करने से पहले कक्ष से सभी ओ2 को हटाना, और ग्लूकोज के बिना एचबीएसएस के साथ कोशिकाओं की उचित धुलाई, माध्यम में मौजूद सभी ग्लूकोज को खत्म करने के लिए है।

अंत में, यहां हम एक सरल, तेज, सस्ती और प्रजनन योग्य तरीके से स्थापित इस्कीमिक स्ट्रोक का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल पेश करते हैं। इसके अतिरिक्त, वर्णित विधि भी न्यूरॉन-और एस्ट्रोसाइट-समृद्ध प्राथमिक संस्कृतियों को लागू करने की अनुमति देती है, लेकिन न्यूरॉन-ग्लिया संस्कृतियों को भी, इस प्रकार कई मस्तिष्क रोगों के मॉडलिंग के लिए एक महान इन विट्रो मॉडल प्रदान करती है, अमर कोशिका रेखाओं और शुद्ध न्यूरोनल या ग्लियल संस्कृतियों की तुलना में जटिलता का एक उच्च स्तर के साथ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों Fundação पैरा एक Ciência ई परियोजनाओं UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 और फैलोशिप SFRH/BD/135936/2018 जेपी के माध्यम से एक सिनोलोजिया द्वारा धन समर्थन स्वीकार करते हैं, परियोजना सेंट्रो-01-0145-फेडरर-000013 के माध्यम से 'प्रोग्रामा ओपेरासियोनल डू सेंट्रो, सेंट्रो 2020" द्वारा और परियोजना पीओसीआई-01-01-0145-फेडर-022122 के माध्यम से बायोइमेजिंग के पीपीबीआई-पुर्तगाली प्लेटफॉर्म को फंडिंग।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 -well culture plates Thermo Fischer Scientific 142475
95% N2/5% CO2 gas cylinder ArLíquido
Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 Invitrogen A11010 1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature
B27 supplement (50x) Gibco 17504-044
Dako Fluorescence Mounting Medium Dako S3023
D-glucose anhydrous Fisher Scientific G/0450/60 3.4 g/L
Epifluorescence microscope Zeiss AxioObserver Z1x 63x objective
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom S0615 10%
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272 120 µg/mL
Glutamate Sigma-Aldrich G8415 25µM
Glutamine Sigma-Aldrich G3126 0.5 mM
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 2 µM; incubation period - 10 min at room temperature
Hypoxia incubation chamber Stemcell Technologies 27310 Chamber used for OGD induction
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 5 mg/L
Ketamine Sigma-Aldrich K-002 87.5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle medium Sigma-Aldrich M0268 warm up to 37 °C before use
Mouse Anti-MAP2 Santa Cruz Biotechnology Sc-74421 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103-049 warm up to 37 °C before use
Paraffin pastilles for histology Sigma-Aldrich 1.07164 Solidification point 56-58°C
Paraformaldehyde Sigma -Aldrich P6148 4% in PBS
Penicilin/Streptomycin Biochrom A 2213 penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL)
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1024
Rabbit Anti-GFAP DAKO Z0334 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Sodium hydrogen carbonate Fisher Scientific S/4240/60 2.2g/L
Xylazine Sigma-Aldrich X1126 12 mg/Kg

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Gava-Junior, G., Roque, C., Mendes-Oliveira, J., Bernardino, A. C., Serrenho, I., Pires, J. P., Baltazar, G. A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia. J. Vis. Exp. (165), e61388, doi:10.3791/61388 (2020).

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